Haute résolution Respirométrie pour évaluer la fonction mitochondriale dans perméabilisées et des cellules intactes

Biology
 

Summary

Haute résolution de respirométrie est utilisé pour déterminer la consommation d'oxygène des mitochondries. Cette technique est simple de déterminer les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale »(I-IV) de la fréquence respiratoire, la capacité maximale du système de transport d'électrons mitochondriale, et l'intégrité de la membrane externe mitochondriale.

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Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J. Vis. Exp. (120), e54985, doi:10.3791/54985 (2017).

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Abstract

Introduction

Mitochondrie remplissent un rôle important dans le métabolisme énergétique cellulaire, en particulier en utilisant de l'oxygène pour produire de l'adénosine triphosphate (ATP). Ils sont impliqués dans la mort cellulaire ainsi que dans plusieurs maladies humaines. la phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS) combine le transport d'électrons le long de la chaîne de transport d'électrons avec une consommation d'oxygène et la synthèse d'ATP. L'acide (TCA) le cycle tricarboxylique mitochondriale est impliqué dans la transformation des protéines, des glucides et des lipides riches en composés énergétiques comme nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et de flavine - adénine - dinucléotide (FADH 2). Électrons du NADH et FADH 2 sont ensuite transférés dans les complexes protéiques de la chaîne de transport d'électrons respiratoires (I à IV) se trouvant dans la membrane mitochondriale interne. En outre, deux autres voies redox peuvent transférer des électrons d'électrons chaîne de transport: i) mitochondrial d'électrons transfert flavoprotein (ETF), qui est situé sur la face de la matrice du mito intérieuremembrane chondrial, et fournit des électrons à partir d'acide gras β-oxydation; et ii) glycérophosphate déshydrogénase mitochondriale qui oxydent le glycérophosphate de dihydroxyacétone phosphate et alimente des électrons à la chaîne de transport d'électrons mitochondriale. Le complexe IV (l'accepteur d'électrons final) transfère les électrons à une molécule d'oxygène, la conversion de l'oxygène à deux molécules d'eau. Le déplacement des électrons de la chaîne respiratoire complexe de transport d'électrons I à IV est couplé avec le flux de protons à partir de la matrice mitochondriale dans l'espace intermembranaire, qui établit un gradient électrochimique à travers la membrane mitochondriale interne. Ensuite, mitochondrial complexe V (ATP synthase) Navettes les ions d'hydrogène de nouveau dans la matrice mitochondriale et synthétise les molécules d'ATP. OXPHOS fonction peut être évaluée in vivo et in vitro en utilisant diverses techniques et divers états de la respiration mitochondriale peut être obtenue. Dans les mitochondries isolées du respirato suivantEtats Ry peuvent être mesurés: i) la respiration mitochondriale de base (état 1), ii) la consommation d'oxygène après l'addition des substrats spécifiques des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale (état 2), iii) la consommation mitochondriale d'oxygène maximale après l'addition de concentrations saturantes adénosine diphosphate (ADP) (état 3) et, iv) repos respiration après la consommation ADP (converti en ATP) (état 4). Dans des cellules intactes les états respiratoires suivants peuvent être mesurés: i) la base de la consommation d'oxygène cellulaire en présence de substrats endogènes et de l'ADP, ii) la base de la consommation d'oxygène cellulaire en présence d'oligomycine (oligomycine insensible à la respiration) et oligomycine sensible à la respiration (ATP CA), iii) une respiration FCCP désaccouplé, et iv) la respiration mitochondriale non après l'addition de l'antimycine A et la roténone. Dans les cellules perméabilisées, des substrats spécifiques des complexes de la chaîne de transport d'électrons et de l'ADP peuvent être ajoutés et les taux maximaux respiratoires du complexe dépendantette I- aussi complexe, II- et respiratoire IV-dépendantes peut être mesurée.

Les mesures de la respiration cellulaire fournissent des informations importantes sur la capacité respiratoire mitochondriale spécifique aux complexes I-IV, l' intégrité mitochondriale et le métabolisme énergétique 1, 2, 3. L' un des dispositifs qui permettent des mesures de la consommation d'oxygène mitochondrial avec une grande précision, la résolution et la sensibilité est la haute résolution oxygraphe 4. Le dispositif à haute résolution oxygraphe contient deux chambres avec des orifices d'injection et chaque chambre est équipée d'un détecteur d'oxygène polarographique. suspensions mitochondriales cellulaires ou isolées sont agités en continu dans le spiromètre. Pour évaluer la fonction mitochondriale, substrats et inhibiteurs de l'activité complexe mitochondrial peuvent être ajoutés selon les protocoles standards. Substrats et inhibiteurs peuvent être titrés par injection into les chambres du oxygraphe, et les taux de consommation d'oxygène sont calculés en utilisant le logiciel et exprimée en picomoles par seconde et par nombre de cellules. Haute résolution respirométrie offre plusieurs avantages par rapport aux dispositifs d'électrodes oxygène polarographique traditionnelles et classiques, y compris une sensibilité accrue et la capacité de travailler avec un petit nombre d'échantillons biologiques tels que des cellules intactes ou perméabilisées. En outre, chaque appareil contient deux chambres, et les taux respiratoires peuvent être enregistrées simultanément pour les comparaisons des concentrations d'oxygène. La haute résolution oxygraphe présente également l'avantage de réduire les fuites d'oxygène à partir des chambres de l'appareil par rapport aux dispositifs traditionnels d'électrode polarographique à oxygène. Un autre dispositif récemment mis au point pour mesurer la consommation cellulaire d'oxygène est l'analyseur de flux extracellulaire de 96 puits 5. L'analyseur de flux extracellulaire est équipé de fluorescence au lieu de capteurs polarographiques. Les avantages de l'extra-cellulaireanalyseur de flux par rapport à la haute résolution oxygraphe sont i) il est un dispositif largement automatisé, ii) il est possible de mesurer la consommation d'oxygène dans 24 et plaques à 96 puits pour le criblage à haut débit, ce qui nécessite donc des quantités plus faibles d'échantillons biologiques, et iii) la mesure supplémentaire de flux glycolytique cellulaire est possible. Les inconvénients de l'analyseur de flux extracellulaire par rapport à la haute résolution oxygraphe sont i) les coûts élevés de l'appareil et de consommables tels que des plaques fluorescentes, qui ne sont pas réutilisables, et ii) que quatre composés par essai / puits sont injectables par conséquent le système est réalisable pour des protocoles de titrage substrat découpleur inhibiteur.

Dans la présente étude, nous utilisons à haute résolution respirométrie pour déterminer la respiration mitochondriale. Pour les expériences cellulaires, la consommation d'oxygène, les cellules sont perméabilisées pour permettre l'entrée de l'ADP exogène et les substrats oxydables mitochondrial pour amener des électrons dans complexes du système respiratoire. Cette approche permet la dissection des complexes mitochondriaux individuels capacités respiratoires, ce qui est un avantage distinct par rapport aux cellules intactes (beaucoup de substrats sont des cellules impermeant). Cependant, la membrane cellulaire perméabilisation va perturber la barrière entre le cytosol et dans l'espace extracellulaire et moyen (lavage de solutés cytosolique) et la composition de l'espace intracellulaire est équilibrée avec le milieu extracellulaire. L'un des inconvénients des cellules perméabilisées par rapport aux cellules intactes est que la membrane externe mitochondriale peut être endommagée si des quantités excessives de détergent sont utilisés lors de la perméabilisation de la cellule. Dans des cellules intactes, de base, couplés et découplés respiration des cellules intactes peut être mesurée. Cette méthode évalue la consommation d'oxygène des cellules intactes, sans addition de substrats exogènes et de l'ADP, reproduisant la fonction respiratoire dans la cellule intégrée et fournissant également des informations sur transp d'électrons mitochondriale maximalecapacité rt 6, 7. L'un des avantages des cellules intactes par rapport aux cellules perméabilisées est que l'environnement cellulaire ne soit pas perturbé et les mitochondries sont en contact avec les composants des cellules entières. Afin de perméabiliser la membrane plasmique cellulaire, des détergents tels que la digitonine 8 ont été utilisés. Cependant, l'intégrité de la membrane externe mitochondriale peut être compromise si des quantités excessives de digitonine sont employés. Pour confirmer que l'intégrité de la membrane externe mitochondriale ne soit pas compromise dans des cellules perméabilisées, le titrage est effectué digitonine afin de déterminer la concentration optimale pour la perméabilisation cellulaire. Pour ces expériences, les cellules sont remises en suspension dans du milieu de la respiration et de la concentration digitonine est titrée par respirométrie en présence de substrats et l'ADP et mitochondriales, les taux de respiration sont mesurés. Respiration des cellules intactes non perméabilisées n'a pas été stimulée en présence d'mitochosubstrats et ADP ndrial. Toutefois, après la titration de la digitonine par paliers produirait perméabilisation progressive des membranes plasmiques, et de la concentration optimale est obtenue digitonine. Cela est démontré par l'augmentation de la respiration jusqu'à la pleine perméabilisation. Qualité mitochondriale et de l' intégrité de la membrane externe peut être vérifiée en ajoutant exogène du cytochrome c 2, 9. Cytochrome c est un électron 12 kDa portant la protéine mitochondriale de la chaîne de transport d'électrons 10, 11, 12. Elle est localisée dans l'espace intermembranaire des mitochondries, et est impliqué dans la consommation d'oxygène, transportant des électrons de complexe III à IV complexe. Une fois que la membrane mitochondriale externe est endommagée, le cytochrome c est libéré, et de la consommation mitochondriale d'oxygène est réduite. Lors de l'addition exogène du cytochrome c, toute augmentation de la respiration mitochondriale est indicative d'unperturbé membrane externe mitochondriale.

Dans perméabilisées cellules, substrats et inhibiteurs de l' activité complexe mitochondrial sont ajoutés à la suite de différents protocoles 3, 9. Par exemple, afin d'enquêter sur les taux respiratoires complexes induits-mitochondriales, le protocole suivant peut être utilisé. Après perméabilisation des cellules, premier complexe I est stimulée par les substrats du malate et du glutamate, qui génèrent NADH comme substrat pour la chaîne respiratoire et provoquer l'activation du complexe I. Par la suite, l'ADP est ajouté pour la conversion en ATP (état 3, actif complexe I-dépendante la respiration). Après un signal stable est atteint, la roténone (complexe mitochondrial I inhibiteur) est administré pour inhiber I. complexe roténone est suivie par le succinate de FADH 2 et activer complexe II (état 3, actif complexe respiration II-dépendant). Afin de mesurer complexe IV-dépendante respiration, premier complexe IIIla respiration dépendante est inhibée par addition d'antimycine A (inhibiteur mitochondrial complexe III). Ensuite, complexe IV-dépendante la respiration est stimulée par l'administration d'ascorbate et tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD automatique peut s'oxyder dans le tampon de la respiration, donc complexe fréquence respiratoire maximale IV-dépendante (Etat 3) est calculé en soustrayant le taux de respiration avant et après l'addition de l'azoture de sodium, un inhibiteur du complexe IV mitochondriale. Les expériences de respiration peut être réalisée en deux chambres d'un oxygraphe en parallèle l'un servant de témoin (cellules non stimulées), l'autre contenant les cellules stimulées. De toute évidence, les cellules peuvent être pré-traitées de diverses manières, par exemple avec des médicaments qui affectent la fonction mitochondriale, avant leur consommation d'oxygène est mesurée dans la chambre de oxygraphe. Ce protocole permet l'examen fonctionnel des complexes individuels de la chaîne respiratoire mitochondriale. En outre, on peut mesurer l'ADP stimulée maximalerespiration (état 3) des cellules perméabilisées, en utilisant l'acide gras exogène sous forme de palmitate. Dans ce protocole, les stocks concentrés de palmitate de sodium sont conjugués avec l'acide gras ultra bovin libre de sérum-albumine (BSA) (6: 1 molaire palmitate: BSA). Ensuite, les cellules sont d'abord perméabilisées avec la respiration digitonine et mitochondriale est évaluée par l'addition de la carnitine et le palmitate suivi par l'addition d'ADP (état 3, la respiration maximale). Ensuite, oligomycine est ajouté à imiter l'état 4 (état 4o) et le rapport de contrôle respiratoire (valeur RCR) est calculé comme état 3 / état 4o. β-oxydation favorise la production d'acétyl - CoA réductase (qui entre dans le cycle TCA) et la génération de FADH 2 et le NADH, les électrons qui sont transmis à la chaîne de transport d'électrons par flavoprotéine d'électrons de transfert et de β-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase. Les mitochondries sont au centre du métabolisme des acides gras et décrits protocole palmitate-BSA peut être utilisé par les chercheurs qui examinent la graissel'oxydation de l'acide ty. Dans des cellules intactes, des activateurs et des inhibiteurs de l' activité du complexe mitochondrial sont ajoutés selon un protocole différent , 6, 9. Pour ces expériences, la première consommation d'oxygène des cellules non perméabilisées en l'absence de substrats exogènes est mesurée (phosphoryler la fréquence respiratoire). Ensuite, le taux de respiration non phosphorylant est mesuré après l'addition de l'oligomycine, qui est un inhibiteur de l'ATP synthase mitochondriale. Ensuite, le protonophore carbonyl cyanure p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) est administré à différentes concentrations et la fréquence respiratoire mitochondriale découplé maximale est mesurée. Protonophores tels que FCCP peuvent induire une augmentation de la perméabilité des protons de la membrane interne, permettant un mouvement passif des protons pour dissiper le gradient chimiosmotique. Une augmentation de la perméabilité à protons découple la respiration oxydative (pas de production d'ATP) et induit une augmentation de l'oconsommation xygène. Ensuite, la roténone et antimycine A sont ajoutés pour inhiber la respiration mitochondriale et la respiration non-mitochondrial est soustraite de tous les autres taux respiratoires.

Les taux de consommation d'oxygène peuvent être exprimées comme IO 2 [pmol x sec -1 x 10 -6 cellules] (débit d'oxygène par million de cellules) qui est calculé en divisant le flux d'oxygène spécifique en volume (dans la chambre à oxygène fermé), JV, O 2 [pmol x s -1 x ml - 1] de la concentration de cellules dans la chambre à cellules (nombre de cellules par volume [10 6 cellules ∙ 1 ml]) 15. Cell-masse flux spécifique d'oxygène, JO 2 [pmol x sec -1 x mg -1], est débit par cellule, IO 2 [pmol x sec -1 x 10 -6 cellules], divisé par la masse par cellule [mg ∙ 10 6 cellules]; ou le volume spécifique de flux, JV, O 2 [pmol x sec -1 x ml -1], divisé par la masse par volume [mg ∙ ml 1]. JO 2 est le flux d'oxygène par une protéine cellulaire, du poids sec ou de volume cellulaire.

Dans la présente étude, en utilisant à haute résolution respirométrie, nous décrivons des protocoles pour déterminer i) la concentration de la digitonine optimale pour toutes perméabilisation de la membrane plasmique cellulaire (essai de titrage digitonine), ii) l'intégrité de la membrane externe mitochondriale en utilisant exogène du cytochrome c, iii) les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale I , fréquence respiratoire maximale II et IV dans les cellules HepG2 digitonine perméabilisées en présence d'ADP exogène et mitochondriales des substrats de la chaîne respiratoire, et iv) de base, associée et maximale respiration découplée (capacité maximale de transport d'électrons) des cellules intactes, sans addition de substrats exogènes et ADP, reproduisant la fonction respiratoire dans la cellule intégrée.

Protocol

1. Culture cellulaire

  1. La culture de cellules HepG2 d'hépatome humain 6 en flacons de 25 cm2 de culture cellulaire dans Modified Eagle du milieu de Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum inactivé à la chaleur de fœtus bovin (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine à 37 ° C dans un incubateur (5% de CO 2, 95% d' air) (densité de semis: 1 x 10 6 cellules par 25 cm 2 de culture cellulaire flacon, le temps d'incubation dans l'incubateur à 37 ° C: 48 heures, la densité des cellules à confluence: 4-5 x 10 6 cellules par 25 cm 2 culture cellulaire flacon).
  2. Réaliser les expériences lorsque les cellules sont de 90% à 95% confluentes.

2. haute résolution Respirométrie Calibration des capteurs d'oxygène polarographiques

  1. Pipette 2,1 ml de tampon de la respiration dans une chambre d'oxygraphe et remuer le tampon en continu en utilisant une barre d'agitation magnétique présent dans la chambre (700 rpm) à 37 ° C pendant 1 heure jusqu'à ce qu'un signal de flux stable d'oxygènele capteur d'oxygène polarographique est obtenu.
    REMARQUE: des électrodes d'oxygène polarographiques à l'intérieur de chaque mesure de concentration d'oxygène de la chambre de oxygraphe et de calculer la consommation d'oxygène (flux) à l'intérieur de chaque chambre. La concentration en oxygène et le taux de consommation d'oxygène (flux) sont affichés en temps réel en ligne dans un ordinateur en utilisant un logiciel d'acquisition et d'analyse des données.
  2. Effectuer un étalonnage à l'air du capteur d'oxygène polarographique selon les protocoles du fabricant 14.
    NOTE: L'étalonnage des capteurs d'oxygène polarographiques dans les milieux de la respiration et de la concentration d'oxygène dans les médias à la saturation de l'air température expérimentale est effectuée une seule fois par jour le matin. Ensuite, les médias peuvent être retirés des chambres et des cellules remises en suspension dans un milieu de respiration frais sont ajoutés à une chambre d'oxygraphe et respiratoire sont mesurés. Après la première expérience, la chambre peut être lavée et d'autres séries d'expériences peut être réalisée en til même chambre sans autre étalonnages.

3. trypsinisation des cellules adhérentes, cellules de comptage

  1. Le jour de l'expérience, le milieu DMEM Aspirer à partir du 25 cm2 de culture cellulaire flacon.
  2. Rincer la monocouche de culture cellulaire dans le flacon de culture avec 5 ml de tampon phosphate salin (PBS).
  3. Introduire à la pipette 0,5 ml de 25 mg / ml de solution de trypsine (préchauffée à 37 ° C dans un bain d'eau à 37 ° C) dans la monocouche cellulaire dans le flacon de culture et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C dans un incubateur (5% de CO 2 , 95% d'air).
  4. Introduire à la pipette 5 ml de DMEM contenant 10% de FBS dans les cellules individuelles dans le flacon de culture cellulaire et les cellules en suspension par pipetage.
  5. Le transfert des cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et remises en suspension centrifuger pendant 5 min à 350 x g à température ambiante et décanter le surnageant.
  6. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de tampon 13 respiration (T ableau 1).
  7. i> Compter les cellules en utilisant un compteur de cellules et de les remettre en suspension dans le tampon de la respiration à une densité finale de 1 x 10 6 cellules / ml. Puisque les taux de respiration cellulaire seront normalisées au nombre de cellules, compter les cellules avec un compteur de cellules exactes et précises.

4. haute résolution Respirométrie

  1. Après étalonnage à l'air ( a effectué une seule fois par jour, les étapes de 2,1 à 2,2), aspirer le milieu de la respiration à partir d' une chambre du oxygraphe et ajouter 2,1 ml de suspension de cellules (1 x 10 6 cellules / ml) provenant de l' étape 3.7 dans la chambre.
  2. Fermer la chambre de oxygraphe par insertion du bouchon.
  3. Incorporer les cellules en continu en utilisant une barre d'agitation magnétique présent dans la chambre (700 rpm) à 37 ° C et enregistrer la respiration cellulaire pendant 5-10 minutes jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable est atteint.
    Remarque: la concentration en oxygène et le signal de flux d'oxygène sont affichées en temps réel en ligne sur un ordinateur en utilisant le logiciel d'acquisition et d'analyse des donnéess = "xref"> 14.
  4. Par la suite, injecter des substrats et des inhibiteurs de la respiration mitochondriale par les orifices des bouchons en utilisant les protocoles d'injection suivants de titane.

5. Digitonine Titration dans des cellules intactes par Respirométrie

  1. Préparer une suspension cellulaire contenant oxygraphe chambre (1 x 10 6 / ml) suivant le mode opératoire décrit dans les étapes 4.1 à 4.3 du protocole.
  2. Injecter 2 pi de roténone 0,2 mM (0,2 uM) "ATTENTION" dans la chambre de oxygraphe contenant une suspension de cellules à travers l'orifice d'injection de titane du bouchon de la chambre à l'aide d'une seringue et d'enregistrer la respiration cellulaire pendant 5-10 min jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable soit atteint, .
    NOTE: Toutes les injections dans les étapes suivantes sont effectuées par les ports de bouchons en utilisant des seringues d'injection de titane. Ajout de la roténone est facultative (il empêche l'écoulement inverse d'électrons) et peut être omise pour des expériences de titrage digitonine, voirl'étape 6.3.
  3. Injecter 20 ul de 1 M de succinate (10 mM) dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire pendant 5-10 min jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable soit atteint.
  4. Injecter 10 ul de 0,5 M d'ADP (2,5 mM) dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire pendant 5-10 min jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable soit atteint.
  5. Injecter 2 ul de 2 mM de digitonine (2 de M) dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire pendant 2-5 min jusqu'à ce qu'un signal stable en oxygène est obtenue.
  6. injecter de nouveau 2 pi de 2 mM de digitonine dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire pendant 2-5 minutes jusqu'à ce qu'un signal stable en oxygène est obtenue.
    REMARQUE: L'addition graduelle de la digitonine aux cellules va induire une augmentation de la consommation cellulaire d'oxygène et le signal de flux d'oxygène augmente.
  7. Continuer à injecter 2-4 pi de 2 mM de digitonine par palier (2-4 uM de chaque étape) dans la chambre. Après chaque étape, enregistrer la respiration cellulaire pour 2-5 mjusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable soit atteint.
    REMARQUE: Arrêter l'injection digitonine lorsque le signal de flux d'oxygène atteint un niveau maximal et de nouvelles injections de digitonine ne pas augmenter le taux de respiration. Les lecteurs devraient déterminer la concentration de digitonine optimale dans leurs laboratoires utilisant leurs propres réactifs et utilisation obtenue concentration de digitonine optimale dans les étapes 6.2 et 7.2 des protocoles suivants pour leurs expériences.

6. Évaluation de la membrane externe mitochondriale Intégrité: Cytochrome C

  1. Préparer une suspension cellulaire contenant oxygraphe chambre (1 x 10 6 / ml) suivant le mode opératoire décrit dans les étapes 4.1 à 4.3 du protocole.
  2. Injecter 2 pl de 8 mM de digitonine ( à 8 uM) dans la chambre de oxygraphe contenant la suspension de cellules (1 x 10 6 / ml) et perméabiliser les cellules pendant 5 min.
  3. Injecter 20 ul de 1 M de succinate (10 mM) dans la chambre de oxygraphe cellulaire et enregistrer respiration pendant 5-10 minutes jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable est atteint.
  4. Injecter 10 ul de 0,5 M d'ADP (2,5 mM) dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire pendant 5-10 min jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable soit atteint.
    NOTE: L'addition d'ADP aux cellules stimulera complexe I et induire une augmentation de la consommation d'oxygène, et le signal de flux d'oxygène va augmenter et se stabiliser.
  5. Injecter 5 ul de 4 mM de cytochrome c (10 uM) dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire pendant 5-10 min jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable soit atteint.
  6. injecter finalement 1 pl de 4 mg / ml oligomycine (2 pg / ml) et on enregistre la respiration cellulaire jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable soit atteint.

7. Respiration Maximal ADP stimulée (Etat 3) des cellules perméabilisées HepG2

  1. Préparer une suspension cellulaire contenant oxygraphe chambre (1 x 10 6 / ml) suivant le mode opératoire décrit dans les étapes 4.1 à 4.3 du protocole.
  2. Injecter 2 pl de 8 mM de digitonine (à 8 uM) dans la chambre de oxygraphe contenant la suspension cellulaire et perméabiliser les cellules pendant 5 min.
  3. Injecter 12,5 ul de 0,8 M de malate (5 mM) et 10 ul de 2 M de glutamate (10 mM) dans la chambre de oxygraphe. respiration cellulaire enregistrement jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable est atteint.
  4. Injecter 10 ul de 0,5 M d'ADP (2,5 mM) dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à ce que le flux d'oxygène signal augmente et se stabilise.
    REMARQUE: L'addition d'ADP dans les cellules va induire une augmentation de la consommation d'oxygène et le signal de flux d'oxygène augmente.
  5. Injecter 2 pi de roténone 0,2 mM (0,2 uM) "ATTENTION" dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à ce que le flux d'oxygène diminue de signal et se stabilise.
  6. Par la suite, l'injection de 20 pl de 1 M de succinate (10 mM) dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à ce que le signal de flux d'oxygène augmenteet se stabilise.
  7. Ensuite, injecter 2 pl de 5 mM antimycine A (5 uM) "ATTENTION" dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à ce que le flux d'oxygène diminue de signal et se stabilise.
  8. Injecter ensuite 2,5 ul d'ascorbate 0,8 mM (1 mM) et immédiatement après l'injection de 2,5 ul de 0,2 mM TMPD (0,25 mM) dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à ce que le flux d'oxygène signal augmente et se stabilise.
  9. injecter enfin 10 pi de 1 M d'azoture de sodium (5 mM) "ATTENTION" dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à ce que le flux d'oxygène diminue de signal et se stabilise.

8. consommation d'oxygène des cellules intactes

  1. Préparer une suspension cellulaire contenant oxygraphe chambre (1 x 10 6 / ml) suivant le mode opératoire décrit dans les étapes 4.1 à 4.3 du protocole.
  2. Injecter 1 pl de 4 mg / ml oligomycine (2 pg / ml) dans la chambre de oxygraphe contenant une suspension cellulaired enregistrement de la respiration cellulaire jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable est atteint.
  3. injecter ensuite 1 ul de 0,2 mM de FCCP (0,1 M) "ATTENTION" dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à ce que le flux d'oxygène signal augmente et se stabilise.
  4. Injecter 3 ul de 0,2 mM de FCCP (0,4 M) dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à ce que le signal de flux d'oxygène supplémentaire augmente et se stabilise.
  5. Titrer FCCP à 0,1 à 0,3 uM étapes en injectant 1-3 pi de 0,2 à 1 mM FCCP (0,1 à 2 um concentration finale dans la chambre) dans la chambre de oxygraphe jusqu'à ce que le signal de flux d'oxygène atteint son niveau maximal et aucune autre augmentation, puis commence à la baisse.
    REMARQUE: Arrêter l'injection FCCP lorsque le signal d'oxygène atteint un niveau maximal et commence à décliner.
  6. Ensuite, l'injection de 2 ul de la roténone 0,2 mM (0,2 uM) et 2 pl de 5 mM antimycine A (5 pM) dans la chambre. la respiration d'enregistrement jusqu'à ce que til flux d'oxygène diminue de signal et se stabilise.

Representative Results

Détermination de Optimum Digitonine Concentration Cellulaire perméabilisation: Digitonine Titration Experiment

Digitonine titrage est effectué afin de déterminer la concentration optimale pour la perméabilisation des cellules HepG2. Pour ces expériences, la digitonine est titrée dans des cellules intactes en présence de la roténone, le succinate (mitochondriale complexe de substrat II) et une quantité saturante de l'ADP (pour induire l'état 3 complexe II-dépendantes) Les taux et respiratoires sont mesurés au début et après chaque titrage (figures 1A et 1B). Le résultat de cette expérience montre que, en l'absence de la digitonine, la respiration cellulaire est très faible et la respiration des cellules intactes, non perméabilisées ne sont pas stimulées en présence du substrat mitochondriale et de l'ADP. Cependant, lors de l'addition par étapes de la digitonine, la membrane plasmique cellulaire est perméabilisées et mitochonrespiration drial (état II complexe dépendant 3) augmente jusqu'à la pleine perméabilisation lorsque succinate et ADP pénètrent dans les cellules. Les résultats montrent que la perméabilisation à une concentration de 8 à 12 uM digitonine est optimale pour la respiration stimulée par l'ADP de cellules HepG2. Cependant, l'intégrité de la membrane externe mitochondriale peut être compromise si des quantités excessives de digitonine sont employés. Comme on le voit sur la figure 1, des quantités excessives de digitonine induit une réduction du complexe II dépendante de l' état 3 qui indique l' intégrité respiratoire compromise de la membrane externe mitochondriale.

Dans les protocoles actuels et suivants, tous les taux de consommation d'oxygène sont exprimés en IO 2 [pmol x sec -1 x 10 -6 cellules] (débit d'oxygène par million de cellules) qui est calculé en divisant le flux d'oxygène spécifique en volume (dans le fermé la chambre à oxygène), JV, O 2 [pmol x s -1 x ml - 1] de concentrat cellulaire ion dans la chambre cellulaire (nombre de cellules par volume [10 6 cellules x ml -1]) 15.

Figure 1
Figure 1: La digitonine titrage pour déterminer la concentration optimale pour la perméabilisation des cellules HepG2. La ligne bleue représente la concentration en oxygène; la ligne rouge représente le débit d'oxygène (pente de la concentration en oxygène). La concentration en oxygène diminue avec le temps que les cellules utilisent l'oxygène disponible. La consommation d'oxygène est exprimée en pmol / (sec x nombre de cellules). (A) Tracés de la haute résolution respirométrie utilisant digitonine, ADP et succinate comme substrat pour la respiration complexe mitochondrial II-dépendante (1 essai). (B) mitochondriales taux de 4 expériences individuelles de respiration présentées en moyenne ± SD.télécharger / 54985 / 54985fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Évaluation de la membrane externe mitochondriale intégrité en utilisant une concentration optimale Digitonine

Pour évaluer l'effet de la concentration de la digitonine optimale (8 uM) sur l'intégrité de la membrane externe de la mitochondrie, les cellules sont perméabilisées avec l'intégrité de la membrane externe de la digitonine et mitochondriale est testé par la mesure de la respiration mitochondriale après l'addition subséquente de succinate (complexe mitochondrial II dépendant de l'état 2 reposant la respiration en l'absence d'ADP), l'ADP (ADP stimulée II du complexe dépendant de l'état 3 la respiration) et le cytochrome c (ADP stimulée II du complexe dépendant de l'état 3 la respiration en présence de cytochrome c), suivi par l'addition d'oligomycine (un inhibiteur de l' ATP synthase) pour mimer l' état 4. Comme on le voit sur la figure 2

Figure 2
Figure 2: Cytochrome c ne favorise pas la respiration des cellules traitées avec de la digitonine (8 uM). traces respiratoires représentatifs pour le test du cytochrome c en utilisant à haute résolution respirométrie. Les cellules sont perméabilisées avec 8 pM digitonine et de l'intégrité de la membrane externe mitochondriale est testée par la mesure de la fréquence respiratoire après l'addition ultérieure de succinate 10 mM (état 2), mM ADP (état 3) 2,5 et 10 uM du cytochrome c (état 3 en présence cytochrome c), suivie par l'addition de 2 pg / ml oligomycine pour imiter l'état 4. la fréquence respiratoire est exprimée en pmol / (sec x million cellules). CII: complexe II. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Évaluation de la membrane externe mitochondriale Intégrité En utilisant une forte concentration de Digitonine

Pour démontrer qu'une très forte concentration de digitonine peut compromettre l'intégrité de la membrane externe mitochondriale, nous avons effectué une expérience en utilisant une dose élevée de digitonine. Pour cette expérience, les cellules sont perméabilisées avec 40 uM digitonine au lieu de 8 pm et l'intégrité de la membrane externe mitochondriale est testée par mesure de la respiration mitochondriale après l'addition subséquente de succinate (complexe mitochondrial II dépendant de l'état de repos 2 respiration en l'absence d'ADP) , ADP (ADP stimulé état complexe II-dépendante 3 respiration) et le cytochrome c (ADP stimulé complexe II-détat ependent 3 respiratoire en présence de cytochrome c), suivi par l'addition d'oligomycine pour mimer l' état 4 , en présence d'oligomycine (figure 3). Le résultat de cette expérience montre que le cytochrome c améliore la respiration des cellules traitées avec une dose élevée de digitonine, ce qui indique une perte de cytochrome c de la membrane externe mitochondriale indiquant l'intégrité compromise de la membrane externe mitochondriale.

figure 3
Figure 3: haute dose de digitonine (40 uM) compromet l' intégrité de la membrane externe mitochondriale. Tracés de la haute résolution respirométrie utilisant succinate comme substrat. La ligne bleue représente la concentration en oxygène; la ligne rouge représente le débit d'oxygène (pente de la concentration en oxygène). La concentration en oxygène diminue avec le temps que les cellules utilisent l'oxygène disponible. La consommation d'oxygène est exprimée enpmol / (sec x nombre de cellules). addition subséquente de 40 uM digitonine, le succinate (10 mM), de l'ADP (2,5 mM), du cytochrome c (10 pM) et oligomycine (2 pg / ml) est indiquée. CII: complexe II. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Maximal ADP stimulée par Respiration (Etat 3) de cellules perméabilisées HepG2, en utilisant un excès Substrats exogènes

I- Complex, II- et IV-dépendante maximale respiration ADP stimulée (état 3) des cellules HepG2 perméabilisées (1 x 10 6 cellules / ml) est mesurée avec succès en utilisant des substrats en excès exogènes (figure 4). Pour cette expérience, les cellules sont perméabilisées avec des taux de consommation d'oxygène et de digitonine mitochondriales sont mesurés après l'addition subséquente de substrats et inhibiteurs, comme décrit dans

Figure 4
Figure 4: Mesure réussie de la respiration maximale ADP stimulée (état 3) des cellules HepG2 perméabilisées. La fréquence respiratoire est exprimée en pmol / (sec x million de cellules). Les cellules sont perméabilisées avec 8 pM digitonine et respiratoire mitochondriale sont mesurés après l'addition ultérieure du glutamate et de malate (état 3, complexe I), la roténone pour inhiber complexe I, succinate (état 3, II complexe), antimycine A à inhiber complexe III et l'ascorbate / TMPD et de l'azoture de sodium pour inhiber le complexe IV. Complexe IV respiration (état 3)est interprété en soustrayant la consommation d'oxygène avant et après l'addition de l'azoture de sodium. CI: complexe I, CII: complexe II, CIV: complexe IV. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Mesure Unsuccessful de Respiration Maximal ADP stimulée (Etat 3) des cellules perméabilisées HepG2

I- Complex, II- et IV-dépendante maximale respiration ADP stimulée (état 3) des cellules HepG2 perméabilisées (1 x 10 6 cellules / ml) ne se mesure pas avec succès en utilisant des substrats en excès exogènes (figure 5). Pour cette expérience, les cellules sont perméabilisées avec des taux de consommation d'oxygène et de digitonine mitochondriales sont mesurés après l'addition subséquente de substrats et inhibiteurs , comme décrit dans la figure 5. Comme on le voit sur la figure 5 figure 4. Une explication possible pour les niveaux respiratoires réduits est la contamination des chambres de oxygraphe avec des inhibiteurs mitochondriaux des expériences précédentes. inhibiteurs mitochondriaux tels que antimycine et roténone sont solubles dans l'éthanol et peuvent coller aux chambres de oxygraphe et les bouchons. Par conséquent, les chambres oxygraphe et les bouchons doivent être lavés abondamment après chaque expérience.

Figure 5
Figure 5: Mesure de Unsuccessful maximale respiration ADP stimulée (état 3) des cellules HepG2 perméabilisées. traces respiratoires représentatifs d'une expérience infructueuse de I- complexe, II- et IV-entraînés maximale respiration ADP stimulée (état 3) des cellules HepG2 perméabilisées en utilisant à haute résolution respirométrie. La fréquence respiratoire est exprimée enpmol / (sec x million de cellules). Les cellules sont perméabilisées avec 8 pM digitonine et respiratoire mitochondriale sont mesurés après l'addition ultérieure du glutamate et de malate (état 3, complexe I), la roténone pour inhiber complexe I, succinate (état 3, II complexe), antimycine A à inhiber complexe III et l'ascorbate / TMPD et de l'azoture de sodium pour inhiber le complexe IV. Complexe IV respiration (Etat 3) est interprétée en soustrayant la consommation d'oxygène avant et après l'addition de l'azoture de sodium. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Respiration Couplé et découplées des cellules intactes

La consommation d'oxygène de base de cellules HepG2 est mesurée en présence d'oligomycine (oligomycine insensible à la respiration) et l' addition séquentielle d'FCCP (figure 6). Basal taux de respiration cellulaire représente la consommation d'oxygène des cellules HepG2 intactes en présence de substrats cellulaires endogènes et peut modifier en réponse à la demande de l'ATP cellulaire. le taux de respiration oligomycine insensible représente une fuite respiration cellulaire et le taux de respiration oligomycine sensible qui représente le chiffre d'affaires ATP cellulaire et est calculé en soustrayant le taux de respiration oligomycine insensible du taux de respiration endogène basale. Le produit chimique découplant FCCP est séquentiellement ajouté à différentes concentrations et la respiration découplée maximale enregistrées. Le taux de respiration mitochondriale maximale découplé (capacité maximale du système de transport d'électrons) pour cette condition expérimentale est obtenue à 0,9-1,2 uM FCCP. Les résultats montrent une activité biphasique FCCP dans les cellules HepG2 intactes. Par conséquent, pour chaque condition expérimentale, FCCP est titré pour obtenir le taux de respiration découplée maximale. Le découplé rapport de contrôle respiratoire (uRCR) est calculé en divisant le FCCPle taux de respiration découplée par le taux de respiration en présence d'oligomycine. Oligomycine sensible respiration (chiffre d'affaires de l'ATP) est calculé en soustrayant oligomycine insensible à la fréquence respiratoire de respiration endogène basale. Le rendement de couplage qui représente la proportion de la consommation mitochondriale d'oxygène utilisé pour la synthèse de l'ATP est calculé en divisant le taux de respiration sensible à l'oligomycine par le taux de respiration basale. A la fin de l'expérience, pour obtenir le taux de respiration mitochondriale non, des inhibiteurs de la chaîne de transport d'électrons mitochondriale sont ajoutés et le taux de respiration mitochondriale non est soustrait de tous les résultats. Pour l'expérience le montre la figure 6, le taux de respiration non-mitochondrial est 26 pmol / (sec x millions de cellules), le taux de respiration basale est de 48 pmol / (sec x million de cellules), oligomycine insensible à la fréquence respiratoire 7 pmol / (sec x millions de cellules), oligomycine sensible à la respiration (chiffre d'affaires de l'ATP) 41 pmol / (sec x millions de cellules) et coupling efficacité 0,85.

Figure 6
Figure 6: Couplé et de la respiration découplée des cellules intactes. traces respiratoires représentatifs de la consommation d'oxygène de base de cellules HepG2 mesurées en présence d'oligomycine (oligomycine insensible à la respiration) et addition séquentielle de FCCP utilisant à haute résolution respirométrie. Par la suite, une fois qu'un signal est stable, la respiration est inhibée par l'addition de la roténone et antimycine A et le reste de fond respiration (respiration non mitochondriale) est soustrait de tous les résultats. La consommation d'oxygène est exprimée en pmol / (sec x nombre de cellules). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Respiration tampon 13
Chimique Concentration
Saccharose 110 mM
EGTA 0,5 mM
MgCl2 3,0 mM
KCl 80 mM
K-lactobionate 60 mM
KH 2 PO 4 10 mM,
taurine 20 mM,
Hepes 20 mM,
BSA 1,0 g / l
pH 7.1

Tableau 1: Composition du tampon de la respiration.

Discussion

L'objectif du présent protocole était d'utiliser à haute résolution respirométrie pour mesurer les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale »(I-IV) des taux respiratoires, la capacité du système de transport d'électrons mitochondriale maximale et l'intégrité de la membrane externe mitochondriale.

Il y a quelques étapes critiques dans le présent protocole. Premièrement, les taux de consommation d'oxygène cellulaire sont généralement normalisées au nombre de cellules (pmol / [sec x nombre de cellules]). Par conséquent, avant de contrôler la consommation d'oxygène cellulaire, il est essentiel d'utiliser un dispositif qui permet des mesures précises et fiables du nombre de cellules. Dans le présent protocole d'un compteur de cellules automatisé a été utilisé (étape 3.7 du protocole et la table des matières). Une deuxième étape critique, en particulier dans les cellules perméabilisées, est le choix du tampon respiratoire dans lequel les cellules sont remises en suspension perméabilisées (étape 3.6 du protocole). Etant donné que la perméabilisation cellulaire peut provoquer une perte de intracellulaions r, il est très important que le moyen utilisé lors de perméabilisation est compatible avec l'environnement intracellulaire. Par conséquent, un tampon de respiration doit contenir une composition et une osmolarité qui reflète à la fois intracellulaire et extracellulaire du milieu (tableau 1) 13. En outre, pour la perméabilisation cellulaire optimale et efficace, il est essentiel de titrer la concentration digitonine, non seulement pour chaque type de cellule, mais également pour chaque densité des cellules, afin d'identifier sa concentration optimale et efficace la plus faible. Si la concentration est trop faible digitonine, les cellules ne seront pas perméabilisées. En revanche, l'exposition des cellules à de grandes quantités de digitonine endommager la membrane externe mitochondriale. Par conséquent, un autre point important est d'étudier l'intégrité de la membrane externe mitochondriale. Afin de ne pas sous-estimer la capacité respiratoire cellulaire, il est également crucial que les expériences de respirométrie sont effectuées à une température physiologique (37 ° C). Un autre point important à considérer est l'utilisation de quantités saturantes d'ADP, en raison de la limitation de la diffusion de l'ADP par rapport à l'oxygène dans les cellules perméabilisées et niveaux de substrat suffisantes pour obtenir un flux respiratoire maximal. Dans certaines expériences dans les cellules perméabilisées, il peut arriver que l'addition de substrats exogènes et ADP ne conduit pas à une augmentation considérable du taux de respiration. Cela peut être dû à plusieurs facteurs. Par exemple, l'utilisation de concentrations élevées de digitonine pour perméabiliser les cellules peut endommager la membrane externe mitochondriale. Par conséquent, on doit doser la digitonine afin de déterminer la concentration optimale pour chaque type de cellule et la densité. En outre, la pureté de la digitonine est également très critique, et disponible dans le commerce digitonine peut varier de manière significative dans la pureté et de nouveaux lots de digitonine acheté doit être titré pour déterminer leurs concentrations optimales pour perméabilisation cellulaire. En outre, il existe plusieurs types de membrane plasmique cellulaire porogèneagents ayant des propriétés différentes. Par exemple, la saponine est un détergent doux que la digitonine, et en fonction du type de cellule, un réactif de perméabilisation cellulaire appropriée doit être sélectionnée.

La plupart des inhibiteurs de la fonction mitochondriale utilisés dans des essais de respirométrie, tels que la roténone antimycine A, sont solubles uniquement dans l'éthanol et collent aux chambres de oxygraphe et les bouchons, ce qui inhibe la respiration cellulaire. Pour éviter ce problème, les chambres de oxygraphe et les bouchons doivent être lavés abondamment avec de l'éthanol à 95%, après chaque essai. Un autre point important à considérer est que, pour les deux tests de respiration cellulaire intacts et perméabilisées, la densité cellulaire, le type et la culture cellulaire confluence peuvent influer sur les taux respiratoires. Par exemple, avec des cellules HepG2, on utilise généralement une densité cellulaire de 1 à 2 millions de cellules par chambre. En utilisant la densité cellulaire très faible pendant respirométrie peut donner lieu à un signal très faible. Nous avons également observé que la culture cellulaire peuvent affecter les confluence taux respiratoires. Pour example, lorsque les cellules HepG2 sont cultivées très confluentes (plus de 100%), ils consomment beaucoup moins d'oxygène.

Pour obtenir un flux d'oxygène stable et reproductible au cours des expériences, un autre point important à considérer est le maintien de la haute résolution respirométrie instrument- c. -à- échange régulier de polarographiques membranes de capteurs d'oxygène et des corrections de fond instrumentales. Pour les expériences avec le découpleur FCCP, il se peut que l'addition de FCCP aux cellules ne stimule pas la respiration cellulaire et le flux maximal est pas obtenue, mais la respiration cellulaire est inhibée. L'inhibition de la consommation d'oxygène cellulaire par addition de FCCP peut indiquer que la concentration FCCP n'a pas été optimale et était trop élevé. Pour ces expériences, pour chaque essai, il est essentiel pour titrer soigneusement la concentration FCCP pour obtenir un flux maximal.

Une limitation de haute résolution respirométrie est que le criblage à haut débit, mise en place decourbes dose-réponse et les expériences de cours de temps pour des quantités limitées d'échantillons biologiques ne sont pas réalisables. Pour ces essais, on peut utiliser d'autres instruments, tels que l'analyseur de flux extracellulaire. D'autres limitations sont i) le dispositif est pas automatisé et nécessite la présence permanente d'un opérateur, ii) il est temps, iii) il n'a que deux chambres et deux tests peuvent être exécutés à un moment, iv) l'entretien de l'instrument , tels que le changement des membranes et des étalonnages, exige beaucoup de temps et v) les chambres ne sont pas à usage unique et peuvent être contaminés par des inhibiteurs. Les avantages de la résolution oxygraphe élevée par rapport aux dispositifs traditionnels polarographiques d'électrodes d'oxygène sont i) une sensibilité plus élevée, ii) un plus petit nombre d'échantillons biologiques nécessaires, iii) les taux respiratoires peuvent être mesurés simultanément dans deux chambres et iv) le dispositif a réduit fuite d'oxygène. Certains avantages de la haute résolution oxygraphe sur le flux analyseur extracellulaire sont i) réduire les coûts de ladispositif et consommables et ii) la faisabilité des protocoles de titrage substrat-découplant-inhibiteur.

Les applications futures ou directions après la maîtrise de cette technique sont des mesures simultanées de la respiration cellulaire, le potentiel de la membrane mitochondriale, H 2 O 2, les niveaux d'ATP et de calcium à l' aide de capteurs optiques dans la même chambre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma A 4386 Chemical
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate Merck 1.00127 Chemical
BSA Sigma A 6003 Chemical
FCCP Sigma C 2920 Chemical, dissolve in ethanol
Countess automated cell counter  Thermo Fisher Scientific n/a Automated cell counting instrument
Cytochrome c Sigma C 7752 Chemical
Digitonin Sigma D 5628 Chemical, dissolve in DMSO
DMEM Gibco 31966021 Medium
EGTA fluka 3779 Chemical
FBS Gibco 26010-074 Medium component
Glutamate Sigma G 1626 Chemical
Hepes Sigma H 7523 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
KH2PO4 Merck 1.04873 Chemical
K-lactobionate Sigma L 2398 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k  Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
Oligomycin Sigma O 4876 Chemical, dissolve in ethanol
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122 Chemical
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical
Trypsin Sigma T 4674 Chemical

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References

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