Design und Implementierung eines automatisierten Illuminating, Anzucht und Probenahmesystem für Mikrobielle optogenetische Anwendungen

1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison
Published 2/19/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Wir haben eine kontinuierliche Kultivierungsvorrichtung zur Verwendung mit optogenetische Systeme Kulturen von Mikroben zu beleuchten und regelmäßig Bildzellen in dem Abwasser mit einem umgekehrten Mikroskop. Die Kultivierung, Probenahme, Bildgebung und Bildanalyse sind voll automatisiert, so dass dynamische Reaktionen auf Beleuchtung kann über mehrere Tage gemessen werden.

Cite this Article

Copy Citation

Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications. J. Vis. Exp. (120), e54894, doi:10.3791/54894 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Optogenetische Systeme verwenden genetisch kodierten Proteine, die Konformation in Reaktion auf bestimmte Wellenlängen des Lichts verändern zellulärer Prozesse zu verändern. Es besteht ein Bedarf für die Kultivierung und Messsysteme, die Beleuchtung und die Stimulation von optogenetische Systeme programmiert einzuarbeiten. Wir stellen ein Protokoll für den Aufbau und die Verwendung eines kontinuierlichen Kultivierungsvorrichtung mikrobiellen Zellen mit programmierter Dosen von Licht zu beleuchten, und automatisch erfassen und die Bilder der Zellen in dem Ausfluß zu analysieren. Der Betrieb dieser Vorrichtung als Chemostat ermöglicht die Wachstumsrate und der Zellumgebung streng kontrolliert werden. Der Austrag der kontinuierlichen Zellkulturen werden regelmäßig Proben genommen und die Zellen werden durch Mehrkanal-Mikroskopie abgebildet. Die Kultivierung, Probenahme, Bildverarbeitung und Bildanalyse sind vollständig automatisiert, so dass dynamische Reaktionen in der Fluoreszenzintensität und zellulärer Morphologie von aus der Kultur Abstrom abgetastete Zellen über mehrere Tage gemessenohne Benutzereingabe. Wir zeigen die Nützlichkeit dieser Kultivierungsvorrichtung durch dynamisches Protein - Produktion in einem Stamm von Saccharomyces cerevisiae konstruiert mit einem optogenetische System induziert die Transkription aktiviert.

Introduction

Optogenetische Systeme verwenden Licht eine wachsende Liste von zellulären Prozessen , einschließlich Expression Gens zu kontrollieren, 1, 2, 3, 4, 5 Proteinlokalisierung, 6 - Protein - Aktivität, 6, 7, 8 Proteinbindungs, 8, 9, 10 und den Proteinabbau. 11 Verfahren für Zellen in einer kontrollierten Umgebung mit programmierten optischen Stimulation und zum Messen von deren Reaktion über biologisch relevanten Zeitskalen Züchten ist notwendig , das Potential dieser Werkzeuge für die Forschung in der Zellbiologie und der Biotechnologie zu nutzen. Unsere Methode nutzt chemostasis eine konstante Zellwachstumsrate in einem gut gemischten aufrechtzuerhalten, aegelesen und temperaturgeregelten Glaskulturgefäß 12, 13, die so programmiert Beleuchtung ausgesetzt ist. Wir Bild einzelnen Zellen in der Kultur Abstrom mit einem umgekehrten Mikroskop die Reaktion der Kultur zu programmierten Beleuchtungs zu messen. Die Kultivierung, Probenahme, Bildgebung und Bildanalyse sind vollständig automatisiert, so dass die Fluoreszenzintensität und Zellmorphologie des Abflusses Zellkultur kann über mehrere Tage ohne Benutzereingabe gemessen werden.

Dieses Protokoll kann in den meisten Labors vertraut mit wachsenden Zellkultur und Mikroskopie durchgeführt werden, und die verwendete Vorrichtung ist kostengünstig und aus leicht verfügbaren Komponenten. Ein transparentes Kulturgefäß über einer Matrix aus Leuchtdioden (LEDs) emittieren kann 1 & mgr; W / cm 2 -10 mW / cm 2 von Licht angeordnet. Mikroben werden in dem Kulturgefäß kontinuierlich gewachsen; eine peristaltische Pumpe verwendet Medien bei der hinzufügenVerdünnungsrate wird eine andere verwendet Kultur mit einer geringeren Rate an das Mikroskop zurückzuziehen, und die Differenz entweicht durch einen Überlaufauslaß. Ein Heizkissen hält die Temperatur. Die Luft wird kontinuierlich in das Kulturgefäß gepumpt, um einen positiven Druck als auch zu halten, wie zu mischen und die Kultur belüften. Mit Ausnahme der Luftpumpe, Leistung dieser Vorrichtungen wird durch einen Mikrocontroller geregelt, die auch eine Eingabe von einem Thermometer und einem angeschlossenen Desktop-Computer empfängt. Der Abstrom Zellkultur wird auf eine Mikrofluidik-Vorrichtung auf der Bühne eines umgekehrten Mikroskops gepumpt. Nicht fluoreszierende und Fluoreszenzbilder werden automatisch erfasst. Die Zellen in den Bildern durch einen Algorithmus gekennzeichnet, daß jede Zelle als eine Region von Interesse (ROI) lokalisiert und mißt die Eigenschaften der einzelnen ROI.

Um eine Anwendung dieses Protokolls zu demonstrieren, maßen wir die Antwort auf unterschiedlichen Lichtintensitäten von Saccharomyces cerevisiae - Zellen entwickelt , mit einem Blaulicht Verantve optogenetische System, das die Transkription von fluoreszierenden Proteins steuert. S. cerevisiae, wie Bäckerhefe allgemein bekannt ist , wurde ausgewählt , weil mehrere optogenetische Systeme für die bereits in diesem System Genexpression Steuerung 14 vorhanden ist , 15, 16. Darüber hinaus ist dieses Modellorganismus für Studien in der Systembiologie 17 und als Fahrgestell für biotechnologische Anwendungen 18, 19, 20 verwendet. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, die Transkription einer Kultur über mehrere Tage zu steuern, indem Eingangslichtintensitäten variierende und die Herstellung eines fluoreszierenden Reporter messen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Abbildung 1

Abbildung 1: Die kontinuierliche Kultivierungsvorrichtung. Dieses vereinfachte Diagramm zeigt, wie soll die Vorrichtung zusammengebaut werden, wenn es um Kultur verwendet wird, beleuchten, und messen die optischen Eigenschaften der Mikroben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Figur 2: Übersicht des Protokolls. Die Schritte in der schattierten Region muss jedes Mal wiederholt werden, das verwendete Protokoll. Closed - Loop - Steuerung möglich ist 34, wird aber in diesem Protokoll nicht implementiert.

1. Bauen Sie das Thermometer an die Leiterplatte


Abbildung 3: Anschlüsse Thermometer Werte zu lesen. Dieses Diagramm zeigt, wie das digitale Thermometer sollte der PCB verbunden werden, so dass der Mikrocontroller Rückkopplung erhalten, die Temperatur der Kultur zu steuern. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Löten Sie den Boden, Daten und positive Spannungsleitungen des digitalen Thermometers in ihre jeweiligen Durchgangslöchern mit "GD + V."
  2. Clip aus einem Stift von einem weiblichen 3-Pin-Header und schneiden Sie die restlichen 2 Pins mit Draht Clippers, so dass es passt in die beiden Durchgangslöchern mit "R2" und nicht den Mikrocontroller behindern. Löten Sie diese an Ort und Stelle. Verbinden Sie die beiden angelötet Stifte durch einen 4,7 kOhm Widerstand in dem Pin-Header eingefügt wird.

2. Verbinden Sie das Netz Control-Komponenten an die Leiterplatte

Abbildung 4
Abbildung 4: Verbindungen zu steuern , um Energie zu dem Heizkissen. Dieses Diagramm zeigt, wie die PCB und Zubehörteile sollten, um die Stromversorgung des Heizkissen zu steuern, zusammengebaut werden. Die Teile zur Steuerung der Schlauchpumpen in ähnlicher Weise verbunden sind. Man beachte, dass die Komponenten für das Thermometer zur Klarheit entfernt wurden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Schneiden Sie 1 cm von den Stiften von fünf weiblichen 3-Pin-Header. Löten Sie diese an den Positionen auf der Leiterplatte (PCB), die als "# 1", "# 2", "# 3", "# 4" und "CB E."
  2. Schneiden Sie 1 cm von den Stiften eines weiblichen 6-Pin und 8-Pin-Header. Löten diese nebeneinanderdie Säule der Durchgangslöcher K1 bis K14 bezeichnet.
  3. Schließen Sie das Heizkissen auf der Leiterplatte.
    1. Die Enden eines 100-kOhm-Widerstand in den Durchgangslöchern markiertem K1 und K2 auf der Platine. Legen Sie eine Metall-Oxid-Halbleiter-Feldeffekttransistor (MOSFET) in die Position markiert # 1 auf der Platine, mit dem Etikett des MOSFET in Richtung K1 gegenüber durch K14 Durchgangslöchern, so dass der Source-Stift ist am nächsten an der "# "Etikett und der Drain-Pin ist am weitesten von der" # "label.
    2. Schneiden Sie die Masseleitung der 5-V-Gleichstrom (DC) Stromversorgungskabel und schließen Sie es an J2. Verbinden Sie die Masseleitung der Heizkissen J1. Verbinden K3 an Pin 3 mit einem 1 kOhm Widerstand. Aktuelle sollte jetzt nur noch von J1 bis J2 fließen, wenn Pin 3 + 5V.z gesetzt
      HINWEIS: Der Widerstand / MOSFET Satz fungiert als Schalter, der vom Stift J1 bis J2 Strom fließen kann, wenn der Pin 3 des Mikrocontrollers auf +5 V eingestellt wird
  4. Verbindendie langsame peristaltische Pumpe.
    1. Die Enden eines 100-kOhm-Widerstand in den Durchgangslöchern markiertem K4 und K5 auf der Platine. Setzen Sie einen MOSFET in die Position markiert # 2 auf der Platine, mit dem Etikett des MOSFET in Richtung K1 bis K14 Durchgangslöchern zugewandt, so dass der Source-Stift ist am nächsten an der "#" Etikett und der Drain-Pin ist am weitesten von der "#" Etikette.
    2. Schneiden Sie die Masseleitung der 12-V-DC-Stromversorgungskabel von der langsamen peristaltische Pumpe. Schließen Sie die Schlauchpumpe zugewandten Ende an J3 und die Wand Warze gerichteten Ende zu J4. Schließen Sie K6 an Pin 4 mit einem 1 kOhm Widerstand. Aktuelle sollte jetzt nur noch von J3 J4 fließen, wenn Pin 4 mit +5 V eingestellt
  5. Schließen Sie die schnelle peristaltische Pumpe
    1. Die Enden eines 100-kOhm-Widerstand in den Durchgangslöchern markiertem K7 und K9 auf der Platine. Setzen Sie einen MOSFET in die Position markiert # 3 auf der Platine, mit dem Etikett des MOSFET in Richtung K1 bis K14 Durchgangslöcher s zugewandt o dass die Quelle Stift ist mit dem "#" label am nächsten, und der Drain-Pin ist am weitesten von der "#" label.
    2. Schneiden Sie die Masseleitung der 12-V-DC-Stromversorgungskabel von der schnellen peristaltische Pumpe. Schließen Sie die Schlauchpumpe zugewandten Ende zu J5 und die Wand Warze gerichteten Ende zu J6. Schließen Sie K9 an Pin 5 mit einem 1 kOhm Widerstand. Aktuelle sollte jetzt nur noch von J5 J6 fließen, wenn Pin 5 mit +5 V eingestellt

3. Schließen Sie die LED-Matrix auf die Leiterplatte

Abbildung 5
Abbildung 5: Anschlüsse der LED - Matrix zu steuern. Dieses Diagramm zeigt, wie die LED-Matrix sollte mit der Leiterplatte verbunden werden. Es zeigt auch, dass die Leiterplatte kann auf dem Mikrocontroller gestapelt werden. Man beachte, dass die Komponenten für das Thermometer und zum Steuern der Gleichstromleistung an anderen Vorrichtungen zur Klarheit entfernt wurden.es / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Löten Sie die 6-polig, 10-polig, und die zwei 8-polige Buchse Stiftleisten in die Durchgangslöcher an den Seiten der Leiterplatte, so dass sie auf der Oberseite des Mikrocontrollers gestapelt werden können.
  2. Löten Sie die 100 nF und die 10 uF Kondensatoren, um ihre markierten Stellen auf der Leiterplatte und stellt fest, dass der Minuspol des 10 uF-Kondensator (kürzere Vorlauf) sollten mit einem negativen Vorzeichen markiert das Durchgangsloch verbunden werden.
  3. Verlöten der LED-Treiber zum 2 von 12 Satz von Durchgangslöchern, wobei die Einbuchtung auf der Fahrer weit von den Durchgangslöchern für die LED-Matrix reserved.
  4. Löten 2 Spalten der männlichen Stiftleisten zu den Durchgangslöchern für die LED-Matrix markiert, und schneiden die Enden dieser unter dem Steckbrett, so dass sie nicht den Mikrocontroller behindern. Verbinden Sie diese mit zwei 8-Draht Streifen Buchse / Buchse Prüfkabeln. Schließen Sie einen zweiten Satz von männlichenStiftleisten an das andere Ende der Schaltdrähte.
  5. Legen Sie die LED-Matrix über dem Median der Steckbrett, und fügen Sie dann den zweiten Satz von Stiftleisten an den Säulen zu beiden Seiten der Matrix. Stellen Sie sicher, dass die elektrischen Anschlüsse die gleichen sind, als ob die LED-Matrix direkt auf die Leiterplatte mit der markierten Seite der Matrix entsprechend der markierten Spalte von Durchgangslöchern verbunden worden waren.
  6. Clip aus einem Stift von einem weiblichen 3-Pin-Header und schneiden Sie die restlichen 2 Pins mit Draht Clippers, so dass es passt in die beiden Durchgangslöchern mit "R1" und nicht den Mikrocontroller behindern. Löten Sie diese. Verbinden Sie die beiden angelötet Stifte durch einen 1 kOhm Widerstand in dem Pin-Header eingefügt wird.
    Hinweis: Das Gefäß Kultivierungs gestapelt werden über die LED-Matrix. Wenn die Drahtbänder des Behälters behindern, versetzt sie von der Matrix. Dann verwenden feste Kerndraht die Lücke zwischen den Matrix-Pins zu überbrücken und den Draht Ribbon Pins, so dass die elektrischen Anschlüsse ch nichtange.

4. Software installieren und eine Verbindung mit Hardware

  1. Stapeln Sie die Platine auf dem Mikrocontroller.
  2. Folgen Sie den Links in der Liste Materialien der integrierten Entwicklungsumgebung (IDE) und benutzerdefinierte Code für den Mikrocontroller zum Download bereit.
  3. Schließen Sie den Mikrocontroller mit dem Mikroskop Computer über eine AB Universal Serial Bus (USB) Kabel. Kompilieren und laden den benutzerdefinierten Code an den Mikrocontroller.
  4. Download von Micro-Manager 21, 22 und 23 FIJI. Konfigurieren Micro-Manager als FIJI Plugin durch eine Kopie der "DLL" Dateien, die "mmplugins" Verzeichnis und die "mmautofocus" Verzeichnis aus dem Verzeichnis, in dem Micro-Manager wurde in die "Fiji.app" Verzeichnis heruntergeladen. Kopieren Sie außerdem die "plugins / Micro-Manager" Verzeichnis in das "Fiji.app/plugins" Verzeichnis.
  5. Laden Sie die "BioreactorController.jar" Datei into das "Fiji.app/mmplugins" Verzeichnis.
  6. Offene Micro-Manager von FIJI> Plugins> Micro-Manager> Micro-Manager Studio. Verwenden Sie die Hardware-Konfigurations-Assistent zum Konfigurieren der Software zur Steuerung des Mikroskops. Fügen Sie die "FreeSerialPort" Gerät im Assistenten mit der Bezeichnung des Ports, an dem der AB-USB-Kabel angeschlossen ist.

5. Stellen und Charakterisieren lichtundurchlässigen Gehäuse für die Anzucht Vessel

  1. Stapeln drei 8-Pin-IC-Sockel als Bausteine ​​auf dem Steckbrett an jeder Ecke der LED-Matrix, so dass das Kulturgefäß auf sie über der Matrix ruhen kann.
  2. Befestigen eines Teils des Diffusionspapier unter der oberen Schicht der Buchsen, so daß das Licht die Kultivierungsbehälter von der LED-Matrix auffällig ist diffus.
  3. Schneiden Sie drei 8 "durch 6" Teile aus schwarzem Schaumstoff. Schneiden Sie einen Teil aus, das die gleiche Größe wie die elektronische Steckbrett ist (2,3 "x 3,5") von der Innenseite des ersten two und ein Abschnitt, der die Größe des Rechtecks, das durch den IC-Buchsen (0,9 "x 1,8") von der Innenseite des dritten gemacht ist. Stapeln dieser Schichten über der LED-Matrix, so dass die letzte Schicht, die 0,9 "x 1,8" Öffnung liegt auch bei der Oberseite der IC-Sockel, und umgibt die LED-Matrix enthält.
  4. Schneiden Sie ein weiteres Blatt aus schwarzem Schaumstoff in einem halben 6 "durch 24" Rechteck zu machen. Diese rollen in eine hohle Säule von schwarzen Schaum, der das Kulturgefäß in mit Raum für Rohre und Leitungen passen, so daß es thermisch und optisch das Kulturgefäß zu isolieren.
  5. Zentrieren Sie die hohle Säule aus schwarzem Schaumstoff über die LED-Matrix, und die Grenze der Spalte auf der Schicht aus schwarzem Schaumstoff darunter markieren. Diese Grenze wird markiert, wo es in der Zukunft zentriert werden sollte.
  6. Schneiden Sie ein 3 "x 3" Portion schwarzen Schaum. Verwenden Sie diese als Deckel später, die an der Spitze der Säule geklebt werden kann externes Licht zu blockieren.
  7. Bringen Sie die Photodiode Leistungssensor zu th e Kultivierung Schiffskappe mit Klebeband befestigen Sie die Kappe und stecken im Gehäuse das Kulturgefäß.
  8. Im Micro-Manager, gehen Sie zu Plugins> Bioreactor-Controller. Stellen Sie die Matrix mit einer Teilmenge des Bereichs von möglichen Intensitäten bei 30 s Intervallen zu beleuchten.
  9. Notieren Sie sich die Lichtintensitäten als auf dem Stromzähler Konsole verbunden mit dem Stromsensor angezeigt. Diese Messungen wird die tatsächliche Intensität von Licht ermöglichen, bekannt sein, wenn die Anzahl von LEDs, die aufleuchten, und die pulsbreitenmodulierten (PWM) Strom zu diesen LEDs eingestellt wird.

6. Bereiten Sie die Anzucht Vessel

Figur 6
Abbildung 6: Behälter - Verbindungen. Dieses Diagramm zeigt, wie das Schiff und die Schläuche der Vorrichtung sollte werden autoklaviert vor angeschlossen werden.blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Mark die Höhe auf jede 2 mL Inkrement der Flüssigkeit im Bereich von 10 ml bis 30 ml in dem Kulturgefäß entspricht. Der Einsatz 10 ml sterilem VE-Wasser, um den Wasserstand zu markieren, fügen Sie 2 ml, um den Wasserstand zu markieren, und wiederholen, bis die 30 ml Ebene gekennzeichnet ist. Decken Sie die Markierungen mit durchsichtigem Klebeband, so dass sie nicht ohne weiteres entfernt werden, und entsorgen Sie die Flüssigkeit.
  2. Legen Sie das lange Ende des Aluminium-Port durch die Silikondichtung, in das Kulturgefäß. Schrauben Sie die Kappe.
  3. Decken Sie eine kurze Aluminium Durchgangsöffnungsauslass mit 1/16 "ID Silikonschlauch. Stecken Sie das distale Ende durch einen weiblichen Luer - Lock - Einfügen und dann einen männlichen Luer - Lock - Stecker. Dieser Ausgang ist eine Ergänzung und wird nicht verwendet werden (Rohr 6 in 6 ).
  4. Schließen Sie zwei kurze Segmente von 1/16 "ID-Silikonschlauch mit männlichen und weiblichen Luer-Schleusen. Schließen Sie das eine Ende mit einem kurzen Aluminium Durchgangsöffnungsauslass und stecken Sie das distal Ende mit einem männlichen Luer und weiblichen Luer-Lock-Stecker. Das Schiff wird durch dieses Rohr (Rohr 7 / 7.1 in Figur 6) beimpft werden.
  5. Verbindung von zwei 1/16 "ID Rohre an den Enden des 1/16" ID peristaltischen Schlauch und Anschlüsse. Schließen Sie das eine Ende mit einem kurzen Aluminium - Port und das andere (Rohr 4 in Abbildung 6). Später wird dies dem Medienkolben verbunden sein.

7. Bereiten Sie die Medien Flask

  1. Verbinden eines 1/16 "Innendurchmesser (ID) Silikonschlauch zur längsten Aluminium-Port. Das Rohr sollte lang genug sein, die Medienflasche zu erreichen. Verbinden eines 1/8" ID männlichen Luer-Lock mit einem kurzen Segment von 1/16 " ID Schlauch zum Anschluss an das vorhergehende Rohr ,, und dann fügen Sie diesen kurzen Abschnitt in den Gummistopfen auf dem Medienkolben (Rohr 3 in Abbildung 6).
  2. Klemmen Sie den Schlauch. Diese Verbindung ermöglicht, dass Luft aus dem Medienkolben zu dem Kulturgefäß zu fließen. Wenn die Medien Kolben später mit Luft ein gepumptd dieses Rohr nicht geklemmten ist, wird die Kultur gemischt, belüftet und gehalten bei einem positiven Druck durch die ankommenden Blasen.
  3. Legen Sie eine 1/16 "ID Schlauch lang genug, um den Boden des Kolbens in den Stopfen zu erreichen, durch die Medien übertragen werden. Schließen Sie ein weiteres 1/16" ID Schlauch zu dieser, und dann wird ein 3/16 "ID Schlauch das. Schließen dieses mit einem 3/16 "ID weiblichen Luer - Lock und einem männlichen Luer - Lock - Stecker (Rohr 1 / 1.1 in Figur 6).
  4. Das dritte Loch in dem Stopfen ist mit einem kurzen Segment von 1/16 "ID Schlauch, mit zwei anderen Segmenten mittlerer Durchmesser Schlauch- und steckbar am distalen Ende (Rohr 2 / 2.1 in Figur 6) gefüllt werden. Dies wird verbunden werden mit einer Vakuumpumpe und später an einer Aquariumpumpe.
    HINWEIS: Wenn der Schlauch nicht leicht durch die Löcher in den Gummistopfen passen können, mit einer Neigung, die Enden des Schlauchs geschnitten. Dann wird das abgeschrägte Ende, das durch das Loch gedrückt wird, kann verwendet werden, um den Rest bis zu ziehen.

  1. Legen Sie einen männlichen Luer-Lock-in ein Segment von 1/16 "ID Silikonschlauch und dann fest 0,022 insert" ID Polytetrafluorethylen (PTFE) Schläuche. Getrennt davon befestigen einen weiblichen Luer - Lock mit einem 1/16 "ID Schlauch. Dann Faden ein Ende entlang der PTFE - Röhre , die Schlösser und die andere auf einen kurzen Aluminium - Port (Rohr 5 in Abbildung 6) zu verbinden.
  2. Schließen Sie den freiliegenden 1/50 "ID Silikonschlauch auf die 1/50" ID Peristaltikschlauch und Anschlüsse. Um dies zu verbinden drei Segmente von 1/50 "ID Schläuche und zwei Segmente von 0,022" ID PTFE-Schlauch, abwechselnd ihnen. Zum Anschluss an das Abwasserkolben über 1/16 "ID Schlauch (Rohr 5 in Figur 6).
  3. Verbinden eines Endes einer 1/16 "ID Silikonschlauch mit dem zweiten längsten Rohr des Aluminium-Anschluss und das andere Ende mit dem Abstrom Kolben. Dieses Aluminiumrohr setzt das Kulturvolumen und überschüssige Kulturüberlauf in den Abwasserbehälter (Rohr 8 in
  4. Autoclave die Kultivierung Montage bei 121 ° C und 15 psi (allgemeine Sterilisation) für 30 min.
    Anmerkung: Die Rohre, durch die die Medien-Kolben gefüllt ist, durch die das Medium Kolben gesaugt wird, und durch die das Kultivierungsgefäß haben inokuliert mehrere Segmente Rohr so ​​dass, wenn das distale Segment kontaminiert ist, kann es eine sterile offenbaren entfernt werden Segment.

9. Bereiten Sie den mikrofluidischen Kanal

  1. Mischungs Polydimethylsiloxan (PDMS) und Härter in einem 9: 1-Verhältnis. Degas und gieße auf dem Silizium-Master-Form.
  2. Heilen die PDMS für 2 h bei 65 ° C und dann geschnitten von der Maske mit einer Rasierklinge. Cut um den PDMS, bis er aus der Form löst. Vermeiden Sie nach unten drücken und den zerbrechlichen Wafer zu brechen.
  3. Verwenden Sie ein 1,2 mm ID Biopsie Lochers Löcher des Kanals an beiden Enden zu stanzen.
  4. Plasma - Bindung das PDMS auf dem Deckglas 24.
  5. Kleben Sie die lange Enden des Deckglases mit dem Trag Alurahmen so dass der PDMS-Kanal auf dem Aluminiumrahmen zentriert ist, und dann die PDMS nochmals 2 h bei 65 ° C backen.

10. Füllen Medien Flask

7
Abbildung 7: Hinzufügen von Medien. Dieses Diagramm zeigt, wie Medien Vakuum in den Medien Kolben gefiltert werden sollen. Es stellt sicher, dass die Medien steril bleibt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Ändern Sie die entsprechenden Medien. Wenn das kontinuierliche Kultivierungssystem als Chemostat betrieben wird, verwenden Sie Medien für einen bestimmten Nährstoff begrenzt.
    Hinweis: Beispiele für Standardmedien Zusammensetzung für Studien mit S. cerevisiae bisher 25 veröffentlicht worden sind,= "Xref"> 26, 27, 28, 29.
  2. Bringen Sie den Vakuumfilter in einen 100-ml-Flasche, entfernen Sie die Nippelabdeckung, entfernen Sie dann den weißen Stecker aus dem Nippel des Vakuumfilter mit einer sterilen Pinzette.
  3. Schließen Sie den 3/16 "ID Silikonschlauch mit dem Nippel, das andere freie Röhre Medienkolben mit einer Vakuumpumpe (Rohre 1 und 2 in 7 bezeichnet), und stellen Sie sicher , dass das Rohr die Medien Kolben an die Kulturgefäß verbinden geklemmt wird geschlossen (Rohr 3 in Figur 7).
  4. Füllen Sie den Filter mit Medien, schalten Sie die Vakuumpumpe und dann filtern Sie den Rest der Medien. Klemmen Sie die 1/16 "ID-Silikonschlauch mit dem Vakuum (Rohr 2 in 7) und schalten Sie die Vakuumpumpe ab.
  5. Entfernen Sie die leurs aus dem Zwischensegment von 1/16 "ID Schlauch mit der Vakuumpumpe verbunden, so daß ein unbelasteten Ende des Rohrs zugänglich ist. Legen the blauen Ende eines Sterilfilter Luftspritze in dieser Röhre.
  6. Klemmen Sie die 3/16 "ID Silikonschlauch (Rohr 1 in Abbildung 7) und ziehen Sie den männlichen Luer von ihm. Ziehen Sie den Stecker aus dem weiblichen Luer der Medieneinlassrohr des Kulturgefäß. Verbinden Sie diese männlichen und weiblichen Luers Medien zu ermöglichen, sein in das Kulturgefäß gepumpt.
  7. Entfernen Sie den Vakuumfilter und die Kappe der 100-ml-Flasche von Medien, die mit dem Vakuumfilter angebracht wurde.
  8. Ein Tag vor dem Kulturgefäß geimpft werden, eine einzige Kolonie der optogenetische Mikrobe in einem Reagenzglas mit 4 ml der im vorherigen Schritt gesammelten Medien impfen, und lassen Sie es bei 30 ° C über Nacht wachsen oder die optimale Temperatur Wachstumstemperatur Kultur unter Rühren.

11. Montieren Sie das Gerät um die Mikroskop

  1. Stellen Sie die kontinuierliche Kultivierung Montage in der Nähe von dem Mikroskop mit den Medien Flasche höher ist als die Kulturgefäß und dem effluent Kolben niedriger als das Kultivierungsgefäß, so dass das Rohr aus Segmenten von 0,022 "ID PTFE - Schlauch besteht (Rohr 5 in Figur 6) können die Mikroskoptisch erreichen. Klebeband sicher die Gummistopfen auf dem Medium Kolben nach unten und Abwasserbehälter.
  2. Ziehen der Enden des 0,022 "ID PTFE Schlauch von der 1/50" ID Silikonschlauch ihnen (Rohr 5 in 6), und schließen diese Enden in den Einlass und Auslass der mikrofluidischen Vorrichtung zu verbinden.
  3. Schließen Sie das weiße Ende des Spritzenluftfilter zum Aquariumpumpe. Der Luftdruck wird Medium in das Kulturgefäß schieben.
  4. Wenn die Medien die Höhe des Abflusses Port erreicht, wickeln Sie die 1/16 "ID Medien Zulaufschlauch und Anschlüsse um die langsame peristaltische Pumpe (Rohr 4 in 6) und die 1/50" ID Probeauslaß Schläuche und Anschlüsse um die schnelle peristaltische Pumpe (Schlauch 5 in Figur 6).
  5. Belüften der Medien durch Lösen des Luft tuwerden zwischen dem Medienflasche und Kulturgefäß.
  6. Band das Heizkissen und Thermometer zu dem Kultivierungsgefäß so daß seine Temperatur gesteuert werden kann. Wickeln Sie den Medienschlauch um das Kulturgefäß, so dass die Eingabe von Medien bei der gleichen Temperatur wie das Gefäß sein wird.
    HINWEIS: Der PWM Strom zu dem Heizkissen wird durch den Mikrocontroller geregelt, die Eingaben von dem Thermometer verwendet das Kultivierungsgefäß bei seiner Solltemperatur zu halten.
  7. Legen Sie das Kulturgefäß in den schwarzen Schaum Gehäuse über die LED-Matrix, und stellen Sie sicher, dass die Rohre nicht eingeklemmt werden.
  8. Im Micro-Manager, gehen Sie zu Plugins> Bioreactor-Controller. Stellen Sie die "Medienpumpe Verhältnis auf" Feld bis 0,1 und die "Probenpumpe Verhältnis auf" Feld auf 0. Die Flussrate sehr niedrig sein wird, aber größer als die Verdampfungsrate.
  9. Klemmen Sie die ankommende Luftschlauch zwischen dem Medienkolben und Kulturgefäß. Ziehen Sie den Stecker aus der Inokulation Rohr (Rohr 7 in
  10. Decken Sie das Gehäuse, so dass kein Licht eintritt, und lassen Sie die Kultur über Nacht wachsen.

12. Kalibrieren Sie die Fördermengen

  1. Im Micro-Manager, gehen Sie zu Plugins> Bioreactor-Controller. Stellen Sie die "Medienpumpe Verhältnis auf" Feld bis 0,5 und die "Probenpumpe Verhältnis auf" Feld auf 0.
  2. Trennen der Überlaufrohr aus dem Abstrom Kolben (Rohr 8 in Figur 6) und das Entnahmerohr aus dem Abstrom Kolben (Rohr 8 in Figur 6) und sammeln Abwasser in getrennten Gefäßen. Sammeln Sie Abwasser für 1 Stunde, beginnend nach dem die Pumpen für 15 min auf gewesen sein.
  3. Berechnen der Strömungsgeschwindigkeit des Mediums in das Kulturgefäß aus dem Volumen in dem Behälter gesammelt, wie:
  4. Passen Sie den Wert des "Medienpumpe Verhältnis auf" Feld, das durch diese lineare Schätzung:
    Equaiton 2
    woher
    Equaiton 3
  5. Iterieren durch diesen Kalibrierungsvorgang, bis die Differenz zwischen der Soll-Strömungsrate und der gemessenen Strömungsrate <0,2 ml / h, wobei die Fließgeschwindigkeit über einen Zeitraum von 1 Stunde gemittelt wird.
  6. Erhöhen Sie den Wert des "Probe - Verhältnis auf" Feld und kalibrieren es in ähnlicher Weise bis etwa 4/5 th des Volumens der Kulturgefäß verläßt , wird durch die Probenpumpe abgepumpt und in etwa 1/5 des Volumens verlässt durch die Überlauföffnung.
  7. Lassen Sie die Kulturdichte bei der kontinuierlichen Kultivierungsvorrichtung über Nacht unter diesen Bedingungen äquilibrieren.
    HINWEIS: Wenn die Zieldurchflussraten nicht erreicht werden kann, änderndie Schlauchpumpen. Flüssigkeit wird mit einer höheren Rate gepumpt, wenn größere Rohrdurchmesser verwendet wird. Folgen Sie Schritt 14 und dann zurück 8.4 zu treten.

13. Collect Mikroskop Bilder von Cultured Microbes

  1. Füllen Sie die Bühnenpositionsliste in Micro-Manager mit einer Reihe von nicht überlappenden Positionen, an denen Bilder in den mikrofluidischen Kanal gepumpt Zellen werden in der Brennebene sein.
  2. Öffnen Sie die "Bioreactor Controller" Plugin. Wählen Sie die gewünschte LED-Matrix Zeitverlauf, Imaging-Kanäle und andere experimentelle Einstellungen aus den Anweisungen. Erfassung und Analyse von Bildern.
  3. Während das Experiment läuft, stellen Sie sicher, dass die Medien in den Medien Kolben klar bleibt. Wenn es bewölkt ist, dann ist es kontaminiert worden.

14. Post-Experiment

  1. Entsorgen Medien, überschüssige Zellkultur und Abwasser.
  2. Füllen Sie den Medien-Kolben mit 200 ml 20% EtOH mit VE-Wasser gemischt. Führen Sie den Chemostat, wie es zuvor hattewurde während des Experiments zu waschen Zelltrümmer und Medien laufen.
  3. Wenn der Alkohollösung aus den Medien Kolben abgelassen hat, zerlegen vollständig die chemostat.
  4. Waschen Sie Gläser und Rohre mit warmem Wasser und einem milden Reinigungsmittel und gründlich mit entsalztem Wasser. Trocknen lassen.
  5. Öffnen Sie die "microcontrollerRecords.csv" Datei, um die Temperatur und LED-Matrix-Status über den Verlauf des Experiments, der "Summary.csv" Datei zu überprüfen Sie die Zusammenfassung von Daten aus jedem Satz von Bildern und die "Ergebnisse <n> .csv" bewertet Dateien Daten zu überprüfen jeden ROI von jeder Zeitperiode zusammenfasst, wobei n die n - te Datensatz ist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Diese Vorrichtung wurde verwendet , um eine Kultur von S. cerevisiae exprimieren , gelb fluoreszierendes Protein (YFP) in Reaktion auf blaues Licht durch einen induzierbaren optogenetische Transkriptionssystem auf dem CRY2 / CIB1 Proteinpaar 30 basierend zu stimulieren. Die Zellen wurden chemostatically in Phosphat begrenzte Medien mit einer durchschnittlichen Verdünnungsrate von 0,2 ± 0,008 gewachsen. Phosphat Begrenzung wird in S. cerevisiae Chemostatexperimenten häufig verwendet , um Wachstumsrate zu steuern und die Wirkungen von Phosphat Beschränkung sind gut charakterisiert. 31, 32, 33 Effluent aus dem kontinuierlich verdünnten Kulturgefäß wurde auf eine Mikrofluidik - Vorrichtung auf einem inversen Mikroskop abgetastet. Die Bilder wurden automatisch wie gezeigt in Abbildung 8 analysiert. Einzelne Zellen wurden in den Hintergrund subtrahiert Phasenkontrastbilder und deren YFP Konzentra identifizierttion wurde von ihrer Fluoreszenz geschätzt als von den Hintergrund-subtrahiert fluoreszierenden Bildern gemessen.

Die Fluoreszenz von 169.677 Zellen wurde aus 33.600 Bildern von Abwasser aus 28 Standorten in der Mikrofluidik-Vorrichtung über die 70 h des Experiments erworben analysiert. Wir verwendeten ein invertiertes Mikroskop mit einem Fluoreszenzbeleuchtungssystem und einer CMOS-Kamera ausgestattet. Die YFP Bilder wurden erworben mit einem 500/20 nm-Anregungsfilter, einem 535/30 nm-Emissionsfilter und einem dichroitischen T515lp. Die Bilder wurden mit einem 40x Phasenkontrast Ziel genommen, unter Köhler-Beleuchtung. Die Bilder wurden in 16-Bit-Farbtiefe mit 87 Pixeln aufgezeichnet pro Mikrometer im Quadrat. Die Kultur wurde für 6 h Intervallen unterschiedlicher Intensität von blauem Licht ausgesetzt ist, durch völlige Dunkelheit für 6 h Intervallen verfolgt. Die Kultur hatte vor der ersten Messung mit Licht belichtet, weshalb seine Fluoreszenzintensität wird während des ersten Dunkelperiode abnimmt. </ P>

Abbildung 9 zeigt die Fluoreszenz aufgrund YFP Produktion bei Aktivierung des optogenetische System in Reaktion auf das Kulturgefäß zu beleuchten. Es zeigt die Nützlichkeit von Einzelzellmessungen der Fluoreszenz über einen Bevölkerungsdurchschnitt-Einzelzellen-Messungen, um die Bevölkerungsverteilung der Fluoreszenzintensität zeigen. Beachten Sie die Ausreißer bei 42 h 26 min. Nachdem die entsprechenden Bilder betrachten, war es offensichtlich, dass es verwendet Klumpen von Zellen in der Mehrzahl der Bilder in Artefakte, die Zellen ähnelte im Hintergrund-subtrahierten Bild, um das zusammengesetzte Bild des Hintergrundes, was zu erzeugen waren. Auch wurde eine Blase aus dem Kulturgefäß zu dem mikrofluidischen Kanal gepumpt und Teile seiner Ränder falsch waren als Zellen von der Bildanalyse-Algorithmus. Da weder die Blase noch die Artefakte aus der Subtraktion der Hintergrund tatsächlichen Zellen entsprach, deren gemessene Fluoreszenzintensitätniedriger ist als die Autofluoreszenz der Zellen. Diese Zahl zeigt die Qualität der Daten, die automatisch über 3 d erworben werden können. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 8
Abbildung 8: visuelle Darstellung des Bildanalysealgorithmus. Diese Bilder wurden für eine einfache Betrachtung abgeschnitten und erweitert. (A) Sechs Bilder werden erfasst den Hintergrund subtrahiert Phasenkontrastbild der Zellkultur zu erzeugen. Nachdem das Hauptbild erworben wird, fünf weitere Bilder werden mit dem Abwasser-Probenpumpe erworben kurz zwischen jeder Aufnahme eingeschaltet, um sicherzustellen, dass die Zellen verschoben werden. Ein zusammengesetztes Bild des Hintergrundes wird aus den fünf Teilbilder erzeugt wird. Der Wert jedes Pixelsim Hintergrundbild ist der Medianwert des gleichen Pixels in der 5 Teilbilder. (B) Der Hintergrund-subtrahierten Bild wird dann in eine binäre. Die binäre wird dann erweitert und die Löcher in kontinuierlichen Abschnitte des binären gefüllt sind. Die gelben Umrisse entsprechen ausgewählten Regionen von Interesse (ROI), basierend auf Größe und Zirkularität Kriterien. (C) Diejenigen ROI werden auf das Fluoreszenzbild abgebildet wird , in dem die Fluoreszenz von jeder Zelle , wenn der Wert des hellsten Pixels innerhalb des ROI gemessen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

9
Abbildung 9: Verteilung der Bevölkerung der Fluoreszenzintensitäten über die Zeit. In diesen Subfigures der Logarithmus der gemessenen Fluorescence wird angezeigt, wobei die übliche Praxis in der Durchflusszytometrie. Die Linie in A und B zeigt die Intensität des Lichts von der Kultur absorbiert oder gebeugt wird , die als die Differenz der Intensität zwischen transmittierte Licht durch sterile Medien und transmittierte Licht durch Zellkultur in dem Kultivierungsgefäß gemessen wird. Es wird gegen die zweite Ordinate aufgetragen. (A) A - Box und Whisker - Plot (5. Perzentil, dem 25. Perzentil, Median, 75 - Perzentil, 95. Perzentil) des Logarithmus der gemessenen Fluoreszenz der Bevölkerung im Laufe der Zeit. (B) ein 2-dimensionales Histogramm der gleichen Daten, wo die Farbe in dem Bereich des entsprechenden Behälter zu der normalisierten Frequenz von Zellen mit einer gemessenen Fluoreszenz entspricht. Die Farben wurden bei 42 h 26 min enthalten, ohne die Ausreißer auf den Bereich von Daten skaliert. Die normierte Frequenz der Ausreißer in der niedrigsten Fluoreszenz bin0,7 ist. (C) Die eindimensionale Histogramme des Logarithmus der gemessenen Fluoreszenz der Bevölkerung vor dem ersten aufgenommenen Belichtung und nach der größte Belichtung. Es zeigt, dass die lichtinduzierte Expression von YFP in diesem Stamm bimodal ist. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wir haben dieses Gerät mit Flexibilität im Auge behalten. Der gesamte Code verwendet wird, ist kostenlos und Open-Source. Die Standard-Bildanalyseprozess Segment Zellen ist einfach und schnell läuft. Benutzerdefinierte Analyse könnte durch die Aufzeichnung von Benutzereingaben durchgeführt werden, während ein repräsentatives Bild mit der FIJI grafischen Benutzeroberfläche Analyse, Umwandlung der Eingabe in ein Skript Beanshell und dann Setzen des Plugin, das Skript zu nennen. Wenn es aufgerufen wird, wird das Skript ein String-Array "Bilder" enthält, die Dateipfade zu den neuesten Satz von Hintergrund-subtrahierten Bilder aufgerufen werden gesendet. Bilder und Daten werden gespeichert, während sie gesammelt werden, so dass sie nicht verloren gehen, wenn ein Experiment abrupt endet. Eine blaue LED-Array wurde zur Induktion unsere optogenetische System gewählt, aber es könnte mit LEDs in verschiedenen Farben ersetzt werden. Es gibt zusätzliche Eingangs- und Ausgangspins auf dem Mikrocontroller sowie Durchgangslöcher für eine zusätzliche MOSFET-Schalter und Relais-Schalter auf der Leiterplatte, die es einfach machen,für dieses System angepasst für komplexere Zwecke werden. Zum Beispiel dieses Gerät arbeiten zu lassen als Turbidostat, verwenden Sie die zusätzlichen Pins auf dem Mikrocontroller über eine LED an die Macht und Werte aus einem Lichtsensor gelesen wird, das Kulturgefäß geschnallt, und dann die Software modifizieren Trübung und verdünnen das Gefäß entsprechend zu messen .

Dabei ist darauf zu achten, dass die Kultur nicht kontaminiert ist, auf sensible Mikroskopie Ausrüstung zu schützen, und um sicherzustellen, dass die Fluidströmungsraten übereinstimmen. Verunreinigungen vor, wenn das Kulturgefäß absichtlich geimpft kann durch das Warten ein paar Tage erkannt werden, bevor das Schiff Impfen und sicherstellen, dass kein Wachstum dort drin ist. verschütten Zellkultur auf dem Mikroskopobjektiv zu vermeiden, prüfen Sie, ob die Mikrofluidik-Vorrichtung durch nicht erste Pumpzellkultur durch sie über einem saugfähigen Tuch undicht wird. Wenn der Fluß der Medien in das Kultivierungsgefäß inkonsistent ist, ist es in der Regel, weil das Rohr umdie Rollen der Schlauchpumpe ist zu locker geworden. Wenn der Luftstrom aus dem Aquariumpumpe inkonsistent ist, stellen Sie sicher, dass es keine U-förmigen Biegungen in dem Abwasser Rohr, wo Flüssigkeitsbecken kann und inkonsequent Luftstrom widerstehen. Wenn Schlauch nach einem Experiment verstopft, weil Medien in der es ausgetrocknet hat, tränken die verstopften Rohre in einem heißen Wasserbad die Verstopfung zu lösen.

Es gibt innere Einschränkungen dieses Protokoll zu prüfen, wenn ein Experiment oder Analyse der Ergebnisse der Planung. In Abhängigkeit von der Verdünnungsrate und die Länge der Röhre verwendet wird, gibt es eine Verzögerung von etwa 10 min, während der die Zellkultur aus der Kulturgefäß zum Mikroskop gepumpt wird. Daher ist es nicht gut zu studieren Veranstaltungen geeignet über kürzere Zeiträume auftreten. Auch, während ein Experiment kontinuierlich für etwa 10 Tage ausgeführt werden kann, begrenzt nur durch das Volumen der Medien, die Entwicklung der Zellkultur ist als die Dauer des Experiments erhöht angesehen werden. Die Limiting Nährstoff der Medien hat profunde Auswirkungen auf den Stoffwechsel und Genexpression 35, 36, 37, 38, 39 und stützt sich deshalb auf den Aspekt der Physiologie unter Studie bestimmt werden sollte. Wenn die Ergebnisse der Analyse, die Bilder vor allem die Bilder von Randdatenpunkten-soll für Fehler in der Art und Weise überprüft werden, dass ROIs durch die Bildanalyseroutine identifiziert wurden. Es ist möglich, Blasen oder Artefakte für Zellen verwechselt werden, wodurch die gemessene Fluoreszenz Verkanten. Eine einfache Möglichkeit, eine solche Fehlmessungen zu eliminieren, ist es, alle ROIs mit Fluoreszenzintensitäten unter der Autofluoreszenzintensität zu verwerfen.

Dieses Protokoll wird für die Messung der Fluoreszenzintensität und / oder zellulärer Morphologie der Abstrom Zellkultur in Reaktion auf Licht in Organismen von Nutzen sein, die in kontinuierlicher Kultur wachsen können, eingestelltTLE zu einer konsistenten Brennebene, wenn sie nicht gerührt und automatisch durch ein Bildanalysealgorithmus identifiziert werden. Der Standardzellenidentifikationsalgorithmus hier verwendet wird, die unmittelbar anwendbar auf annähernd kugelförmige Mikroben, die Hefe ähneln Knospung. Eine Alternative 40 dieses Protokolls ist , Mikroorganismen in einer Menge von Chargenkulturen zu wachsen, und einen Ansatz dann für jeden Zeitpunkt abzutasten und um die Probe durch Flusszytometrie charakterisieren. Allerdings sind die Vorteile der hier beschriebene Protokoll, dass die Proben aus der gleichen Kultur genommen werden, können viele Proben genommen werden, und der Prozess ist automatisiert. Dieses Protokoll verbessert auch auf ein ähnliches Verfahren , bei dem optogenetische Hefe 34 unter einem Mikroskop kontinuierlich kultiviert und abgebildet wurden durch mehrere Bilder schnell zu erwerben und nicht durch Fluoreszenz - Vorbelastungs ROIs Identifikation. Ein großer Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass viele Messungen der einzelnen Zellen kann regelmäßig über mehrere Tage erhalten werden without Benutzereingabe. Nach der Messung kann die Reaktion der mikrobiellen Kultur zu Belichtung, ein nächster Schritt in silico Regelung der Reaktion zu implementieren sein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

Wir möchten, dass bei der Prüfung der Protokoll, Kieran Sweeney für hilfreiche Diskussionen und Bearbeitung, und Taylor Scott, My An-adirekkun und Stephanie Geller für das kritische Lesen des Manuskripts Molly Lazar und Verónica Delgado für die Unterstützung zu bestätigen. Megan Nicole McClean, Ph.D. hält an der Scientific-Schnittstelle vom Burroughs Wellcome Fund ein Career Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Extensive lab manual GitHub NA An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results.
Fritzing Design Viewer Fritzing NA The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) Adafruit 50 Microcontroller. 1 required.
Arduino Stackable Header Kit SparkFun Electronics 10007 Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required.
Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V Adafruit 180 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Soldering iron stand Adafruit 150 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g Adafruit 145 For making electrical connections to the PCB. 1 required.
0.1 μF capacitor SparkFun Electronics COM-08375 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
10 μF capacitor SparkFun Electronics COM-00523 Stabilizes voltage in PCB. 1 required.
MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219 Maxim MAX7219CNG LED driver. 1 required.
8 pin IC Socket Mouser Electronics 575-144308 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix.
24 Pin IC socket Mouser Electronics 535-24-3518-10 Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB.
Digital multimeter Adafruit 2034 For troubleshooting electronics. 1 required.
Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") SparkFun Electronics PRT-12693 Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. 
Flush diagonal wire cutters Adafruit 152 For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required.
Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm) Adafruit 793 Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required.
Half-size breadboard Adafruit 64 The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it.
Miniature 8x8 Blue LED Matrix Adafruit 956 Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white.
Stackable header-3 pin SparkFun Electronics 13875 8 required.
Resistor Kit - 1/4W (500 total) SparkFun Electronics 10969 For electronics. 1 required.
 IRL520N MOSFET International Rectifier IRL520N Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required.
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) SparkFun Electronics PRT 11367 Wire for electronics. 1 required.
5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed Adafruit 276 Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required.
12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 798 For peristaltic pumps. 2 required.
Electric Heating Pad - 10cm x 5cm Adafruit 1481 For heating the bioreactor. 1 required.
Low flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-1 For pumping media. 1 required
Medium flow variable flow peristaltic pump Fisher Scientific 13-876-2 For pumping culture. 1 required.
9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed Adafruit 63 For microcontroller power supply. Order 1.
High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras Adafruit 642 Thermometer for the bioreactor. 1 required.
Micromanager Micromanager NA The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJI ImageJ NA The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development Environment Arduino NA The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Custom code GitHub NA The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB Cable A to B - 6 Foot SparkFun Electronics CAB-00512 Used to download data to microcontroller. 1 required.
bioreactorTimecourse_example.csv GitHub NA The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Tota-frost gels (diffusion paper) B&H B&H # LOFSFTL
MFR # T1-72
For LED matrix. 1 required.
Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in Grainger, inc 20JL37 Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required.
Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW  Thorlabs S120VC For measuring light intensity. 1 required.
Labelling Tape Fisher Scientific 159015N For labelling and securing loose components. 1 required.
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD Thorlabs PM100D For measuring light intensity. 1 required.
100mL GL45 hybridization glass bottle Bellco Glass, Inc. (7910-40150) Bioreactor vessel. 1 required.
Six port assembly Bellco Glass, Inc. Custom  For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm  long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. 
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 Amazon B0009F3P3U Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame.
1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57288 Tubing. ~25' required.
Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 Cole-Parmer EW-62992-32 Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required.
2L Laboratory Flask Pyrex 4980 Media flask and effluent flask. 2 required.
Day pinchcock Fisher Scientific 5867 For pinching tubes shut. 3 required.
Replacement tubing assembly 1/16" ID Traceable Products 3372 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Replacement tubing assembly 1/50" ID Traceable Products 3371 The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.
Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-00 Connectors. ~10 luers are required.
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45505-04 Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing.
Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk Cole-Parmer EW-45502-00 Connectors. ~10 luers required.
Female luer x 3/16" hose barb adapter Cole-Parmer EW-45502-08 Connectors. ~10 luers required.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer SC-45502-28
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk Cole-Parmer EW-45505-56
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll Cole-Parmer EW-06417-21 Tubing. 1 roll required.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft Cole-Parmer EW-96410-13 Tubing. ~25' required.
3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing United States Plastic Corp. 57293 Tubing. ~1' required.
Vacuum filter Fisher Scientific 974107 Nalgene vacuum filter for sterile filtering media.
Aquel Oxy-Boost 200 Rena Aquatic Supply AP200 Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. 
0.2 μm pore syringe filter Corning International 431229 This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required.
Slygard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Slygard 184 For microfluidic device. 1 required.
American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades Fisher Scientific 17989000 For cutting tubes and PDMS. 1 blade required.
Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID Sigma-Aldrich WHAWB100028 ALDRICH For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required.
Microscope cover glass 22x60-1.5 Fisher Scientific 12-544-G For microfluidic device. 1 required.
Rectangular aluminum frame with a square window Custom Custom To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches.
Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches
Thickness: ~1/32 inches

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10, (3), 196-202 (2014).
  2. Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods. 58, (4), 385-391 (2012).
  3. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature biotechnology. 20, (10), 1041-1044 (2002).
  4. Polstein, L. R., Gersbach, C. a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134, (40), 16480-16483 (2012).
  5. Polstein, L. R., Gersbach, C. a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemical Biology. 11, (3), 198-200 (2015).
  6. Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast. Molecular biology of the cell. 24, (15), 2419-2430 (2013).
  7. Lee, S., Park, H., et al. Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells. Nature methods. 11, (6), 633-636 (2014).
  8. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, (12), 973-975 (2010).
  9. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol. 27, (10), 941-945 (2009).
  10. Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein. Biochemistry. 52, (38), 6653-6661 (2013).
  11. Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function. Chemistry & Biology. 20, (4), 619-626 (2013).
  12. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science (New York, N.Y.). 112, (2920), 715-716 (1950).
  13. Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, (4), 390-410 (1950).
  14. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).
  15. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, 973-975 (2010).
  16. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature chemical biology. 10, (7), 502-511 (2014).
  17. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: An experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189, (3), 695-704 (2011).
  18. Galanie, S., Smolke, C. D. Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids. Microbial cell factories. 14, (1), 144 (2015).
  19. Gerngross, T. U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature biotechnology. 22, (11), 1409-1414 (2004).
  20. van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek. 90, (4), 391-418 (2006).
  21. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14 (2010).
  22. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of biological methods. 1, (2), (2014).
  23. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  24. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14, (3), 590-597 (2005).
  25. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast. Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  26. Boer, V. M., Tai, S. L., et al. Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures. FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).
  27. Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).
  28. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  29. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104, (6), 399-405 (2014).
  30. Liu, H., Yu, X., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science (New York, N.Y.). 322, (5907), 1535-1539 (2008).
  31. McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Research. 41, (4), 1-10 (2013).
  32. McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Molecular biology of the cell. 23, (15), 2993-3007 (2012).
  33. McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22, (22), 4447-4459 (2011).
  34. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6, (3), 366-372 (2014).
  35. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19, (1), 352-367 (2008).
  36. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular biology of the cell. 21, (1), 198-211 (2010).
  37. Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast. Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).
  38. Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses. Microbial cell factories. 10, (1), 104 (2011).
  39. Shimizu, K. Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses. Metabolites. 4, (1), 1-35 (2013).
  40. Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nature methods. 11, (4), 449-455 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats