De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

Biology
 

Summary

respirometria de alta resolução é usado para determinar o consumo de oxigênio mitocondrial. Esta é uma técnica simples para determinar mitocondrial complexos da cadeia respiratória "(I-IV) taxa respiratória, capacidade mitocondrial máxima do sistema de transporte de elétrons e de integridade mitocondrial externa da membrana.

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Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J. Vis. Exp. (120), e54985, doi:10.3791/54985 (2017).

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Abstract

Introduction

As mitocôndrias desempenham papéis importantes no metabolismo da energia celular, especialmente através da utilização de oxigénio para a produção de trifosfato de adenosina (ATP). Eles são implicados na morte de células e em várias doenças humanas. fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) combina transporte de elétrons ao longo da cadeia de transporte de elétrons com o consumo de oxigênio e síntese de ATP. O ciclo mitocondrial tricarboxílico (TCA) está envolvido na conversão de proteínas, hidratos de carbono e gorduras, em compostos ricos em energia como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) e flavina adenina dinucleótido (FADH 2). Os electrões do NADH e FADH2, em seguida, são transferidos para os complexos de proteína de transporte de electrões da cadeia respiratória (I a IV) localizado na membrana mitocondrial interna. Além disso, dois outros percursos redox pode transferir electrões para corrente de transporte: i) mitocondrial de electrões transferência flavoproteína (FEF), que está localizado na face da matriz interior Mitomembrana condral, e fornece elétrons de ácidos graxos β-oxidação; e ii) glicerofosfato desidrogenase mitocondrial que oxida glicerofosfato de fosfato de dihidroxiacetona e alimenta elétrons para a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial. IV Complex (o receptor de elétrons final) transfere os elétrons a uma molécula de oxigênio, convertendo oxigênio para duas moléculas de água. Movendo dos electrões do complexo cadeia de transporte electrónico respiratório I a IV é acoplado com o fluxo de protões a partir da matriz mitocondrial para o espaço intermembranar que estabelece um gradiente electroquímico através da membrana interna mitocondrial. Depois, mitocondrial complexo V (ATP sintase) transporta os íons de hidrogênio de volta para a matriz mitocondrial e sintetiza moléculas de ATP. OXPHOS função pode ser avaliada in vivo e in vitro utilizando várias técnicas e vários estados da respiração mitocondrial pode ser obtido. Em mitocôndrias isoladas a seguinte influencestados Ry pode ser medido: i) basal respiração mitocondrial (estado 1), ii) o consumo de oxigénio após a adição de substratos específicos dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (estado 2), iii) o consumo de oxigénio mitocondrial máxima após a adição de concentrações saturantes de difosfato de adenosina (ADP) (estado 3) e, iv) a respiração de repouso após o consumo de ADP (convertido em ATP) (estado 4). Em células intactas as seguintes estados respiratórios podem ser medidos: i) consumo de oxigénio celular basal, na presença de substratos endógenos e ADP, ii) o consumo de oxigénio celular basal, na presença de oligomicina (oligomicina-insensível respiração) e oligomicina-sensível respiração (ATP volume), iii) FCCP respiração desacoplado, e iv) a respiração não-mitocondrial após a adição de antimicina a e rotenona. Em células permeabilizadas, podem ser adicionados os substratos específicos dos complexos de cadeia de transporte electrónico e máximas de ADP e dependente de complexos s taxas respiratóriasuch I- tão complexo, II- e respiratória IV-dependentes podem ser medidos.

As medições da respiração celular fornecem importantes insights sobre a capacidade respiratória mitocondrial específico para complexos I-IV, integridade mitocondrial eo metabolismo 1, 2, 3 energia. Um dos dispositivos que permitem que as medições de consumo de oxigénio mitocondrial com alta precisão, sensibilidade e resolução é o oxygraph de alta resolução 4. O dispositivo de alta resolução oxygraph contém duas câmaras com as portas de injecção e cada câmara está equipada com um sensor de oxigénio polarográfica. suspensões mitocondriais celulares ou isoladas são agitados continuamente no respirometer. Para avaliar a função mitocondrial, substratos e inibidores de atividade complexa mitocondrial podem ser adicionados de acordo com protocolos padrão. Os substratos e inibidores pode ser titulado por injecção into as câmaras do oxygraph, e as taxas de consumo de oxigênio são calculados usando o software e expressa como picomoles por segundo por número de células. De alta resolução ventilometria oferece várias vantagens sobre dispositivos eletrodo de oxigênio polarographic tradicionais e convencionais, incluindo aumento da sensibilidade ea capacidade de trabalhar com um pequeno número de amostras biológicas, tais como células intactas ou permeabilizadas. Além disso, cada dispositivo contém duas câmaras, e taxas respiratórias podem ser gravados simultaneamente para as comparações das concentrações de oxigénio. O oxygraph de alta resolução, também tem a vantagem de redução das fugas de oxigénio a partir das câmaras do dispositivo em relação aos dispositivos de eléctrodos de oxigénio polarográficos tradicionais. Outro dispositivo recentemente desenvolvido para medir o consumo de oxigênio celular é a de 96 poços analisador de fluxo extracelular 5. O analisador de fluxo extracelular está equipado com sensores de fluorescência em vez de polarografia. As vantagens da extracelularanalisador de fluxo em comparação com o oxygraph de alta resolução são i) é em grande parte um dispositivo automatizado, ii), é possível medir o consumo de oxigénio em 24 e placas de 96 poços para rastreio de elevado rendimento, necessitando de menores quantidades de amostras biológicas, e iii) medição adicional do fluxo glicolítico celular é possível. As desvantagens do analisador de fluxo extracelular em comparação com o oxygraph de alta resolução são: i) os elevados custos do dispositivo e de bens de consumo, tais como placas fluorescentes, que são não reutilizáveis, e ii) apenas quatro compostos por ensaio / poço são injectável , por conseguinte, o sistema não é praticável para protocolos de titulação substrato-desacoplador-inibidor.

No presente estudo, utilizamos de alta resolução respirometria para determinar respiração mitocondrial. Para as experiências de consumo de oxigénio celulares, as células são permeabilizadas para permitir a entrada de ADP exógeno e mitocondriais substratos oxidáveis ​​para a alimentação de electrões em complexes do sistema respiratório. Esta abordagem permite a dissecção de complexos mitocondriais individuais capacidades respiratórias, o que é uma vantagem distinta em relação a células intactas (muitos substratos são de célula-impermeabilizante). No entanto, a permeabilização da membrana celular irá perturbar a barreira entre o citosol e o espaço extracelular e forma (lavagem de solutos citosólicas) e a composição do espaço intracelular é equilibrada com o meio extracelular. Uma das desvantagens de células permeabilizadas sobre células intactas é que a membrana mitocondrial externa pode ser danificado se quantidades excessivas de detergente são empregues durante a permeabilização celular. Em células intactas, basal, respiração das células intactas acoplado e desacoplado pode ser medido. Este método avalia o consumo de oxigénio de células intactas sem a adição de substratos exógenos e ADP, que reproduz a função respiratória na célula integrado e também fornecer informação sobre máxima transpo de electrões mitocondrialcapacidade rt 6, 7. Uma das vantagens de células intactas sobre células permeabilizadas é que ambiente celular não é interrompido e as mitocôndrias são em contacto com toda a componentes das células. A fim de permeabilizar a membrana plasmática celular, tais como detergentes digitonina foram utilizados 8. No entanto, a integridade da membrana exterior mitocondrial pode ser comprometida se são empregues quantidades excessivas de digitonina. Para confirmar que a integridade da membrana mitocondrial externa não está comprometida em células permeabilizadas, a titulação é efectuada de digitonina para determinar a concentração óptima para permeabilização celular. Para estas experiências, as células são ressuspensas em meio de respiração e concentração de digitonina é titulado por ventilometria na presença de substratos mitocondriais e ADP, e taxas respiratórias são medidos. Respiração de células intactas, não-permeabilizadas não é estimulado na presença de mitochondrial substratos e ADP. No entanto, a titulação subsequente digitonina gradual renderia permeabilização gradual de membranas de plasma, e a concentração óptima é obtida digitonina. Isto é mostrado pelo aumento da respiração até permeabilização completo. Mitocondrial qualidade e integridade da membrana externa pode ser verificada por adição exógena citocromo c 2, nove. Citocromo c é uma proteína transportando 12 elétrons kDa da cadeia mitocondrial de transporte de elétrons 10, 11, 12. Ele está localizado no espaço intermembranar mitocondrial, e está envolvido no consumo de oxigénio, transportar electrões do complexo III a IV complexo. Uma vez que a membrana mitocondrial externa está danificado, citocromo c é liberado, e o consumo de oxigénio é reduzida mitocondrial. Após a adição de citocromo c exógeno, qualquer aumento na respiração mitocondrial é indicativo de uminterrompido membrana mitocondrial externa.

Em células permeabilizadas, substratos e inibidores da actividade do complexo mitocondrial são adicionados seguindo vários protocolos de 3, 9. Por exemplo, a fim de investigar as taxas respiratórias-driven complexos mitocondriais, o protocolo seguinte pode ser usado. Após a permeabilização das células, o primeiro complexo I é estimulada pela malato substratos e glutamato, os quais geram o NADH como um substrato para a cadeia respiratória e provocam a activação do complexo I. Em seguida, o ADP é adicionado para a conversão de ATP (estado 3, activa complexo I-dependente respiração). Depois de um sinal estável seja alcançado, rotenona (complexo I mitocondrial inibidor) é administrado para inibir complexo I. rotenona é seguido por succinato de FADH 2 e para activar o complexo II (estado 3, activa complexo respiração II-dependentes). A fim de medir a respiração dependente do complexo IV, primeiro complexo IIIrespiração -dependente é inibida pela adição de antimicina A (inibidor mitocondrial complexo III). Em seguida, a respiração complexo dependente de IV é estimulado através da administração de ascorbato e tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD pode auto-oxidam no buffer de respiração, por conseguinte, a taxa de respiração máxima complexo dependente de IV (estado 3) é calculada subtraindo-se as taxas respiratórias antes e depois da adição de azida de sódio, um inibidor do complexo mitocondrial IV. As experiências de respiração pode ser levada a cabo em duas câmaras de um oxygraph em paralelo um servindo como um controlo (células não estimuladas), o outro contendo as células estimuladas. Obviamente, as células podem ser pré-tratados de várias maneiras, por exemplo, com drogas que afectam funções mitocondriais, antes de o seu consumo de oxigénio é medida na câmara de oxygraph. Este protocolo permite o exame funcional dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial individuais. Além disso, pode-se medir a ADP-estimulada máximarespiração (estado 3) de células permeabilizadas, utilizando ácido gordo exógeno sob a forma de palmitato. Neste protocolo, as ações concentradas de palmitato de sódio são conjugados com ácido graxo de ultra albumina do soro bovino livre (BSA) (6: 1 proporção molar de palmitato: BSA). Em seguida, as células são primeiro permeabilizadas com digitonina e a respiração mitocondrial é avaliada pela adição de carnitina e ácido palmítico, seguido pela adição de ADP (estado 3, respiração máxima). Então, oligomicina é adicionado para imitar o estado 4 (estado 4o) e índice de controlo respiratório (valor RCR) é calculado como o estado 3 / estado 4o. β-oxidação promove a produção de acetil-CoA (que entra no ciclo do TCA) e geração de FADH 2 e NADH, os electrões dos quais são passados para a cadeia de transporte de electrões por flavoproteína de transferência de electrões e β-hidroxiacil-CoA-desidrogenase. As mitocôndrias são colocados no centro do metabolismo do ácido gordo e descrito protocolo palmitato-BSA pode ser usado por investigadores examinam gorduraa oxidação de ácidos Ty. Em células intactas, ativadores e inibidores da actividade do complexo mitocondrial são adicionados na sequência de um protocolo diferente 6, 9. Para estas experiências, primeiro o consumo de oxigénio de células não-permeabilizadas, na ausência de substratos exógenos é medido (fosforilar taxa de respiração). Em seguida, a taxa de respiração de não-fosforilação é medida após a adição de oligomicina, que é um inibidor da ATP sintase mitocondrial. Em seguida, o cianeto de carbonilo protonophore p-Trifluormetoxifenilidrazona (FCCP) é administrado em várias concentrações e a taxa respiratória mitocondrial desacoplada máxima é medida. Protonophores tais como FCCP pode induzir um aumento na permeabilidade de protões da membrana interior, permitindo o movimento passivo de protões para dissipar o gradiente quimiosmótica. Um aumento na permeabilidade de protões desacopla respiração oxidativo (sem a produção de ATP) e induz um aumento na óconsumo xygen. Depois, rotenona e antimicina A são adicionados para inibir a respiração mitocondrial, e a respiração mitocondrial não é subtraída de todas as outras taxas respiratórias.

As taxas de consumo de oxigénio pode ser expresso como 2 IO [pmol x seg-1 x 10 células -6] (fluxo de oxigénio por milhão de células) que é calculado dividindo-se o fluxo de oxigénio específicos do volume (em oxigénio na câmara fechada), JV, ó 2 [pmol x seg -1 x ml-1], através da concentração de células na câmara de células (número de células por volume [10 6 células ∙ ml 1]) 15. Cell-massa fluxo de oxigênio específico, JO 2 [pmol x seg -1 x mg -1], é o fluxo por célula, IO 2 [pmol x seg -1 x 10 -6 células], divididos em massa por célula [mg ∙ 10 6 células]; ou específicos de volume de fluxo, JV, O 2 [pmol x seg -1 x ml -1], dividido por massa por volume [mg ∙ ml 1]. JO 2 é o fluxo de oxigénio por proteína de células, peso seco ou volume celular.

No presente estudo, usando alta resolução ventilometria, que descrevem protocolos para determinar i) concentração óptima de digitonina para completa a permeabilização da membrana do plasma celular (ensaio de titulação de digitonina), ii) a integridade mitocondrial externa da membrana utilizando exógeno citocromo c, iii) complexos da cadeia respiratória mitocondrial I , II e IV as taxas respiratórias máximas em células HepG2 permeabilizadas-digitonina, na presença de ADP exógeno e substratos da cadeia respiratória mitocondrial, e iv) basal, acoplado e máxima respiração desacoplado (capacidade de transporte de electrões máxima) de células intactas sem a adição de substratos exógenos e ADP, que reproduz a função respiratória na célula integrado.

Protocol

Cultura 1. celular

  1. Células de cultura de hepatoma humano HepG2 6 em 25 centímetros 2 frascos de cultura de células em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro inactivado por calor de bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C numa incubadora (5% de CO 2, 95% de ar) (densidade de sementeira: 1 X 10 6 células por balão de cultura de 25 centímetros de células 2, tempo de incubação na incubadora a 37 ° C: 48 horas, a densidade celular em confluência: 4-5 x 10 6 culas por 25 cm garrafa de cultura de 2 célula).
  2. Executar as experiências quando as células são de 90% a 95% confluentes.

2. High-resolution Respirometria calibração de sensores de oxigênio Polarográfico

  1. Pipetar 2,1 ml de tampão de respiração numa câmara de oxygraph e agita-se o tampão continuamente usando uma barra de agitação magnética presente na câmara (700 rpm) a 37 ° C durante 1 h até que um sinal de fluxo de oxigénio estávelo sensor de oxigénio é obtido polarográfica.
    NOTA: eletrodos de oxigênio Polarográfico dentro de cada concentração medida de oxigénio câmara oxygraph e calcular o consumo de oxigênio (fluxo) dentro de cada câmara. A concentração de oxigénio e as taxas de consumo de oxigênio (de fluxo) são exibidos em tempo real on-line em um computador utilizando o software para aquisição e análise de dados.
  2. Executar uma calibração de ar do sensor de oxigénio polarográfico de acordo com os protocolos do fabricante 14.
    NOTA: A calibração de sensores de oxigênio polarográficos em media respiração e concentração de oxigênio nos meios de comunicação na saturação do ar temperatura experimental é realizada apenas uma vez por dia no período da manhã. Depois, os meios de comunicação pode ser removido das câmaras e as células ressuspensas em meios frescos respiração são adicionados a uma câmara de oxygraph e taxas respiratórias são medidos. Após a primeira experiência, a câmara pode ser lavada e uma série adicional de experiências pode ser realizada em tele mesma câmara sem mais calibrações.

3. A tripsinização de células aderentes, contagem de células

  1. No dia da experiência, aspirar o DMEM a partir do balão de cultura de 25 centímetros de células 2.
  2. Lavar a monocamada de cultura de células no frasco de cultura com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
  3. Pipetar 0,5 ml de 25 mg / ml de solução de tripsina (pré-aquecido a 37 ° C num banho de água a 37 ° C) na monocamada de células no recipiente de cultura e incuba-se durante 5 min a 37 ° C num CO incubadora (5% 2 , 95% de ar).
  4. Pipetar 5 ml de DMEM contendo FBS a 10% para as células destacadas do frasco de cultura de células e suspender as células por pipetagem.
  5. Transferência de células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar novamente suspensas durante 5 min a 350 xg à temperatura ambiente e decanta-se o sobrenadante.
  6. Ressuspender o sedimento celular em 1 ml de tampão de respiração 13 (T abela 1).
  7. i> Contar as células utilizando um contador de células e ressuspender-los em tampão de respiração para uma densidade final de 1 x 10 6 células / ml. Como as taxas de respiração celular será normalizado ao número de células, contar as células com um contador de células exato e preciso.

4. High-resolution Respirometria

  1. Depois de calibração do ar (realizada apenas uma vez por dia, as etapas de 2,1-2,2), aspirar o meio a partir de uma câmara de respiração do oxygraph e adicionar 2,1 ml de suspensão de células (1 X 10 6 células / ml) a partir do passo 3.7 para a câmara.
  2. Fechar a câmara de oxygraph por inserção da rolha.
  3. Agita-se continuamente as células com uma barra de agitação magnética presente na câmara (700 rpm) a 37 ° C e gravar a respiração celular durante 5-10 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.
    NOTA: A concentração de oxigênio e sinal de fluxo de oxigênio são exibidos em tempo real on-line em um computador utilizando o software para aquisição e análise de dadoss = "xref"> 14.
  4. Em seguida, injectar substratos e inibidores para a respiração mitocondrial através dos orifícios de injecção de titânio das rolhas, utilizando os seguintes protocolos.

5. Digitonin titulação em células intactas por Respirometria

  1. Prepara-se uma suspensão de células contendo oxygraph câmara (1 x 10 6 / ml) seguindo o processo descrito nos passos 4.1 a 4.3 do protocolo.
  2. Injectar 2 ul de rotenona 0,2 mM (0,2 uM) 'CUIDADO "para dentro da câmara oxygraph contendo suspensão de células através da porta de injecção de titânio da rolha de câmara usando uma seringa e gravar a respiração celular durante 5-10 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é conseguido .
    NOTA: Todas as injeções nas seguintes etapas são realizadas através dos portos de injeção de titânio de rolhas usando seringas. A adição de rotenona é opcional (que evita o fluxo de electrões reversa) e pode ser omitida no caso de experiências de titulação digitonina, verpasso 6.3.
  3. Injecte 20 ul de succinato 1 M (10 mM) para a câmara de oxygraph e gravar a respiração celular durante 5-10 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.
  4. Injectam-se 10 ul de 0,5 M de ADP (2,5 mM) para a câmara de oxygraph e gravar a respiração celular durante 5-10 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.
  5. Injectar 2 ul de digitonina 2 mM (2 mM) para a câmara de oxygraph e gravar a respiração celular para 2-5 min, até que um sinal de oxigénio estável é alcançada.
  6. Novamente injectar 2 ul de 2 mM de digitonina para dentro da câmara oxygraph e gravar a respiração celular para 2-5 min, até que um sinal de oxigénio estável é alcançada.
    NOTA: adição gradual de digitonina para as células irá induzir um aumento no consumo de oxigénio celular e o sinal de fluxo de oxigénio irá aumentar.
  7. Continuar injectando 2-4 ul de 2 mM stepwise digitonina (2-4 uM em cada passo) para dentro da câmara. Após cada etapa, registrar a respiração celular para 2-5 maté que é alcançado um sinal de fluxo de oxigénio estável.
    NOTA: Pare de injetar digitonina quando o sinal de fluxo de oxigênio atinge um nível máximo e mais injecções de digitonina não aumentam a taxa de respiração. Os leitores devem determinar a concentração de digitonina ideal em seus laboratórios usando seus próprios reagentes e uso obtidos concentração ideal digitonina nos passos 6.2 e 7.2 dos seguintes protocolos para seus experimentos.

6. Avaliação da integridade de membrana mitocondrial externa: citocromo C

  1. Prepara-se uma suspensão de células contendo oxygraph câmara (1 x 10 6 / ml) seguindo o processo descrito nos passos 4.1 a 4.3 do protocolo.
  2. Injectar 2 ul de digitonina mM de oito (8 uM) para a câmara de oxygraph contendo a suspensão de células (1 x 10 6 / ml) e permeabilizar as células durante 5 min.
  3. Injecte 20 ul de succinato 1 M (10 mM) para a câmara de oxygraph e gravar Respirat celularde iões para 5-10 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.
  4. Injectam-se 10 ul de 0,5 M de ADP (2,5 mM) para a câmara de oxygraph e gravar a respiração celular durante 5-10 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.
    NOTA: A adição de ADP para as células irão estimular complexo I e induzir um aumento no consumo de oxigénio, e o sinal de fluxo de oxigénio irá aumentar e estabilizar.
  5. Injectar 5 ul de 4 mM de citocromo c (10 pM) para a câmara de oxygraph e gravar a respiração celular durante 5-10 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.
  6. Finalmente injectar 1 ml de 4 mg / ml de oligomicina (2 ug / ml) e gravar a respiração celular até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.

7. máxima do ADP estimulado Respiração (estado 3) de células permeabilizadas HepG2

  1. Prepara-se uma suspensão de células contendo oxygraph câmara (1 x 10 6 / ml) seguindo o processo descrito nos passos 4.1 a 4.3 do protocolo.
  2. Injectar 2 ul de digitonina mM de oito (8 uM) para a câmara de oxygraph contendo a suspensão de células e permeabilizar as células durante 5 min.
  3. Injectar 12,5 ul de 0,8 M de malato (5 mM) e 10 ul de 2 M de glutamato (10 mM) para a câmara de oxygraph. respiração celular da ficha, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.
  4. Injectam-se 10 ul de 0,5 M de ADP (2,5 mM) para a câmara de oxygraph e gravar a respiração celular até que os sinais de fluxo de oxigénio aumenta e estabiliza.
    NOTA: A adição de ADP às células irá induzir um aumento no consumo de oxigénio e o sinal de fluxo de oxigénio irá aumentar.
  5. Injectar 2 ul de rotenona 0,2 mM (0,2 M) "CUIDADO" para a câmara oxygraph e registrar a respiração celular até que as diminuições de sinal de fluxo de oxigênio e estabiliza.
  6. Em seguida, injectar 20 jil de um succinato H (10 mM) para a câmara de oxygraph gravar e até que a respiração celular sinal aumenta o fluxo de oxigénioe estabiliza.
  7. Em seguida, injetar 2 mL de 5 mM antimicina A (5 M) "CUIDADO" para a câmara oxygraph e registrar a respiração celular até que as diminuições de sinal de fluxo de oxigênio e estabiliza.
  8. Em seguida, injectam 2,5 ul de ascorbato 0,8 mM (1 mM) e imediatamente após a injecção 2,5 ul de TMPD 0,2 mM (0,25 mM) para a câmara de oxygraph e gravar a respiração celular até que os sinais de fluxo de oxigénio aumenta e estabiliza.
  9. Finalmente Injectam-se 10 ul de azida de sódio 1 M (5 mM) "CUIDADO" para dentro da câmara oxygraph e gravar a respiração celular até que as diminuições de sinal de fluxo de oxigénio e estabiliza.

8. Consumo de Oxigênio de células intactas

  1. Prepara-se uma suspensão de células contendo oxygraph câmara (1 x 10 6 / ml) seguindo o processo descrito nos passos 4.1 a 4.3 do protocolo.
  2. Injectar 1 ul de 4 mg / ml de oligomicina (2 ug / ml) para dentro da câmara oxygraph contendo uma suspensão de célulasd ficha respiração celular até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada.
  3. Depois injetar 1 ml de 0,2 mM de FCCP (0,1 M) "CUIDADO" para a câmara oxygraph e registrar a respiração celular até que o oxigênio sinal aumenta fluxo e estabiliza.
  4. Injectar 3 uL de 0,2 mM de FCCP (0,4 uM) para a câmara de oxygraph gravar e até que a respiração celular sinal aumenta ainda mais o fluxo de oxigénio e estabiliza.
  5. Titula-se FCCP em 0,1 a 0,3 uM passos 1-3 por injecção de ul de 0,2 a 1 mM de FCCP (0,1 a 2 uM concentração final na câmara) para dentro da câmara oxygraph até que o sinal de fluxo de oxigénio atinge o seu nível máximo e sem mais aumentos e, em seguida começa a diminuir.
    NOTA: Pare de injetar FCCP quando o sinal de oxigênio atinge um nível máximo e começa a diminuir.
  6. Em seguida, injectar 2 ul de rotenona 0,2 mM (0,2 mM) e 2 ul de 5 mM de antimicina A (5 uM) para dentro da câmara. Grave a respiração até tele diminui sinal de fluxo de oxigênio e estabiliza.

Representative Results

Determinação da Optimum Digitonin Concentração para Cellular permeabilização: Digitonin Titulação Experiment

A digitonina da titulação é efectuada para determinar a concentração óptima para permeabilização das células HepG2. Para estas experiências, a digitonina é titulado em células intactas na presença de rotenona, succinato (complexo mitocondrial substrato II) e uma quantidade saturante de ADP (que induzem um estado de 3 complexo II-dependentes), e respiratória são medidos na linha de base e depois de cada titulação (Figuras 1A e 1B). O resultado desta experiência mostra que, na ausência de digitonina, respiração celular é muito baixo e a respiração das células intactas, não-permeabilizadas não é estimulado na presença de substrato e ADP mitocondrial. No entanto, após a adição passo a passo de digitonina, a membrana plasmática celular é permeabilizadas e mitochonrespiração drial (complexo dependente da II estado 3) aumenta-se a permeabilização completo quando succinato e ADP entrar nas células. Os resultados mostram que a permeabilização, a uma concentração de 8-12 uM digitonina é óptima para a respiração ADP-estimulada de células HepG2. No entanto, a integridade da membrana exterior mitocondrial pode ser comprometida se são empregues quantidades excessivas de digitonina. Como mostrado na Figura 1, as quantidades excessivas de digitonina induziu uma redução no complexo II dependente de estado 3 da respiração indica a integridade da membrana mitocondrial externa comprometida.

Nos protocolos actuais e seguintes, todas as taxas de consumo de oxigénio são expressos como IO 2 [pmol x seg-1 x 10 células -6] (fluxo de oxigénio por milhão de células) que é calculado dividindo-se o fluxo de oxigénio específico volume (no fechado câmara de oxigênio), JV, O 2 [pmol x seg -1 x ml -1] por concentrat celular de iões na câmara de células (número de células por volume [10 6 células x ml-1]) 15.

figura 1
Figura 1: A digitonina titulação para determinar a concentração óptima para permeabilização das células HepG2. A linha azul representa a concentração de oxigênio; a linha vermelha representa o fluxo de oxigênio (inclinação da concentração de oxigênio). A concentração de oxigénio diminui ao longo do tempo que as células utilizar o oxigénio disponível. O consumo de oxigénio é expressa como pmol / (seg x número de células). (A) Os traçados da respirometria de alta resolução usando digitonina, ADP e succinato como substrato para o complexo mitocondrial respiração II-dependente (1 experimento). (B) as taxas de respiração mitocondrial de 4 experiências individuais apresentados como médias ± SD.carregar 54.985 / 54985fig1large.jpg "target =" / _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Avaliação da integridade de membrana mitocondrial externa Utilizando uma concentração óptima digitonina

Para avaliar o efeito da concentração de digitonina óptima (8? M) na integridade da membrana mitocondrial externa, as células são permeabilizadas com a integridade da membrana exterior de digitonina e mitocondrial é testado através da medição da respiração mitocondrial após a subsequente adição de succinato (complexo mitocondrial II dependente de estado 2 de repouso respiração na ausência de ADP), ADP (ADP estimulado complexo II dependente de estado 3 da respiração) e citocromo C (ADP estimulado complexo II dependente de estado 3 da respiração na presença de citocromo C), seguido pela adição de oligomicina (um inibidor de ATP sintase) para imitar o estado 4. Como mostrado na Figura 2

Figura 2
Figura 2: O citocromo C não melhora a respiração das células tratadas com digitonina (8 uM). vestígios respiratórios representativos para o teste de citocromo c usando alta resolução respirometria. As células são permeabilizadas com 8 digitonina uM e integridade mitocondrial externa da membrana é testado através da medição da taxa respiratória após a subsequente adição de succinato 10 mM (estado 2), ADP 2,5 mM (estado 3) e 10 uM de citocromo c (estado 3 na presença citocromo C), seguido pela adição de 2 ug / ml oligomicina para imitar o estado 4. a frequência respiratória é expressa como pmol / (seg x millioN células). CII: Complexo II. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Avaliação da integridade de membrana mitocondrial externa com elevada concentração de digitonina

Para demonstrar que uma concentração muito elevada de digitonina pode comprometer a integridade da membrana mitocondrial externa, foi realizada uma experiência utilizando uma dose elevada de digitonina. Para esta experiência, as células são permeabilizadas com digitonina 40 uM em vez de 8 uM, e integridade mitocondrial externa da membrana é testado através da medição da respiração mitocondrial após a subsequente adição de succinato (complexo mitocondrial II-dependente estado de repouso 2 respiração na ausência de ADP) , ADP (ADP estimulado estado complexo II dependente 3 da respiração) e citocromo c (ADP estimulado complexo II-dependent estado 3 da respiração na presença de citocromo C), seguido pela adição de oligomicina para imitar o estado 4 na presença de oligomicina (Figura 3). O resultado desta experiência mostra que o citocromo c aumenta a respiração das células tratadas com uma dose elevada de digitonina, indicando uma perda de citocromo c a partir da membrana mitocondrial externa, indicando a integridade da membrana mitocondrial externa comprometida.

Figura 3
Figura 3: alta dose de digitonina (40 M) compromete a integridade mitocondrial externa da membrana. Traçados da alta-resolução ventilometria utilizando succinato como substrato. A linha azul representa a concentração de oxigênio; a linha vermelha representa o fluxo de oxigênio (inclinação da concentração de oxigênio). A concentração de oxigénio diminui ao longo do tempo que as células utilizar o oxigénio disponível. O consumo de oxigénio é expressa comopmol / (seg x número de células). A subsequente adição de 40 uM de digitonina, succinato (10 mM), ADP (2,5 mM), citocromo c (10 pM) e oligomicina (2 ug / ml) é indicado. CII: Complexo II. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Maximal ADP estimulada respiração (estado 3) de células permeabilizadas HepG2, utilizando um excesso substratos exógenos

Complexo I, II e IV-dependente máxima respiração ADP-estimulada (estado 3) das células HepG2 permeabilizadas (1 X 10 6 células / ml) é medida com sucesso usando excesso de substratos exógenos (Figura 4). Para esta experiência, as células são permeabilizadas com digitonina taxas de consumo de oxigénio e mitocondriais são medidos após a adição subsequente de substratos e inibidores como descrito em

Figura 4
Figura 4: medição bem sucedida de máxima respiração ADP-estimulada (estado 3) de células HepG2 permeabilizadas. A frequência respiratória é expressa como pmol / (seg x milhão de células). As células são permeabilizadas com 8 digitonina? M e respiratória mitocondrial são medidos após a subsequente adição de glutamato e malato (estado 3, complexo I), rotenona para inibir o complexo I, succinato (estado 3, II complexo), antimicina A para inibir complexo III e ascorbato / TMPD e azida de sódio para inibir o complexo IV. Complexo IV da respiração (estado 3)é interpretado pela subtracção do consumo de oxigénio antes e depois da adição de azida de sódio. CI: Eu complexo, CII: Complexo II, CIV: IV complexa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Medição sem êxito do Respiração Maximal ADP-estimulada (estado 3) de células permeabilizadas HepG2

Complexo I, II e IV-dependente máxima respiração ADP-estimulada (estado 3) das células HepG2 permeabilizadas (1 x 10 6 culas / ml) não é medida com sucesso usando excesso de substratos exógenos (Figura 5). Para esta experiência, as células são permeabilizadas com digitonina taxas de consumo de oxigénio e mitocondriais são medidos após a adição subsequente de substratos e inibidores, como descrito na Figura 5. Como mostrado na Figura 5 Figura 4. Uma possível explicação para os níveis reduzidos respiratórios é a contaminação das câmaras oxygraph com inibidores mitocondriais obtidos em experiências anteriores. inibidores mitocondriais, tais como antimicina e rotenona são solúveis em etanol e pode ficar com as câmaras oxygraph e rolhas. Portanto as câmaras e as rolhas oxygraph deve ser lavada extensivamente após cada experiência.

Figura 5
Figura 5: medição sem êxito de máxima respiração ADP-estimulada (estado 3) de células HepG2 permeabilizadas. vestígios respiratórios representativos de uma experiência mal sucedida de I- complexa, II- e IV-driven máxima respiração ADP-estimulada (estado 3) de células HepG2 permeabilizadas usando de alta resolução respirometria. A frequência respiratória é expressa comopmol / (seg x milhão de células). As células são permeabilizadas com 8 digitonina? M e respiratória mitocondrial são medidos após a subsequente adição de glutamato e malato (estado 3, complexo I), rotenona para inibir o complexo I, succinato (estado 3, II complexo), antimicina A para inibir complexo III e ascorbato / TMPD e azida de sódio para inibir o complexo IV. Complexo IV respiração (estado 3) é interpretado pela subtracção do consumo de oxigénio antes e depois da adição de azida de sódio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Respiração acoplado ou não de células intactas

O consumo de oxigénio basal células HepG2 'é medida na presença de oligomicina (oligomicina-insensível respiração) e adição sequencial de FCCP (Figura 6). Basal taxa de respiração celular representa o consumo de oxigênio das células HepG2 intactas na presença de substratos celulares endógenos e pode alterar em resposta à demanda ATP celular. taxa de respiração oligomicina-insensitive representa vazar a respiração celular e taxa de respiração oligomicina-sensível, que representa o volume de negócios ATP celular e é calculado subtraindo a taxa de respiração oligomicina-insensitive da taxa de respiração endógena basal. O desacoplador FCCP química é sequencialmente adicionado a diferentes concentrações e respiração desacoplado máxima gravados. A taxa respiratória máxima mitocondrial desacoplado (capacidade máxima do sistema de transporte de elétrons) para essa condição experimental é obtida em 0,9-1,2 uM FCCP. Os resultados mostram uma actividade bifásica de FCCP em células HepG2 intactas. Portanto, para cada condição experimental, FCCP é titulada para obter a taxa de respiração desacoplado máxima. O índice de controlo respiratório desacoplado (uRCR) é calculado dividindo-se o FCCPtaxa de respiração desacoplado pela taxa de respiração na presença de oligomicina. Oligomicina sensível respiração (volume de negócios ATP) é calculado subtraindo oligomicina-insensitive taxa de respiração de respiração endógena basal. Acoplamento eficiência que representa a proporção do consumo de oxigénio mitocondrial utilizada para sintetizar ATP é calculada dividindo a taxa de respiração sensível ao oligomicina pela taxa de respiração basal. No final da experiência, para se obter a taxa de respiração de não-mitocondrial, inibidores da cadeia de transporte electrónico mitocondrial são adicionados e a taxa de respiração de não-mitocondrial é subtraído de todos os resultados. Para a experiência mostrada na Figura 6, a taxa de respiração de não-mitocondrial é de 26 pmol / (seg x milhões de células), a taxa de respiração basal é de 48 pmol / (seg x milhão de células), oligomicina-insensível taxa de respiração 7 pmol / (seg x milhões de células), oligomicina sensível respiração (volume de negócios ATP) 41 pmol / (seg x milhões de células) e couplin0,85 g eficiência.

Figura 6
Figura 6: Acoplado e respiração desacoplado de células intactas. vestígios respiratórias representativos de consumo de oxigénio basal células HepG2 'medida na presença de oligomicina (oligomicina-insensível respiração) e adição sequencial de FCCP utilizando-ventilometria alta resolução. Depois disso, uma vez que um sinal estável seja alcançado, a respiração é inibida com a adição de rotenona e antimicina A e o restante fundo respiração (respiração não-mitocondrial) é subtraído de todos os resultados. O consumo de oxigénio é expressa como pmol / (seg x número de células). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tampão Respiração 13
Químico Concentração
sacarose 110 mM
EGTA 0,5 mM
MgCl2 3,0 mm
KCl 80 mM
K-lactobionato 60 mM
KH 2 PO 4 10 mM
taurina 20 mM
Hepes 20 mM
BSA 1,0 g / L
pH 7.1

Tabela 1: A composição do tampão de respiração.

Discussion

O objetivo do presente protocolo foi a utilização de alta resolução respirometria para medir mitocondrial complexos da cadeia respiratória "(I-IV) taxa respiratória, a capacidade do sistema de transporte de elétrons mitocondrial máxima e integridade mitocondrial externa da membrana.

Existem alguns passos críticos dentro do presente protocolo. Em primeiro lugar, as taxas de consumo de oxigénio celular são geralmente normalizados para o número de células (pmol / [seg x número de células]). Portanto, antes de monitorização do consumo de oxigénio de células, é crítica a utilização de um dispositivo que permite medições precisas e fiáveis ​​do número de células. No presente protocolo de um contador de células automatizado foi usado (passo 3.7 do protocolo e tabela de materiais). Um segundo passo crítico, especialmente em células permeabilizadas, é a escolha de tampão de respiração em que as células são permeabilizadas ressuspenso (passo 3.6 do protocolo). Desde permeabilização celular pode induzir a perda de intracellulaiões r, é muito importante que o meio utilizado durante a permeabilização é compatível com o meio intracelular. Portanto, o tampão deve conter a respiração e uma composição de osmolaridade, que reflecte tanto o intracelular e o ambiente extracelular (Tabela 1) 13. Além disso, para permeabilização celular óptimo e eficaz, é fundamental para titular digitonina concentração não só para cada tipo de célula, mas também para cada densidade de células, para identificar a sua concentração óptima e mínima eficaz. Se a concentração de digitonina é demasiado baixa, as células não irão ser permeabilizadas. Em contraste, a exposição das células a grandes quantidades de digitonina vai danificar a membrana mitocondrial externa. Portanto, outro ponto importante é investigar a integridade mitocondrial externa da membrana. A fim de não subestimar a capacidade respiratória celular, é também crucial que os experimentos ventilometria são realizados a uma temperatura fisiológica (37 ° C). Outro ponto importante a considerar é a utilização de quantidades saturantes de ADP, devido à limitação de difusão de ADP contra oxigénio nas células permeabilizadas e os níveis de substrato suficientes para se obter fluxo respiratório máximo. Em algumas experiências em células permeabilizadas, pode acontecer que a adição de substratos exógenos e A ADP não conduzir a um aumento considerável na taxa de respiração. Isto pode ser causada por vários factores. Por exemplo, a utilização de altas concentrações de digitonina para permeabilizar as células podem danificar a membrana mitocondrial externa. Portanto, deve titular digitonina para determinar a concentração óptima para cada tipo de célula e a densidade. Além disso, a pureza de digitonina também é muito crítico, e está disponível comercialmente de digitonina pode variar significativamente em pureza e novos lotes de digitonina adquirido deve ser titulada para determinar as suas concentrações óptimas para a permeabilização celular. Além disso, existem vários tipos de membrana de plasma celular dos poros que formamagentes com propriedades diferentes. Por exemplo, a saponina é um detergente mais suave do que digitonina, e dependendo do tipo de célula, um reagente de permeabilização celular adequado deve ser seleccionado.

A maioria dos inibidores da função mitocondrial utilizados em ensaios de respirometria, tais como rotenona antimicina A, são solúveis apenas em etanol e ficar com as câmaras oxygraph e rolhas, inibindo a respiração celular. Para evitar este problema, as rolhas e câmaras oxygraph devem ser lavadas exaustivamente com etanol a 95% depois de cada ensaio. Outro ponto importante a considerar é que para ambos os ensaios respiração celular intactos e permeabilizadas, densidade celular, o tipo ea confluência de cultura celular pode afetar as taxas respiratórias. Por exemplo, com células HepG2, geralmente usamos uma densidade celular de 1 a 2 milhões de células por câmara. Usando densidade celular muito baixa durante ventilometria pode dar origem a um sinal muito fraco. Observamos também que a cultura de células de confluência pode afetar as taxas respiratórias. para example, quando as células HepG2 são cultivadas muito confluentes (mais de 100%), que consomem muito menos oxigénio.

Para obter um fluxo de oxigênio estável e reprodutível durante as experiências, outro ponto importante a considerar é a manutenção da respirometria de alta resolução instrument- ou seja, troca regular das membranas do sensor de oxigénio polarográficos e instrumentais correcções de fundo. Para as experiências com o desacoplador FCCP, pode ser que a adição de FCCP para as células não estimula a respiração celular e fluxo máxima não é obtido, mas em vez disso a respiração celular é inibida. A inibição do consumo de oxigénio celular após a adição de FCCP pode indicar que a concentração de FCCP não foi óptima e foi muito alta. Para estas experiências, para cada ensaio, é essencial para titular cuidadosamente concentração FCCP para se obter fluxo máxima.

Uma limitação da respirometria de alta resolução é que a triagem de alto rendimento, o estabelecimento deAs curvas de resposta à dose e ensaios de curso de tempo para quantidades limitadas de amostras biológicas não são viáveis. Para estes ensaios, pode-se usar outros instrumentos, tais como o analisador de fluxo extracelular. Outras limitações são: i) o dispositivo não é automatizado e requer a presença contínua de um operador, ii) é demorado, iii) tem apenas duas câmaras e apenas dois ensaios podem ser executados de uma vez, iv) manutenção do aparelho , como alterar as membranas e calibrações, requer muito tempo e v) as câmaras não são de uso único e pode se tornar contaminada com inibidores. As vantagens do oxygraph alta resolução através de dispositivos de eléctrodos de oxigénio polarográficos tradicionais são i) maior sensibilidade, ii) um número menor de amostras biológicas necessárias, iii) taxas respiratórias podem ser medidos simultaneamente em duas câmaras e iv) o dispositivo foi reduzida fuga de oxigénio. Algumas das vantagens do oxygraph de alta resolução sobre o analisador de fluxo extracelular são: i) os custos mais baixos dodispositivo e consumíveis e ii) viabilidade de protocolos de titulação substrato-desacoplador-inibidor.

As aplicações futuras ou direções Depois de dominar esta técnica são medições simultâneas de respiração celular, potencial de membrana mitocondrial, H 2 O 2, ATP e cálcio níveis usando sensores ópticos na mesma câmara.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma A 4386 Chemical
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate Merck 1.00127 Chemical
BSA Sigma A 6003 Chemical
FCCP Sigma C 2920 Chemical, dissolve in ethanol
Countess automated cell counter  Thermo Fisher Scientific n/a Automated cell counting instrument
Cytochrome c Sigma C 7752 Chemical
Digitonin Sigma D 5628 Chemical, dissolve in DMSO
DMEM Gibco 31966021 Medium
EGTA fluka 3779 Chemical
FBS Gibco 26010-074 Medium component
Glutamate Sigma G 1626 Chemical
Hepes Sigma H 7523 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
KH2PO4 Merck 1.04873 Chemical
K-lactobionate Sigma L 2398 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k  Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
Oligomycin Sigma O 4876 Chemical, dissolve in ethanol
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122 Chemical
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical
Trypsin Sigma T 4674 Chemical

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References

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