उच्च संकल्प Respirometry permeabilized और बरकरार कोशिकाओं में mitochondrial समारोह का आकलन करने के लिए

Biology
 

Summary

उच्च संकल्प respirometry mitochondrial ऑक्सीजन की खपत निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस mitochondrial श्वसन श्रृंखला परिसरों '(मैं-चतुर्थ) श्वसन दर, अधिक से अधिक mitochondrial इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली की क्षमता, और mitochondrial बाहरी झिल्ली अखंडता को निर्धारित करने के लिए एक सरल तकनीक है।

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Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J. Vis. Exp. (120), e54985, doi:10.3791/54985 (2017).

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Abstract

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया, सेलुलर ऊर्जा चयापचय में महत्वपूर्ण भूमिका को पूरा विशेष रूप से ऑक्सीजन का उपयोग adenosine triphosphate (एटीपी) के उत्पादन के लिए है। वे कोशिका मृत्यु और कई मानव रोगों में फंसा रहे हैं। Mitochondrial आक्सीकारक फास्फारिलीकरण (OXPHOS) ऑक्सीजन की खपत और एटीपी संश्लेषण के साथ इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के साथ इलेक्ट्रॉन परिवहन को जोड़ती है। Mitochondrial tricarboxylic एसिड (टीसीए) चक्र प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट और वसा का रूपांतरण निकोटिनामाइड एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड (NADH) और पीला रंग adenine डाईन्यूक्लियोटाइड के रूप में ऊर्जा समृद्ध यौगिकों (FADH 2) में में शामिल है। NADH और FADH 2 की इलेक्ट्रॉनों तो सांस इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला प्रोटीन परिसरों के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं (मैं चतुर्थ) भीतरी mitochondrial झिल्ली में स्थित है। इसके अलावा, दो अन्य redox रास्ते परिवहन श्रृंखला इलेक्ट्रॉन के इलेक्ट्रॉनों हस्तांतरण कर सकते हैं: i) mitochondrial इलेक्ट्रॉन स्थानांतरित flavoprotein (ईटीएफ) जो भीतरी Mito के मैट्रिक्स चेहरे पर स्थित हैफैटी एसिड β ऑक्सीकरण से chondrial झिल्ली, और आपूर्ति इलेक्ट्रॉनों; और ii) mitochondrial glycerophosphate डिहाइड्रोजनेज जो dihydroxyacetone फॉस्फेट के लिए glycerophosphate ऑक्सीकरण होता है और mitochondrial इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के लिए इलेक्ट्रॉनों खिलाती है। परिसर चतुर्थ (परम इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता), एक ऑक्सीजन अणु इलेक्ट्रॉनों स्थानान्तरण पानी के दो अणुओं में ऑक्सीजन परिवर्तित। चतुर्थ करने के लिए मैं सांस इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला परिसर से इलेक्ट्रॉनों का चल रहा है intermembrane अंतरिक्ष जो mitochondrial भीतरी झिल्ली भर में एक विद्युत ढाल स्थापित करने के लिए mitochondrial मैट्रिक्स से प्रोटॉन प्रवाह के साथ युग्मित है। बाद में, mitochondrial परिसर वी (एटीपी synthase) हाइड्रोजन आयन mitochondrial मैट्रिक्स में वापस शटल और एटीपी अणुओं synthesizes। OXPHOS समारोह vivo में इन विट्रो में विभिन्न तकनीकों और विभिन्न mitochondrial श्वसन राज्यों का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता का आकलन किया जा सकता है। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया निम्नलिखित respirato मेंRY राज्यों मापा जा सकता है: i) बेसल mitochondrial श्वसन (राज्य 1), द्वितीय) mitochondrial श्वसन श्रृंखला परिसरों के विशिष्ट substrates के अलावा के बाद ऑक्सीजन की खपत (राज्य 2), iii) अधिक से अधिक mitochondrial ऑक्सीजन की खपत की सांद्रता saturating के अलावा के बाद adenosine diphosphate (ADP) (राज्य 3) और, चतुर्थ) ADP खपत (एटीपी करने के लिए परिवर्तित करने के बाद आराम कर रही श्वसन) (राज्य) 4। बरकरार कोशिकाओं में निम्नलिखित श्वसन राज्यों मापा जा सकता है: i) अंतर्जात substrates और ADP की उपस्थिति में बेसल सेलुलर ऑक्सीजन की खपत, द्वितीय) oligomycin की उपस्थिति में बेसल सेलुलर ऑक्सीजन की खपत (oligomycin-असंवेदनशील श्वसन) और oligomycin के प्रति संवेदनशील श्वसन (एटीपी कारोबार), iii) FCCP uncoupled श्वसन, और antimycin ए और rotenone के अलावा के बाद iv) गैर-mitochondrial श्वसन। permeabilized कोशिकाओं में, इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला परिसरों और ADP के विशिष्ट substrates जोड़ा जा सकता है और अधिक से अधिक जटिल निर्भर सांस की दरों रोंuch के रूप में जटिल मैं-, द्वितीय और चतुर्थ निर्भर सांस की दरों में मापा जा सकता है।

सेलुलर श्वसन की माप mitochondrial श्वसन परिसरों मैं-चतुर्थ, mitochondrial अखंडता और ऊर्जा चयापचय 1, 2, 3 के लिए विशिष्ट क्षमता में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। उपकरणों जो उच्च सटीकता, संकल्प और संवेदनशीलता के साथ mitochondrial ऑक्सीजन की खपत की माप सक्षम की एक उच्च संकल्प Oxygraph 4 है। उच्च संकल्प Oxygraph डिवाइस इंजेक्शन बंदरगाहों के साथ दो कक्षों में शामिल है और प्रत्येक कक्ष एक polarographic ऑक्सीजन सेंसर से लैस है। सेलुलर या पृथक mitochondrial निलंबन respirometer में लगातार हड़कंप मच गया। mitochondrial जटिल गतिविधि के लिए mitochondrial समारोह, substrates और अवरोधकों का आकलन करने के लिए मानक प्रोटोकॉल का पालन जोड़ा जा सकता है। Substrates और अवरोधकों इंजेक्शन int द्वारा titrated किया जा सकताओ Oxygraph के कक्षों, और ऑक्सीजन की खपत की दर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर की गणना की और प्रति कोशिकाओं की संख्या प्रति सेकंड picomoles के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। उच्च संकल्प respirometry वृद्धि की संवेदनशीलता और ऐसे बरकरार या permeabilized कोशिकाओं के रूप में जैविक नमूने की कम संख्या के साथ काम करने की क्षमता सहित पारंपरिक और पारंपरिक polarographic ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड उपकरणों पर कई लाभ प्रदान करता है। इसके अलावा, प्रत्येक डिवाइस दो कक्षों में शामिल है, और सांस की दरों में ऑक्सीजन सांद्रता की तुलना के लिए एक साथ दर्ज किया जा सकता है। उच्च संकल्प Oxygraph भी पारंपरिक polarographic ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड उपकरणों की तुलना में युक्ति कक्षों से ऑक्सीजन की कम रिसाव का लाभ दिया है। हाल ही में एक और डिवाइस सेलुलर ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए विकसित 96 अच्छी तरह से बाह्य प्रवाह विश्लेषक 5 है। बाह्य प्रवाह विश्लेषक polarographic सेंसर के बजाय रोशनी से सुसज्जित है। कोशिकी के फायदेप्रवाह विश्लेषक उच्च संकल्प Oxygraph मैं) कर रहे हैं यह एक बड़े पैमाने पर स्वचालित उपकरण है ii) यह 24 और उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए 96 अच्छी तरह प्लेटें में ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए संभव है की तुलना में है, इसलिए, जैविक नमूने की कम मात्रा की आवश्यकता होती है और iii) सेलुलर glycolytic प्रवाह के अतिरिक्त माप संभव है। उच्च संकल्प Oxygraph की तुलना में बाह्य प्रवाह विश्लेषक का नुकसान रहा हैं) डिवाइस के लिए और इस तरह फ्लोरोसेंट प्लेट, जो गैर पुन: प्रयोज्य हैं के रूप में उपभोक्ता वस्तुओं की उच्च लागत, और द्वितीय) परख प्रति केवल चार यौगिकों / अच्छी तरह से इंजेक्शन हैं अत: प्रणाली सब्सट्रेट-uncoupler-अवरोध अनुमापन प्रोटोकॉल के लिए संभव नहीं है।

वर्तमान अध्ययन में, हम mitochondrial श्वसन निर्धारित करने के लिए उच्च संकल्प respirometry का उपयोग करें। सेलुलर ऑक्सीजन की खपत प्रयोगों के लिए, कोशिकाओं Complexe में इलेक्ट्रॉनों के भोजन के लिए बहिर्जात ADP और oxidizable mitochondrial substrates के प्रवेश को अनुमति देने के लिए कर रहे हैं permeabilizedश्वसन प्रणाली के एस। यह दृष्टिकोण अलग-अलग mitochondrial परिसरों श्वसन क्षमता के विच्छेदन, जो बरकरार कोशिकाओं की तुलना में एक विशिष्ट लाभ है (कई substrates सेल impermeant) कर रहे हैं अनुमति देता है। हालांकि, कोशिका झिल्ली permeabilization cytosol और बाह्य अंतरिक्ष और मध्यम (साइटोसोलिक विलेय के बाहर धोने) और intracellular अंतरिक्ष की संरचना के बीच बाधा बाह्य माध्यम के साथ equilibrated है बाधित करेगा। बरकरार कोशिकाओं पर permeabilized कोशिकाओं के नुकसान में से एक यह है कि mitochondrial बाहरी झिल्ली यदि डिटर्जेंट की अत्यधिक मात्रा में सेल permeabilization के दौरान कार्यरत हैं क्षतिग्रस्त किया जा सकता है। बरकरार कोशिकाओं में, बेसल, बरकरार कोशिकाओं के युग्मित और uncoupled श्वसन मापा जा सकता है। इस विधि बहिर्जात substrates और ADP के अलावा बिना बरकरार कोशिकाओं की ऑक्सीजन की खपत का मूल्यांकन करता है, एकीकृत सेल में श्वसन समारोह reproducing और भी अधिक से अधिक mitochondrial इलेक्ट्रॉन परिवहन के बारे में जानकारी उपलब्ध कराने केRT क्षमता 6, 7। permeabilized कोशिकाओं पर बरकरार कोशिकाओं के लाभ में से एक यह है कि सेलुलर पर्यावरण बाधित नहीं है और माइटोकॉन्ड्रिया कोशिकाओं के पूरे घटकों के साथ संपर्क में हैं। आदेश सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली permeabilize करने के लिए, इस तरह के रूप में digitonin डिटर्जेंट 8 इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, mitochondrial बाहरी झिल्ली अखंडता यदि digitonin की अत्यधिक मात्रा में कार्यरत हैं समझौता किया जा सकता है। कि mitochondrial बाहरी झिल्ली अखंडता permeabilized कोशिकाओं में समझौता नहीं किया है इस बात की पुष्टि करने के लिए, digitonin अनुमापन सेलुलर permeabilization के लिए इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण किया जाता है। इन प्रयोगों के लिए, कोशिकाओं श्वसन के माध्यम में resuspended हैं और digitonin एकाग्रता mitochondrial substrates और ADP, और श्वसन दर की उपस्थिति में respirometry द्वारा titrated है मापा जाता है। अक्षत, गैर permeabilized कोशिकाओं की श्वसन mitocho की उपस्थिति में प्रेरित नहीं हैndrial substrates और ADP। हालांकि, बाद में चरणबद्ध digitonin अनुमापन प्लाज्मा झिल्ली का क्रमिक permeabilization उपज होता है, और इष्टतम digitonin एकाग्रता प्राप्त की है। यह पूरा करने के लिए permeabilization श्वसन तक की वृद्धि से दिखाया गया है। Mitochondrial गुणवत्ता और बाहरी झिल्ली अखंडता exogenous साइटोक्रोम ग 2, 9 जोड़कर सत्यापित किया जा सकता। साइटोक्रोम ग mitochondrial इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला 10, 11, 12 के एक 12 केडीए इलेक्ट्रॉन प्रोटीन ले जा रहा है। यह mitochondrial intermembrane अंतरिक्ष में स्थानीय है, और ऑक्सीजन की खपत में शामिल है, जटिल चतुर्थ करने के लिए जटिल III से इलेक्ट्रॉनों ले। एक बार जब mitochondrial बाहरी झिल्ली क्षतिग्रस्त है, साइटोक्रोम ग जारी की है, और mitochondrial ऑक्सीजन की खपत कम हो जाता है। exogenous साइटोक्रोम ग के अलावा पर, mitochondrial श्वसन में किसी भी वृद्धि एक का संकेत हैmitochondrial बाहरी झिल्ली खलल डाल दिया।

Permeabilized कोशिकाओं, substrates और mitochondrial जटिल गतिविधि के अवरोधकों में विभिन्न प्रोटोकॉल का पालन जोड़ रहे हैं 3, 9। आदेश mitochondrial परिसर संचालित सांस की जांच करने के लिए दरों में उदाहरण के लिए, निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है। कोशिकाओं के permeabilization के बाद, पहली जटिल मैं substrates Malate और ग्लूटामेट, जो सांस की श्रृंखला के लिए एक सब्सट्रेट के रूप NADH पैदा करते हैं और जटिल मैं बाद में, ADP एटीपी (राज्य 3, सक्रिय करने के लिए रूपांतरण के लिए जोड़ा जाता है की सक्रियता के भड़काने से प्रेरित है जटिल मैं निर्भर श्वसन)। बाद एक स्थिर संकेत तक पहुँच जाता है, rotenone (mitochondrial परिसर मैं अवरोध करनेवाला) जटिल आई Rotenone FADH से 2 succinate द्वारा पीछा किया जाता है को बाधित करने के लिए और जटिल द्वितीय (राज्य 3, सक्रिय जटिल द्वितीय निर्भर श्वसन) को सक्रिय करने के लिए किया जाता है। आदेश जटिल चतुर्थ निर्भर श्वसन, पहली जटिल III को मापने के लिएनिर्भर श्वसन antimycin एक (mitochondrial परिसर III अवरोध) को जोड़ने से हिचकते हैं। बाद में, जटिल चतुर्थ निर्भर श्वसन एस्कॉर्बेट और tetramethylphenylendiamine (TMPD) प्रशासन द्वारा प्रेरित है। TMPD श्वसन बफर में ऑटो-oxidize कर सकते हैं, इसलिए अधिक से अधिक जटिल चतुर्थ निर्भर श्वसन दर (राज्य 3) पहले और सोडियम azide, mitochondrial जटिल चतुर्थ के एक अवरोध के बाद इसके अलावा श्वसन दर घटाकर की जाती है। श्वसन प्रयोगों समानांतर एक एक नियंत्रण (unstimulated कोशिकाओं) के रूप में की सेवा में एक Oxygraph के दो कक्षों, अन्य युक्त प्रेरित कोशिकाओं में बाहर किया जा सकता है। जाहिर है, कोशिकाओं को विभिन्न तरीकों, जैसे पूर्व इलाज किया जा सकता है, mitochondrial कार्यों को प्रभावित कर दवाओं के साथ, पहले उनके ऑक्सीजन की खपत Oxygraph कक्ष में मापा जाता है। इस प्रोटोकॉल व्यक्ति mitochondrial श्वसन श्रृंखला परिसरों के कार्यात्मक परीक्षा की अनुमति देता है। इसके अलावा, एक अधिक से अधिक ADP उत्तेजित उपाय कर सकते हैंश्वसन permeabilized कोशिकाओं, palmitate के रूप में exogenous फैटी एसिड का उपयोग कर के (राज्य 3)। (: 1 दाढ़ अनुपात palmitate: बीएसए 6) इस प्रोटोकॉल में, सोडियम palmitate केंद्रित शेयरों अल्ट्रा फैटी एसिड मुक्त गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ संयुग्मित हैं। बाद में, कोशिकाओं पहले digitonin और mitochondrial श्वसन के साथ permeabilized रहे हैं carnitine के अलावा द्वारा मूल्यांकन किया है और ADP (राज्य 3, अधिक से अधिक श्वसन) के अलावा द्वारा पीछा palmitate। फिर, oligomycin राज्य 4 (राज्य 4o) और श्वसन नियंत्रण अनुपात (रेसकोर्स रोड मूल्य) की नकल करने के लिए जोड़ा गया है राज्य 3 / राज्य 4o के रूप में गणना की है। β ऑक्सीकरण एसिटाइल सीओए के उत्पादन (जो टीसीए चक्र में प्रवेश करती है) और FADH 2 और NADH, जिनमें से इलेक्ट्रॉनों इलेक्ट्रॉन स्थानांतरित flavoprotein और β-hydroxyacyl सीओए डिहाइड्रोजनेज द्वारा इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के लिए पारित कर रहे हैं की पीढ़ी को बढ़ावा देता है। माइटोकॉन्ड्रिया फैटी एसिड चयापचय के केंद्र में हैं और बताया palmitate-बीएसए प्रोटोकॉल वसा की जांच के शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया जा सकताTy एसिड ऑक्सीकरण। बरकरार कोशिकाओं में, activators और mitochondrial जटिल गतिविधि के अवरोधकों एक अलग प्रोटोकॉल 6, 9 निम्नलिखित जोड़ रहे हैं। इन प्रयोगों के लिए, बहिर्जात substrates के अभाव में गैर permeabilized कोशिकाओं की पहली ऑक्सीजन की खपत (श्वसन दर phosphorylating) मापा जाता है। फिर, गैर phosphorylating श्वसन दर oligomycin के अलावा, जो mitochondrial एटीपी synthase के एक अवरोध है के बाद मापा जाता है। बाद में, protonophore कार्बोनिल साइनाइड पी trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) विभिन्न सांद्रता में प्रशासित किया जाता है और अधिक से अधिक mitochondrial uncoupled श्वसन दर मापा जाता है। ऐसे FCCP के रूप में Protonophores भीतर की झिल्ली की प्रोटॉन पारगम्यता में वृद्धि पैदा कर सकते हैं, chemiosmotic ढाल फैलने के लिए प्रोटॉनों के निष्क्रिय आंदोलन की इजाजत दी। प्रोटॉन पारगम्यता में वृद्धि ऑक्सीडेटिव श्वसन (कोई एटीपी उत्पादन) uncouples और ओ में वृद्धि लातीxygen खपत। बाद में, rotenone और antimycin एक mitochondrial श्वसन को बाधित करने के लिए जोड़ रहे हैं, और गैर mitochondrial श्वसन अन्य सभी श्वसन दर से घटाया जाता है।

ऑक्सीजन की खपत की दर कब 2 [pmol एक्स सेकंड -1 एक्स 10 -6 कोशिकाओं] (मिलियन कोशिकाओं प्रति ऑक्सीजन का प्रवाह), जो मात्रा विशेष ऑक्सीजन प्रवाह (बंद ऑक्सीजन चैम्बर में) विभाजित करके गणना की है, जेवी, हे के रूप में व्यक्त किया जा सकता 2 [pmol एक्स सेकंड -1 एक्स मिलीलीटर -1] सेल एकाग्रता द्वारा सेल कक्ष में (मात्रा प्रति कोशिकाओं की संख्या [10 6 कोशिकाओं ∙ मिलीलीटर 1]) 15। सेल-जन के विशिष्ट ऑक्सीजन प्रवाह, JO 2 [pmol एक्स सेकंड -1 एक्स मिलीग्राम -1], सेल प्रति प्रवाह है, कब 2 [pmol एक्स सेकंड -1 एक्स 10 -6 कोशिकाओं], सेल प्रति जन द्वारा विभाजित [मिलीग्राम ∙ 10 6 कोशिकाओं]; या मात्रा विशेष प्रवाह, जेवी, हे 2 [pmol एक्स सेकंड -1 एक्स मिलीलीटर -1], वॉल्यूम प्रति जन द्वारा विभाजितUme [मिलीग्राम ∙ मिलीलीटर 1]। JO 2 सेल प्रोटीन, सूखी वजन या सेल की मात्रा प्रति ऑक्सीजन प्रवाह है।

उच्च संकल्प respirometry का उपयोग करते हुए वर्तमान अध्ययन में, हम प्रयोग कर exogenous साइटोक्रोम ग मैं यह निर्धारित करने के लिए) पूरा सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली permeabilization के लिए इष्टतम digitonin एकाग्रता (digitonin अनुमापन परख), द्वितीय) mitochondrial बाहरी झिल्ली अखंडता, iii) mitochondrial श्वसन श्रृंखला परिसरों मैं प्रोटोकॉल का वर्णन , द्वितीय और चतुर्थ बहिर्जात ADP और mitochondrial श्वसन श्रृंखला substrates, और की उपस्थिति में digitonin-permeabilized HepG2 कोशिकाओं में अधिक से अधिक सांस की दरों iv) बेसल, मिलकर और बरकरार कोशिकाओं का अधिक से अधिक uncoupled श्वसन (अधिक से अधिक इलेक्ट्रॉन परिवहन क्षमता) बहिर्जात substrates के अलावा बिना और ADP, एकीकृत सेल में श्वसन समारोह reproducing।

Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. संस्कृति मानव hepatoma HepG2 कोशिकाओं 25 में 6 सेमी 2 Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) एक मशीन (5% सीओ में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त सेल संस्कृति बोतल 2, 95% हवा) (बोने घनत्व: cM 1 एक्स 10 प्रति 25 6 कोशिकाओं 2 सेल संस्कृति फ्लास्क, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ऊष्मायन समय: 48 घंटा, confluency पर सेल घनत्व: 25 सेमी प्रति 4-5 x 10 6 कोशिकाओं 2 सेल संस्कृति फ्लास्क)।
  2. जब कोशिकाओं को 90% से 95% करने के लिए मिला हुआ हैं प्रयोगों प्रदर्शन करना।

Polarographic ऑक्सीजन सेंसर की 2. उच्च संकल्प Respirometry कैलिब्रेशन

  1. पिपेट 2.1 एक Oxygraph कक्ष में श्वसन बफर के मिलीलीटर और बफर हलचल लगातार की एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत तक 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय सरगर्मी बार चैम्बर (700 आरपीएम) में मौजूद का उपयोग करpolarographic ऑक्सीजन सेंसर प्राप्त की है।
    नोट: प्रत्येक Oxygraph चैम्बर के उपाय ऑक्सीजन एकाग्रता के भीतर Polarographic ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड और प्रत्येक कक्ष के भीतर ऑक्सीजन की खपत (प्रवाह) की गणना। ऑक्सीजन एकाग्रता और ऑक्सीजन की खपत दर (प्रवाह) डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग कर वास्तविक समय ऑनलाइन प्रदर्शित कर रहे हैं एक कंप्यूटर में।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार 14 polarographic ऑक्सीजन सेंसर की एक हवा अंशांकन प्रदर्शन करना।
    नोट: हवा संतृप्ति प्रयोगात्मक तापमान पर मीडिया में श्वसन मीडिया और ऑक्सीजन एकाग्रता में polarographic ऑक्सीजन सेंसर के कैलिब्रेशन केवल एक बार सुबह में दैनिक किया जाता है। बाद में मीडिया कक्षों और एक ताजा श्वसन मीडिया में resuspended कोशिकाओं से हटाया जा सकता है एक Oxygraph चैम्बर के लिए जोड़ रहे हैं और सांस की दरों में मापा जाता है। पहले प्रयोग के बाद, चैम्बर धोया जा सकता है और प्रयोगों के अतिरिक्त श्रृंखला टी में किया जा सकता हैउन्होंने आगे calibrations के बिना ही चैंबर।

3. trypsinization पक्षपाती कोशिकाओं, गिनती प्रकोष्ठों के

  1. प्रयोग के दिन, 25 सेमी 2 सेल संस्कृति कुप्पी से DMEM aspirate।
  2. फॉस्फेट बफर खारा के 5 मिलीलीटर (पीबीएस) के साथ संस्कृति फ्लास्क में सेल संस्कृति monolayer कुल्ला।
  3. पिपेट 0.5 trypsin समाधान (एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक prewarmed) संस्कृति फ्लास्क में सेल monolayer में 25 मिलीग्राम / एमएल के मिलीलीटर और एक मशीन (5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते 95% हवा)।
  4. DMEM सेल संस्कृति फ्लास्क में अलग कक्षों में 10% FBS युक्त और pipetting द्वारा कोशिकाओं को निलंबित पिपेट 5 मिलीलीटर।
  5. स्थानांतरण कमरे के तापमान पर 350 XG पर 5 मिनट के लिए resuspended एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज के लिए कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला छानना।
  6. श्वसन बफर 13 (टी सक्षम 1) के 1 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend।
  7. मैं> एक सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गणना और 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम घनत्व को श्वसन बफर में उन्हें resuspend। सेलुलर श्वसन दरों सेल नंबर के लिए सामान्यीकृत किया जाएगा के बाद से, एक सही और सटीक सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गिनती।

4. उच्च संकल्प Respirometry

  1. बाद हवा अंशांकन (केवल एक बार दैनिक प्रदर्शन किया, 2.1-2.2 कदम), Oxygraph के एक कक्ष से श्वसन मध्यम aspirate और चैम्बर के लिए कदम 3.7 से सेल निलंबन (1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) के 2.1 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. डाट की प्रविष्टि द्वारा Oxygraph चैम्बर बंद।
  3. लगातार 37 डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय सरगर्मी बार चैम्बर (700 आरपीएम) में मौजूद कोशिकाओं का उपयोग कर हलचल और 5-10 मिनट के लिए सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड तक एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत हासिल की है।
    नोट: ऑक्सीजन एकाग्रता और ऑक्सीजन प्रवाह संकेत डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग कर वास्तविक समय ऑनलाइन प्रदर्शित कर रहे हैं एक कंप्यूटर मेंएस = "xref"> 14।
  4. बाद में, निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग stoppers के टाइटेनियम इंजेक्शन बंदरगाहों के माध्यम से mitochondrial श्वसन के लिए substrates और अवरोधकों इंजेक्षन।

5. Respirometry द्वारा बरकरार कोशिकाओं में digitonin अनुमापन

  1. प्रक्रिया कदम प्रोटोकॉल का 4.3 करने के लिए 4.1 में वर्णित के बाद एक Oxygraph चैम्बर युक्त सेल निलंबन (1 x 10 6 / एमएल) तैयार करें।
  2. एक सिरिंज का उपयोग Oxygraph चैम्बर डाट की टाइटेनियम इंजेक्शन बंदरगाह के माध्यम से सेल निलंबन युक्त कक्ष में 0.2 मिमी rotenone (0.2 माइक्रोन) के 'चेतावनी' के 2 μl इंजेक्षन और 5-10 मिनट के लिए सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड तक एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत हासिल की है ।
    नोट: निम्न चरणों में सभी इंजेक्शन सीरिंज का उपयोग कर stoppers के टाइटेनियम इंजेक्शन बंदरगाहों के माध्यम से प्रदर्शन कर रहे हैं। rotenone के अलावा वैकल्पिक है (यह रिवर्स इलेक्ट्रॉन प्रवाह को रोकता है) और digitonin अनुमापन प्रयोगों के लिए छोड़ा जा सकता है, देखते हैंकदम 6.3।
  3. Oxygraph कक्ष में 1 एम succinate (10 मिमी) के 20 μl इंजेक्षन और 5-10 मिनट के लिए सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड तक एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत हासिल की है।
  4. Oxygraph कक्ष में 0.5 एम ADP (2.5 मिमी) के 10 μl इंजेक्षन और 5-10 मिनट के लिए सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड तक एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत हासिल की है।
  5. Oxygraph कक्ष में 2 मिमी digitonin (2 माइक्रोन) के 2 μl इंजेक्षन और 2-5 मिनट के लिए सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड तक एक स्थिर ऑक्सीजन संकेत हासिल की है।
  6. फिर digitonin Oxygraph कक्ष में 2 मिमी के 2 μl इंजेक्षन और 2-5 मिनट के लिए सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड तक एक स्थिर ऑक्सीजन संकेत हासिल की है।
    नोट: कोशिकाओं को digitonin की stepwise अलावा सेलुलर ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि हुई है और ऑक्सीजन प्रवाह में वृद्धि होगी संकेत प्रेरित करेगा।
  7. चैम्बर में 2 मिमी digitonin stepwise (2-4 माइक्रोन के हर कदम) के 2-4 μl इंजेक्शन लगाने के लिए आगे बढ़ें। प्रत्येक चरण के बाद, 2-5 मीटर के लिए सेलुलर श्वसन रिकॉर्डमें जब तक एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत हासिल की है।
    नोट: digitonin इंजेक्शन लगाने जब ऑक्सीजन प्रवाह संकेत एक अधिकतम स्तर तक पहुँचता है और digitonin के आगे इंजेक्शन श्वसन दर में वृद्धि नहीं करना बंद करो। पाठकों को अपनी प्रयोगशालाओं में इष्टतम digitonin एकाग्रता का निर्धारण करना चाहिए कदम 6.2 और उनके प्रयोगों के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल का 7.2 में अपने स्वयं के अभिकर्मकों और उपयोग प्राप्त इष्टतम digitonin एकाग्रता का उपयोग।

6. Mitochondrial बाहरी झिल्ली अखंडता का मूल्यांकन: साइटोक्रोम ग

  1. प्रक्रिया कदम प्रोटोकॉल का 4.3 करने के लिए 4.1 में वर्णित के बाद एक Oxygraph चैम्बर युक्त सेल निलंबन (1 x 10 6 / एमएल) तैयार करें।
  2. Oxygraph सेल निलंबन (1 x 10 6 / एमएल) युक्त कक्ष में 8 मिमी digitonin (8 सुक्ष्ममापी) के 2 μl इंजेक्षन और 5 मिनट के लिए कोशिकाओं permeabilize।
  3. Oxygraph कक्ष में 1 एम succinate (10 मिमी) के 20 μl इंजेक्षन और सेलुलर respirat रिकॉर्ड5-10 मिनट के लिए आयन जब तक एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत हासिल की है।
  4. Oxygraph कक्ष में 0.5 एम ADP (2.5 मिमी) के 10 μl इंजेक्षन और 5-10 मिनट के लिए सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड तक एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत हासिल की है।
    नोट: कोशिकाओं को ADP के अतिरिक्त कॉम्प्लेक्स मैं उत्तेजित और ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि को प्रेरित करेगा, और ऑक्सीजन प्रवाह बढ़ाने के लिए और संकेत स्थिर होगा।
  5. Oxygraph कक्ष में 4 मिमी साइटोक्रोम ग (10 माइक्रोन) के 5 μl इंजेक्षन और 5-10 मिनट के लिए सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड तक एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत हासिल की है।
  6. अंत में 4 मिलीग्राम / एमएल oligomycin (2 माइक्रोग्राम / एमएल) के 1 μl इंजेक्षन और कोशिकीय श्वसन रिकॉर्ड तक एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत हासिल की है।

7. अधिकतम ADP उत्तेजित श्वसन permeabilized HepG2 कोशिकाओं की (राज्य 3)

  1. प्रक्रिया कदम प्रोटोकॉल का 4.3 करने के लिए 4.1 में वर्णित के बाद एक Oxygraph चैम्बर युक्त सेल निलंबन (1 x 10 6 / एमएल) तैयार करें।
  2. Oxygraph सेल निलंबन युक्त कक्ष में 8 मिमी digitonin (8 सुक्ष्ममापी) के 2 μl इंजेक्षन और 5 मिनट के लिए कोशिकाओं permeabilize।
  3. Malate के 0.8 एम (5 मिमी) की 12.5 μl और Oxygraph कक्ष में ग्लूटामेट की 2 एम (10 मिमी) के 10 μl इंजेक्षन। एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत तक रिकॉर्ड सेलुलर श्वसन हासिल की है।
  4. Oxygraph कक्ष में 0.5 एम ADP (2.5 मिमी) के 10 μl इंजेक्षन और ऑक्सीजन प्रवाह संकेत बढ़ जाती है जब तक सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड और स्थिर।
    नोट: कोशिकाओं को ADP के अतिरिक्त ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि हुई है और ऑक्सीजन प्रवाह में वृद्धि होगी संकेत प्रेरित करेगा।
  5. Oxygraph कक्ष में 0.2 मिमी rotenone (0.2 माइक्रोन) के 'चेतावनी' के 2 μl इंजेक्षन और ऑक्सीजन प्रवाह संकेत कम हो जाती है जब तक सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड और स्थिर।
  6. बाद में, Oxygraph कक्ष में 1 एम succinate (10 मिमी) के 20 μl इंजेक्षन और ऑक्सीजन प्रवाह संकेत बढ़ जाती है जब तक सेलुलर श्वसन रिकॉर्डऔर स्थिर।
  7. फिर, Oxygraph कक्ष में एक (5 माइक्रोन) के 'चेतावनी' antimycin 5 मिमी की 2 μl इंजेक्षन और ऑक्सीजन प्रवाह संकेत कम हो जाती है जब तक सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड और स्थिर।
  8. फिर 0.8 मिमी एस्कॉर्बेट (1 मिमी) के 2.5 μl इंजेक्षन और तुरंत बाद Oxygraph कक्ष में 0.2 मिमी TMPD (0.25 मिमी) के 2.5 μl इंजेक्षन और ऑक्सीजन प्रवाह संकेत बढ़ जाती है जब तक सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड और स्थिर।
  9. अंत में Oxygraph कक्ष में 1 एम सोडियम azide (5 मिमी) 'चेतावनी' के 10 μl इंजेक्षन और ऑक्सीजन प्रवाह संकेत कम हो जाती है जब तक सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड और स्थिर।

8. बरकरार कोशिकाओं की ऑक्सीजन की खपत

  1. प्रक्रिया कदम प्रोटोकॉल का 4.3 करने के लिए 4.1 में वर्णित के बाद एक Oxygraph चैम्बर युक्त सेल निलंबन (1 x 10 6 / एमएल) तैयार करें।
  2. Oxygraph चैम्बर युक्त सेल निलंबन एक में 4 मिलीग्राम / एमएल oligomycin (2 माइक्रोग्राम / एमएल) के 1 μl इंजेक्षनएक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत तक डी रिकॉर्ड सेलुलर श्वसन हासिल की है।
  3. बाद में Oxygraph कक्ष में FCCP 0.2 मिमी (0.1 माइक्रोन) के 'चेतावनी' के 1 μl इंजेक्षन और ऑक्सीजन प्रवाह संकेत बढ़ जाती है जब तक सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड और स्थिर।
  4. Oxygraph कक्ष में FCCP 0.2 मिमी (0.4 माइक्रोन) के के 3 μl इंजेक्षन और आगे ऑक्सीजन प्रवाह संकेत बढ़ जाती है जब तक सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड और स्थिर।
  5. Oxygraph कक्ष में (कक्ष में 0.1 करने के लिए 2 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) 0.2 1 मिमी FCCP को 1-3 μl इंजेक्शन लगाने तक ऑक्सीजन प्रवाह संकेत इसकी अधिकतम स्तर और आगे नहीं बढ़ जाती है और उसके बाद तक पहुँच द्वारा 0.1 0.3 माइक्रोन के लिए चरणों में FCCP titrate घट रही शुरू होता है।
    नोट: FCCP इंजेक्शन लगाने जब ऑक्सीजन संकेत एक अधिकतम स्तर तक पहुँच जाता है और गिरावट शुरू होता है बंद करो।
  6. फिर, 0.2 मिमी rotenone (0.2 माइक्रोन) और 5 मिमी की 2 μl antimycin कक्ष में एक (5 माइक्रोन) के के 2 μl इंजेक्षन। रिकार्ड श्वसन टी तकवह ऑक्सीजन प्रवाह संकेत घट जाती है और स्थिर।

Representative Results

Digitonin अनुमापन प्रयोग: सेलुलर permeabilization के लिए इष्टतम digitonin एकाग्रता का निर्धारण

Digitonin अनुमापन HepG2 कोशिकाओं की permeabilization के लिए इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए किया जाता है। (प्रेरित करने के लिए जटिल द्वितीय निर्भर राज्य 3) इन प्रयोगों के लिए, digitonin rotenone, succinate (mitochondrial जटिल द्वितीय सब्सट्रेट) और ADP की एक saturating राशि की उपस्थिति में बरकरार कोशिकाओं में titrated है, और सांस की दरों में आधारभूत और प्रत्येक के बाद मापा जाता है अनुमापन (आंकड़े 1 ए और 1 बी)। इस प्रयोग के परिणाम से पता चलता है कि digitonin के अभाव में, सेलुलर श्वसन बहुत कम है और अक्षत, गैर permeabilized कोशिकाओं की श्वसन mitochondrial सब्सट्रेट और ADP की उपस्थिति में प्रेरित नहीं है। हालांकि, digitonin का चरणबद्ध अलावा पर, सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली permeabilized और mitochon हैdrial श्वसन (जटिल द्वितीय निर्भर राज्य 3) पूर्ण permeabilization तक बढ़ जाती है जब succinate और ADP कोशिकाओं में प्रवेश। परिणाम बताते हैं कि 8-12 माइक्रोन की digitonin एकाग्रता में permeabilization HepG2 कोशिकाओं की ADP उत्तेजित श्वसन के लिए इष्टतम है। हालांकि, mitochondrial बाहरी झिल्ली अखंडता यदि digitonin की अत्यधिक मात्रा में कार्यरत हैं समझौता किया जा सकता है। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, digitonin की अत्यधिक मात्रा में समझौता mitochondrial बाहरी झिल्ली अखंडता का संकेत में जटिल द्वितीय निर्भर राज्य 3 श्वसन कमी प्रेरित किया।

वर्तमान और निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, ऑक्सीजन की खपत की दर कब 2 [pmol एक्स सेकंड -1 एक्स 10 -6 कोशिकाओं] (मिलियन कोशिकाओं प्रति ऑक्सीजन का प्रवाह), जो (बंद मात्रा में विशेष ऑक्सीजन प्रवाह को विभाजित करके गणना की है के रूप में व्यक्त कर रहे हैं ऑक्सीजन चैम्बर), जेवी, हे 2 [pmol एक्स सेकंड -1 एक्स मिलीलीटर -1] सेल concentrat द्वारा सेल कक्ष में आयन (मात्रा प्रति कोशिकाओं की संख्या [10 6 कोशिकाओं x मिलीलीटर -1]) 15।

आकृति 1
चित्रा 1: digitonin अनुमापन HepG2 कोशिकाओं की permeabilization के लिए इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए। ब्लू लाइन ऑक्सीजन एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है; लाल रेखा ऑक्सीजन का प्रवाह (ऑक्सीजन एकाग्रता की ढलान) का प्रतिनिधित्व करता है। ऑक्सीजन एकाग्रता समय के साथ कम हो जाती है के रूप में कोशिकाओं उपलब्ध ऑक्सीजन का उपयोग करें। ऑक्सीजन की खपत pmol / (कोशिकाओं की संख्या x सेकंड) के रूप में व्यक्त किया जाता है। (ए) उच्च संकल्प respirometry से Tracings mitochondrial जटिल द्वितीय निर्भर श्वसन (1 प्रयोग) के लिए digitonin का उपयोग कर, ADP और सब्सट्रेट के रूप में succinate। 4 अलग-अलग प्रयोगों से (बी) mitochondrial श्वसन दरों प्रस्तुत ± एसडी मतलब है।अपलोड / 54985 / 54985fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Mitochondrial बाहरी झिल्ली अखंडता का मूल्यांकन एक इष्टतम digitonin एकाग्रता का उपयोग

(Mitochondrial जटिल द्वितीय निर्भर आराम की स्थिति 2 बाहरी mitochondrial झिल्ली अखंडता पर इष्टतम digitonin एकाग्रता (8 माइक्रोन) के के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, कोशिकाओं digitonin और mitochondrial बाहरी झिल्ली निष्ठा के साथ कर रहे हैं permeabilized succinate के बाद के अलावा के बाद mitochondrial श्वसन की माप द्वारा परीक्षण किया गया है ADP के अभाव में श्वसन), ADP (ADP जटिल द्वितीय निर्भर राज्य 3 श्वसन) और साइटोक्रोम ग प्रेरित (ADP प्रेरित जटिल साइटोक्रोम ग की उपस्थिति) में द्वितीय-निर्भर राज्य 3 श्वसन, oligomycin के अलावा द्वारा पीछा (एक अवरोध करनेवाला एटीपी synthase) के राज्य 4. नकल करने के लिए चित्रा 2 में दिखाया गया है

चित्र 2
चित्रा 2: साइटोक्रोम सी कोशिकाओं digitonin (8 माइक्रोन) के साथ इलाज के श्वसन वृद्धि नहीं करता है। साइटोक्रोम ग परीक्षण उच्च संकल्प respirometry प्रयोग करने के लिए प्रतिनिधि श्वसन निशान। प्रकोष्ठों 8 माइक्रोन के digitonin और mitochondrial बाहरी झिल्ली निष्ठा के साथ कर रहे हैं permeabilized उपस्थिति में 10 मिमी succinate (राज्य 2), 2.5 मिमी ADP (राज्य 3) और 10 माइक्रोन के साइटोक्रोम ग (राज्य 3 के बाद के अलावा के बाद सांस की दरों की माप द्वारा परीक्षण किया गया है साइटोक्रोम ग), 2 माइक्रोग्राम / एमएल oligomycin राज्य 4. श्वसन दर की नकल करने के अलावा द्वारा पीछा pmol / (सेकंड के रूप में व्यक्त किया जाता है x million कोशिकाओं)। सीआईआई: जटिल द्वितीय। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Mitochondrial बाहरी झिल्ली अखंडता का मूल्यांकन digitonin के एक उच्च एकाग्रता का उपयोग

प्रदर्शित करने के लिए कि digitonin का एक बहुत ही उच्च एकाग्रता mitochondrial बाहरी झिल्ली अखंडता समझौता कर सकते हैं, हम digitonin के एक उच्च खुराक का उपयोग करते हुए एक प्रयोग किया। इस प्रयोग के लिए, कोशिकाओं को 40 माइक्रोन के बजाय digitonin 8 सुक्ष्ममापी, और mitochondrial बाहरी झिल्ली निष्ठा के साथ कर रहे हैं permeabilized succinate के बाद के अलावा के बाद mitochondrial श्वसन की माप द्वारा परीक्षण किया जाता है (mitochondrial जटिल द्वितीय निर्भर आराम कर ADP के अभाव में राज्य 2 श्वसन) , ADP (ADP प्रेरित जटिल द्वितीय निर्भर राज्य 3 श्वसन) और साइटोक्रोम ग (ADP प्रेरित जटिल द्वितीय-डीependent राज्य साइटोक्रोम ग की उपस्थिति में 3 श्वसन), oligomycin की उपस्थिति (चित्रा 3) में राज्य के 4 की नकल करने oligomycin के अलावा द्वारा पीछा किया। इस प्रयोग के परिणाम से पता चलता है कि साइटोक्रोम ग कोशिकाओं digitonin के एक उच्च खुराक के साथ इलाज के श्वसन को बढ़ाता है, mitochondrial बाहरी झिल्ली समझौता mitochondrial बाहरी झिल्ली अखंडता का संकेत से साइटोक्रोम ग का एक नुकसान का संकेत है।

चित्र तीन
चित्रा 3: digitonin की उच्च खुराक (40 माइक्रोन) के mitochondrial बाहरी झिल्ली अखंडता समझौता। सब्सट्रेट के रूप में उपयोग करते हुए succinate respirometry उच्च संकल्प से Tracings। ब्लू लाइन ऑक्सीजन एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है; लाल रेखा ऑक्सीजन का प्रवाह (ऑक्सीजन एकाग्रता की ढलान) का प्रतिनिधित्व करता है। ऑक्सीजन एकाग्रता समय के साथ कम हो जाती है के रूप में कोशिकाओं उपलब्ध ऑक्सीजन का उपयोग करें। ऑक्सीजन की खपत के रूप में व्यक्त किया जाता हैpmol / (सेकंड कोशिकाओं की संख्या x)। 40 माइक्रोन के digitonin, succinate (10 मिमी), ADP (2.5 मिमी), साइटोक्रोम ग (10 माइक्रोन) के और oligomycin (2 माइक्रोग्राम / एमएल) के बाद के अलावा संकेत दिया है। सीआईआई: जटिल द्वितीय। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अधिकतम ADP उत्तेजित श्वसन permeabilized HepG2 कोशिकाओं की (राज्य 3), अतिरिक्त Exogenous substrates का उपयोग

परिसर मैं-, permeabilized HepG2 कोशिकाओं (1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) के द्वितीय और चतुर्थ निर्भर अधिक से अधिक ADP उत्तेजित श्वसन (राज्य 3) सफलतापूर्वक अतिरिक्त बहिर्जात substrates (चित्रा 4) का उपयोग कर मापा जाता है। इस प्रयोग के लिए, कोशिकाओं digitonin और mitochondrial ऑक्सीजन की खपत दर के साथ कर रहे हैं permeabilized में वर्णित के रूप में substrates और अवरोधकों के बाद इसके बाद मापा जाता है

चित्रा 4
चित्रा 4: permeabilized HepG2 कोशिकाओं का अधिक से अधिक ADP उत्तेजित श्वसन (राज्य 3) के सफल माप। श्वसन दर pmol / (सेकंड एक्स मिलियन कोशिकाओं) के रूप में व्यक्त किया जाता है। प्रकोष्ठों 8 माइक्रोन के digitonin और mitochondrial श्वसन दर के साथ permeabilized कर रहे हैं, जटिल मैं, succinate (राज्य 3, जटिल द्वितीय) को बाधित करने के लिए ग्लूटामेट और Malate (राज्य 3, जटिल मैं), rotenone के बाद के अलावा के बाद मापी जाती हैं और जटिल III को बाधित करने antimycin और एस्कॉर्बेट / TMPD और सोडियम azide जटिल चतुर्थ को बाधित करने के लिए। परिसर चतुर्थ श्वसन (राज्य 3)पहले और सोडियम azide के अलावा के बाद ऑक्सीजन की खपत घटाकर से व्याख्या की है। सीआई: जटिल मैं, सीआईआई: जटिल द्वितीय, CIV: जटिल चतुर्थ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अधिकतम ADP उत्तेजित श्वसन की असफल मापन permeabilized HepG2 कोशिकाओं की (राज्य 3)

परिसर मैं-, द्वितीय और चतुर्थ निर्भर अधिक से अधिक ADP उत्तेजित श्वसन permeabilized HepG2 कोशिकाओं (1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) के राज्य (3) को सफलतापूर्वक अतिरिक्त बहिर्जात substrates (चित्रा 5) का उपयोग मापा नहीं है। इस प्रयोग के लिए, कोशिकाओं digitonin और mitochondrial ऑक्सीजन की खपत दर के साथ कर रहे हैं permeabilized चित्रा 5 में वर्णित के रूप में substrates और अवरोधकों के बाद के अलावा के बाद मापा जाता है। चित्रा 5 में दिखाया गया है चित्रा 4 में दिखाया गया है परिणामों की तुलना में। कम हो श्वसन के स्तर के लिए एक संभावित व्याख्या यह पिछले प्रयोगों से mitochondrial अवरोधकों के साथ Oxygraph कक्षों का संक्रमण है। ऐसे antimycin और rotenone के रूप में Mitochondrial अवरोधकों इथेनॉल में घुलनशील होते हैं और Oxygraph कक्षों और stoppers के लिए छड़ी कर सकते हैं। इसलिए Oxygraph कक्षों और stoppers एक प्रयोग के बाद बड़े पैमाने पर धोया जाना चाहिए।

चित्रा 5
चित्रा 5: permeabilized HepG2 कोशिकाओं का अधिक से अधिक ADP उत्तेजित श्वसन (राज्य 3) के असफल माप। जटिल मैं- की एक असफल प्रयोग के प्रतिनिधि श्वसन निशान, द्वितीय और चतुर्थ संचालित उच्च संकल्प respirometry का उपयोग कर permeabilized HepG2 कोशिकाओं का अधिक से अधिक ADP उत्तेजित श्वसन (राज्य 3)। श्वसन दर के रूप में व्यक्त किया जाता हैpmol / (सेकंड एक्स मिलियन कोशिकाओं)। प्रकोष्ठों 8 माइक्रोन के digitonin और mitochondrial श्वसन दर के साथ permeabilized कर रहे हैं, जटिल मैं, succinate (राज्य 3, जटिल द्वितीय) को बाधित करने के लिए ग्लूटामेट और Malate (राज्य 3, जटिल मैं), rotenone के बाद के अलावा के बाद मापी जाती हैं और जटिल III को बाधित करने antimycin और एस्कॉर्बेट / TMPD और सोडियम azide जटिल चतुर्थ को बाधित करने के लिए। परिसर चतुर्थ श्वसन (राज्य 3) पहले और सोडियम azide के अलावा के बाद ऑक्सीजन की खपत घटाकर से व्याख्या की है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बरकरार कोशिकाओं के युग्मित और uncoupled श्वसन

HepG2 कोशिकाओं 'बेसल ऑक्सीजन की खपत oligomycin (oligomycin-असंवेदनशील श्वसन) और FCCP के अनुक्रमिक अलावा (चित्रा 6) की उपस्थिति में मापा जाता है। Basaएल सेलुलर श्वसन दर अंतर्जात सेलुलर substrates की उपस्थिति में बरकरार HepG2 कोशिकाओं की ऑक्सीजन की खपत का प्रतिनिधित्व करता है और सेलुलर एटीपी की मांग के जवाब में बदल सकते हैं। Oligomycin-असंवेदनशील श्वसन दर सेलुलर श्वसन और oligomycin के प्रति संवेदनशील श्वसन दर जो सेलुलर एटीपी कारोबार का प्रतिनिधित्व करता है और बेसल अंतर्जात श्वसन दर से oligomycin-असंवेदनशील श्वसन दर घटाकर की जाती है रिसाव का प्रतिनिधित्व करता है। रासायनिक FCCP uncoupler क्रमिक रूप से अलग सांद्रता और अधिक से अधिक uncoupled श्वसन दर्ज की गई पर जोड़ा जाता है। अधिक से अधिक mitochondrial uncoupled श्वसन दर (अधिक से अधिक इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली की क्षमता) इस प्रयोगात्मक हालत के लिए 0.9-1.2 माइक्रोन के FCCP पर प्राप्त की है। परिणाम बरकरार HepG2 कोशिकाओं में FCCP की एक biphasic सक्रियता दिखाई। इसलिए, प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए, FCCP अधिक से अधिक uncoupled श्वसन दर प्राप्त करने के लिए titrated है। uncoupled श्वसन नियंत्रण अनुपात (uRCR) FCCP विभाजित करके गणना की हैoligomycin की उपस्थिति में श्वसन की दर से uncoupled श्वसन दर। Oligomycin के प्रति संवेदनशील श्वसन (एटीपी कारोबार) oligomycin-असंवेदनशील बेसल अंतर्जात श्वसन से श्वसन दर घटाकर की जाती है। दक्षता जो एटीपी के संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया mitochondrial ऑक्सीजन की खपत के अनुपात में प्रतिनिधित्व बेसल श्वसन दर से oligomycin के प्रति संवेदनशील श्वसन दर विभाजित करके गणना की है युग्मन। प्रयोग के अंत में, गैर mitochondrial श्वसन दर प्राप्त करने के लिए, mitochondrial इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला अवरोधकों जोड़ रहे हैं और गैर-mitochondrial श्वसन दर सभी परिणामों से घटाया जाता है। प्रयोग 6 चित्र में दिखाया के लिए, गैर mitochondrial श्वसन दर 26 pmol / (सेकंड एक्स मिलियन कोशिकाओं), बेसल श्वसन दर 48 pmol / (सेकंड एक्स लाख कोशिकाओं) है, oligomycin-असंवेदनशील श्वसन दर 7 pmol / (सेक एक्स मिलियन कोशिकाओं), oligomycin के प्रति संवेदनशील श्वसन (एटीपी कारोबार) 41 pmol / (सेकंड एक्स मिलियन कोशिकाओं) और Couplinजी दक्षता 0.85।

चित्रा 6
चित्रा 6: युग्मित और बरकरार कोशिकाओं के uncoupled श्वसन। HepG2 कोशिकाओं 'बेसल ऑक्सीजन की खपत के प्रतिनिधि श्वसन निशान oligomycin (oligomycin-असंवेदनशील श्वसन) और FCCP के अनुक्रमिक इसके अलावा उच्च संकल्प respirometry का उपयोग कर की उपस्थिति में मापा जाता है। इसके बाद, एक बार एक स्थिर संकेत तक पहुँच जाता है, श्वसन rotenone और antimycin एक के अलावा और शेष पृष्ठभूमि श्वसन (गैर mitochondrial श्वसन) सभी परिणामों से घटाया जाता है साथ हिचकते हैं। ऑक्सीजन की खपत pmol / (कोशिकाओं की संख्या x सेकंड) के रूप में व्यक्त किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

श्वसन बफर 13
रासायनिक एकाग्रता
सुक्रोज 110 मिमी
EGTA 0.5 मिमी
2 MgCl 3.0 मिमी
KCl 80 मिमी
कश्मीर lactobionate 60 मिमी
के.एच. 2 4 पीओ 10 मिमी
बैल की तरह 20 मिमी
Hepes 20 मिमी
बीएसए 1.0 ग्राम / एल
पीएच 7.1

तालिका 1: श्वसन बफर की संरचना है।

Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य उच्च संकल्प respirometry का उपयोग करने के mitochondrial श्वसन श्रृंखला परिसरों '(मैं-चतुर्थ) श्वसन दर, अधिक से अधिक mitochondrial इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली की क्षमता और mitochondrial बाहरी झिल्ली अखंडता को मापने के लिए किया गया था।

वहाँ वर्तमान प्रोटोकॉल के भीतर कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सबसे पहले, सेलुलर ऑक्सीजन की खपत दर आम तौर पर कोशिकाओं की संख्या के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं (pmol / [कोशिकाओं की संख्या x सेकंड])। इसलिए, सेलुलर ऑक्सीजन की खपत की निगरानी से पहले, यह महत्वपूर्ण है कि एक डिवाइस कोशिकाओं की संख्या की सही और विश्वसनीय माप सक्षम बनाता का उपयोग करने के लिए है। वर्तमान प्रोटोकॉल में एक स्वचालित सेल काउंटर (कदम प्रोटोकॉल और सामग्री की तालिका के 3.7) का इस्तेमाल किया गया है। एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम है, खासकर permeabilized कोशिकाओं में, जिसमें permeabilized कोशिकाओं (कदम प्रोटोकॉल का 3.6) resuspended हैं श्वसन बफर का विकल्प है। सेलुलर permeabilization intracellula की हानि पैदा कर सकते हैं के बाद सेआर आयनों, यह बहुत महत्वपूर्ण है कि permeabilization के दौरान इस्तेमाल मध्यम intracellular पर्यावरण के साथ संगत है। इसलिए, श्वसन बफर एक संरचना और परासारिता जो दोनों intracellular और बाह्य वातावरण (तालिका 1) 13 दर्शाता शामिल करना चाहिए। इसके अलावा, इष्टतम और प्रभावी सेलुलर permeabilization के लिए, यह महत्वपूर्ण है न केवल प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए बल्कि प्रत्येक कोशिका घनत्व के लिए एकाग्रता digitonin titrate करने के लिए, अपने इष्टतम और सबसे कम प्रभावी एकाग्रता की पहचान है। अगर digitonin एकाग्रता बहुत कम है, कोशिकाओं permeabilized नहीं किया जाएगा। इसके विपरीत, digitonin की बड़ी मात्रा के लिए कोशिकाओं के जोखिम mitochondrial बाहरी झिल्ली को नुकसान होगा। इसलिए, एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु mitochondrial बाहरी झिल्ली अखंडता की जांच करने के लिए है। आदेश सेलुलर सांस की क्षमता कम करने के लिए नहीं, यह भी महत्वपूर्ण है कि respirometry प्रयोगों एक शारीरिक तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं (37 डिग्री सेल्सियस)। एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु पर विचार करने के permeabilized कोशिकाओं और पर्याप्त सब्सट्रेट के स्तर में ऑक्सीजन अधिक से अधिक श्वसन प्रवाह प्राप्त करने के लिए बनाम ADP के प्रसार सीमा की वजह से ADP की मात्रा को संतृप्त, का उपयोग है। permeabilized कोशिकाओं में कुछ प्रयोगों में, यह बहिर्जात substrates की है कि इसके अलावा हो सकता है और ADP श्वसन की दर में काफी वृद्धि करने के लिए नेतृत्व नहीं करता है। यह कई कारकों की वजह से हो सकता है। उदाहरण के लिए, digitonin की उच्च सांद्रता का उपयोग कोशिकाओं permeabilize के mitochondrial बाहरी झिल्ली को नुकसान पहुंचा सकता है। इसलिए, एक digitonin titrate प्रत्येक कोशिका प्रकार और घनत्व के लिए इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए करना चाहिए। इसके अलावा, digitonin की पवित्रता भी बहुत महत्वपूर्ण है, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध digitonin सेलुलर permeabilization के लिए उनके इष्टतम सांद्रता निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए titrated पवित्रता और खरीदा digitonin के नए बैच में काफी भिन्न हो सकते है। इसके अलावा, वहाँ ताकना बनाने सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली के कई प्रकार हैंविभिन्न गुणों के साथ एजेंटों। उदाहरण के लिए, सैपोनिन digitonin से एक मामूली डिटर्जेंट है, और सेल के प्रकार पर निर्भर करता है, एक उचित सेल permeabilization अभिकर्मक चयन किया जाना चाहिए।

mitochondrial ऐसे rotenone antimycin एक के रूप में respirometry assays में इस्तेमाल समारोह की सबसे निरोधक, केवल इथेनॉल में घुलनशील होते हैं और Oxygraph कक्षों और stoppers से चिपके रहते हैं, सेलुलर श्वसन बाधा। इस समस्या से बचने के लिए, Oxygraph कक्षों और stoppers प्रत्येक परख के बाद 95% इथेनॉल के साथ बड़े पैमाने पर धोया जाना चाहिए। एक अन्य महत्वपूर्ण बात पर विचार करना है कि दोनों बरकरार है और permeabilized सेलुलर श्वसन assays के लिए, सेल घनत्व, प्रकार और सेल संस्कृति संगम सांस की दरों को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, HepG2 कोशिकाओं के साथ, हम आम तौर पर चैम्बर प्रति 1 से 2 लाख करने के लिए कोशिकाओं के एक सेल घनत्व का उपयोग करें। respirometry के दौरान बहुत कम सेल घनत्व का प्रयोग एक बहुत कमजोर संकेत को जन्म दे सकते हैं। हम यह भी कहा है कि सेल संस्कृति confluency सांस की दरों को प्रभावित कर सकता है। EXA के लिएmple, जब HepG2 कोशिकाओं को बहुत मिला हुआ बड़े हो रहे हैं (100 से अधिक%), वे बहुत कम ऑक्सीजन खपत करते हैं।

प्रयोगों के दौरान एक स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ऑक्सीजन प्रवाह प्राप्त करने के लिए, एक और महत्वपूर्ण मुद्दे पर विचार करने के लिए उच्च संकल्प respirometry instrument- यानी, polarographic ऑक्सीजन सेंसर झिल्ली और वाद्य पृष्ठभूमि सुधार के नियमित आदान-प्रदान के रखरखाव है। uncoupler FCCP के साथ प्रयोगों के लिए, यह कोशिकाओं को FCCP की है कि इसके अलावा प्रोत्साहित नहीं करता सेलुलर श्वसन और अधिक से अधिक प्रवाह प्राप्त नहीं है, लेकिन इसके बजाय सेलुलर श्वसन हिचकते है हो सकता है। FCCP के अलावा पर सेलुलर ऑक्सीजन की खपत का निषेध का संकेत हो सकता है कि FCCP एकाग्रता इष्टतम नहीं था और बहुत अधिक थी। इन प्रयोगों के लिए, प्रत्येक परख के लिए, यह जरूरी है सावधानी FCCP एकाग्रता titrate करने के लिए अधिक से अधिक प्रवाह प्राप्त करने के लिए है।

उच्च संकल्प respirometry की एक सीमा है कि उच्च throughput स्क्रीनिंग की स्थापना हैखुराक प्रतिक्रिया घटता है और जैविक नमूने की सीमित मात्रा के लिए समय पाठ्यक्रम प्रयोगों संभव नहीं हैं। इन assays के लिए, एक ऐसे बाह्य प्रवाह विश्लेषक के रूप में अन्य उपकरणों, उपयोग कर सकते हैं। अन्य सीमाओं i) डिवाइस स्वचालित नहीं कर रहे हैं और एक ऑपरेटर की निरंतर उपस्थिति की आवश्यकता है, ii) यह समय लगता है, iii) यह एक समय में चलाया जा सकता है केवल दो कक्षों और केवल दो assays है, चतुर्थ) साधन के रखरखाव है , इस तरह की झिल्ली और calibrations बदलने के रूप में, समय की बहुत आवश्यकता है और v) कक्षों एकल उपयोग नहीं कर रहे हैं और अवरोधकों के साथ दूषित हो सकता है। पारंपरिक polarographic ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड उपकरणों से अधिक उच्च संकल्प Oxygraph के फायदे i) उच्च संवेदनशीलता, द्वितीय) जैविक नमूने की छोटी संख्या की आवश्यकता है, iii) सांस की दरों में एक साथ दो कक्षों में मापा जा सकता है और चतुर्थ) डिवाइस ऑक्सीजन रिसाव कम हो गया हैं। बाह्य प्रवाह विश्लेषक से अधिक उच्च संकल्प Oxygraph के कुछ लाभ i) के निचले खर्च कर रहे हैंडिवाइस और उपभोग्य और द्वितीय) सब्सट्रेट-uncoupler-अवरोध अनुमापन प्रोटोकॉल की व्यवहार्यता।

इस तकनीक के माहिर के बाद भविष्य अनुप्रयोगों या निर्देश कोशिकीय श्वसन mitochondrial झिल्ली क्षमता का एक साथ माप, एच 22, एक ही कक्ष में ऑप्टिकल सेंसर का उपयोग एटीपी और कैल्शियम का स्तर।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma A 4386 Chemical
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate Merck 1.00127 Chemical
BSA Sigma A 6003 Chemical
FCCP Sigma C 2920 Chemical, dissolve in ethanol
Countess automated cell counter  Thermo Fisher Scientific n/a Automated cell counting instrument
Cytochrome c Sigma C 7752 Chemical
Digitonin Sigma D 5628 Chemical, dissolve in DMSO
DMEM Gibco 31966021 Medium
EGTA fluka 3779 Chemical
FBS Gibco 26010-074 Medium component
Glutamate Sigma G 1626 Chemical
Hepes Sigma H 7523 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
KH2PO4 Merck 1.04873 Chemical
K-lactobionate Sigma L 2398 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k  Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
Oligomycin Sigma O 4876 Chemical, dissolve in ethanol
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122 Chemical
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical
Trypsin Sigma T 4674 Chemical

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References

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