Mit Hilfe der Sleeve-Technik in einem Mausmodell der Aorta Transplantation - ein Lehr-Video

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Summary

Wir präsentieren eine Orthotopic Aorten-Transplantation-Modell mit der Sleeve-Technik bei Mäusen. Es ist eine sehr schnelle Anastomose-Methode, die in Studien von Gefäßerkrankungen eingesetzt werden können.

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Rowinska, Z., Gorressen, S., Merx, M. W., Koeppel, T. A., Zernecke, A., Liehn, E. A. Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video. J. Vis. Exp. (128), e54915, doi:10.3791/54915 (2017).

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Abstract

Orthotopen Aorten Transplantation mit der Sleeve-Technik reduziert Verletzungen der Aorta mit Ausfallrate von nur 10-20 %. Die Zeit, um die Aorta bei Mäusen mit der Hülse Methode anastomosieren war kurz und einfach durchschnittlich 20 min, schönem Studien von Iso/allo Transplantaten. Der folgende Artikel beschreibt die Aorta Transplantationsverfahren in unserem Labor verwendet. Die Mäuse wurden mit einer Mischung aus 1,5 % Volumen Isoflurane und 100 % Sauerstoff über eine Gesichtsmaske betäubt. An dieser Stelle wurde das Segment der Aorta zwischen der Nierenarterien und der Bifurkation von Vena Cava, frei vorbereitet und Clampedat getrennt die proximalen und distalen Segmente mit einer einzigen Seide Naht. Vor dem Entfernen der Aorta wurde eine Kochsalzlösung mit Heparin in der minderwertigen Vena Cava injiziert. Dann zwischen den Klemmen die Aorta geschnitten wurde und eine Kochsalzlösung Heparin-Lösung wurde verwendet, um das Lumen zu spülen. Der Sleeve-Technik mit monofile Fäden wurde verwendet, um die Bauchaorta im orthotopen Standpunkt zu verpflanzen.

Introduction

In einer früheren Studie hingewiesen, wurde großer Aufmerksamkeit auf murinen Aorten Transplantation Modelle gelegt die Unterscheidung zwischen bestimmten vaskuläre Reaktionen durch das Transplantat selbst verursacht und bestimmte systemische Faktoren, verbunden mit einer Arteriogenic Umgebung zu ermöglichen 1 , 2 , 3. der Hauptfaktor, der hier eine entscheidende Rolle spielt ist die Verfügbarkeit von Knockout und transgenen Mäusen. Ihre Beteiligung in einem solchen Modell bietet die Möglichkeit der Identifizierung und Bestimmung neue pathophysiologischen Wege im Zusammenhang mit der Entwicklung der degenerative Gefäßerkrankungen, wie Arteriosklerose und Aneurysma Bildung4, 5.

Es ist erwähnenswert, dass während der Transplantation eine intrinsische Ischämie/Reperfusion Verletzungen der Gefäße für die Transplantation bestimmt auftreten kann. Daher kann nicht das Auftreten von spezifischen Problemen mit Transplantat Integrität oder eine unerwartete Entzündungsreaktion während der postoperativen Phase ausgeschlossen werden möglicherweise entgegensteht pathophysiologische Veränderungen der degenerative Gefäßerkrankungen3 ,4,5,6,7. Hülse Anastomose ist die alternative in einem Ende für arteriellen Anastomose von Schiffen mit einem Durchmesser von weniger als einem Millimeter und in Nieren- und Herz-Transplantation in Ratten die nachträglich angepasst wurde erfolgreich auf Aorten-angewendet wurde Transplantation bei Mäusen durch Dambrin Et al. 8 , 9 , 10 , 11.

Aortenklappe Schaden mit der Hülse-Transplantation-Technik wird mit einer sehr niedrigen technischen Ausfallrate, weil es im Durchschnitt nur 20 Minuten dauerten minimiert. Unsere bisherigen Ergebnisse zeigten hervorragende funktionelle und strukturelle Eigenschaften einer Isograft in Vivo nach der Transplantation mit der Sleeve-Technik-1. Dambrin Et Al. beschreiben, die nach eine kurze Lernkurve die Erfolgsquote über 78 %10. Komplikationen wie Thrombose sind selten, z. B. Engelbrecht Et Al. Thrombose mit der Sleeve-Technik in Nierentransplantation in der Ratte8nicht beobachten.

Das murine Aorten Transplantation Modell mit Hülse Anastomosen ist ein schnelles und einfaches Werkzeug Iso/Allograft Reaktionen im transplantierten Behälter zu studieren. Dieses Video veranschaulicht die Aorta Transplantationsverfahren in unserem Labor durchgeführt. Diese Transplantation Modell möglicherweise hilfreich bei der Festlegung der zugrunde liegenden pathologischen Mechanismen der degenerative Gefäßerkrankungen und kann zur weiteren Auswertung molekularer und pharmakologischen Interventionen12beitragen.

Protocol

Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Probanden wurden genehmigt durch das institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der RWTH Aachen University, AZ 84-02.04.2012.A234.

Hinweis: die Prozedur zeigt sich mit erwachsenen männlichen Wildtyp-Mäusen mit CD1 Hintergrund. Halten Sie die Mäuse in ein spezialisiertes Labor-Einheit, vor und nach der Operation, angemessenen Zugang zu Nahrungsmitteln, spezialisierte tierärztliche Kontrolle und Behandlung zu gewährleisten. Wenn die Tiere gekauft werden im Außenbereich erlauben Akklimatisation eine Woche vor der Operation.

1. Vorbereitung des Spenders

  1. benutzen sterile Materialien und Instrumente zu sterilen Bedingungen während der Operation um Infektionen zu vermeiden.
  2. Betäuben jede Maus mit einer Mischung von 1,5 % vom Volumen Isoflurane und 100 % Sauerstoff über eine Gesichtsmaske. Legen Sie der Maus auf einer Plattform in die Rückenlage und Band ihre Beine auf dem OP-Tisch. Überprüfen Sie ihre Reflexe durch Kneifen die Hinterfüße um sicherzustellen, dass die Maus ausreichend betäubt ist. Legen Sie ophthalmologischen Salbe auf die Augen, um zu verhindern, dass während des Verfahrens Trocknung.
  3. Entfernen Sie alle Haare aus dem Bauch mit einer Enthaarungscreme Gel oder verwenden Sie einen Rasierer. Führen Sie den Vorgang unter sterilen Bedingungen. Den Bauch mit abwechselnden Peelings von Chlorhexidin und sterilem Wasser zu desinfizieren.
  4. Die Aorta Spender über eine Mittellinie Bauchschnitt mit Schere oder Skalpell entfernen. Ziehen Sie den Darm manuell auf der rechten Seite. Den Darm über sanft manuell zu reflektieren, zu der Seite mit Pulver Handschuhe.
    1. Legen Sie den Darm auf ein Stück Gaze benetzt mit Kochsalzlösung um es feucht zu halten.
    2. Sezieren der Bauchschlagader sehr sorgfältig aus dem umgebenden Gewebe mit einem stumpfen Dissektion mit einer Pinzette entfernt.
    3. Segment der Aorta zwischen der Nierenarterien und seiner Gabelung aus der Vena Cava mit einer Pinzette zu trennen.
    4. Sichern die kleinen Zweige dieses Segments sehr vorsichtig mit 11: 0 Monofile einzelne Naht.
    5. Vor dem Entfernen der Aorta, injizieren 0,5 Milliliter (mL) Kochsalzlösung mit 50 U von Heparin in die minderwertige Vena Cava.
    6. Lassen Sie die Spendertieres aussaugen nachdem das Segment der Aorta entfernt ist.
    7. Die Prothese voll mit Kochsalzlösung spülen und dann sofort auf einen Container mit eiskalter Kochsalzlösung übertragen.

2. Vorbereitung des Empfängers

  1. Empfänger Tier mit einer Mischung von 1,5 % vom Volumen Isoflurane und 100 % Sauerstoff über eine Gesichtsmaske zu betäuben dann Haare entfernen und desinfizieren (Abschnitt 1). Eine Mittellinie Einschnitt aus dem Xiphoid, das Becken mit einem Skalpell aus- und Einfahren der Bauch-Wände. Legen Sie ophthalmologischen Salbe auf die Augen, Trockenheit während des Verfahrens zu verhindern.
  2. Wickeln der Darm in Salzlösung befeuchtet Gaze und verdrängen sehr schonend für das Tier ' rechts s.
  3. Dissect Infrarenal Aorta frei zwischen den Nierenarterien proximal und der Bifurkation nach distal mit einer Pinzette.
  4. Sichern die kleinen Zweige dieses Segments sehr vorsichtig mit 11: 0 Monofile einzelne Naht.
  5. Klemmen Sie die proximalen und distalen Teile der Aorta mit einer einzigen Seide Naht 6-0.
  6. Die Aorta in der Mitte zwischen den Klemmen zu teilen und die abgeschnittenen Enden mit heparinisierten Kochsalzlösung zu spülen Sie das Lumen offen zu bewässern.
  7. Stellen Sie das Transplantat mit der Fütterung Schiff Ende eingefügt in das empfangende Gefäß gefolgt von Nähen mit 11: 0 Monofile kümmert sich um jede Torsion der Aorta zu vermeiden, indem Sie richtig ausrichten der Spender und Empfänger (auf orthotopen Abbildung 1) 10.
  8. lösen Sie vorsichtig die Ligaturen nach Durchführung einer Inspektiondes der Anastomose. Lassen Sie zuerst die distalen Klammer. Dies führt zu niedrigen Druck halten die Wände zusammen vor dem Freigeben der proximalen Hochdruckseite.
  9. Durchspülen die Prothese sofort und auf einen sichtbaren Puls überprüfen. Entfernen Sie vorsichtig die Reste der Seide. Die optimale Überlappung zwischen Spender und Empfänger Aorta beträgt 1-2 mm.
  10. Der Abdominal-Inhalt in den Bauchraum zurück und schließen Sie das ganze mit einer laufenden 3-0 Polyglycolic Säure Naht gewickelt.
  11. Geben die Maus Buprenorphin (0,05 mg/kg Körpergewicht subkutan (SC)) vor dem Beenden Anästhesie.
  12. Ein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es vollständig bewusst ist. Verwalten von Schmerz-Therapie mit Buprenophine 0,05 mg/kg Körpergewicht verabreicht SC dreimal täglich für drei Tage nach der Operation, wie von der institutionellen Aufsichtsbehörde genehmigt.
  13. Für Gewebe, die Ernte, betäuben die Empfänger Mäuse als oben beschrieben und bündig die Schiffe mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gefolgt von 4 % Formaldehyd/PBS (pH = 7,4) durch Herzpunktion. Entfernen Sie die Transplantate vorsichtig. Nach der Übernachtung Fixierung in 4 % Formaldehyd/PBS, Prozess Proben weiter und Einbettung in Paraffin.

Representative Results

Die Mäuse erholt aus der Narkose innerhalb von 15-30 min ohne beobachteten körperlichen Beeinträchtigung, obwohl gab es ein erhöhtes Risiko von Thrombosen. Ultraschall-Analyse wurde in postoperativen Folgen aufgebraucht. Der Wildtyp-Mäusen, die in der Studie verwendeten stellte keine Veränderungen in den Dimensionen ihrer Lumen. Dementsprechend wurden weder Stenosen noch aneurysmal Formationen beobachtet. Die Transplantation Tiere gegen Plaque Entwicklung der Gefäßwände (Abbildung 2) aufweisen.

Konventionelle befleckenden Verfahren wie Immunhistologie können verwendet werden, um festzustellen, die Plaque, Muster von glatten Muskelzellen und die Ansammlung von Makrophagen. In unserer Studie die histologische und immunhistochemische Färbung erfolgte 6 Wochen nach der Transplantation um die Integrität des Transplantats zu testen. Histologische Färbung (Hämatoxylin und Eosin (HE) und immunhistochemische Färbung (Aktin glatte Muskulatur (SMA) und Makrophagen (MAC2)) (Abbildung 3) zeigte uns unverändert Verteilungsmuster der glatten Muskelzellen, intakt Endothelzellen Futter und keine Ansammlung von Zellen in der Intima. Diese Ergebnisse zeigen, dass keine signifikanten Läsion oder Zelle Aktivierung in den transplantierten Gefäßen (Abbildung 3) erkannt wurde.

Figure 1
Abbildung 1 : Hülse Technik. Die Bauchaorta wurde mit Hilfe der Sleeve-Technik transplantiert. In diesem Verfahren wurde des Spenders Aorta der orthotopen Position mit oberflächlichen Bissen in der Fütterung Schiff vorhanden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Intraoperative und Ultraschallbilder. Beispiele für die intraoperative (Autopsie) Ansicht der Grafts 6 Wochen nach der Transplantation (A), der dreidimensionale Ultraschall (B) und B-Modus Ansicht (C). Die postoperative Follow-up wurde mit Ultraschall durchgeführt. Die Bilder zeigen die Durchgängigkeit des Transplantats bei unveränderter in Lumen Abmessungen. Darüber hinaus wurden keine Stenosen oder aneurysmal Formationen beobachtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Histologische und immunhistochemische Bilder. Die histologische und immunhistochemische repräsentative Bilder von transplantierten Tiere 6 Wochen nach der Transplantation. Keine signifikanten Läsionen wurden in transplantierten Hauptschlagadern von Histologie beobachtet (Hämatoxylin und Eosin, 100 X Vergrößerung, Maßstabsleiste = 50 µm), immunhistochemische Färbung (glatte Muskulatur Aktin SMA (rot) oder Makrophagen MAC2 (grün), 200 X Vergrößerung, Skala Bar = 25 µm). Kerne wurden durch DAPI (blau) gegen gefärbt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Vor dieser Studie wurden verschiedene Transplantation Modelle bei Mäusen gründlich analysierten3,6,7,10,13,14. Das Modell der Aorta Transplantation mit der Sleeve-Technik mit Modifikationen von Dambrin Et Al. wurde ausgewählt, da sie unsere Kriterien abgestimmt und eine hohe Zuverlässigkeit der Hülse Anastomose im Vergleich zu herkömmlichen End-to-End-Naht-Methoden zeigte 1 , 10.

Diese Technik ist in vielerlei Hinsicht günstig mit Kreuz-Klemme Zeit erheblich reduziert die Schäden an der Aorta während der Operation zu minimieren. Eine geringe Inzidenz von Thrombosen beobachtet zusätzlich eine mögliche Diskrepanz im Schiff Kaliber zwischen Spender und Empfänger zu vermeiden. Die obigen Beobachtungen machen diese Technik sehr gut geeignet für die Untersuchung von Gefäßerkrankungen in der Aorta Transplantationen bei Mäusen.

In einer Folgestudie, in der eine Ultraschalluntersuchung 8 Wochen nach der Transplantation durchgeführt wurde, wurden keine signifikanten Veränderungen festgestellt. Dies bestätigte Annahmen, dass Schäden an der Aorta während der Operation minimal1wäre.

Das Pfropfen Verfahren in diesem Artikel vorgestellten garantiert keine Beeinträchtigung in der Graft-Integrität und seine Funktion. Daher kann geschlossen werden, dass dieses experimentelle Transplantation-Modell als ein wertvolles Werkzeug für künftige molekulare und pharmakologische Untersuchungen der degenerativen Schiff Krankheit genetisch veränderter Mäuse dienen kann.

Wir glauben, dass die video-Guide als Unterrichtsmaterial zur Veranschaulichung der Verwendung dieses einfachen Modells Arterio-arterielle funktionieren kann und es zu weiteren fruchtbaren Diskussion über viele wichtige Themen im vaskulären Erkrankungen beitragen. Diese sehr schnelle Anastomose-Methode kann verwendet werden, arterielle Verschlusskrankheit in gentechnisch veränderten Mäusen zu studieren. Es kann auch als eine Änderung in das Aneurysma-Modell kombiniert mit Transplantation verwendet werden.

Während des Verfahrens gibt es kritische Punkte. Die Platzierung des Nahtmaterials selbst ist der wichtigste Schritt. Der Chirurg muss darauf achten, um Torsion der Aorta durch korrekte Ausrichtung von Spender und Empfänger zu vermeiden. Die Klammern werden sorgfältig nach Inspektion der Anastomose entfernt. Die distalen Klammer sollte immer zuerst was zu niedrigem Druck halten die Wände zusammen vor der proximalen Hochdruckseite Veröffentlichung freigegeben werden. Die Folge einer nicht richtig befolgt die Reihenfolge der Veröffentlichung würde bluten.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgements

Wir möchten Roma Wieczorek, Peter Kurdybacha für ihre hervorragende Bearbeitung Unterstützung und Leon Decker und Uli Heuter für ihre hervorragenden technischen Betreuung danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Halsey Needle Holder Fine Science Tools 12001-13
Dumont #5 Forceps - Fine Science Tools 11254-20
Lexer-Baby Scissors Fine Science Tools 14079-10
Castroviejo Micro Needle Holder Fine Science Tools 12060-01
Vannas Scissors Aesculap, Germany Typ OC498R
Castroviejo Suture Forceps Geuder, Germany 19015
6-0 silk black (Silk) Deknatel, Research Triangle Park NC, USA 18020-60- FST
11-0 monofilament (Ethilon) Ethicon, Norderstedt, Germany EH7438G
3-0 polyglycolic acid suture (Serafit) Serag-Wiessner, Naila, Germany 60203214
Isofluorane Any genericon
Heparin Any genericon
0.9% saline Any genericon
Buprenorphine Any genericon
Bepanthene eye and nose cream Bayer, Germany
Microscop Zeiss Opmi MDO/S5
Vaporiser Eickemeyer TEC3
Ultrasound Vevo, Canada 770,2100

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