Høj opløsning respirometri at vurdere mitokondrie funktion i permeabiliseret og intakte celler

Biology
 

Summary

Høj opløsning respirometri anvendes til at bestemme mitokondrie iltforbrug. Dette er en enkel teknik til at bestemme mitochondriske respiratorisk kæde-komplekser '(I-IV) respirationsfrekvenser, maksimal mitokondriel elektrontransport systemkapaciteten, og mitokondriel ydre membran integritet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J. Vis. Exp. (120), e54985, doi:10.3791/54985 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Mitokondrier opfylde vigtige roller i cellulære energiomsætning, især ved hjælp af ilt til at producere adenosin trifosfat (ATP). De er impliceret i celledød og i flere humane sygdomme. Mitokondrie oxidative fosforylering (OXPHOS) kombinerer elektron transport langs elektron transportkæden med iltforbrug og ATP-syntese. Mitokondrie tricarboxylsyre (TCA) cyklussen er involveret i omdannelsen af proteiner, kulhydrater og fedt til energi rige forbindelser som nikotinamidadenindinucleotid (NADH) og flavinadenindinukleotid (FADH 2). Elektroner af NADH og FADH 2 overføres derefter til de respiratoriske elektrontransportkæden proteinkomplekser (I-IV) placeret i den indre mitokondrielle membran. Derudover kan to andre redox pathways overføre elektroner til elektrontransportkæden: i) mitokondrie elektron-overførende flavoprotein (ETF) som er placeret på matrixen flade af den indvendige mitochondrial membran, og leverer elektroner fra fedtsyre β-oxidation; og ii) mitokondrie glycerophosphat dehydrogenase som oxiderer glycerophosphat til dihydroxyacetonefosfat og feeds elektroner til den mitokondrielle elektrontransportkæden. Kompleks IV (den ultimative elektronacceptor) overfører elektroner til en oxygen-molekyle, konvertere ilt til to molekyler vand. Flytning af elektronerne fra respiratorisk elektrontransportkæden kompleks I-IV kobles med proton flow fra den mitokondriske matrix til intermembrane rum, der etablerer en elektrokemisk gradient over den mitokondriske indre membran. Bagefter mitokondrie kompleks V (ATP syntase) pendulfart de hydrogenioner tilbage ind i den mitokondrielle matrix og syntetiserer ATP molekyler. OXPHOS funktion kan vurderes in vivo og in vitro under anvendelse af forskellige teknikker og forskellige mitochondriale respiration tilstande kan opnås. I isolerede mitokondrier følgende respiratorisk-ry tilstande kan måles: i) basal mitokondrie respiration (tilstand 1), ii) iltforbrug efter tilsætning af specifikke substrater af de mitochondriale respiratoriske kæde-komplekser (tilstand 2), iii) maksimal mitokondrie iltforbrug efter tilsætning af mættende koncentrationer af adenosindiphosphat (ADP) (tilstand 3), og iv) hvilende respiration efter ADP forbrug (omregnet til ATP) (tilstand 4). I intakte celler følgende respiratoriske tilstande kan måles: i) basale cellulære iltforbrug i overværelse af endogene substrater og ADP, ii) basal cellulær iltforbrug i tilstedeværelse af oligomycin (oligomycin-ufølsom respiration) og oligomycin-følsomme respiration (ATP omsætning), iii) FCCP ukoblet respiration, og iv) ikke-mitokondriel respiration efter tilsætning af antimycin A og rotenon. I permeabiliserede celler kan specifikke substrater af elektrontransportkæden komplekser og ADP tilsættes og maximum komplekse-afhængig respirationsfrekvenser such så kompleks I-, II- og IV-afhængige respiratoriske satser kan måles.

Målinger af cellulære respiration giver vigtig indsigt i mitokondrie respiratoriske kapacitet specifik for komplekser I-IV, mitokondrie integritet og energi stofskifte 1, 2, 3. En af de anordninger, der muliggør målinger af mitokondrie iltforbrug med stor nøjagtighed, opløsning og følsomhed er høj opløsning oxygraph 4. Den høje opløsning oxygraph enhed indeholder to kamre med injektion porte og hvert kammer er udstyret med en polarografisk ilt sensor. Cellular eller isolerede mitokondrie suspensioner omrøres kontinuerligt i respirometer. For at vurdere mitokondriefunktionen, substrater og inhibitorer for mitokondriel kompleks aktivitet kan tilføjes efter standardprotokoller. Substrater og inhibitorer kan titreres ved injektion into kamrene i oxygraph og forbrug ilt satser beregnes ved hjælp af software og udtrykt som picomol per sekund per antal celler. Høj opløsning respirometri giver flere fordele i forhold til traditionelle og konventionelle polarografisk oxygenelektrode enheder, herunder øget følsomhed og evnen til at arbejde med et lille antal biologiske prøver såsom intakte eller permeabiliserede celler. Derudover indeholder hver enhed to kamre, og respiratoriske satser kan optages samtidigt for sammenligninger af iltkoncentrationer. Høj opløsning oxygraph har også den fordel, reduceret lækage af oxygen fra enheden kamre sammenlignet med traditionelle polarografiske oxygen elektrodeanordninger. En anden indretning nylig udviklet til at måle cellulær iltforbrug er den 96-brønd ekstracellulære flux analysator 5. Det ekstracellulære flux analysator er udstyret med fluorescens i stedet for polarografiske sensorer. Fordelene ved den ekstracellulæreflux analysator sammenlignet med den høje opløsning oxygraph er i) er en stort set automatiseret anordning, ii) er det muligt at måle iltforbruget i 24- og 96-brønds plader til high-throughput screening, derfor kræver mindre mængder biologiske prøver, og iii) yderligere måling af cellulær glycolytiske flux er mulig. Ulemperne ved det ekstracellulære flux analysator i sammenligning med den høje opløsning oxygraph er i) de høje omkostninger ved indretningen og til hjælpematerialer såsom fluorescerende plader, som er ikke-genanvendelige, og ii) kun fire forbindelser pr assay / brønd er injicerbare derfor er systemet ikke er muligt for substrat-afkobler-inhibitor-titrering protokoller.

I den foreliggende undersøgelse, bruger vi høj opløsning respirometri at bestemme mitokondrielle respiration. For cellulære eksperimenter forbrug oxygen cellerne permeabiliseres for at tillade optagelse af eksogent ADP og oxiderbare mitokondriske substrater til tilførsel elektroner i complexes i åndedrætsorganerne. Denne fremgangsmåde giver mulighed dissektion af individuelle mitokondriske komplekser respiratoriske kapacitet, hvilket er en klar fordel i forhold til intakte celler (mange substrater er celle-impermeabel). Dog vil cellemembranpermeabilisering forstyrre barriere mellem cytosolen og ekstracellulære rum og medium (udvaske af cytosoliske opløste stoffer) og sammensætningen af ​​det intracellulære rum ækvilibreres med det ekstracellulære medium. En af ulemperne ved permeabiliserede celler frem intakte celler er, at den mitokondriske ydre membran kan blive beskadiget, hvis store mængder vaskemiddel anvendes under celle permeabilisering. I intakte celler, basal, koblet og ukoblet respiration af intakte celler kan måles. Denne metode evaluerer oxygen forbrug af intakte celler uden tilsætning af exogene substrater og ADP, der gengiver den respiratoriske funktion i den integrerede celle og også give oplysninger om maksimal mitokondriel elektron transport kapacitet 6, 7. En af fordelene ved intakte celler frem permeabiliserede celler er, at cellulære miljø ikke forstyrres, og mitokondrier er i kontakt med hele komponenter i cellerne. For at permeabilisere den cellulære plasmamembran, har detergenter såsom digitonin blevet anvendt 8. Dog kan mitokondrie ydre membran integritet blive truet, hvis store mængder digitonin er ansat. For at bekræfte, at mitokondrier ydre membran integritet ikke kompromitteres i permeabiliserede celler, er digitonin titrering udført for at bestemme den optimale koncentration for cellulær permeabilisering. Til disse eksperimenter cellerne resuspenderes i respiration medium og digitonin koncentration bestemmes ved titrering ved respirometri i nærvær af mitokondrielle substrater og ADP og respirationsfrekvenser måles. Respiration af intakte, ikke-permeabiliserede celler ikke stimuleret i nærvær af mitochondrial substrater og ADP. Imidlertid ville efterfølgende trinvis digitonin titrering opnåelse gradvis permeabilisering af plasmamembraner, og der opnås optimal digitonin koncentration. Dette fremgår af stigningen i respiration op til fuld permeabilisering. Mitokondrie kvalitet og ydre membran integritet kan verificeres ved at tilføje eksogene cytochrom c 2, 9. Cytochrom c er en 12 kDa elektron bærer proteinet ifølge den mitokondrielle elektrontransportkæden 10, 11, 12. Det er lokaliseret i mitokondriske intermembrane rum, og er involveret i oxygenforbrug, transporterer elektroner fra kompleks III til kompleks IV. Når den mitokondriske ydre membran er beskadiget, er cytochrom c frigives, og mitokondriel iltforbrug reduceres. Ved tilsætning af eksogent cytochrom c, alle udbygninger i mitokondrie respiration er indikativ for enforstyrret mitokondriske ydre membran.

I permeabiliserede celler, substrater og hæmmere af mitokondrie kompleks aktivitet tilsættes efter forskellige protokoller 3, 9. For eksempel for at undersøge mitochondriske kompleks-drevet respirationsfrekvenser, kan følgende protokol anvendes. Efter permeabilisering af cellerne, er første kompleks I stimuleres af substraterne malat og glutamat, som genererer NADH som substrat til det respiratoriske kæde og provokere aktiveringen af ​​komplekse I. Derefter tilsættes ADP tilsat til omdannelse til ATP (tilstand 3, aktiv kompleks I-afhængige respiration). Efter en stabil signal er nået, rotenon (mitochondrial kompleks I-inhibitor) indgivet for at inhibere kompleks I. Rotenone efterfølges af succinat til FADH 2 og aktivere kompleks II (tilstand 3, aktivt kompleks II-afhængige respiration). For at måle kompleks IV-afhængige respiration, første kompleks III-afhængige respiration inhiberes ved tilsætning af antimycin A (mitokondriel kompleks III inhibitor). Bagefter er kompleks IV-afhængig respiration stimuleret ved indgivelse ascorbat og tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD kan auto-oxidere i respiration puffer, derfor den maksimale kompleks IV-afhængig respirationshastighed (State 3) beregnes ved at subtrahere respirationshastigheder før og efter tilsætning af natriumazid, en inhibitor af mitokondriel kompleks IV. Respirationsfaserne eksperimenter kan udføres i to kamre i en oxygraph parallelt-one tjener som en kontrol (ikke-stimulerede celler), den anden indeholder de stimulerede celler. Det er klart, at cellerne kan forbehandles på forskellige måder, fx med lægemidler, der påvirker mitochondriale funktioner, før deres iltforbruget måles i oxygraph kammeret. Denne protokol tillader funktionel undersøgelse af de enkelte mitokondrie respiratoriske kæde komplekser. Desuden kan man måle maksimal ADP-stimulerederespiration (tilstand 3) af permeabiliserede celler under anvendelse exogen fedtsyre i form af palmitat. I denne protokol, er koncentrerede lagre af natriumpalmitat konjugeret med ultra fedtsyrefrit bovint serumalbumin (BSA) (6: 1 molforhold palmitat: BSA). Bagefter celler først er permeabiliserede med digitonin og mitokondrielle respiration bedømt ved tilsætning af carnitin og palmitat efterfulgt af tilsætning af ADP (tilstand 3, maksimal respiration). Derefter oligomycin tilføjes efterligne tilstand 4 (state 4o) og respiratorisk kontrol ratio (RCR) beregnes som tilstand 3 / stat 4o. β-oxidation fremmer produktion af acetyl CoA (der træder i TCA cyklus) og generering af FADH 2 og NADH, elektronerne hvoraf føres til elektrontransportkæden ved elektronmikroskopi-overførende flavoprotein og β-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase. Mitokondrier er i centrum af fedtsyremetabolisme og beskrevet palmitat-BSA-protokol kan anvendes af forskere undersøger fedtty acid oxidation. I intakte celler, er aktivatorer og inhibitorer af mitokondrie kompleks aktivitet tilføjet efter en anden protokol 6, 9. Til disse forsøg er først iltforbrug af ikke-permeabiliserede celler i fravær af eksogene substrater målt (phosphorylerende respiration sats). Derefter ikke-phosphorylerende respirationsfrekvens målt efter tilsætning af oligomycin, som er en inhibitor af mitokondriel ATP syntase. Bagefter protonophore carbonyl cyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) administreret i forskellige koncentrationer og den maksimale mitokondrie ukoblet respirationsfrekvens måles. Protonophores såsom FCCP kan fremkalde en forøgelse i proton permeabilitet af den indre membran, så passiv bevægelse af protoner til at sprede den chemiosmotic gradient. En stigning i proton permeabilitet afkobler oxidative respiration (ingen ATP produktion) og inducerer en stigning i oxygen forbrug. Bagefter rotenon og antimycin A tilføjes til inhibere mitokondrisk respiration, og ikke-mitokondriel respiration subtraheres fra alle andre respiratoriske satser.

Satserne forbrug ilt kan udtrykkes som IO 2 [pmol x sek -1 x 10 -6 celler] (ilt flow per million celler), der beregnes ved at dividere volumen-specifik ilt flux (i det lukkede ilt kammer), JV, O 2 [pmol x sek-1 x ml-1] af cellekoncentration i celle kammer (antal celler per volumen [10 6 celler ∙ ml 1]) 15. Cell-mass specifik ilt flux, JO 2 [pmol x sek -1 x mg -1], er flow per celle, IO 2 [pmol x sek -1 x 10 -6 celler], divideret med massen per celle [mg ∙ 10 6 celler]; eller volumen-specifik flux, JV, O 2 [pmol x sek -1 x ml -1], divideret med masse pr volume [mg ∙ ml 1]. JO 2 er oxygen flux pr celleprotein, tørvægt eller cellevolumen.

I den foreliggende undersøgelse under anvendelse høj opløsning respirometri beskriver vi protokoller til at bestemme i) optimal digitonin koncentration for fuldstændig cellulær plasma membranpermeabilisering (digitonin titrering assay), ii) mitokondrie ydre membran integritet under anvendelse exogen cytochrom c, iii) mitochondriale respiratoriske kæde-komplekser I , II og IV maksimale respiratoriske satser i digitonin-permeabilized HepG2-celler i nærvær af exogent ADP og mitochondriale respiratoriske kæde substrater, og iv) basal, koblet og maksimal ukoblet respiration (maksimal elektron transportkapaciteten) af intakte celler uden tilsætning af exogene substrater og ADP, der gengiver den respiratoriske funktion i den integrerede celle.

Protocol

1. Cellekultur

  1. Kultur human hepatoma HepG2 celler 6 i 25 cm 2 celledyrkningskolber i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en inkubator (5% CO 2, 95% luft) (podningsdensitet: 1 x 10 6 celler pr 25 cm2 cellekultur kolbe, inkubationstid i 37 ° C inkubator: 48 timer, celledensitet på sammenflydning: 4-5 x 10 6 celler pr 25 cm 2 cellekultur kolbe).
  2. Udfør eksperimenterne når cellerne er 90% til 95% konfluente.

2. Høj opløsning respirometri Kalibrering af polarografisk Oxygen sensorer

  1. Afpipetteres 2,1 ml respiration puffer i en oxygraph kammer og rør bufferen kontinuerligt under anvendelse af en magnetisk omrøringsstang stede i kammeret (700 rpm) ved 37 ° C i 1 time, indtil et stabilt oxygen flux signalden polarografisk ilt sensoren er opnået.
    BEMÆRK: polarografisk ilt elektroder inden for hver oxygraph kammer koncentration foranstaltning ilt og beregne iltforbrug (flux) inden for hver kammer. Koncentrationen af ​​ilt og forbrug ilt satser (flux) vises real-time online i en computer ved hjælp af software til indsamling og analyse af data.
  2. Udfør en luft kalibrering af polarografisk oxygensensor ifølge producentens protokoller 14.
    BEMÆRK: Kalibrering af polarografiske ilt sensorer i respiration medier og iltkoncentrationen i medierne på luftmætning eksperimentel temperatur udføres kun en gang dagligt om morgenen. Bagefter medierne kan fjernes fra kamrene og celler resuspenderes i en frisk respiration medier tilsættes til en oxygraph kammer og respirationsfrekvenser måles. Efter det første eksperiment, kan kammeret blive vasket og kan udføres yderligere serie af eksperimenter i than samme kammer uden yderligere kalibreringer.

3. trypsinisering af adhærente celler, tælle celler

  1. På dagen for eksperimentet opsug DMEM fra 25 cm2 cellekultur kolbe.
  2. Skyl cellekultur monolag i dyrkningskolbe med 5 ml phosphatbufret saltvand (PBS).
  3. Afpipetteres 0,5 ml 25 mg / ml trypsin-opløsning (forvarmet til 37 ° C i et 37 ° C vandbad) til cellemonolaget i kulturen kolben og inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C i en inkubator (5% CO2 , 95% luft).
  4. Afpipetteres 5 ml DMEM indeholdende 10% FBS i de løsnede celler i cellekultur kolbe og suspendere cellerne ved pipettering.
  5. Overførsel resuspenderes cellerne til et 15 ml centrifugerør og centrifugeres i 5 minutter ved 350 xg ved stuetemperatur og dekanter supernatanten.
  6. Resuspender cellepelleten i 1 ml respiration buffer 13 (T stand 1).
  7. i> Tæl celler under anvendelse af en celletæller og resuspender dem i respiration puffer til en endelig densitet på 1 x 10 6 celler / ml. Da cellulære respiration satser vil blive normaliseret til celle nummer, tælle cellerne med en nøjagtig og præcis celletæller.

4. høj opløsning respirometri

  1. Efter luft kalibrering (udføres kun en gang dagligt, trin 2,1-2,2), opsug åndedræt medium fra et kammer i oxygraph og tilsæt 2,1 ml cellesuspension (1 x 10 6 celler / ml) fra trin 3.7 til kammeret.
  2. Luk oxygraph kammer ved indføring af proppen.
  3. Omrør cellerne kontinuerligt under anvendelse af en magnetisk omrøringsstang stede i kammeret (700 rpm) ved 37 ° C og optage cellulære respiration i 5-10 min, indtil en stabil oxygen flux signal opnås.
    BEMÆRK: Koncentrationen af ​​ilt og ilt flux signal vises real-time online i en computer ved hjælp af software til indsamling og analyse af datas = "xref"> 14.
  4. Bagefter injicere substrater og inhibitorer for mitokondrie respiration gennem titanium injektion havne i propperne ved hjælp af følgende protokoller.

5. Digitonin Titrering i intakte celler ved respirometri

  1. Forbered en oxygraph kammer indeholdende cellesuspension (1 x 10 6 / ml) efter den er beskrevet i trin 4.1 til 4.3 i protokollen procedure.
  2. Injicer 2 pi 0,2 mM rotenon (0,2 uM) »PAS« i oxygraph kammer indeholdende cellesuspension gennem titanium injektionsporten af ​​kammeret prop anvendelse af en sprøjte og registrere cellulære respiration i 5-10 min, indtil en stabil oxygen flux signal opnås .
    BEMÆRK: Alle injektioner i følgende trin udføres gennem titanium injektion havne propper bruger sprøjter. Tilsætning af rotenon er valgfri (det forhindrer revers elektronstrøm) og kan udelades for digitonin titreringsforsøg, setrin 6.3.
  3. Injicer 20 pi 1 M succinat (10 mM) i oxygraph kammeret og optage cellulære respiration i 5-10 min, indtil en stabil oxygen flux signal opnås.
  4. Der injiceres 10 pi 0,5 M ADP (2,5 mM) i oxygraph kammeret og optage cellulære respiration i 5-10 min, indtil en stabil oxygen flux signal opnås.
  5. Injicer 2 pi 2 mM digitonin (2 uM) i oxygraph kammeret og optage cellulære respiration i 2-5 min, indtil en stabil ilt signal er opnået.
  6. Igen injicere 2 pi 2 mM digitonin i oxygraph kammeret og optage cellulære respiration i 2-5 min, indtil en stabil ilt signal er opnået.
    BEMÆRK: trinvis tilsætning af digitonin til cellerne vil inducere en stigning i cellulær iltforbrug og oxygen flux signalet øges.
  7. Fortsæt indsprøjtning 2-4 pi 2 mM digitonin trinvis (2-4 uM hvert trin) ind i kammeret. Efter hvert trin, optage cellulære respiration for 2-5 mi indtil et stabilt oxygen flux signal opnås.
    BEMÆRK: Stop indsprøjtning digitonin når ilt flux signal når et maksimalt niveau, og yderligere injektioner af digitonin øger ikke respiration sats. Læserne skal bestemme optimal digitonin koncentration i deres laboratorier ved hjælp af deres egne reagenser og brug opnås optimal digitonin koncentration i trin 6.2 og 7.2 i de følgende protokoller for deres eksperimenter.

6. Evaluering af mitokondrie ydre membran Integrity: cytochrom C

  1. Forbered en oxygraph kammer indeholdende cellesuspension (1 x 10 6 / ml) efter den er beskrevet i trin 4.1 til 4.3 i protokollen procedure.
  2. Injicer 2 pi 8 mM digitonin (8 uM) i oxygraph kammer indeholdende cellesuspensionen (1 x 10 6 / ml) og permeabilisere cellerne i 5 minutter.
  3. Injicer 20 pi 1 M succinat (10 mM) i oxygraph kammeret og optage cellulære respiration i 5-10 minutter, indtil et stabilt oxygen flux signal opnås.
  4. Der injiceres 10 pi 0,5 M ADP (2,5 mM) i oxygraph kammeret og optage cellulære respiration i 5-10 min, indtil en stabil oxygen flux signal opnås.
    BEMÆRK: Tilsætning af ADP til cellerne vil stimulere kompleks I og inducere en stigning i oxygenforbrug, og oxygen flux signalet vil øge og stabilisere.
  5. Injicer 5 pi 4 mM cytochrom c (10 uM) i oxygraph kammeret og optage cellulære respiration i 5-10 min, indtil en stabil oxygen flux signal opnås.
  6. Endelig injicere 1 ml af 4 mg / ml oligomycin (2 ug / ml) og optage cellulære respiration indtil et stabilt oxygen flux signal opnås.

7. Maksimal ADP-stimuleret Respiration (stat 3) i permeabiliserede HepG2 celler

  1. Forbered en oxygraph kammer indeholdende cellesuspension (1 x 10 6 / ml) efter den er beskrevet i trin 4.1 til 4.3 i protokollen procedure.
  2. Injicer 2 pi 8 mM digitonin (8 uM) i oxygraph kammer, der indeholder cellesuspensionen og permeabilisere cellerne i 5 minutter.
  3. Injicer 12,5 pi 0,8 M af malat (5 mM) og 10 pi 2 M af glutamat (10 mM) i det oxygraph kammeret. Optag cellulær respiration, indtil et stabilt oxygen flux signal opnås.
  4. Der injiceres 10 pi 0,5 M ADP (2,5 mM) i oxygraph kammeret og optage cellulære respiration indtil oxygen flux signal stiger og stabiliseres.
    BEMÆRK: Tilsætning af ADP til cellerne vil inducere en stigning i oxygenforbrug og oxygen flux signalet øges.
  5. Indsprøjtes 2 ul 0,2 mM rotenon (0,2 uM) "ADVARSEL" ind i oxygraph kammer og optage cellulære respiration indtil signal aftager ilt flux og stabiliserer.
  6. Bagefter injicere 20 ul 1 M succinat (10 mM) i oxygraph kammeret og optage cellulære respiration indtil oxygen flux signal stigningerog stabiliserer.
  7. Derefter injicere 2 pi af 5 mM antimycin (5 uM) "ADVARSEL" ind i oxygraph kammer og optage cellulære respiration indtil signal aftager ilt flux og stabiliserer.
  8. Derefter injiceres 2,5 pi 0,8 mM ascorbat (1 mM) og umiddelbart efter injicere 2,5 pi 0,2 mM TMPD (0,25 mM) i oxygraph kammeret og optage cellulære respiration indtil oxygen flux signal stiger og stabiliseres.
  9. Endelig injicere 10 pi 1 M natriumazid (5 mM) "ADVARSEL" ind i oxygraph kammeret og optage cellulære respiration indtil signal aftager oxygen flux og stabiliserer.

8. Oxygen Forbrug af intakte celler

  1. Forbered en oxygraph kammer indeholdende cellesuspension (1 x 10 6 / ml) efter den er beskrevet i trin 4.1 til 4.3 i protokollen procedure.
  2. Injicer 1 pi 4 mg / ml oligomycin (2 ug / ml) ind i oxygraph kammer indeholdende cellesuspension end rekord cellulær respiration, indtil et stabilt oxygen flux signal opnås.
  3. Bagefter injicere 1 ml af 0,2 mM FCCP (0,1 uM) "ADVARSEL" ind i oxygraph kammer og optage cellulære respiration indtil ilt flux signal stiger og stabiliserer.
  4. Sprøjt 3 pi 0,2 mM FCCP (0,4 uM) i oxygraph kammer og optage cellulære respiration indtil ilt flux signal stiger yderligere og stabiliserer.
  5. FCCP i 0,1 til 0,3 uM trin titrere ved at injicere 1-3 pi på 0,2 til 1 mM FCCP (0,1 til 2 pM slutkoncentration i kammeret) i oxygraph kammeret, indtil den oxygen flux signal når dens maksimale niveauer og ingen yderligere stigninger og derefter begynder at falde.
    BEMÆRK: Stop injicere FCCP når ilt signal når et maksimalt niveau og begynder at falde.
  6. Derefter injiceres 2 pi 0,2 mM rotenon (0,2 uM) og 2 pi 5 mM antimycin (5 uM) ind i kammeret. Optag åndedræt indtil than oxygen flux signal aftager og stabiliseres.

Representative Results

Bestemmelse af Optimum Digitonin Koncentration for Cellulær Permeabilisering: Digitonin Titrering Experiment

Digitonin titrering udføres for at bestemme den optimale koncentration for permeabilisering af HepG2-celler. Til disse eksperimenter er digitonin titreres i intakte celler i nærvær af rotenon, succinat (mitokondrie kompleks II substrat) og en mættende mængde af ADP (for at inducere kompleks II-afhængige tilstand 3), og respirationsfrekvenser måles ved baseline og efter hver titrering (figur 1A og 1B). Resultatet af dette forsøg viser, at i fravær af digitonin, cellulære respiration er meget lav og respiration af intakte, ikke-permeabiliserede celler ikke stimuleret i nærvær af mitokondrie substrat og ADP. Dog ved trinvis tilsætning af digitonin, er den cellulære plasmamembran permeabiliseret og mitochondrial respiration (kompleks II-afhængig tilstand 3) øges op til fuld permeabilisering når succinat og ADP trænger ind i cellerne. Resultaterne viser, at permeabilisering ved en digitonin koncentration på 8-12 uM er optimal for ADP-stimuleret respiration af HepG2-celler. Dog kan mitokondrie ydre membran integritet blive truet, hvis store mængder digitonin er ansat. Som vist i figur 1, overskydende mængder af digitonin inducerede en reduktion i kompleks II-afhængig tilstand 3 respiration indikerer kompromitteret mitokondriel ydre membran integritet.

I de foreliggende og følgende protokoller, er alle iltforbruget satser udtrykt som IO 2 [pmol x sek -1 x 10 -6 celler] (ilt flow per million celler), der beregnes ved at dividere volumen-specifik ilt flux (i lukket ilt kammer), JV, O 2 [pmol x sek -1 x ml -1] af celle koncentrat ion i cellen kammer (antal celler pr volumen [10 6 celler x ml-1]) 15.

figur 1
Figur 1: Digitonin titrering til bestemmelse af den optimale koncentration for permeabilisering af HepG2-celler. Den blå linje repræsenterer iltkoncentrationen; den røde linje repræsenterer oxygen flow (hældning oxygenkoncentration). Iltkoncentrationen falder over tid som celler bruger ilt. Iltforbruget udtrykkes som pmol / (sek x antal celler). (A) tracings fra høj opløsning respirometri hjælp digitonin, ADP og succinat som substrat til mitokondriel kompleks II-afhængige respiration (1 eksperiment). (B) Mitochondrial respiration satser fra 4 individuelle eksperimenter præsenteret som gennemsnit ± SD.upload / 54.985 / 54985fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Evaluering af mitokondrie ydre membran Integrity Brug en optimal Digitonin Koncentration

For at evaluere effekten af ​​optimal digitonin koncentration (8 uM) på den ydre mitokondriske membran integritet cellerne permeabiliseret med digitonin og mitokondriel ydre membran integritet testes ved måling af mitokondriel respiration efter efterfølgende tilsætning af succinat (mitochondrial kompleks II-afhængige hviletilstand 2 respiration i fravær af ADP), ADP (ADP stimulerede kompleks II-afhængig tilstand 3 respiration) og cytochrom c (ADP stimulerede kompleks II-afhængig tilstand 3 respiration i nærvær af cytochrom c), efterfulgt af tilsætning af oligomycin (en inhibitor af ATP syntase) at efterligne tilstanden 4. Som vist i figur 2

Figur 2
Figur 2: cytochrom C ikke øger respiration af cellerne behandlet med digitonin (8 uM). Repræsentative respiratoriske spor for cytochrom c testen med høj opløsning respirometri. Celler permeabiliseret med 8 uM digitonin og mitokondriel ydre membran integritet testes ved måling af respirationsfrekvenser efter efterfølgende tilsætning af 10 mM succinat (tilstand 2), 2,5 mM ADP (tilstand 3) og 10 uM cytochrom c (tilstand 3 i nærvær cytochrom c), efterfulgt af tilsætning af 2 ug / ml oligomycin at efterligne tilstanden 4. Respirationsfrekvens udtrykkes som pmol / (sec x million celler). CII: kompleks II. Klik her for at se en større version af dette tal.

Evaluering af mitokondrie ydre membran Integrity anvende en høj koncentration af Digitonin

For at demonstrere, at en meget høj koncentration af digitonin kan kompromittere mitokondriel ydre membran integritet, udførte vi et eksperiment under anvendelse af en høj dosis af digitonin. Til dette forsøg er celler permeabiliseret med 40 uM digitonin i stedet for 8 uM, og mitokondriel ydre membran integritet testes ved måling af mitokondriel respiration efter efterfølgende tilsætning af succinat (mitochondrial kompleks II-afhængige hviletilstand 2 respiration i fravær af ADP) ADP (ADP stimulerede kompleks II-afhængig tilstand 3 respiration) og cytochrom c (ADP stimulerede kompleks II-dependent tilstand 3 respiration i nærvær af cytochrom c), efterfulgt af tilsætning af oligomycin at efterligne tilstanden 4 i nærvær af oligomycin (figur 3). Resultatet af dette forsøg viser, at cytochrom c forbedrer åndedræt af celler behandlet med en høj dosis af digitonin, hvilket indikerer et tab af cytochrom c fra den mitokondriske ydre membran indikerer kompromitteret mitokondriel ydre membran integritet.

Figur 3
Figur 3: Høj dosis af digitonin (40 uM) kompromitterer mitokondrie ydre membran integritet. Tracings fra høj opløsning respirometri bruge succinat som substrat. Den blå linje repræsenterer iltkoncentrationen; den røde linje repræsenterer oxygen flow (hældning oxygenkoncentration). Iltkoncentrationen falder over tid som celler bruger ilt. Iltforbruget udtrykkes sompmol / (sek x antal celler). Efterfølgende tilsætning af 40 uM digitonin, succinat (10 mM), ADP (2.5 mM), cytochrom c (10 uM) og oligomycin (2 ug / ml) er vist. CII: kompleks II. Klik her for at se en større version af dette tal.

Maksimal ADP-stimuleret respiration (stat 3) i permeabiliserede HepG2 Cells, Brug Overskydende Eksogene Substrater

Kompleks I-, er II og IV-afhængig maksimal ADP-stimuleret respiration (tilstand 3) af permeabiliserede HepG2-celler (1 x 10 6 celler / ml) med held målt under anvendelse overskydende exogene substrater (figur 4). Til dette forsøg er celler permeabiliseres med digitonin og mitochondriale forbrug oxygen satser måles efter efterfølgende tilsætning af substrater og inhibitorer som beskrevet i

Figur 4
Figur 4: Vellykket måling af maksimal ADP-stimuleret respiration (tilstand 3) af permeabiliserede HepG2-celler. Respirationsfrekvens udtrykkes som pmol / (sek x million celler). Celler permeabiliseres med 8 uM digitonin og mitokondrie respiratoriske satser måles efter den efterfølgende tilsætning af glutamat og malat (tilstand 3, kompleks I), rotenon at hæmme kompleks I, succinat (tilstand 3, kompleks II), antimycin at hæmme kompleks III og ascorbat / TMPD og natriumazid for at inhibere kompleks IV. Kompleks IV respiration (stat 3)fortolkes ved at subtrahere oxygenforbrug før og efter tilsætning af natriumazid. CI: kompleks I, CII: kompleks II, CIV: kompleks IV. Klik her for at se en større version af dette tal.

Mislykket Måling af Maximal ADP-stimuleret Respiration (stat 3) i permeabiliserede HepG2 celler

Kompleks I-, er II og IV-afhængig maksimal ADP-stimuleret respiration (tilstand 3) af permeabiliserede HepG2-celler (1 x 10 6 celler / ml) ikke med held målt ved anvendelse overskydende exogene substrater (figur 5). Til dette forsøg er celler permeabiliseres med digitonin og mitochondriale forbrug oxygen satser måles efter efterfølgende tilsætning af substrater og inhibitorer som beskrevet i figur 5. Som vist i figur 5 figur 4. En mulig forklaring på reducerede respiratoriske niveauer er forurening af oxygraph kamre med mitokondrie-hæmmere fra tidligere eksperimenter. Mitokondrie hæmmere såsom antimycin og rotenon er opløseligt i ethanol og kan holde sig til de oxygraph kamre og propper. Derfor oxygraph kamre og propper skal vaskes grundigt efter hvert forsøg.

Figur 5
Figur 5: Mislykket måling af maksimal ADP-stimuleret respiration (tilstand 3) af permeabiliserede HepG2-celler. Repræsentative respiratoriske spor af en mislykket eksperiment af komplekse I-, II- og IV-drevne maksimal ADP-stimuleret respiration (tilstand 3) af permeabiliserede HepG2-celler ved hjælp af høj-opløsning respirometri. Respirationsfrekvens udtrykkes sompmol / (sec x million celler). Celler permeabiliseres med 8 uM digitonin og mitokondrie respiratoriske satser måles efter den efterfølgende tilsætning af glutamat og malat (tilstand 3, kompleks I), rotenon at hæmme kompleks I, succinat (tilstand 3, kompleks II), antimycin at hæmme kompleks III og ascorbat / TMPD og natriumazid for at inhibere kompleks IV. Kompleks IV respiration (stat 3) fortolkes ved at fratrække iltforbrug før og efter tilsætning af natriumazid. Klik her for at se en større version af dette tal.

Og frakobles Respiration af intakte celler

HepG2-celler 'basale iltforbrug måles i nærvær af oligomycin (oligomycin-ufølsomme respiration) og sekventiel tilsætning af FCCP (figur 6). Basal cellulær respiration rate betegner oxygen forbrug af intakte HepG2-celler i nærvær af endogene cellulære substrater og kan ændre som reaktion på cellulær ATP efterspørgsel. Oligomycin-ufølsom respirationsfrekvens repræsenterer lække cellulære respiration og oligomycin-følsomme respirationsraten som repræsenterer cellulære ATP omsætning og beregnes ved at trække den oligomycin-ufølsomme respiration sats fra basal endogene respiration sats. Den kemiske afkobleren FCCP sekventielt tilsat ved forskellige koncentrationer og maksimal ukoblet respiration optaget. Den maksimale mitokondrielle koblet respiration sats (maksimal elektron transportsystem kapacitet) for denne eksperimentelle tilstand opnås ved 0,9-1,2 uM FCCP. Resultaterne viser en bifasisk aktivitet af FCCP i intakte HepG2-celler. Derfor, for hver eksperimentel tilstand, FCCP titreres for at opnå maksimal koblet respiration sats. Den koblet respiratoriske kontrol ratio (uRCR) beregnes ved at dividere FCCPafkoblet respiration sats med respirationsraten i tilstedeværelse af oligomycin. Oligomycin-følsomme respiration (ATP omsætning) beregnes ved at trække oligomycin-ufølsom respiration sats fra basal endogene respiration. Kobling effektivitet, som udgøres af den del af mitokondrie iltforbrug anvendes til at syntetisere ATP beregnes ved at dividere oligomycin-sensitive respirationsraten af ​​den basale respirationsraten. Ved afslutningen af ​​forsøget, at opnå ikke-mitokondriel respiration rate, er mitokondrie elektrontransportkæden inhibitorer tilsat, og ikke-mitokondriel respiration rate subtraheres fra alle resultater. Til eksperimentet vist i figur 6, den ikke-mitokondrielle respiration sats er 26 pmol / (sec x millioner celler), den basale respirationshastighed er 48 pmol / (sec x millioner celler), oligomycin-ufølsomme respirationsraten 7 pmol / (sec x millioner celler), oligomycin-sensitive respiration (ATP omsætning) 41 pmol / (sec x millioner celler) og coupling effektivitet 0,85.

Figur 6
Figur 6: og frakobles respiration af intakte celler. Repræsentative respiratoriske spor af HepG2-celler 'basal ilt forbrug målt i nærvær af oligomycin (oligomycin-ufølsomme respiration) og sekventiel tilsætning af FCCP hjælp høj opløsning respirometri. Derefter når et stabilt signal er nået, respiration inhiberes ved tilsætning af rotenon og antimycin A og den resterende baggrund respiration (ikke-mitokondriel respiration) subtraheres fra alle resultater. Iltforbruget udtrykkes som pmol / (sek x antal celler). Klik her for at se en større version af dette tal.

Respiration buffer 13
Kemisk Koncentration
saccharose 110 mM
EGTA 0,5 mM
MgCl2 3,0 mM
KCI 80 mM
K-lactobionat 60 mM
KH 2 PO 4 10 mM
Taurin 20 mM
Hepes 20 mM
BSA 1,0 g / l
pH 7.1

Tabel 1: Sammensætningen af respiration puffer.

Discussion

Formålet med denne protokol var at bruge høj opløsning respirometri at måle mitokondrie respiratoriske kæde komplekser '(I-IV) respiratoriske satser, maksimal mitokondrie elektron transportsystem kapacitet og mitokondrier ydre membran integritet.

Der er nogle kritiske skridt i denne protokol. Først cellulær iltforbrug satser sædvanligvis normaliseret til antallet af celler (pmol / [sec x antal celler]). Derfor, før overvågning forbrug cellulær ilt, er det vigtigt at anvende en anordning, der muliggør nøjagtige og pålidelige målinger af antallet af celler. I den foreliggende protokol en automatiseret celletæller har været brugt (trin 3.7 i protokollen og tabellen af ​​materialer). Et andet kritisk trin, især i permeabiliserede celler, er valget af respiration puffer, hvori permeabiliserede celler resuspenderes (trin 3.6 i protokollen). Eftersom cellulær permeabilisering kan inducere tab af intracellular ioner, er det meget vigtigt, at mediet anvendes under permeabilisering er forenelig med intracellulære miljø. Derfor bør respiration puffer indeholde en sammensætning og en osmolaritet, som afspejler både intracellulære og det ekstracellulære miljø (tabel 1) 13. Hertil kommer, for optimal og effektiv cellulær permeabilisering, er det afgørende at titrere digitonin koncentration ikke kun for hver celletype, men også for hver celle densitet, at identificere sin optimale og laveste effektive koncentration. Hvis digitonin koncentrationen er for lav, vil cellerne ikke permeabiliseres. Derimod vil udsættelse af cellerne til store mængder af digitonin beskadige den mitokondriske ydre membran. Derfor er en anden vigtig pointe er at undersøge mitokondriel ydre membran integritet. For ikke at undervurdere cellulære respiratoriske kapacitet, er det også afgørende, at der udføres respirometri eksperimenter ved en fysiologisk temperatur (37 ° C). Et andet vigtigt punkt at overveje er brugen af ​​mættende mængder af ADP på ​​grund af diffusion begrænsning af ADP versus oxygen i permeabiliserede celler og tilstrækkelige substratniveauer at opnå maksimal respiratorisk flux. I nogle eksperimenter i permeabiliserede celler, kan det ske, at tilsætning af exogene substrater og ADP ikke fører til en betydelig stigning i antallet af åndedræt. Dette kan være forårsaget af flere faktorer. For eksempel kan anvendelse af høje koncentrationer af digitonin at permeabilisere cellerne beskadige mitokondriske ydre membran. Derfor bør man titreres digitonin at bestemme den optimale koncentration for hver celletype og tæthed. Endvidere renhed digitonin er også meget kritisk, og kommercielt tilgængelige digitonin kan variere betydeligt i renhed og nye partier af indkøbt digitonin bør titreres at bestemme deres optimale koncentrationer for cellulær permeabilisering. Derudover er der flere typer af cellulære plasmamembran poredannendemidler med forskellige egenskaber. For eksempel, saponin er en mildere detergent end digitonin, og afhængigt af celletypen, bør vælges en passende celle permeabiliseringsreagenset.

De fleste inhibitorer af mitokondrisk funktion anvendes i respirometri assays, såsom rotenon antimycin A, kun opløselige i ethanol og holde sig til de oxygraph kamre og propper, inhibering cellulær respiration. For at undgå dette problem, skal oxygraph kamre og propper vaskes grundigt med 95% ethanol efter hver analyse. Et andet vigtigt punkt at overveje, er, at for både intakte og permeabiliserede cellulære respiration analyser, kan celletæthed, type og cellekultur sammenløbet påvirke respiratoriske satser. For eksempel med HepG2-celler, vi normalt bruge en celledensitet på 1 til 2 millioner celler pr kammer. Anvendelse af meget lav celletæthed under respirometri kan give anledning til en meget svagt signal. Vi bemærkede også, at cellekultur sammenflydning kan påvirke de respiratoriske satser. For EXAmple, når HepG2 celler dyrkes meget sammenflydende (mere end 100%), de forbruger meget mindre ilt.

For at opnå en stabil og reproducerbar ilt flux ved forsøg, et andet vigtigt punkt at overveje, er vedligeholdelsen af høj opløsning respirometri instrumentspecifikke dvs. regelmæssig udveksling af polarografiske ilt sensor membraner og instrumentale baggrund korrektioner. Til forsøg med afkobleren FCCP, kan det være, at tilsætning af FCCP til cellerne ikke stimulerer cellulær respiration og maksimal flux opnås ikke, men i stedet cellulær respiration inhiberes. Inhibering af cellulær iltforbrug ved tilsætning af FCCP kan indikere, at FCCP koncentration var ikke optimal og var for høj. Til disse eksperimenter for hvert assay, er det vigtigt at omhyggeligt titrere FCCP fusions opnå maksimal flux.

En begrænsning ved høj opløsning respirometri er, at high-throughput screening, etablering afdosisresponskurver og tidsforløbet eksperimenter for begrænsede mængder af biologiske prøver ikke er mulig. Til disse assays kan man anvende andre instrumenter, såsom det ekstracellulære flux analysator. Andre begrænsninger er i) enheden er ikke automatiseret og kræver den stadige tilstedeværelse af en operatør, ii) det er tidskrævende, iii) det har kun to kamre og kun to analyser kan køre på et tidspunkt, iv) vedligeholdelse af apparatet , såsom ændring af membranerne og kalibreringer, kræver en masse tid og v) kamrene er ikke engangsbrug og kan blive forurenet med inhibitorer. Fordelene ved den høje opløsning oxygraph forhold til traditionelle polarografiske oxygen elektrodeanordninger er i) højere følsomhed, ii) et mindre antal biologiske prøver påkrævet, iii) respirationsfrekvenser kan måles samtidigt i to kamre og iv) anordningen har reduceret oxygen lækage. Nogle af fordelene ved den høje opløsning oxygraph over ekstracellulære flux analysator er i) lavere omkostninger tilenhed og hjælpematerialer og ii) gennemførlighed af substrat-afkobler-inhibitor titrering protokoller.

Fremtidige applikationer eller retninger efter mastering denne teknik er samtidige målinger af cellulær respiration, mitochondriemembranpotential, H 2 O 2, ATP og calciumniveauer anvender optiske sensorer i det samme kammer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma A 4386 Chemical
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate Merck 1.00127 Chemical
BSA Sigma A 6003 Chemical
FCCP Sigma C 2920 Chemical, dissolve in ethanol
Countess automated cell counter  Thermo Fisher Scientific n/a Automated cell counting instrument
Cytochrome c Sigma C 7752 Chemical
Digitonin Sigma D 5628 Chemical, dissolve in DMSO
DMEM Gibco 31966021 Medium
EGTA fluka 3779 Chemical
FBS Gibco 26010-074 Medium component
Glutamate Sigma G 1626 Chemical
Hepes Sigma H 7523 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
KH2PO4 Merck 1.04873 Chemical
K-lactobionate Sigma L 2398 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k  Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
Oligomycin Sigma O 4876 Chemical, dissolve in ethanol
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122 Chemical
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical
Trypsin Sigma T 4674 Chemical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, (2), 297-312 (2011).
  2. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
  3. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Protoc. 7, (6), 1068-1085 (2012).
  4. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Mendez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27, (6), 583-596 (1995).
  5. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol Cell Physiol. 292, (1), C125-C136 (2007).
  6. Djafarzadeh, S., Vuda, M., Takala, J., Jakob, S. M. Effect of remifentanil on mitochondrial oxygen consumption of cultured human hepatocytes. PLoS One. 7, (9), e45195 (2012).
  7. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67, (10), 1022-1035 (2012).
  8. Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal Biochem. 416, (2), 218-227 (2011).
  9. Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
  10. Nicholls, P. Cytochrome c binding to enzymes and membranes. Biochim Biophys Acta. 346, (3-4), 261-310 (1974).
  11. Cortese, J. D., Voglino, A. L., Hackenbrock, C. R. Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c. Biochemistry. 37, (18), 6402-6409 (1998).
  12. Gorbenko, G. P. Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer. Biochim Biophys Acta. 1420, (1-2), 1-13 (1999).
  13. Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 11080-11085 (2000).
  14. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  15. Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. Mitochondr Physiol Network 17.18. OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. 64 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics