Conception et mise en œuvre d'un Illuminating automatisé, la culture, et du système d'échantillonnage pour Microbial optogénétiques Applications

1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison
Published 2/19/2017
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Bioengineering

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Summary

Nous avons conçu un appareil de culture en continu destiné à être utilisé avec des systèmes optogénétiques pour éclairer les cultures de micro-organismes et cellules d'image régulièrement dans l'effluent avec un microscope inversé. La culture, l'échantillonnage, l'imagerie et l'analyse d'images sont entièrement automatisées afin que les réponses dynamiques à l'éclairage peuvent être mesurés sur plusieurs jours.

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Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications. J. Vis. Exp. (120), e54894, doi:10.3791/54894 (2017).

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Abstract

systèmes optogénétiques utilisent des protéines génétiquement codés qui changent de conformation en réponse à des longueurs d'onde spécifiques de la lumière pour modifier les processus cellulaires. Il existe un besoin pour la culture et la mesure de systèmes comprenant un éclairage programmé et la stimulation des systèmes optogénétiques. Nous présentons un protocole pour la construction et l'utilisation d'un appareil de culture en continu pour éclairer des cellules microbiennes avec des doses programmées de lumière, et automatiquement d'acquérir et analyser des images de cellules dans l'effluent. Le fonctionnement de cet appareil permet chémostat le taux de croissance et l'environnement cellulaire à être étroitement contrôlés. L'effluent de la culture cellulaire continue est régulièrement prélevé et les cellules sont imagées par microscopie à canaux multiples. La mise en culture, l'échantillonnage, l'imagerie et l'analyse d'image sont entièrement automatisées de sorte que les réponses dynamiques de l'intensité de fluorescence et de la morphologie cellulaire des cellules prélevées à partir de l'effluent de la culture sont mesurés sur plusieurs jourssans intervention de l'utilisateur. Nous démontrons l'utilité de cet appareil de culture en induisant de façon dynamique la production de protéines dans une souche de Saccharomyces cerevisiae conçu avec un système de optogenetic qui active la transcription.

Introduction

Systèmes optogénétiques utilisent la lumière pour contrôler une liste croissante des processus cellulaires , y compris l' expression des gènes, 1, 2, 3, 4, 5 localisation des protéines, l' activité 6 de protéines, 6, 7, liaison 8 protéines, 8, 9, 10 et la dégradation des protéines. 11 Un procédé de culture de cellules dans un environnement contrôlé avec une stimulation optique programmée et pour mesurer leur réponse sur des périodes biologiquement pertinentes est nécessaire pour exploiter le potentiel de ces outils pour la recherche en biologie cellulaire et la biotechnologie. Notre procédé met à profit chemostasis pour maintenir un taux de croissance de la constante de cellule dans un endroit bien mélangé, aenominale, et le récipient de culture en verre à température contrôlée 12, 13 qui est exposé à un éclairage programmé. Nous, l'image cellules individuelles dans l'effluent de la culture avec un microscope inversé pour mesurer la réponse de la culture à un éclairage programmé. La mise en culture, l'échantillonnage, l'imagerie et l'analyse d'image sont entièrement automatisées de sorte que l'intensité de la fluorescence et de la morphologie cellulaire de la culture cellulaire des effluents peuvent être mesurés sur plusieurs jours sans intervention de l'utilisateur.

Ce protocole peut être mis en oeuvre dans la plupart des laboratoires familiers avec la culture et la microscopie de cellules en croissance, et l'appareil utilisé est peu coûteux et constitué de composants facilement disponibles. Un récipient de culture transparente est placée au- dessus d' une matrice de diodes électroluminescentes (DEL) capables d'émettre une uW / cm 2 à 10 mW / cm2 de lumière. Les microbes sont cultivées dans un récipient de culture en continu; une pompe péristaltique est utilisée pour ajouter des médias à lataux de dilution, un autre sert à retirer la culture à un taux inférieur au microscope, et la différence sort par une sortie de trop-plein. Un coussin chauffant pour maintenir la température. De l'air est continuellement pompée dans le récipient de culture pour maintenir une pression positive, ainsi que pour mélanger et oxygéner la culture. À l'exception de la pompe à air, l'alimentation de ces dispositifs est régulée par un microcontrôleur qui reçoit également une entrée d'un thermomètre et d'un ordinateur connecté. La culture cellulaire effluent est pompé vers un dispositif microfluidique sur la platine d'un microscope inversé. Non-fluorescent et images fluorescentes sont automatiquement acquises. Les cellules dans les images sont caractérisées par un algorithme qui permet de localiser chaque cellule en tant que région d'intérêt (ROI) et mesure les propriétés de chaque ROI.

Pour démontrer une application de ce protocole, nous avons mesuré la réponse à différentes intensités lumineuses des cellules Saccharomyces cerevisiae modifiées avec une responsa lumière bleueve optogenetic système qui contrôle la transcription de la protéine fluorescente. S. cerevisiae, communément connu sous le nom de levure de boulanger, a été choisi parce que plusieurs systèmes optogénétiques pour contrôler l' expression génique dans ce système il existe déjà 14, 15, 16. En outre, cet organisme modèle est couramment utilisé pour les études de la biologie des systèmes 17 et en tant que châssis pour des applications biotechnologiques 18, 19, 20. Les résultats représentatifs montrent que ce protocole peut être utilisé pour contrôler la transcription d'une culture pendant plusieurs jours en faisant varier les intensités lumineuses d'entrée et en mesurant la production d'un rapporteur fluorescent.

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Protocol

Figure 1

Figure 1: Le dispositif de culture continue. Ce schéma simplifié montre comment l'appareil doit être assemblé quand il est utilisé pour la culture, illuminer, et à mesurer les propriétés optiques des microbes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Vue d' ensemble du protocole. Les étapes de la région ombrée doivent être répétées chaque fois que le protocole est utilisé. Le contrôle en boucle fermée est possible 34, mais n'a pas été mis en œuvre dans ce protocole.

1. Monter le thermomètre à la carte de circuit imprimé


Figure 3: Connexions à lire les valeurs du thermomètre. Ce diagramme montre comment le thermomètre numérique doit être connectée à la carte PCB de sorte que le microcontrôleur peut obtenir une rétroaction pour contrôler la température de la culture. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Souder le sol, des données et des lignes de tension positive du thermomètre numérique à leur respectif à travers des trous marqués "GD + V."
  2. Coupez une broche à partir d'une tête à 3 broches femelle et couper les 2 broches restantes avec un coupe-fil, de telle sorte qu'il peut tenir dans les deux trous traversants étiquetés «R2» et pas obstruer le microcontrôleur. Soudez cela en place. Connecter les deux broches soudées en insérant une résistance de 4,7 kQ dans l'en-tête de la broche.

2. Connectez le Con PuissanceComposants TROL au Circuit Board

Figure 4
Figure 4: Connexions pour contrôler l' alimentation du coussin chauffant. Ce diagramme montre comment les parties de PCB et accessoires doivent être assemblés afin de contrôler l'alimentation du coussin chauffant. Les pièces à contrôler les pompes péristaltiques sont reliées d'une manière similaire. On notera que les composants pour le thermomètre ont été supprimés pour plus de clarté. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Coupez 1 cm des broches de cinq embases femelles 3 broches. Soudez les aux positions sur la carte de circuit imprimé (PCB) marqué comme "# 1", "# 2", "# 3", "# 4" et "CB E."
  2. Coupez 1 cm des broches d'un 6 broches et 8 broches connecteur femelle. Souder celles-ci côte à côtela colonne des trous à travers marqué K1 par K14.
  3. Connectez le coussin chauffant à la carte de circuit imprimé.
    1. Insérez les extrémités d'une résistance de 100 kQ dans le K1 trous traversants étiquetés et K2 sur le PCB. Insérer un transistor à effet de champ métal-oxyde-semiconducteur (MOSFET) dans la position marquée # 1 sur le circuit imprimé, l'étiquette du MOSFET tournée vers l'K1 à travers K14 trous traversants de sorte que l'axe de la source est plus proche de la "# "étiquette, et la tige d'évacuation est la plus éloignée du label" # ".
    2. Couper la ligne de la (DC) Câble d'alimentation 5 V courant de terre et le connecter à J2. Connectez la ligne du coussin chauffant à J1 au sol. Connectez K3 à la broche 3 avec une résistance de 1 kQ. Actuel devrait maintenant seulement couler de J1 à J2 lorsque la broche 3 est réglé sur + 5V.z
      REMARQUE: Les fonctions de réglage de résistance / MOSFET comme un interrupteur qui permet au courant de circuler de la broche J1 à J2 lorsque la broche 3 du microcontrôleur est réglé sur +5 V.
  4. Relierla pompe péristaltique lente.
    1. Insérer les extrémités d'une résistance de 100 kQ dans le K4 trous traversants marqués et K5 sur le PCB. Insérer un transistor MOS dans la position marquée # 2 sur le circuit imprimé, l'étiquette du MOSFET tournée vers l'K1 à travers K14 trous traversants de sorte que l'axe de la source est plus proche de l'étiquette "#", et l'axe d'écoulement est la plus éloignée du label "#".
    2. Couper la ligne du DC câble 12 V d'alimentation de la pompe péristaltique lente du sol. Raccorder la pompe péristaltique face fin à J3 et la verrue mur face fin à J4. Connectez K6 à la broche 4 avec une résistance de 1 kQ. Actuel devrait maintenant seulement couler de J3 à J4 lorsque la broche 4 est réglé sur +5 V.
  5. Raccorder la pompe péristaltique rapide
    1. Insérez les extrémités d'une résistance de 100 kQ dans la K7 trous traversants étiquetés et K9 sur le PCB. Insérez un MOSFET dans la position marquée n ° 3 sur le circuit imprimé, avec l'étiquette du MOSFET tournée vers le K1 par K14 à travers des trous s o que la broche de source est plus proche de l'étiquette "#", et la tige de vidange est le plus éloigné de l'étiquette "#".
    2. Couper la ligne du DC câble 12 V d'alimentation de la pompe péristaltique rapide au sol. Raccorder la pompe péristaltique face fin à J5 et la verrue mur face fin à J6. Connectez K9 à la broche 5 avec une résistance de 1 kQ. Actuel devrait maintenant seulement couler de J5 à J6 lorsque la broche 5 est fixé à +5 V.

3. Branchez la matrice LED à la carte de circuit imprimé

Figure 5
Figure 5: Connexions pour contrôler la matrice de LED. Ce diagramme montre comment la matrice de LED doit être connecté à la carte. Elle montre également que le circuit imprimé peut être empilé sur le microcontrôleur. On notera que les composants pour le thermomètre et pour commander l'alimentation CC à d'autres dispositifs ont été supprimés pour plus de clarté.es / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Soudez le 6 broches, 10 broches, et les deux têtes de broches femelles 8 broches dans les trous traversants sur les côtés du PCB de telle sorte qu'il peut être empilé sur le dessus du microcontrôleur.
  2. Soudez le 100 nF et les 10 condensateurs uF à leurs positions marquées sur le PCB, en notant que la borne négative du 10 condensateur de pF (plomb plus courte) doit être relié au trou de passage marqué d'un signe négatif.
  3. Souder le conducteur de LED à l'ensemble 2 par 12 des trous traversants, dans le renfoncement sur le conducteur loin de la traversée des trous réservés à la matrice de LED.
  4. Soudez 2 colonnes de têtes de broches mâles aux trous traversants marqués pour la matrice de LED, et couper les extrémités de ceux-ci sous le breadboard de telle sorte qu'ils ne seront pas obstruer le microcontrôleur. Reliez ces deux bandes 8 fils de fils de connexion femelle / femelle. Connecter un second jeu de sexe masculintêtes de broches à l'autre extrémité des fils de connexion.
  5. Insérez la matrice de LED sur la médiane de la planche à pain, puis insérez le deuxième jeu de têtes de broches pour les colonnes de chaque côté de la matrice. Faire en sorte que les connexions électriques sont les mêmes que si la matrice de LED a été directement reliée au circuit imprimé avec la face imprimée de la matrice correspondant à la colonne marquée de trous traversants.
  6. Coupez une broche à partir d'une tête à 3 broches femelle et couper les 2 broches restantes avec un coupe-fil, de telle sorte qu'il peut tenir dans les deux trous traversants étiquetés "R1" et pas obstruer le microcontrôleur. Soudez cela. Connecter les deux broches soudées en insérant une résistance de 1 kohm dans l'en-tête de broche.
    Remarque: Le récipient de culture est empilé au-dessus de la matrice de LED. Si les rubans de fils obstruer le vaisseau, les décalé par rapport à la matrice. Ensuite, utilisez un fil de base solide pour combler l'écart entre les broches de la matrice et les broches de ruban de fil, tels que les connexions électriques ne pas change.

4. Installer le logiciel et se connecter au matériel

  1. Empilez le PCB sur le microcontrôleur.
  2. Suivez les liens dans la liste des matériaux pour télécharger l'environnement de développement intégré (IDE) et un code personnalisé pour le microcontrôleur.
  3. Connectez le microcontrôleur à l'ordinateur via un câble microscope universel AB bus série (USB). Compiler et télécharger le code personnalisé au microcontrôleur.
  4. Télécharger Micro-Manager 21, 22 et FIDJI 23. Configurer Micro-Manager comme un plugin FIDJI en copiant tous les fichiers ".DLL", le répertoire "mmplugins" et le répertoire "mmautofocus" dans le répertoire où Micro-Manager a été téléchargé dans le répertoire "Fiji.app". Aussi, copier les "plugins / Micro-Manager" répertoire dans le répertoire "Fiji.app/plugins".
  5. Télécharger le "BioreactorController.jar" fichier into le répertoire "Fiji.app/mmplugins".
  6. Ouvrez Micro-Manager de FIDJI> Plugins> Micro-Manager> Micro-Studio Manager. Utilisez l'Assistant de configuration du matériel pour configurer le logiciel pour contrôler le microscope. Inclure le dispositif "FreeSerialPort" dans l'Assistant avec l'étiquette du port auquel le câble USB AB est connecté.

5. Assurez-vous et Caractériser le boîtier étanche à la lumière pour le récipient de culture

  1. Empiler trois supports de circuits intégrés 8 broches en tant que blocs de construction sur la carte de test à chaque coin de la matrice de LED de telle sorte que le récipient de culture peut reposer sur eux au-dessus de la matrice.
  2. Fixer une partie du papier de diffusion sous la couche supérieure des douilles, de telle sorte que la lumière frappant le récipient de culture à partir de la matrice de LED est diffuse.
  3. Découpez trois 8 "par 6" portions de mousse noire. Couper une partie qui est la même taille que la carte de test électronique (2,3 "x 3,5") à partir de l'intérieur de la première two et d'une partie qui correspond à la taille du rectangle réalisé par les supports de circuits intégrés (0,9 "x 1,8") à partir de l'intérieur de la troisième. Empiler ces couches sur la matrice de LED de telle sorte que la couche finale contenant le "x 1,8" 0,9 se trouve l'ouverture, même avec la partie supérieure des supports de circuits intégrés, et entoure la matrice LED.
  4. Coupez une feuille supplémentaire de mousse noire en deux pour faire un rectangle 6 "par 24". Rouler dans cette colonne creuse de mousse noire que le récipient de culture peut loger dans la chambre avec des tubes et des câbles, de telle sorte qu'il thermiquement et isoler optiquement le récipient de culture.
  5. Centre de la colonne creuse de mousse noire sur la matrice de LED, et marquer la limite de la colonne sur la couche de mousse noire en dessous. Cette frontière marquera où il doit être centré dans l'avenir.
  6. Découpez un 3 "x 3" portion de mousse noire. Utilisez plus tard comme un couvercle qui peut être collé sur le haut de la colonne pour bloquer la lumière extérieure.
  7. Fixez le capteur de puissance de photodiode à th e la culture casquette de navire avec du ruban adhésif, fixer le capuchon, et insérer le récipient de culture dans l'enceinte.
  8. Dans Micro-Manager, accédez à Plugins> bioréacteur Controller. Réglez la matrice pour éclairer à un sous-ensemble de la gamme d'intensités possibles à 30 s d'intervalle.
  9. Enregistrer les intensités lumineuses comme montré sur la console wattmètre reliée au capteur de courant. Ces mesures permettront à l'intensité réelle de la lumière pour être connu lorsque le nombre de voyants qui sont allumés et (PWM) courant de largeur d'impulsion modulée à ces DEL est réglé.

6. Préparer le récipient de culture

Figure 6
Figure 6: les connexions des navires. Ce diagramme montre comment le récipient et le tube de l'appareil doivent être connectés avant d'être passés à l'autoclave.blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Marquer la hauteur correspondant à chaque incrément de 2 ml de liquide dans la plage de 10 ml à 30 ml dans le récipient de culture. Insérez 10 ml d'eau déminéralisée stérile, marquer le niveau d'eau, ajouter 2 mL, marquer le niveau d'eau, et répéter jusqu'à ce que le niveau de 30 ml est marqué. Couvrir les marques avec du ruban adhésif transparent de sorte qu'ils ne sont pas faciles à enlever et éliminer le liquide.
  2. Placer la partie longue de l'orifice d'aluminium à travers le joint de silicone, dans le récipient de culture. Visser le bouchon.
  3. Couvrir une sortie de port court aluminium avec 1/16 "tube ID de silicium. Branchez l'extrémité distale par l' insertion d' un luer lock femelle, puis la connexion d' un bouchon luer lock mâle. Cette sortie est complémentaire, et ne sera pas utilisé (tube 6 sur la figure 6 ).
  4. Connectez deux courts segments de 1/16 "tube de silicone d'identité avec des serrures mâles et femelles luer. Branchez une extrémité à une prise de port court d'aluminium et de brancher le distal extrémité avec un luer mâle et femelle luer prise serrure. Le navire sera inoculé à travers ce tube (tube 7 / 7.1 à la figure 6).
  5. Connecter deux 1/16 "tubes d'identité aux extrémités du 1/16" ID tubes et connecteurs péristaltique. Branchez une extrémité à un port d'aluminium court et branchez l'autre (tube 4 sur la figure 6). Par la suite, ce sera reliée au flacon de support.

7. Préparer le Flask Média

  1. Connecter un "tube de diamètre interne (ID) de silicone sur le port d'aluminium le plus long. Le tube doit être assez long pour atteindre le ballon de médias. Connecter un 1/8" 1/16 luer serrure ID mâle à un court segment de 1/16 " tube ID, connectez ce au tube précédent ,, puis insérer ce court segment dans le bouchon en caoutchouc sur le ballon des médias (tube 3 dans la figure 6).
  2. Fixer le tube. Cette connexion permet à l'air de circuler de la fiole de support au récipient de culture. Lorsque le ballon de médias est ensuite pompée avec un aird ce tube est desserrée, la culture sera mélangé, aéré, et maintenu à une pression positive par les bulles entrants.
  3. Insérez un «tube ID assez long pour atteindre le fond du flacon dans le bouchon, à travers laquelle les médias seront transférés. Branchez un autre 1/16" 1/16 tube ID à celui-ci, puis un tube 3/16 "ID à que. Branchez cela avec un "ID luer lock femelle 3/16 et un bouchon luer lock mâle (tube 1 / 1.1 sur la figure 6).
  4. Le troisième trou dans le bouchon doit être rempli avec un court segment de 1/16 "tube d'identification, connecté à deux autres segments de tubes de diamètre moyen et obturé à l'extrémité distale (tube 2 / 2.1 sur la figure 6). Cela sera connecté une pompe à vide et ensuite à une pompe d'aquarium.
    NOTE: Si le tuyau ne rentre pas facilement à travers les trous dans le bouchon en caoutchouc, couper les extrémités du tube en biais. Ensuite, l'extrémité inclinée qui est poussé à travers le trou peut être utilisé pour tirer le reste à travers.

  1. Insérez un verrou de luer mâle dans un segment de 1/16 "tube de silicone d'identité, puis insérez fermement 0,022" ID polytétrafluoroéthylène (PTFE) tube. Séparément, joindre un luer lock femelle à un 1/16 "tube d'identité. Ensuite, le fil d' une extrémité le long du tube de PTFE pour relier les serrures et l'autre à un port d'aluminium court (tube 5 sur la figure 6).
  2. Connectez le "tube de silicone d'identification au 1/50" 1/50 exposés tube et connecteurs péristaltique ID. Pour cela, connectez trois segments de 1/50 "tube ID et deux segments de 0,022" tube ID de PTFE, en les alternant. Connectez - le à la fiole d' effluent via 1/16 "tube ID (tube 5 dans la figure 6).
  3. Relier une extrémité d'un tube 16/1 "de silicone d'identification au deuxième tube le plus long de l'orifice d'aluminium et l'autre extrémité dans le ballon de l'effluent. Ce tube d'aluminium définit le volume de la culture et de la culture en excès se déverse dans le réservoir d'effluents (tube 8
  4. Autoclave l'ensemble de la culture à 121 ° C et 15 psi (stérilisation générale) pendant 30 min.
    Remarque: Les tubes à travers lesquels le flacon de support est rempli, à travers lequel le flacon de média est aspiré et à travers laquelle le récipient de culture est inoculé avoir de multiples segments de tube de sorte que si le segment distal est contaminé, il peut être enlevé pour révéler une stérile segment.

9. Préparer le canal microfluidique

  1. Mélanger les huiles polydiméthylsiloxanes (PDMS) et un agent de durcissement dans un rapport de 9 à 1. Degas et versez sur le moule maître de silicium.
  2. Cure PDMS pendant 2 heures à 65 ° C, puis le couper du masque avec une lame de rasoir. Couper autour des PDMS jusqu'à ce qu'elle se détache du moule. Évitez de pousser vers le bas et briser la plaquette fragile.
  3. Utilisez un 1,2 mm ID trou biopsie perforateur pour percer des trous aux deux extrémités de la chaîne.
  4. Liaison Plasma les PDMS à la vitre de couverture 24.
  5. Tape le temps les extrémités de la lamelle couvre-objet sur le châssis de support en aluminium de telle sorte que le canal de PDMS est centrée sur le châssis en aluminium, et puis cuire le PDMS à nouveau pendant 2 h à 65 ° C.

10. Remplissez la Flasque Médias

Figure 7
Figure 7: Ajout de médias. Ce diagramme montre comment les médias doivent être filtrés sous vide dans le ballon de médias. Il veille à ce que les médias reste stérile. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Faire les médias appropriés. Si le système de culture en continu sera exploité comme un chemostat, utiliser les médias limitées pour un nutriment spécifique.
    NOTE: Des exemples de composition de support standard pour les études avec S. cerevisiae ont été publiées précédemment 25,= "xref"> 26, 27, 28, 29.
  2. Fixer le filtre à vide à une bouteille de 100 ml, retirez le couvercle du mamelon, puis retirez la fiche blanche du mamelon du filtre à vide avec des pincettes stériles.
  3. Connectez le tube de silicone 3/16 "ID du mamelon, un autre tuyau libre du flacon de médias à une pompe à vide (tubes 1 et 2 de la figure 7, respectivement), et veiller à ce que le tube reliant le ballon de support au récipient de culture est serré fermer (tube 3 sur la figure 7).
  4. Remplissez le filtre avec les médias, tourner sur la pompe à vide, puis filtrer le reste des médias. Fixer le tube de silicone 1/16 "ID relié au vide (tube 2 dans la figure 7) et éteindre la pompe à vide.
  5. Retirer les their du segment intermédiaire de 1/16 "ID tube relié à la pompe à vide de sorte qu'une extrémité non contaminée du tube est accessible. Insérez ee extrémité bleue d'un filtre à air de la seringue stérile dans ce tube.
  6. Fixer le tube 3/16 "de silicone ID (tube 1 dans la figure 7) et débranchez le luer mâle de celui - ci. Débranchez la fiche de la luer femelle du tube d'entrée des médias du récipient de culture. Reliez ces mâles et femelles Luer pour permettre aux médias d'être pompé dans le récipient de culture.
  7. Retirez le filtre à vide et plafonner le ml bouteille de médias qui a été attaché au filtre à vide 100.
  8. Un jour avant le récipient de culture sera inoculé, inoculer une seule colonie du microbe optogenetic dans un tube à essai avec 4 ml de médias recueillies à l'étape précédente, et le laisser grandir pendant une nuit à température optimale de croissance de la température de la culture à 30 ° C ou avec agitation.

11. Assembler l'appareil autour du Microscope

  1. Fixer l'assemblage de culture en continu à proximité du microscope avec le support flacon supérieur à celui du récipient de culture et effluent flacon inférieur à celui du récipient de culture, de telle sorte que le tube constitué de segments de 0,022 "tube en PTFE ID (tube 5 sur la figure 6) peut atteindre la platine du microscope. fermement bande vers le bas le bouchon en caoutchouc du flacon de support et du récipient l' effluent.
  2. Déconnecter les extrémités du "tube en PTFE d'identification de l'1/50" 0,022 tube de silicone d'identification qui les relient (tube 5 sur la figure 6), et de brancher ces extrémités dans l'entrée et la sortie du dispositif microfluidique.
  3. Connectez l'extrémité blanche du filtre à air de la seringue à la pompe d'aquarium. La pression d'air va pousser les médias dans le récipient de culture.
  4. Lorsque les médias atteint le niveau de l'orifice d' effluent, envelopper le "tube de support d'ID d'entrée et connecteurs autour de la pompe péristaltique lente (tube 4 sur la figure 6) et le 1/50" 1/16 ID échantillon tubulure de sortie et des connecteurs autour du rapide pompe péristaltique (tube 5 sur la figure 6).
  5. Aérer les médias par débridage l'air tuêtre entre le ballon des médias et la culture de navire.
  6. Tape le coussin chauffant et d'un thermomètre dans le récipient de culture de telle sorte que sa température peut être contrôlée. Enrouler le tube de support autour du récipient de culture de sorte que les supports entrant seront à la même température que celle du récipient.
    NOTE: Le courant PWM pour le coussin chauffant est régulé par le microcontrôleur qui utilise des entrées du thermomètre pour maintenir le récipient de culture à sa température de consigne.
  7. Insérez le récipient de culture dans l'enceinte de mousse noire sur la matrice LED, et veiller à ce que les tubes ne sont pas coincés.
  8. Dans Micro-Manager, accédez à Plugins> bioréacteur Controller. Réglez le "ratio de médias de la pompe sur" champ à 0,1 et le «ratio de la pompe de l'échantillon sur" champ à 0. Le débit sera très faible, mais supérieure à la vitesse d'évaporation.
  9. Fixer le tube d'air entrant entre le ballon des médias et la culture de navire. Retirez le bouchon du tube d'inoculation (tube 7 dans la figure
  10. Couvrir l'enceinte de sorte qu'aucune lumière pénètre, et que la culture se développer pendant la nuit.

12. Calibrer les taux de pompage

  1. Dans Micro-Manager, accédez à Plugins> bioréacteur Controller. Réglez le "rapport de la pompe des médias sur« champ à 0,5 et le «ratio de la pompe de l'échantillon sur" champ à 0.
  2. Déconnecter le tuyau de trop - plein d' effluent du ballon (tube 8 sur la figure 6) et le tube de prélèvement du flacon effluent (tube 8 sur la figure 6) et recueillir l' effluent dans des récipients séparés. Recueillir les effluents pendant 1 heure, en commençant après les pompes ont été pendant 15 min.
  3. Calculer le taux d'écoulement de milieu dans le récipient de culture à partir du volume collecté dans le récipient en tant que:
  4. Réglez la valeur du "rapport de la pompe des médias sur" terrain par cette estimation linéaire:
    Equaiton 2

    Equaiton 3
  5. Effectuer une itération dans cette procédure d'étalonnage jusqu'à ce que la différence entre le débit souhaité et le débit mesuré est <0,2 ml / h, où le débit est moyennée sur une période de 1 h.
  6. Augmenter la valeur du "rapport d'échantillonnage sur" le terrain et calibrer de manière similaire jusqu'à approximativement 4/5 ème du volume sortant du récipient de culture est pompée par la pompe d'échantillonnage et environ 1/5 du volume quitte par l'orifice de trop-plein.
  7. Laisser la densité de la culture dans le dispositif de culture continue équilibrer dans ces conditions pendant une nuit.
    NOTE: Si les débits cible ne peut pas être atteint, le changementle tuyau de la pompe péristaltique. Le liquide est pompé à un débit plus élevé lorsque les tubes de plus grand diamètre est utilisé. Suivez l'étape 14, puis revenir à l'étape 8.4.

13. Collectionnez Microscope Images de Microbes Cultured

  1. Remplir la scène Position Liste de Micro-Manager avec un ensemble de positions qui ne se chevauchent à laquelle les images de cellules injectées dans le canal microfluidique seront dans le plan focal.
  2. Ouvrez le plug-in "bioréacteur Controller". Sélectionnez le cours désiré de temps de matrice de LED, les canaux d'imagerie, et d'autres paramètres expérimentaux à partir des invites. Recueillir et analyser les images.
  3. Bien que l'expérience fonctionne, veiller à ce que les médias dans le ballon des médias reste claire. Si elle est trouble, il a été contaminé.

14. Post-expérience

  1. Jeter les médias, la culture de cellules en excès et des effluents.
  2. Remplir le flacon de support avec 200 ml de 20% d'EtOH mélangé avec de l'eau déminéralisée. Exécutez le chemostat comme il l'avait précédemmentété exécuté pendant l'expérience pour laver les débris cellulaires et les médias.
  3. Lorsque la solution d'alcool a drainé du ballon de médias, démonter le chemostat pleinement.
  4. Laver la verrerie et les tubes avec de l'eau chaude et un détergent doux et rincer abondamment avec de l'eau déminéralisée. Laisser sécher.
  5. Ouvrez le fichier "microcontrollerRecords.csv" pour examiner la température et l'état de la matrice LED au cours de l'expérience, le fichier "Summary.csv" pour examiner les données sommaires de chaque ensemble d'images et les "Résultats <n> .csv" fichiers pour examiner les données résumant chaque ROI de chaque période de temps, où n est le n - ième jeu de données.

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Representative Results

Cet appareil a été utilisé pour stimuler une culture de S. cerevisiae exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP) en réponse à la lumière bleue par l' intermédiaire d' un système de transcription optogenetic inductible basé sur la protéine paire 30 CRY2 / de CIB1. Les cellules ont été cultivées en chemostat dans des milieux de phosphate limité à un taux de dilution de 0,2 ± moyenne de 0,008. Limitation de phosphate est couramment utilisé dans S. expériences en chémostat cerevisiae pour contrôler le taux de croissance et les effets de la limitation de phosphate sont bien caractérisés. 31, 32, 33 L' effluent provenant du récipient de façon continue la mise en culture diluée a été échantillonné à un dispositif microfluidique sur un microscope inversé. Les images sont automatiquement analysées comme le montre la figure 8. Les cellules individuelles ont été identifiées dans les images à contraste de phase fond soustraites et leur concentra YFPtion a été estimée à partir de leur fluorescence, telle que mesurée à partir des images fluorescentes de fond déduit.

La fluorescence des cellules a été analysée 169,677 33,600 à partir des images acquises à partir d'effluents 28 emplacements dans le dispositif microfluidique au cours des 70 heures de l'expérience. Nous avons utilisé un microscope inversé équipé d'un système d'éclairage par fluorescence et une caméra CMOS. Les images YFP ont été acquises avec un 500/20 nm excitation filtre, un filtre 535/30 nm d'émission, et un dichroïque T515lp. Les images ont été prises avec un objectif de contraste de phase 40X, sous un éclairage Köhler. Les images ont été enregistrées en 16 bits couleur avec 87 pixels par micromètre carré. La culture a été exposée à des intensités de lumière bleue variable pour 6 heures d'intervalle, suivie par l'obscurité totale pendant 6 heures d'intervalle. La culture a été exposée à la lumière avant la première mesure, ce qui est la raison pour laquelle l'intensité de la fluorescence diminue au cours de la première période sombre. </ P>

La figure 9 montre la fluorescence due à la production YFP lors de l' activation du système optogenetic en réponse à l' illumination du récipient de culture. Cela démontre l'utilité des mesures de cellules uniques de la fluorescence sur une population de mesures monocellulaires moyenne révèle la répartition de la population de l'intensité de fluorescence. Notez la valeur aberrante à 42 h 26 min. Après avoir examiné les images correspondantes, il est apparu qu'il y avait des amas de cellules, dans la majorité des images utilisées pour produire l'image composite de l'arrière-plan, ce qui entraîne des artefacts qui ressemblent à des cellules dans l'image d'arrière-plan soustraites. De plus, une bulle dans le récipient de culture a été pompé vers le canal microfluidique et les parties de bords sont confondus avec les cellules par l'algorithme d'analyse d'images. Étant donné que ni la bulle ni les artefacts de soustraction du fond correspondent à des cellules réelles, leur intensité de fluorescence mesuréeest inférieure à l'autofluorescence des cellules. Ce chiffre témoigne de la qualité des données qui peuvent être automatiquement acquis plus de 3 d. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8
Figure 8: représentation visuelle de l'algorithme d'analyse d'images. Ces images ont été coupées et élargi pour faciliter la visualisation. (A) six images sont acquises pour générer l'image à contraste de phase d' arrière-plan soustraites de la culture cellulaire. Une fois l'image principale est acquise, cinq images supplémentaires sont acquises avec la pompe d'effluent d'échantillonnage brièvement allumé entre chaque acquisition afin d'assurer que les cellules sont déplacées. Une image composite de l'arrière-plan est généré à partir des cinq images composantes. La valeur de chaque pixeldans l'image d'arrière-plan est la valeur médiane de ce même pixel à travers les 5 images composantes. (B) l'image d'arrière-soustraites est ensuite converti en binaire. Le binaire est alors dilaté et les trous dans les sections continues du binaire sont remplis. Les contours jaunes correspondent à des régions d'intérêt sélectionnées (ROI), basée sur la taille et la circularité critères. (C) Les ROI sont mis en correspondance avec l'image fluorescente, où la fluorescence de chaque cellule est mesurée comme étant la valeur du pixel le plus clair à l'intérieur de la ROI. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 9
Figure 9: Répartition de la population d'intensités de fluorescence au fil du temps. Dans ces sous-figures du logarithme de fluor mesuréeescence est affiché, conformément à la pratique standard dans la cytométrie de flux. La ligne A et B indique l'intensité de la lumière absorbée ou diffracté par la culture, qui est mesurée par la différence d'intensité entre la lumière transmise à travers les médias stériles et la lumière transmise à travers la culture de cellules dans le récipient de culture. Elle est tracée par rapport au second axe des ordonnées. (A) Une boîte à moustaches (5 e centile, 25 e percentile, médiane, 75 e centile, 95 e percentile) du logarithme de la fluorescence mesurée de la population au fil du temps. (B) un histogramme en 2 dimensions des mêmes données, lorsque la couleur correspond à la fréquence normalisée de cellules présentant une fluorescence mesurée dans la plage de la cellule correspondante. Les couleurs ont été réduits à la plage de données sans la valeur aberrante à 42 h 26 min inclus. La fréquence normalisée de la valeur aberrante dans le plus bas bin de fluorescenceest 0,7. (C) Un histogrammes dimensionnelles du logarithme de la fluorescence mesurée de la population avant la première exposition enregistrée à la lumière et après la plus grande exposition à la lumière. Il démontre que l'expression induite par la lumière de la YFP dans cette souche est bimodale. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Nous avons conçu cet appareil avec une flexibilité à l'esprit. Tout le code utilisé est gratuit et open-source. Le processus d'analyse d'image par défaut pour les cellules de segment est simple et fonctionne rapidement. Analyse personnalisée pourrait être mis en œuvre par l'enregistrement d'entrée de l'utilisateur lors de l'analyse d'une image représentative de l'interface utilisateur graphique FIDJI, convertir l'entrée d'un script beanshell, puis définir le plugin pour appeler le script. Quand il est appelé, ce script sera envoyé un tableau String appelé "images" contenant les chemins de fichiers à l'ensemble le plus récent d'images de fond soustrait. Les images et les données sont enregistrées comme elles sont collectées afin qu'ils ne sont pas perdues si une expérience se termine brusquement. Un tableau LED bleu a été choisi pour induire notre système optogenetic mais il pourrait être remplacé par des LED de couleurs différentes. Il y a des broches d'entrée et de sortie supplémentaires sont disponibles sur le microcontrôleur ainsi que des trous de passage pour un interrupteur à transistor MOS supplémentaire et le commutateur de relais sur le circuit imprimé qui le rendent facilepour ce système d'être adapté à des fins plus complexes. Par exemple, pour rendre cet appareil fonctionne comme un turbidostat, utilisez les broches supplémentaires sur le microcontrôleur pour alimenter une LED et lire les valeurs à partir d'un capteur de lumière attaché au récipient de culture, puis modifier le logiciel pour mesurer la turbidité et diluer le navire en conséquence .

Des précautions doivent être prises pour s'assurer que la culture ne soit pas contaminé, afin de protéger l'équipement de microscopie sensible, et de veiller à ce que les débits de fluide sont cohérentes. Impuretés avant le moment où le récipient de culture est inoculé intentionnellement peuvent être détectés par d'attendre quelques jours avant d'inoculer la cuve et en vérifiant qu'il n'y a pas de croissance à l'intérieur. Pour éviter de renverser la culture cellulaire sur l'objectif du microscope, vérifier que le dispositif microfluidique ne fuira pas par la première culture de cellules de pompage à travers elle sur un tissu absorbant. Si le flux de média dans le récipient de culture est incohérent, il est habituellement parce que le tube autour deles rouleaux de la pompe péristaltique est devenue trop lâche. Si le flux d'air de la pompe d'aquarium est incompatible, assurer qu'il n'y a pas de coudes en forme de U dans le tube d'effluent où le liquide peut résister à la piscine et d'une manière incompatible flux d'air. Si un tube est bouché après une expérience parce que les médias a séché à l'intérieur de celui-ci, faire tremper les tubes bouchés dans un bain d'eau chaude pour dissoudre le sabot.

Il y a des limites intrinsèques à ce protocole à prendre en compte lors de la planification d'une expérience ou de l'analyse des résultats. En fonction du taux de dilution et la longueur du tube utilisé, il existe un délai d'environ 10 minutes au cours de laquelle la culture cellulaire est pompée à partir du récipient de culture au microscope. Par conséquent, il est pas bien adapté pour étudier les événements qui se produisent sur des périodes plus courtes. En outre, alors qu'une expérience peut fonctionner en continu pendant une dizaine de jours, limitée seulement par le volume des médias, l'évolution de la culture cellulaire doit être considérée comme la durée de l'expérience augmente. Le limiting éléments nutritifs des médias a des effets profonds sur le métabolisme et l' expression des gènes 35, 36, 37, 38, 39 et devrait donc être déterminé en fonction de l'aspect de la physiologie à l'étude. Lors de l'analyse des résultats, les images-en particulier les images de données périphériques des points devraient être examinés pour les erreurs dans la façon dont ROIs ont été identifiés par la routine d'analyse d'image. Il est possible que des bulles ou des artefacts d'être pris pour des cellules, biaisant ainsi la fluorescence mesurée. Une façon simple d'éliminer ces mesures erronées consiste à éliminer tous les ROIs avec des intensités de fluorescence ci-dessous l'intensité auto-fluorescence.

Ce protocole sera utile pour mesurer l'intensité de fluorescence et / ou la morphologie cellulaire de la culture cellulaire des effluents en réponse à la lumière dans les organismes qui peuvent se développer en culture continue, réglezTLE à un plan focal cohérente lorsqu'ils ne sont pas agité, et être automatiquement identifié par un algorithme d'analyse d'image. L'algorithme d'identification de cellule par défaut utilisée ici sera plus directement applicable aux microbes grossièrement sphériques qui ressemblent en herbe levure. Une alternative 40 à ce protocole est de cultiver des microbes dans un ensemble de cultures discontinues, puis échantillonner un lot pour chaque point de temps et de caractériser l'échantillon par cytométrie de flux. Cependant, les avantages du protocole décrit ici sont que des échantillons sont prélevés sur la même culture, de nombreux échantillons peuvent être prélevés, et le processus est automatisé. Ce protocole améliore également sur une méthode similaire dans laquelle la levure optogenetic étaient cultivées en continu et imagé sous un microscope 34 par l' acquisition de plusieurs images rapidement et ne pas solliciter l' identification ROIs par fluorescence. Un grand avantage de ce protocole est que de nombreuses mesures de cellules individuelles peuvent être régulièrement acquises sur plusieurs jours-haut d'entrée d'utilisateur. Après avoir mesuré la réponse de la culture microbienne à l' exposition à la lumière, l'étape suivante peut consister à mettre en oeuvre in silico contrôle en boucle fermée de la réponse.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Molly Lazar et Verónica Delgado aide pour tester le protocole, Kieran Sweeney pour des discussions utiles et l'édition, et Taylor Scott, My An-adirekkun, et Stephanie Geller pour la lecture critique du manuscrit. Megan Nicole McClean, Ph.D. est titulaire d'une bourse de carrière à l'interface scientifique du Burroughs Wellcome Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Extensive lab manual GitHub NA An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results.
Fritzing Design Viewer Fritzing NA The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) Adafruit 50 Microcontroller. 1 required.
Arduino Stackable Header Kit SparkFun Electronics 10007 Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required.
Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V Adafruit 180 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Soldering iron stand Adafruit 150 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g Adafruit 145 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
0.1 μF capacitor SparkFun Electronics COM-08375 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
10 μF capacitor SparkFun Electronics COM-00523 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219 Maxim MAX7219CNG LED driver. 1 required.
8 pin IC Socket Mouser Electronics 575-144308 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix.
24 Pin IC socket Mouser Electronics 535-24-3518-10 Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB.
Digital multimeter Adafruit 2034 For troubleshooting electronics. 1 required.
Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") SparkFun Electronics PRT-12693 Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. 
Flush diagonal wire cutters Adafruit 152 For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required.
Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm) Adafruit 793 Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required.
Half-size breadboard Adafruit 64 The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it.
Miniature 8x8 Blue LED Matrix Adafruit 956 Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white.
Stackable header-3 pin SparkFun Electronics 13875 8 required.
Resistor Kit - 1/4W (500 total) SparkFun Electronics 10969 For electronics. 1 required.
 IRL520N MOSFET International Rectifier IRL520N Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required.
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) SparkFun Electronics PRT 11367 Wire for electronics. 1 required.
5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed Adafruit 276 Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required.
12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 798 For peristaltic pumps. 2 required.
Electric Heating Pad - 10cm x 5cm Adafruit 1481 For heating the bioreactor. 1 required.
Low flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-1 For pumping media. 1 required
Medium flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-2 For pumping culture. 1 required.
9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 63 For microcontroller power supply. Order 1.
High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras Adafruit 642 Thermometer for the bioreactor. 1 required.
Micromanager Micromanager NA The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJI ImageJ NA The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development Environment Arduino NA The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Custom code GitHub NA The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB Cable A to B - 6 Foot SparkFun Electronics CAB-00512 Used to download data to microcontroller. 1 required.
bioreactorTimecourse_example.csv GitHub NA The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Tota-frost gels (diffusion paper) B&H B&H # LOFSFTL
MFR # T1-72
For LED matrix. 1 required.
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in Grainger, inc 20JL37 Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required.
Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW  Thorlabs S120VC For measuring light intensity. 1 required.
Labelling Tape Fisher Scientific 159015N For labelling and securing loose components. 1 required.
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD Thorlabs PM100D For measuring light intensity. 1 required.
100mL GL45 hybridization glass bottle Bellco Glass, Inc. (7910-40150) Bioreactor vessel. 1 required.
Six port assembly Bellco Glass, Inc. Custom  For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm  long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. 
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 Amazon B0009F3P3U Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame.
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57288 Tubing. ~25' required.
Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 Cole-Parmer EW-62992-32 Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required.
2L Laboratory Flask Pyrex 4980 Media flask and effluent flask. 2 required.
Day pinchcock Fisher Scientific 5867 For pinching tubes shut. 3 required.
Replacement tubing assembly 1/16" ID Traceable Products 3372 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Replacement tubing assembly 1/50" ID Traceable Products 3371 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-00 Connectors. ~10 luers are required.
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-04 Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing.
Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-00 Connectors. ~10 luers required.
Female luer x 3/16" hose barb adapter Cole-Parmer EW-45502-08 Connectors. ~10 luers required.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer SC-45502-28
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer EW-45505-56
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll Cole-Parmer EW-06417-21 Tubing. 1 roll required.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft Cole-Parmer EW-96410-13 Tubing. ~25' required.
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57293 Tubing. ~1' required.
Vacuum filter Fisher Scientific 974107 Nalgene vacuum filter for sterile filtering media.
Aquel Oxy-Boost 200 Rena Aquatic Supply AP200 Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. 
0.2 μm pore syringe filter Corning International 431229 This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required.
Slygard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Slygard 184 For microfluidic device. 1 required.
American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades Fisher Scientific 17989000 For cutting tubes and PDMS. 1 blade required.
Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID Sigma-Aldrich WHAWB100028 ALDRICH For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required.
Microscope cover glass 22x60-1.5 Fisher Scientific 12-544-G For microfluidic device. 1 required.
Rectangular aluminum frame with a square window Custom Custom To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches.
Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches
Thickness: ~1/32 inches

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References

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