Høy oppløsning respirometri å vurdere mitokondrienes funksjon i permeabilized og intakte celler

Biology
 

Summary

Høy oppløsning respirometri brukes til å bestemme mitokondrie oksygenforbruk. Dette er en enkel teknikk for å bestemme mitokondrielle luftkjedekomplekser '(I-IV) respiratoriske priser, maksimal mitokondrielle elektrontransportsystem kapasitet, og mitokondrielle ytre membranintegritet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J. Vis. Exp. (120), e54985, doi:10.3791/54985 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Mitokondrier oppfylle viktige roller i cellulær energi metabolisme, særlig ved hjelp av oksygen for å produsere adenosin trifosfat (ATP). De er innblandet i celledød og i en rekke menneskelige sykdommer. Mitokondriell oksidativ fosforylering (OXPHOS) kombinerer elektrontransport langs elektrontransportkjeden med oksygenforbruk og ATP syntese. Den mitokondrielle trikarboksylsyre (TCA) syklusen er involvert i omdannelsen av proteiner, karbohydrater og fett til energirike forbindelser som nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) og flavin-adenin-dinukleotid (fadh 2). Elektroner fra NADH og FADH 2 blir deretter overført til de respiratoriske elektrontransportkjeden proteinkomplekser (I til IV) som er plassert i den indre mitokondrie-membran. I tillegg kan to andre redoks-reaksjonsveier overføre elektroner til elektrontransportkjeden: i) mitokondrielle elektronoverførende flavoprotein (etf) som er plassert på matrisen flate av den indre mitochondrial membran, og leverer elektroner fra fettsyre β-oksidasjon; og ii) mitokondrielle glycerofosfat-dehydrogenase, som oksyderer glycerofosfat til dihydroksyaceton fosfat og strømmer elektroner til den mitokondrielle elektrontransportkjeden. Kompleks IV (den endelige elektronakseptor) overfører elektroner til en oksygenmolekyl, omdannelse av oksygen til to molekyler vann. Flytting av elektroner fra luftelektrontransportkjeden kompleks I til IV er kombinert med proton strømning fra mitokondrie matrisen til den intermembrane plass som etablerer en elektrokjemisk gradient over mitokondrie indre membran. Etterpå mitokondrie kompleks V (ATP syntase) transporterer hydrogenioner tilbake inn i mitokondrie matrise og syntetiserer ATP molekyler. OXPHOS funksjon kan vurderes in vivo og in vitro ved hjelp av forskjellige teknikker og forskjellige mitokondrielle respirasjonssystemer tilstander kan oppnås. I isolerte mitokondrier følgende virkry tilstander kan måles: i) basal mitokondriell respirasjon (tilstand 1), ii) oksygenforbruk etter tilsetning av spesifikke substrater for de mitokondrielle respiratoriske kjede-komplekser (tilstand 2), iii) maksimalt mitokondrielle oksygenforbruk etter tilsetning av mettende konsentrasjoner av adenosindifosfat (ADP) (tilstand 3) og, iv) hviler åndedrett etter ADP forbruk (omdannet til ATP) (tilstand 4). I intakte celler følgende respiratoriske tilstander kan måles: i) basale cellulære oksygenforbruk i nærvær av endogene substrater og ADP, ii) basale cellulære oksygenforbruk i nærvær av oligomycin (oligomycin-insensitive respirasjon) og oligomycin-sensitive respirasjon (ATP omsetning), iii) FCCP ukoblet åndedrett, og iv) ikke-mitokondriell respirasjon etter tilsetningen av antimycin A og rotenon. I permeabiliserte celler, kan spesifikke substrater for elektrontransportkjeden komplekser og ADP tilsettes, og maksimale komplekse avhengige priser respiratoriske such så komplisert I-, II- og IV-avhengige luftveiene priser kan måles.

Målinger av cellulær respirasjon gi viktig innsikt i mitokondrieluftkapasitet spesifikke for komplekser I-IV, mitokondrie integritet og energi metabolisme 1, 2, 3. En av de enhetene som gjør målinger av mitokondrienes oksygenforbruk med høy nøyaktighet, oppløsning og følsomhet er høy oppløsning oxygraph 4. Den høyoppløselige oxygraph anordning inneholder to kamre med injeksjonsportene, og hvert kammer er utstyrt med en polarografisk oksygensensor. Cellular eller isolerte mitokondrie suspensjoner blir rørt kontinuerlig i respirometer. For å vurdere mitokondrienes funksjon, substrater og hemmere for mitokondrie kompleks aktivitet kan legges følgende standardprotokoller. Underlag og hemmere kan titreres ved injeksjon into kamrene i oxygraph og oksygen forbruk priser er beregnet ved hjelp av programvare og uttrykt som picomol per sekund per antall celler. Høy oppløsning respirometri tilbyr flere fordeler i forhold til tradisjonelle og konvensjonelle polarografisk oksygenelektrode enheter, inkludert økt følsomhet og evne til å arbeide med et lite antall av biologiske prøver slik som intakte eller permeabiliserte celler. I tillegg inneholder hver enhet to kamre, og luftveis priser kan registreres samtidig for sammenligninger av oksygenkonsentrasjon. Den høyoppløselige oxygraph har også fordelen av redusert lekkasje av oksygen fra enhetskamrene i forhold til tradisjonelle polarographic oksygen elektrodeanordningene. En annen innretning nylig utviklet for å måle cellulær oksygenforbruk er den 96-brønns ekstracellulære fluks analysator 5. Det ekstracellulære fluks analysatoren er utstyrt med fluorescens i stedet for polarographic sensorer. Fordelene med den ekstracellulæreflux analysator sammenlignet med høy oppløsning oxygraph er i) det er en stor grad automatisert enhet, ii) det er mulig å måle oksygenforbruk i 24- og 96-brønners plater for high-throughput screening, derfor krever lavere mengder av biologiske prøver, og iii) ekstra måling av celle glycolytic forandring er mulig. Ulempene med den ekstracellulære flux analysatoren i forhold til den høyoppløselige oxygraph er i) de høye kostnadene ved enheten og forbruksvarer som for eksempel fluoriserende plater, som er ikke-gjenbrukbare, og ii) bare fire forbindelser per test / brønn er injiserbare derfor systemet ikke er mulig for substrat-uncoupler-inhibitor titrering protokoller.

I denne studien bruker vi høy oppløsning respirometri å bestemme mitokondrielle respirasjonen. For cellulære oksygen forbruk forsøk ble cellene permeabilisert for å tillate oppføring av eksogene ADP og oksyderbare mitokondrielle substrater for tilførsel av elektroner inn i complexes av luftveiene. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for disseksjon av individuelle mitokondrielle komplekser luftkapasitet, noe som er en klar fordel sammenlignet med intakte celler (mange substrater er celle-impermeant). Imidlertid vil cellemembranen permeabilization forstyrre barriere mellom cytosol og ekstracellulære rom og medium (vaske ut av cytosoliske oppløste stoffer) og sammensetningen av det intracellulære rommet er i likevekt med det ekstracellulære medium. En av ulempene ved permeabiliserte celler enn intakte celler, er at det mitokondrielle ytre membranen kan bli skadet hvis store mengder vaskemiddel anvendes under celle permeabiliseringen. I intakte celler, basal, koplet og frakoplet respirasjon av intakte celler kan måles. Denne metoden evaluerer oksygenforbruk på intakte celler uten tilsetning av eksogene substrater og ADP, og reproduserer lungefunksjon i den integrerte cellen og også gi informasjon om maksimale mitokondrielle elektron transport kapasitet 6, 7. En av fordelene med intakte celler enn permeabiliserte celler er at cellemiljøet ikke blir forstyrret, og mitokondrier er i kontakt med hele komponenter av cellene. For å permeabilisere den cellulære plasmamembranen, er detergenter som digitonin blitt brukt åtte. Imidlertid kan mitokondrie ytre membranintegritet bli svekket hvis store mengder digitonin er ansatt. For å bekrefte at mitokondrienes ytre membran integritet ikke er svekket i permeabilized celler, er digitonin titrering utført for å bestemme den optimale konsentrasjonen for cellulær permeabilization. For disse eksperimentene ble cellene resuspendert i åndedrett medium og digitonin konsentrasjon titreres ved respirometri i nærvær av mitokondrielle substrater og ADP, og respirasjonsmålinger måles. Respirasjon av intakte, ikke-permeabiliserte celler som ikke er stimulert i nærvær av mitochondrial underlag og ADP. Imidlertid ville etterfølgende trinnvis digitonin-titrering ga gradvis permeabiliseringen av plasmamembraner, og optimal digitonin konsentrasjon oppnås. Dette er vist ved økningen av respirasjon opp til full permeabiliseringen. Mitokondrie kvalitet og ytre membran integritet kan bekreftes ved å legge eksogene cytokrom c 2, 9. Cytokrom c er et 12 kDa elektron-bærer-proteinet i det mitokondrielle elektrontransportkjeden 10, 11, 12. Det er lokalisert i den mitokondrielle intermembrane plass, og er involvert i oksygenforbruk, bærende elektroner fra komplekset III til IV kompleks. Når den mitokondrielle ytre membran er skadet, cytokrom c frigjøres, og mitokondrienes oksygenforbruket reduseres. Ved tilsetning av eksogen cytokrom c, noe forstørrelse i mitokondriell respirasjon er en indikasjon på enforstyrret mitokondrie ytre membran.

I permeabilized celler, substrater og hemmere av mitokondrie kompleks aktivitet legges følgende ulike protokoller 3, 9. For eksempel for å undersøke mitokondrielle komplekse drevet luftveiene priser, kan den følgende protokoll benyttes. Etter permeabiliseringen av cellene, blir først kompleks I stimulert av substrater malat og glutamat, som genererer NADH som et substrat for den respiratoriske kjeden og fremkalle aktivering av komplekset I. Deretter blir ADP tilsettes for omdannelse til ATP (tilstand 3, aktive komplekset jeg avhengig åndedrett). Etter et stabilt signal er nådd, rotenon (mitokondrisk kompleks I-inhibitor) administrert for å hemme komplekse I. rotenon etterfølges av succinat til FADH 2 og for å aktivere kompleks II (tilstand 3, aktive komplekse II-avhengig respirasjon). For å måle komplekse IV-avhengige åndedrett, første kompleks III-avhengig respirasjon inhiberes ved tilsetning av antimycin A (mitokondrisk kompleks III-hemmer). Etterpå er kompleks IV avhengig åndedrett stimulert ved å administrere askorbat og tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD kan auto-oksidere i åndedrett buffer, derfor den maksimale komplekse IV-avhengige pusterytme (tilstand 3) beregnes ved å subtrahere respirasjonsmålinger før og etter tilsetning av natriumazid, en inhibitor for mitokondriell kompleks IV. Åndedrett eksperimenter kan utføres i to kamre med en oxygraph i parallell-en tjener som en kontroll (ikke-stimulerte celler), den andre inneholdende de stimulerte celler. Selvfølgelig cellene kan forbehandles på forskjellige måter, for eksempel, med legemidler som påvirker mitokondrielle funksjoner, før deres oksygenforbruket måles i oxygraph kammeret. Denne protokollen tillater funksjonell undersøkelse av de individuelle mitokondrie respiratoriske kjede-komplekser. I tillegg kan man måle maksimal ADP-stimulerterespirasjon (tilstand 3) i permeabiliserte celler, ved hjelp av eksogene fettsyrer i form av palmitat. I denne protokollen, er konsentrert bestander av natrium-palmitat konjugert med ultra fettsyrefri bovint serumalbumin (BSA) (6: 1 molforhold palmitat: BSA). Etterpå ble cellene først blir permeabiliserte med digitonin og mitokondriell respirasjon bestemmes ved tilsetning av karnitin og palmitat, etterfulgt av tilsetning av ADP (tilstand 3, maksimal respirasjon). Deretter oligomycin lagt for å etterligne tilstand 4 (state 4o) og luftkontrollforholdet (RCR verdi) er beregnet som stat 3 / stat 4o. β-oksidasjon fremmer produksjon av acetyl CoA (som kommer inn i den TCA-syklus) og generering av FADH 2 og NADH, elektronene som sendes til elektrontransportkjeden ved elektronoverførende flavoprotein og β-hydroksyacyl-CoA-dehydrogenase. Mitokondriene er i sentrum av fettsyremetabolisme og beskrevet palmitat-BSA-protokoll kan benyttes av forskere som undersøker fettty syre oksidering. I intakte celler, aktivatorer og inhibitorer av mitokondriell aktivitet komplekset tilsettes etter en annen protokoll 6, 9. For disse forsøk, er første oksygenforbruk av ikke-permeabiliserte celler i fravær av eksogene substrater måles (fosforylerende pusterytme). Deretter, blir det ikke-fosforyleringsmiddel respirasjonsfrekvens målt etter tilsetning av oligomycin, som er en inhibitor av mitokondrial ATP-syntase. Etterpå er det protonophore karbonyl cyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) administrert ved forskjellige konsentrasjoner og maksimal mitokondrie frikoblet respirasjonsfrekvens måles. Protonophores som FCCP kan indusere en styrking i proton permeabilitet av den indre membran, slik passiv bevegelse av protoner for å spre den chemiosmotic gradient. En økning i proton-permeabilitet frakobler oksydativ åndedrett (ingen ATP produksjon) og induserer en økning i oxygen forbruk. Etterpå blir rotenon og antimycin lagt til hemme mitokondrie respirasjon, og ikke-mitokondriell respirasjon er trukket fra alle andre luftveis priser.

Oksygenforbruk kan uttrykkes som IO 2 [pmol x sek -1 x 10 -6 celler] (oksygen per million celler) som beregnes ved å dividere volumspesifikke oksygenfluks (i det lukkede kammer oksygen), JV, O 2 [pmol x sek -1 x ml -1] av cellekonsentrasjonen i cellekammeret (antall celler pr volum [10 6 celler ∙ ml 1]) 15. Cell-mass spesifikk oksygen forandring, JO 2 [pmol x sek -1 x mg -1], er flyten per celle, IO 2 [pmol x sek -1 x 10 -6 celler], dividert med massen per celle [mg ∙ 10 6 celler]; eller volumspesifikke flux, JV, O 2 [pmol x sek -1 x ml -1], dividert med masse per volumUme [mg ∙ ml 1]. JO 2 er oksygenfluksen pr celle protein, tørrvekt eller cellevolum.

I denne studien ved hjelp av høy oppløsning respirometri beskriver vi protokoller for å bestemme i) optimal digitonin konsentrasjon for fullstendig mobil plasma membran permeabilization (digitonin titrering assay), ii) mitokondrielle ytre membran integritet ved hjelp av eksogene cytokrom c, iii) mitokondrie respiratoriske kjeden komplekser jeg , II og iV maksimal luftveiene priser i digitonin-permeabilisert HepG2-celler i nærvær av eksogent ADP og mitokondrielle respiratoriske kjeden substrater, og iv) basal, kombinert og maksimal frakobles respirasjon (maksimal elektrontransportkapasiteten) av intakte celler uten tilsetning av eksogene substrater og ADP, og reproduserer lungefunksjon i den integrerte cellen.

Protocol

1. Cell Culture

  1. Kultur humane hepatom HepG2 celler 6 i 25 cm2 cellekulturflasker i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en inkubator (5% CO 2, 95% luft) (seeding densitet: 1 x 10 6 celler per 25 cm2 cellekulturkolbe, inkubasjonstid på 37 ° C inkubator: 48 timer, celletettheten ved konfluens: 4-5 x 10 6 celler pr 25 cm 2 cellekultur kolbe).
  2. Utføre forsøkene når cellene er 90% til 95% sammenflytende.

2. Høy oppløsning respirometri Kalibrering av polarographic oksygen sensorer

  1. Pipetter 2,1 ml av respirasjon buffer i en oxygraph kammer og omrør buffer kontinuerlig ved hjelp av en magnetisk rørestav til stede i kammeret (700 rpm) ved 37 ° C i 1 time inntil en stabil oksygenfluks signal avDet oppnås den polarografisk oksygensensoren.
    MERK: polarographic oksygen elektroder innenfor hver oxygraph kammer måle oksygenkonsentrasjon og beregne oksygenforbruk (flux) i hvert kammer. Oksygenkonsentrasjonen og oksygen forbruk priser (flux) vises i sanntid i en datamaskin ved hjelp av programvare for datainnsamling og analyse.
  2. Utføre en luft kalibrering av polarografisk oksygensensor ifølge produsentens protokoller 14.
    MERK: Kalibrering av polarographic oksygen sensorer i åndedrett media og oksygenkonsentrasjon i mediene på luftmetning eksperimentell temperatur utføres bare én gang daglig om morgenen. Etterpå media kan bli fjernet fra kamrene og cellene resuspendert i et friskt respirasjon media blir tilsatt til en oxygraph kammer og respiratoriske prisene blir målt. Etter den første eksperiment, kan kammeret bli vasket og ytterligere serie av eksperimenter kan utføres i than samme kammeret uten ytterligere kalibreringer.

3. trypsinering av heftende celler, Telle Cells

  1. På dagen for eksperimentet, aspirere den DMEM fra 25 cm2 cellekulturkolbe.
  2. Rens cellekulturmonolaget på kulturflaske med 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
  3. Pipetter 0,5 ml av 25 mg / ml trypsin-oppløsning (forvarmet til 37 ° C i et 37 ° C vannbad) inn i cellen monolag i kulturen kolbe og inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C i en inkubator (5% CO2 , 95% luft).
  4. Pipettes 5 ml DMEM inneholdende 10% FBS i de frittliggende cellene i cellekulturkolbe og suspendere cellene ved pipettering.
  5. Overføring resuspendert celler til et 15 ml sentrifugerør og sentrifuger i 5 minutter ved 350 x g ved romtemperatur, og dekanter supernatanten.
  6. Cellepelleten suspenderes i 1 ml åndedrett buffer 13 (T stand 1).
  7. i> Tell cellene ved anvendelse av en celleteller og resuspender dem i åndedrett buffer til en endelig tetthet på 1 x 10 6 celler / ml. Siden mobilnettet åndedrett priser vil bli normalisert til celle nummer, telle cellene med en nøyaktig og presis celleteller.

4. Høy oppløsning respirometri

  1. Etter luft kalibrering (bare utføres en gang daglig, trinn 2.1 til 2.2), Aspirer respirasjonen medium fra et kammer i den oxygraph og tilsett 2,1 ml av cellesuspensjon (1 x 10 6 celler / ml) fra trinn 3,7 til kammeret.
  2. Lukk oxygraph kammeret ved innføring av proppen.
  3. Rør cellene kontinuerlig ved hjelp av en magnetisk rørestav til stede i kammeret (700 rpm) ved 37 ° C og opp cellulær respirasjon i 5-10 min inntil en stabil oksygenfluks signal er oppnådd.
    MERK: oksygenkonsentrasjon og oksygen flux signal vises i sanntid i en datamaskin ved hjelp av programvare for datainnsamling og analyses = "xref"> 14.
  4. Etterpå injisere substrater og hemmere for mitokondrielle respirasjonen gjennom titan injeksjons portene på stopperne ved hjelp av følgende protokoller.

5. Digitonin Titrering i intakte celler ved respirometri

  1. Fremstille en oxygraph kammer inneholdende cellesuspensjon (1 x 10 6 / ml) ved å følge prosedyren beskrevet i trinn 4.1 til 4.3 i protokollen.
  2. Injiser 2 pl 0,2 mM rotenon (0,2 pM) 'fare' inn i det oxygraph kammeret inneholdende cellesuspensjonen gjennom titaninjeksjonsåpningen av kammeret stopperen ved hjelp av en sprøyte og registrere cellulær respirasjon i 5-10 min inntil en stabil oksygenfluks signal er oppnådd .
    MERK: Alle injeksjoner i de følgende trinnene er utført gjennom titan injeksjonshavnene stoppere som bruker sprøyter. Tilsetning av rotenon er valgfritt (det hindrer omvendt elektronstrømmer) og kan utelates for digitonin titrering eksperimenter, setrinn 6.3.
  3. Injiser 20 ul av 1 M succinat (10 mM) inn i oxygraph kammeret og registrere cellulær respirasjon i 5-10 min inntil en stabil oksygenfluks signal er oppnådd.
  4. Injiser 10 ul av 0,5 M ADP (2,5 mM) i oxygraph kammeret og registrere cellulær respirasjon i 5-10 min inntil en stabil oksygenfluks signal er oppnådd.
  5. Injiser 2 pl 2 mM digitonin (2 uM) inn i oxygraph kammeret og registrere cellulær respirasjon i 2-5 minutter inntil en stabil oksygensignalet er oppnådd.
  6. Igjen injisere 2 pl 2 mM digitonin inn i oxygraph kammeret og registrere cellulær respirasjon i 2-5 minutter inntil en stabil oksygensignalet er oppnådd.
    MERK: Trinnvis tilsetning av digitonin til cellene vil frembringe en økning i cellulær oksygenforbruk og oksygenfluksen signalet vil øke.
  7. Fortsett å injisere 2-4 pl av 2 mM digitonin trinnvise (2-4 pM hvert trinn) inn i kammeret. Etter hvert trinn opp celleåndingen for 2-5 mi inntil en stabil oksygenfluks signal er oppnådd.
    MERK: Stopp injisere digitonin når oksygen flux signal når en maksimal nivå og ytterligere injeksjoner av digitonin ikke øker respirasjon. Leserne bør bestemme optimal digitonin konsentrasjon i sine laboratorier ved hjelp av sine egne reagenser og bruk oppnådd optimal digitonin konsentrasjon i trinnene 6.2 og 7.2 av følgende protokoller for sine eksperimenter.

6. Evaluering av mitokondrie Ytre membranintegritet: Cytokrom C

  1. Fremstille en oxygraph kammer inneholdende cellesuspensjon (1 x 10 6 / ml) ved å følge prosedyren beskrevet i trinn 4.1 til 4.3 i protokollen.
  2. Injiser 2 ul av 8 mM digitonin (8 pM) inn i oxygraph kammeret som inneholder cellesuspensjon (1 x 10 6 / ml) og permeabilisere cellene i 5 min.
  3. Injiser 20 ul av 1 M succinat (10 mM) inn i oxygraph kammeret og registrere cellulær respiration i 5-10 min inntil en stabil oksygenfluks signal er oppnådd.
  4. Injiser 10 ul av 0,5 M ADP (2,5 mM) i oxygraph kammeret og registrere cellulær respirasjon i 5-10 min inntil en stabil oksygenfluks signal er oppnådd.
    MERK: Tilsetning av ADP til cellene vil stimulere kompleks I og induserer en økning i oksygenforbruk, og oksygenfluksen signalet vil øke og stabilisere seg.
  5. Injiser 5 pl 4 mM cytokrom c (10 uM) inn i oxygraph kammeret og registrere cellulær respirasjon i 5-10 min inntil en stabil oksygenfluks signal er oppnådd.
  6. Endelig injisere 1 ul av 4 mg / ml oligomycin (2 ug / ml) og registrere cellulær respirasjon inntil en stabil oksygenfluks signal er oppnådd.

7. Maximal ADP-stimulert respirasjon (State 3) permeabilized HepG2 celler

  1. Fremstille en oxygraph kammer inneholdende cellesuspensjon (1 x 10 6 / ml) ved å følge prosedyren beskrevet i trinn 4.1 til 4.3 i protokollen.
  2. Injiser 2 ul av 8 mM digitonin (8 pM) inn i oxygraph kammeret som inneholder cellesuspensjonen og permeabilisere cellene i 5 min.
  3. Injiser 12,5 pl av 0,8 M av malat (5 mM) og 10 pl av 2 M av glutamat (10 mM), og i oxygraph kammeret. Record cellulær respirasjon inntil en stabil oksygenfluks signal er oppnådd.
  4. Injiser 10 ul av 0,5 M ADP (2,5 mM) i oxygraph kammeret og registrere cellulær respirasjon inntil oksygenfluks signalet øker og stabiliserer seg.
    MERK: Tilsetning av ADP til cellene vil frembringe en økning i oksygenforbruk og oksygenfluksen signalet vil øke.
  5. Sprøyt 2 mL av 0,2 mM rotenon (0,2 mm) "FORSIKTIG" i oxygraph kammeret og registrere mobilnettet åndedrett inntil oksygen flux signal reduseres og stabiliseres.
  6. Etterpå injisere 20 pl av 1 M succinat (10 mM) inn i oxygraph kammeret og registrere cellulær respirasjon inntil oksygenfluks signalet økerog stabiliserer.
  7. Deretter injisere 2 mL av 5 mM antimycin (5 mm) "FORSIKTIG" i oxygraph kammeret og registrere mobilnettet åndedrett inntil oksygen flux signal reduseres og stabiliseres.
  8. Deretter injiseres 2,5 ul av 0,8 mM askorbat (1 mM) og umiddelbart etter injisere 2,5 pl 0,2 mM TMPD (0,25 mM) i oxygraph kammeret og registrere cellulær respirasjon inntil oksygenfluks signalet øker og stabiliserer seg.
  9. Endelig injisere 10 pl 1 M natriumazid (5 mM) 'fare' inn i oxygraph kammeret og registrere cellulær respirasjon inntil oksygen fluks signal reduseres og stabiliseres.

8. Oksygen Forbruk av intakte celler

  1. Fremstille en oxygraph kammer inneholdende cellesuspensjon (1 x 10 6 / ml) ved å følge prosedyren beskrevet i trinn 4.1 til 4.3 i protokollen.
  2. Injiser 1 ul av 4 mg / ml oligomycin (2 ug / ml) inn i oxygraph kammer inneholdende et cellesuspensjond posten cellulær respirasjon inntil en stabil oksygenfluks signal er oppnådd.
  3. Etterpå injisere 1 mL av 0,2 mM av FCCP (0,1 mm) "FORSIKTIG" i oxygraph kammeret og registrere mobilnettet åndedrett til oksygen flux signal øker og stabiliserer.
  4. Injiser 3 ul av 0,2 mM av FCCP (0,4 uM) inn i oxygraph kammeret og registrere cellulær respirasjon inntil oksygenfluks signalet øker ytterligere og stabiliseres.
  5. Titrere FCCP på 0,1 til 0,3 uM trinn ved injisering av 1-3 ul 0,2 til 1 mM FCCP (0,1 til 2 uM sluttkonsentrasjon i kammeret) inn i oxygraph kammeret inntil oksygenfluksen signalet når sin maksimale nivåer og ingen ytterligere økning og deretter starter fallende.
    MERK: Stopp injisere FCCP når oksygen signal når en maksimal nivå og begynner å avta.
  6. Deretter injiserer 2 pl 0,2 mM rotenon (0,2 uM) og 2 pl av 5 mM antimycin A (5 uM) inn i kammeret. Record åndedrett til than oksygen flux signal reduseres og stabiliseres.

Representative Results

Fastsettelse av Optimum Digitonin Konsentrasjon for Cellular Permeabilization: Digitonin Titrering Experiment

Digitonin titrering utføres for å bestemme den optimale konsentrasjonen for permeabiliseringen av HepG2-celler. For disse eksperimentene er digitonin titreres i intakte celler i nærvær av rotenon, succinat (mitokondrisk kompleks II substrat) og en metnings mengde av ADP (for å indusere kompleks II-avhengige tilstand 3), og luftveiene priser er målt ved basislinje og etter hvert titrering (figur 1A og 1B). Resultatet av dette eksperimentet viser at i fravær av digitonin, er meget lav og respirasjon av intakte, ikke-permeabiliserte celler som ikke er stimulert i nærvær av mitokondriell substrat og ADP cellulær respirasjon. Men ved trinnvis tilsetning av digitonin, blir den cellulære plasmamembranen permeabilisert og mitochondrial respirasjon (kompleks II avhengig tilstand 3) øker opp til full permeabilization når succinate og ADP inn i cellene. Resultatene viser at permeabiliseringen ved en digitonin konsentrasjon på 8-12 uM er optimal for ADP-stimulert åndedrett fra HepG2-celler. Imidlertid kan mitokondrie ytre membranintegritet bli svekket hvis store mengder digitonin er ansatt. Som vist i figur 1, for store mengder av digitonin induserte en reduksjon i kompleks II avhengig tilstand 3 åndedrett som indikerer nedsatt mitokondrie ytre membranintegritet.

I dagens og følgende protokoller, alle oksygenforbruk uttrykt som IO 2 [pmol x sek -1 x 10 -6 celler] (oksygen per million celler) som er beregnet ved å dividere volumspesifikke oksygen fluks (i lukket oksygen kammer), JV, O 2 [pmol x sek -1 x ml -1] av cellen Konsentrater ion i cellen kammer (antall celler per volum [10 6 celler x ml -1]) 15.

Figur 1
Figur 1: Digitonin titrering for å bestemme den optimale konsentrasjonen for permeabiliseringen av HepG2-celler. Den blå linjen representerer oksygenkonsentrasjon; den røde linje representerer oksygen (helling av oksygenkonsentrasjon). Oksygenkonsentrasjonen avtar over tid som celler å anvende det tilgjengelige oksygen. Oksygenforbruket er uttrykt som pmol / (sek x antall celler). (A) tracings fra høyoppløselig respirometri bruker digitonin, ADP og succinate som substrat for mitokondrie kompleks II avhengig respirasjon (1 eksperiment). (B) MITOKONDRIELLE respirasjonsmålinger fra 4 individuelle eksperimenter presentert som betyr ± SD.laste opp / 54985 / 54985fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Evaluering av mitokondrie ytre membran integritet ved hjelp av en Optimal Digitonin Konsentrasjon

For å evaluere effekten av optimal digitonin konsentrasjon (8 pM) på ytre mitokondriemembranintegritet, blir cellene permeabilisert med digitonin og mitokondrie ytre membranintegritet blir testet ved måling av mitokondriell respirasjon etter den etterfølgende tilsetning av succinat (mitokondrisk kompleks II-avhengig hvilende tilstand 2 åndedrett i fravær av ADP), ADP (ADP stimulert kompleks II avhengig tilstand 3 åndedrett) og cytokrom c (ADP-stimulerte kompleks II avhengig tilstand 3 åndedrett, i nærvær av cytokrom c), etterfulgt av tilsetning av oligomycin (en inhibitor av ATP syntase) for å etterligne tilstand 4. Som vist i figur 2

Figur 2
Figur 2: Cytokrom c styrke ikke åndedrett av cellene behandlet med digitonin (8 pM). Representative respiratoriske spor for cytokrom c test med høy oppløsning respirometri. Celler blir permeabilisert med 8 pM digitonin og mitokondrielle ytre membranintegritet blir testet ved måling av luftveiene priser etter den etterfølgende tilsetning av 10 mM succinat (tilstand 2), 2,5 mM ADP (tilstand 3) og 10 pM cytokrom c (tilstand 3 i nærvær cytokrom c), etterfulgt av tilsetning av 2 ug / ml oligomycin for å etterligne tilstand 4. Puste hastighet er uttrykt som pmol / (sek x million celler). CII: kompleks II. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Evaluering av Mitokondriell ytre membranintegritet ved hjelp av en høy konsentrasjon av Digitonin

For å demonstrere at en meget høy konsentrasjon av digitonin kan kompromittere mitokondrie ytre membranintegritet, utførte vi et eksperiment ved bruk av en høy dose av digitonin. For dette eksperimentet ble cellene permeabilisert med 40 uM digitonin i stedet for 8 uM, og mitokondrielle ytre membranintegritet blir testet ved måling av mitokondriell respirasjon etter den etterfølgende tilsetning av succinat (mitokondrisk kompleks II-avhengig hvilende tilstand 2 åndedrett i fravær av ADP) , ADP (ADP stimulert kompleks II avhengig tilstand 3 åndedrett) og cytokrom c (ADP stimulert kompleks II-dependent tilstand 3 åndedrett, i nærvær av cytokrom c), etterfulgt av tilsetning av oligomycin å etterligne tilstand 4 i nærvær av oligomycin (figur 3). Resultatet av dette eksperimentet viser at cytokrom c øker åndedrett av cellene behandlet med en høy dose av digitonin, noe som indikerer et tap av cytokrom c fra den mitokondrielle ytre membran som indikerer nedsatt mitokondrie ytre membranintegritet.

Figur 3
Figur 3: Høy dose digitonin (40 mm) kompromisser mitokondrie ytre membran integritet. Tracings fra den høyoppløselige respirometri hjelp succinate som substrat. Den blå linjen representerer oksygenkonsentrasjon; den røde linje representerer oksygen (helling av oksygenkonsentrasjon). Oksygenkonsentrasjonen avtar over tid som celler å anvende det tilgjengelige oksygen. Oksygenforbruk er uttrykt sompmol / (sek x antall celler). Etterfølgende tilsetning av 40 uM digitonin, succinat (10 mM), ADP (2,5 mM), cytokrom c (10 uM) og oligomycin (2 ug / ml) er angitt. CII: kompleks II. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Maximal ADP-stimulert respirasjon (State 3) permeabilized HepG2 celler, Bruke Overflødig Eksogene Underlag

Komplekset I-, II- og er IV-avhengig maksimal ADP-stimulert respirasjon (tilstand 3) av permeabiliserte HepG2-celler (1 x 10 6 celler / ml) med hell målt ved anvendelse av overskudd av eksogene substrater (figur 4). For dette eksperimentet ble cellene permeabilisert med digitonin og mitokondrielle oksygenforbruk måles etter påfølgende tilsetning av substrater og inhibitorer som beskrevet i

Figur 4
Figur 4: Vellykket måling av maksimal ADP-stimulert respirasjon (tilstand 3) av permeabiliserte HepG2 celler. Respirasjonsfrekvens er uttrykt som pmol / (sek x million celler). Celler blir permeabilisert med 8 pM digitonin og mitokondrielle luftveiene priser måles etter påfølgende tilsetning av glutamat og malat (tilstand 3, kompleks I), rotenon for å hemme kompleks I, succinat (tilstand 3, kompleks II), antimycin A for å hemme kompleks III og askorbat / TMPD og natriumazid for å hemme kompleks IV. Kompleks IV respirasjon (State 3)blir tolket ved å subtrahere den oksygenforbruk før og etter tilsetning av natriumazid. CI: kompleks I, CII: kompleks II, CIV: kompleks IV. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Mislykket Måling av Maximal ADP-stimulert respirasjon (State 3) permeabilized HepG2 celler

Komplekset I-, II- og er IV-avhengig maksimal ADP-stimulert respirasjon (tilstand 3) av permeabiliserte HepG2-celler (1 x 10 6 celler / ml) ikke blitt målt ved anvendelse av overskudd av eksogene substrater (figur 5). For dette eksperimentet ble cellene permeabilisert med digitonin og mitokondrielle oksygenforbruk måles etter påfølgende tilsetning av substrater og inhibitorer som beskrevet i figur 5. Som vist i figur 5 Figur 4. En mulig forklaring på redusert luftveis nivåer er forurensning av oxygraph kamre med mitokondrie-hemmere fra tidligere eksperimenter. Mitokondrie-hemmere som antimycin og rotenon er løselig i etanol og kan holde seg til de oxygraph kamre og stoppere. Derfor oxygraph kamre og propper må vaskes grundig etter hvert eksperiment.

Figur 5
Figur 5: Mislykket måling av maksimal ADP-stimulert respirasjon (tilstand 3) av permeabiliserte HepG2 celler. Representative respiratoriske spor av et mislykket eksperiment av komplekse I-, II- og IV-drevet maksimal ADP-stimulert respirasjon (tilstand 3) av permeabilized HepG2 celler ved hjelp av høyoppløselige respirometri. Respirasjonsfrekvens uttrykkes sompmol / (sek x million celler). Celler blir permeabilisert med 8 pM digitonin og mitokondrielle luftveiene priser måles etter påfølgende tilsetning av glutamat og malat (tilstand 3, kompleks I), rotenon for å hemme kompleks I, succinat (tilstand 3, kompleks II), antimycin A for å hemme kompleks III og askorbat / TMPD og natriumazid for å hemme kompleks IV. Komplekset IV respirasjon (tilstand 3) blir tolket ved å subtrahere den oksygenforbruk før og etter tilsetning av natriumazid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Sammen og frikoblet Respirasjon av intakte celler

HepG2-celler "basal oksygenforbruket måles i nærvær av oligomycin (oligomycin-insensitive respirasjon) og sekvensiell tilsetning av FCCP (Figur 6). Basal cellulær respirasjon hastighet representerer oksygen forbruk av intakte HepG2 celler i nærvær av endogene cellulære substrater, og kan endre i respons til cellulære ATP etterspørsel. Oligomycin-insensitive respirasjonsfrekvens representerer lekke cellulær respirasjon og oligomycin følsomme pusterytme som representerer cellular ATP omsetning og beregnes ved å trekke den oligomycin-insensitive pusterytme fra basal endogen pusterytme. Den kjemiske uncoupler FCCP er sekvensielt tilsatt ved ulike konsentrasjoner og maksimal frikoblet åndedrett registrert. Den maksimale mitokondrie frikoblet pusterytme (maksimal elektrontransportsystemet kapasitet) for denne eksperimentelle tilstanden oppnås ved 0,9 til 1,2 mikrometer FCCP. Resultatene viser en bifasisk aktivitet av FCCP i intakte HepG2 celler. Derfor, for hver eksperimentell tilstand, FCCP titreres for å oppnå maksimal frakoplet pusterytme. Den frikoblet luftkontroll ratio (uRCR) beregnes ved å dividere FCCPfrikoblet respirasjonsfrekvens ved respirasjon i nærvær av oligomycin. Oligomycin-sensitive respirasjon (ATP omsetning) beregnes ved å trekke oligomycin-insensitive pusterytme fra basal endogen respirasjon. Kobling av effektivitet som representerer andelen av mitokondrienes oksygenforbruk som brukes til å syntetisere ATP beregnes ved å dividere den oligomycin følsomme respirasjonsfrekvens ved basalpusterytme. Ved slutten av eksperimentet, for å oppnå ikke-mitokondriell respirasjon, er mitokondrielle elektrontransportkjeden inhibitorer tilsatt, og ikke-mitokondriell respirasjon blir subtrahert fra alle resultatene. For forsøket vist i figur 6, er den ikke-mitokondriell respirasjon 26 pmol / (sek x millioner celler), er basal respirasjonshastigheten 48 pmol / (sek x million celler), oligomycin-insensitive respirasjonsfrekvens 7 pmol / (sek x millioner celler), oligomycin sensitive respirasjon (ATP omsetning) 41 pmol / (sek x millioner celler) og Coupling effektivitet 0.85.

Figur 6
Figur 6: Sammen og frikoblet respirasjon av intakte celler. Representative respiratoriske spor av HepG2-celler "basal oksygenforbruk målt i nærvær av oligomycin (oligomycin-insensitive respirasjon) og sekvensiell tilsetning av FCCP ved hjelp av høy-oppløsning respirometri. Deretter, når et stabilt signal er nådd, åndedrett inhiberes ved tilsetning av rotenon og antimycin A og de resterende bakgrunns åndedrett (non-mitokondriell respirasjon) blir subtrahert fra alle resultatene. Oksygenforbruket er uttrykt som pmol / (sek x antall celler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Respirasjon buffer 13
Kjemisk Konsentrasjon
sukrose 110 mm
EGTA 0,5 mm
MgCl2 3,0 mm
KCl 80 mm
K-laktobionat 60 mm
KH 2 PO 4 10 mm
taurin 20 mm
Hepes 20 mm
BSA 1,0 g / l
pH 7.1

Tabell 1: Sammensetning av respirasjon buffer.

Discussion

Formålet med den foreliggende protokollen var å bruke høy oppløsning respirometri å måle mitokondrielle luftkjedekomplekser '(I-IV) respiratoriske priser, maksimal mitokondrienes elektrontransportsystemet kapasitet og mitokondrie ytre membran integritet.

Det er noen viktige skritt i denne protokoll. Først blir cellulær oksygenforbruk vanligvis normalisert til antall celler (pmol / [sec x antall celler]). Derfor, før overvåking av cellulær oksygenforbruk, er det viktig å bruke en anordning som gjør det mulig nøyaktige og pålitelige målinger av antall celler. I den foreliggende protokoll en automatisk celleteller er blitt brukt (trinn 3.7 i protokollen og bord av materialer). Et annet kritisk punkt, spesielt i permeabiliserte celler, er valget av buffer åndedrett hvori permeabiliserte celler oppslemmes på nytt (trinn 3.6 i protokollen). Siden mobilnettet permeabilization kan indusere tap av intracellular-ioner, er det meget viktig at det medium som brukes under permeabiliseringen er kompatibel med intracellulære miljø. Derfor bør åndedrett buffer inneholde en sammensetning og osmolaritet som reflekterer både intracellulære og ekstracellulære miljø (tabell 1) 13. I tillegg, for optimal og effektiv cellulær permeabiliseringen, er det avgjørende å titrere digitonin konsentrasjon ikke bare for hver enkelt celletype, men også for hver enkelt celletettheten, for å identifisere den optimale og laveste effektive konsentrasjon. Hvis digitonin-konsentrasjonen er for lav, vil cellene ikke permeabilisert. I motsetning til dette, vil eksponering av cellene til store mengder av digitonin skade mitokondrie ytre membran. Derfor er et annet viktig poeng å undersøke mitokondrie ytre membran integritet. For ikke å undervurdere cellulære luftkapasitet, er det også avgjørende at respirometri-forsøk utføres ved en fysiologisk temperatur (37 ° C). Et annet viktig punkt å vurdere er bruken av mette mengder av ADP, på grunn av diffusjon begrensning av ADP versus oksygen i permeabiliserte celler og tilstrekkelig underlaget nivåer for å oppnå maksimal luft fluks. I noen forsøk i permeabiliserte celler, kan det skje at tilsetning av eksogene substrater og ADP ikke fører til en betydelig økning i hastigheten av åndedrett. Dette kan være forårsaket av flere faktorer. For eksempel kan bruken av høye konsentrasjoner av digitonin for å permeabilisere cellene skade mitokondrie ytre membran. Derfor bør en titrere digitonin for å bestemme den optimale konsentrasjonen for hver celletype og tetthet. Videre renhet digitonin er også svært kritisk, og kommersielt tilgjengelig digitonin kan variere betydelig i renhet og nye grupper av kjøpt digitonin bør titreres for å bestemme deres optimale konsentrasjoner for cellulær permeabilization. I tillegg finnes det flere typer celleplasmamembranen poredannendeagenter med forskjellige egenskaper. For eksempel, er saponin en mildere detergent enn digitonin, og avhengig av celletype, bør en passende celle permeabiliseringen reagens velges.

De fleste hemmere av mitokondrienes funksjon som brukes i respirometri analyser, for eksempel rotenon antimycin, er løselig bare i etanol og holde seg til oxygraph kamre og stoppere, hemme cellulær respirasjon. For å unngå dette problemet, må oxygraph kamre og stoppere vaskes grundig med 95% etanol etter hver analyse. Et annet viktig punkt å vurdere er at for både intakte og permeabilized celleåndingen analyser, kan celletetthet, type og cellekultur løpet påvirker luftveiene priser. For eksempel, med HepG2-celler, vi bruker vanligvis en celletetthet på 1 til 2 millioner celler per kammer. Ved hjelp av meget lav celletetthet under respirometri kan gi opphav til et meget svakt signal. Vi har også observert at cellekultur konfluens kan påvirke luftveiene priser. for example, når HepG2-celler blir dyrket meget sammenflytende (mer enn 100%), de bruker mye mindre oksygen.

For å få en stabil og reproduserbar oksygen forandring i løpet av eksperimenter, et annet viktig punkt å vurdere er vedlikehold av høyoppløselig respirometri Instrument- dvs. regelmessig utveksling av polarographic oksygen sensor membraner og instrumentale bakgrunns rettelser. For eksperimenter med uncoupler FCCP, kan det være at tilsetning av FCCP til cellene ikke stimulerer cellulær respirasjon og maksimal flux er ikke oppnås, men i stedet cellulær respirasjon inhiberes. Inhibering av celleoksygenforbruk ved tilsetning av FCCP kan tyde på at FCCP-konsentrasjonen var ikke optimal, og var for høy. For disse eksperimentene, for hver analyse, er det viktig å nøye titrere FCCP konsentrasjon for å oppnå maksimal flux.

En begrensning av høyoppløste respirometri er at high-throughput screening, etablering avdose-responskurver og tidsforløpseksperimenter for begrensede mengder av biologiske prøver er ikke gjennomførbart. For disse analysene, kan man bruke andre virkemidler, som for eksempel den ekstracellulære flux analysator. Andre begrensninger er i) at enheten ikke er automatisert, og krever kontinuerlig tilstedeværelse av en operatør, ii) det er tidkrevende, iii) den har bare to kamre og bare to analyser kan kjøres samtidig, iv) vedlikehold av apparatet , for eksempel endring av membraner og kalibreringer, krever mye tid og v) kamrene er ikke enkel bruk og kan bli forurenset med hemmere. Fordelene med den høye oppløsning oxygraph i forhold til tradisjonelle polarographic oksygen elektrodeanordningene er i) høyere følsomhet, ii) mindre antall biologiske prøver som kreves, iii) lufthastigheter kan måles samtidig i to kamre, og iv) at enheten har redusert oksygenlekkasje. Noen fordeler av den høyoppløselige oxygraph over ekstracellulære flux analysatoren er i) lavere kostnader for denenheten og forbruksmateriell og ii) gjennomførbarhet av substrat-uncoupler-hemmer titrering protokoller.

Fremtidige applikasjoner eller retninger etter å mestre denne teknikken er samtidige målinger av cellulær respirasjon, mitokondriemembranen potensial, H 2 O 2, ATP og kalsiumnivå ved hjelp av optiske sensorer i samme kammer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma A 4386 Chemical
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate Merck 1.00127 Chemical
BSA Sigma A 6003 Chemical
FCCP Sigma C 2920 Chemical, dissolve in ethanol
Countess automated cell counter  Thermo Fisher Scientific n/a Automated cell counting instrument
Cytochrome c Sigma C 7752 Chemical
Digitonin Sigma D 5628 Chemical, dissolve in DMSO
DMEM Gibco 31966021 Medium
EGTA fluka 3779 Chemical
FBS Gibco 26010-074 Medium component
Glutamate Sigma G 1626 Chemical
Hepes Sigma H 7523 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
KH2PO4 Merck 1.04873 Chemical
K-lactobionate Sigma L 2398 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k  Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
Oligomycin Sigma O 4876 Chemical, dissolve in ethanol
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122 Chemical
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical
Trypsin Sigma T 4674 Chemical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, (2), 297-312 (2011).
  2. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
  3. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Protoc. 7, (6), 1068-1085 (2012).
  4. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Mendez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27, (6), 583-596 (1995).
  5. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol Cell Physiol. 292, (1), C125-C136 (2007).
  6. Djafarzadeh, S., Vuda, M., Takala, J., Jakob, S. M. Effect of remifentanil on mitochondrial oxygen consumption of cultured human hepatocytes. PLoS One. 7, (9), e45195 (2012).
  7. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67, (10), 1022-1035 (2012).
  8. Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal Biochem. 416, (2), 218-227 (2011).
  9. Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
  10. Nicholls, P. Cytochrome c binding to enzymes and membranes. Biochim Biophys Acta. 346, (3-4), 261-310 (1974).
  11. Cortese, J. D., Voglino, A. L., Hackenbrock, C. R. Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c. Biochemistry. 37, (18), 6402-6409 (1998).
  12. Gorbenko, G. P. Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer. Biochim Biophys Acta. 1420, (1-2), 1-13 (1999).
  13. Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 11080-11085 (2000).
  14. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  15. Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. Mitochondr Physiol Network 17.18. OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. 64 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics