הכנת תסיסנית והדמיה אורכית תפקוד הלב in vivo באמצעות מיקרוסקופית קוהרנטיות אופטית (OCM)

Biology

GE Global Research must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

מחקר אורך של הלב בחיות קטנות תורם להבנת מגוון רחב של מחלות לב וכלי דם אנושיות קשורות, כגון מומי לב מולד הקשורים גן 1,2. בעשורים האחרונים, במודלים של בעלי חיים שונים, כגון 3,4 עכבר, 5,6 Xenopus, 7,8 דג זברה, עופות 9, ו תסיסנית 10-16, שמש לנהל בלב-התפתחות האנושית הקשורים במחקר. מודל העכבר כבר בשימוש נרחב ללמוד התפתחות לב חריגה נורמליות פנוטיפים פגמו לב עקב הדמיון שלה עם 3,4 לב האנושי. עובר Xenopus שימושי במיוחד בחקר התפתחות לב עקב טיפולה הקל 5,6 שקיפות חלקית. השקיפות של עובר ואת הזחל המוקדם של מודל דג הזברה מאפשרת תצפית אופטית קלה של 7,8 פיתוח לב. מודל העופות הוא נושא משותף של מחקרי לב התפתחותי becausדואר בלב ניתן לגשת בקלות לאחר הסרת קליפות ביצים ואת הדמיון המורפולוגי של לבבות עופות לבני אדם 9. המודל תסיסנית יש מספר מאפיינים ייחודיים ההופכים אותו לאידיאלי עבור ביצוע מחקרים ארוכי טווח של הלב. ראשית, הצינור בלב תסיסנית הוא ~ 200 מיקרומטר מתחת לפני השטח הגבה, אשר מספק נוחות עבור גישה אופטית ותצפית על הלב. בנוסף, מנגנונים מולקולריים רבים מסלולים גנטיים שמורים בין תסיסנית ובעלי החוליות. Orthologs של למעלה מ -75% מגני מחל אנושיות נמצאו תסיסנית, אשר הפכה אותו בשימוש נרחב במחקרים מהונדסים 11,13. יתר על כן, יש לו מחזור חיים קצר ועלויות תחזוקה נמוכות, ויש בו נעשה שימוש נפוץ כמודל דגימה למחקר בביולוגיה התפתחותית 14-16.

דיווחים קודמים תיאר את הפרוטוקולים לניטור תפקוד הלב תסיסנית כגון שהואArtBeat. עם זאת, תהליכים לנתיחה נדרשו 17,18. הדמיה אופטית מספקת דרך יעילה לחזות התפתחות לב בחיות בשל אופיו הלא-פולשנית. שיטות הדמיה אופטיות שונות יושמו במחקר לב חי ביצוע, כגון מיקרוסקופיה שני פוטונים 19, מיקרוסקופיה confocal 20,21, מיקרוסקופיה גיליון אור 22, ו טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (אוקטובר) 16,23-26. יחסית, אוק הוא מסוגל לספק עומק הדמיה גדול בלבבות חיה קטנים ללא שימוש בחומרי ניגוד תוך שמירה על רזולוציה גבוהה מהירות הדמית ultrahigh, אשר חשובה לבעלי חי הדמיה לחיות. בנוסף, העלות הנמוכה של פיתוח מערכת אוקטובר יש לפופולרי בטכניקה זו דימות אופטית של דגימות. אוקטובר שימש בהצלחה עבור מחקר אורך של דרוזופילה. באמצעות אוקטובר, הדמיה מורפולוגית ופונקציונלית לב שבוצעה כדי ללמוד את מבנה הלב, funcתפקידים תזונתיים של גנים, ואת המנגנונים של מומים קרדיווסקולרים מודלי מוטציה במהלך התפתחות לב. לדוגמא, ירידה בתפקוד לב תלוי גיל קבלה אוששה הקשורות אנזים למטה מוסדר ההמרה-אנגיוטנסין (ACER) גנים תסיסנית עם אוקטובר 27. Phenotyping של קרדיומיופתיה גנים הקשורים הודגם תסיסנית באמצעות אוקטובר 28-33. המחקר באמצעות אוקטובר חשף גם את התפקיד הפונקציונלי של גן SOX5 אדם בלב תסיסנית 34. לעומת אוקטובר, OCM משתמשת אובייקטיבית עם צמצם מספרי גבוה כדי לספק רזולוציה רוחבית טוב יותר. בעבר, התפקוד לקוי הלב נגרם על ידי השתקת גני יממת אדם ortholog dCry / dClock נחקר באמצעות מערכת OCM מנהג 15,16, כמו גם את ההשפעה של דיאטה עתירה שומן על cardiomyopathies תסיסנית להבין אדם מושרה שמן מחלות לב. 15

הנה, הפרוטוקול דואר ניסוי מסוכם עבור מחקר אורך של שינויים מורפולוגיים ופונקציונליים לב תסיסנית ב instar השני (L2), instar השלישי (L3), גולם יום 1 (PD1), גולם יום 2 (PD2), יום גולם 3 (PD3) גולם, יום 4 (PD4), גולם יום 5 (PD5), ומבוגרים (איור 1) באמצעות OCM להעמיק את הלימוד של מחלות לב מולדות אדם קשור. פרמטרים פונקציונלי לב, כגון משאבי אנוש CAP נותחו כמותית בשלבים התפתחותיים שונים כדי לחשוף את תכונות התפתחות הלב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מערכת OCM עבור דימות אופטי של תסיסנית 16

  1. בחר ספקטרומטר ומצלמת קו סריקה במהירות גבוהה המספקת מסגרת בשיעור של מסגרת 80 לפחות / sec כך שמערכת OCM תוכל לפתור את פעימות הלב של דרוזופילה.
  2. השתמש מקור אור בפס רחב על מנת להבטיח את הרזולוציה צירית של 2 מיקרומטר לזהות את מבנה הלב של דרוזופילה.
  3. השתמש אובייקטיבי 10X להשגת פתרון רוחבי גבוה.
  4. השתמש במראה מוט 45 ° כדי לשקף את קרן אור זרוע התייחסות כדי ליצור קרן אור זרוע מדגם טבעתית להאריך את עומק המיקוד של הדגימות.
  5. פיתוח תוכנת מחשב מותאם אישית כדי לשלוט במערכת OCM ולבצע מדידות.

2. תרבות תסיסנית

  1. הכנת אוכל לטוס תקן
    1. שים ~ 5 מ"ל נוסחה תסיסנית מיידית לתוך בקבוקון קלקרצינור בסיוע מצנח נייר.
    2. יוצקים ~ מי מיליליטר 8 לתוך הנוסחא להרוות את המזון כראוי.
    3. להוסיף תוספי מזון שונים על האוכל לטוס סטנדרט לניסויים שונים. כאשר מתכוננים All-טרנס -retinal (ATR) מזון עבור optogenetic צעדה הניסוי 35, השתמש פיפטה כדי לחלץ 100 מ"מ ATR ולפרוץ ~ 8 מ"ל מים כדי לקבל את ריכוז ATR של 1 מ"מ במזון. לאחר ערבוב פתרון אחיד, יוצקים את הפתרון לתוך נוסחה ומערבבים אותו במידה מספקת.
    4. כדי להכין דיאטה עתירת שומן ללימוד תפקוד הלב הקשורות להשמנה תסיסנית, 10,15 תמהיל ~ 10 מ"ל נוסחה עם 15 מ"ל מים בכוס וחום במשך 30 שניות במיקרוגל. שים קצת שמן קוקוס כתית מעולה אורגני בכוס אחרת ומחמם במשך 90 שניות במיקרוגל.
    5. חלץ 7.5 שמן קוקוס מ"ל ומערבבים עם הנוסחה מוכן מספיק כדי להפוך את יחס משקל / נפח של שמן קוקוס למזון ~ 30/100, ואת הen תמצית ~ 2 מ"ל מעורב המזון ולשים אותו לתחתית של התחתית.
    6. חכו דקות 1 עד בינוני רווי ביסודיות. לדחוס את המזון בקפדנות עם משטח שטוח כדי לייעל את תנאי החיים של דרוזופילה. להוסיף 6 - 8 גרגרי שמרי הנוסחא המוכנה, וחבר את הצינור עם מקבץ של כותנה.
  2. צלבי זבוב פרות ותרבות
    1. קח צינור עם אוכל לטוס תקן מוכן, ולהסיר את הכותנה הפקוקה. להעביר בזהירות את הזבובים הבוגרים (זכר ונקבה) אל הצינור, וחבר את הצינור עם כותנה מייד. בדוק את הכותנה לוודא כי אין פער בין כותנת קיר הצינור כדי למנוע זבובים לברוח מן הצינור.
    2. שמור על זבובי פירות בחממה ב 25 מעלות צלזיוס במשך הכלאות. רוב הגנים פעילים ואת החלבונים התאיים מסונתזים על 25 מעלות צלזיוס 36-39.
    3. להוציא את הצינורית מן החממה לאחר העברת יד 8 אdult טסה מתוך הצינור כדי להשיג את הביצים בגיל דומה לשליטה ניסיון.
    4. המשך culturing את הביצים באינקובטור ב 25 מעלות צלזיוס, שהיא הטמפרטורה תקן לפיתוח תסיסנית עם תקופת הפיתוח של 8.5 ימים 40,41.
      הערה: טמפרטורה משפיעה על תקופה התפתחותית (מביצה לבוגר) וביטוי ברמה של גנים שונים.

3. ביצוע דימות אופטי עם OCM

  1. זחל זבוב הר עבור דימות אופטי
    הערה: הביצה של פתחי תסיסנית ב -22 - 24 שעות של 25 מעלות צלזיוס כדי הזחל instar הראשון (L1). זחל instar השני מתגלה לאחר עוד 24 שעות. צורת הזחל הגדולה היא זחל instar השלישי, אשר molts לאחר כ -24 שעות. מאפיינים מבניים זחל יכולים לשמש כדי להבדיל בין שלבי ההתפתחות השונים שלהם. גודלו של איברי הפה בין instar הראשון ואת instar השני שונה. הפהווים של זחל instar הראשון הם מאוד קטנים נראים כמו שני זוגות של כתמים שחורים זעירים, תוך פי הווים של זחל instar השני הם גדולים יותר, המבנה ברור יותר. Spiracles משמש בדרך כלל כדי לזהות את instar השני ואת instar השלישי. זחל instar השני באלות spiracles הקדמי, בעוד, עבור instar השלישי, spiracles הקדמי הם מסועפים. טבעת כתום כהה תתחיל להופיע בקצה של spiracles האחורי של זחל instar השלישי.
    1. החלת נייר דבק דו צדדי לשקופית זכוכית מיקרוסקופ נקיה. להרחיק את בועות האוויר מתחת לסרט כדי למנוע ההשתקפויות שנגרמו על ידי בועות אוויר במהלך ההדמיה.
    2. קח את אחד הצינורות עם הזבובים התרבותיים החוצה מהחממה בשלב הזחל.
    3. זהה את הזחל בתקשורת, להסיר אותו מהתקשורת עם מברשת ומקום רך על טישו נקי. הסר את כל אוכל שדבק בו הזחל עם מברשת רכה רטובה וייבש אותו על הרקמה.
    4. הזז את Cleaned לטוס רקמה תחת העדשה האובייקטיבית של מיקרוסקופ שדה רחב.
    5. התאם את המיקוד של מיקרוסקופ כדי למצוא תצוגה ברורה של הזבוב. זהה את השלב ההתפתחותי התקין של הזחל על ידי המאפיינים המבניים שלה עם מיקרוסקופ.
    6. מקם את הזבוב באמצעות מברשת רכה. ודא הגוף ישר עם הצד הגבה פונה כלפי מעלה כדי להתכונן הרכבה בשקופית הזכוכית על ידי הצד הגבה. בצע פעולה זו תחת מיקרוסקופ.
    7. ודא הזחל הוא יבש לחלוטין לפני ההרכבה בקלטת. אחרת, הזחל לא ידבק לקלטת.
    8. היצמד הגבו בצד של הזבוב ממוקם לקלטת בצד הכפולה בשקופית הזכוכית עם לחץ מתון. שים לב יותר מדי לחץ יכול להרוג את הזבוב כוח מעט מדי יוביל לטוס התנועה במהלך ההדמיה.
  2. דימות אופטי של תסיסנית בשלבים הזחל (L2 ו- L3) עם OCM
    הערה: לומן רחב של צינור הלב יכול להיות FOund ממוקם במגזרי בין A5 ל A8 בשלבי הזחל (איור 1). התמונות הרוחביות OCM M-mode (2D + זמן) נרכשו על קטע A7 של צינור הלב עבור כל זחל כדי להקל על הסיסטולי וניתוח הדיאסטולי.
    1. מניח את הזחל רכוב על הבמה המדגמת מתכווננת של מערכת OCM לאורך בכיוון y-רוחבי עם הצד הגבה פונה כלפי מעלה מתחת העדשה האובייקטיבית. חור קטן במת המדגם הכרחי צבת הזחל להימנע מהמגע שלו עם המטוס הבמה.
    2. התאם את הבמה המדגמת להעביר את צינור הלב של זבוב הפרות למישור המוקד של קרן ההדמיה. כדי למצוא בקלות במגזר A7, למצוא באזור האחורי של צינור הלב עם בזמן אמת תמונות OCM חתכו בתוכנת רכישת תמונה. ואז להזיז את הבמה קדימה עד במגזר A7 גלוי.
    3. פרמטרי סט של תוכנת רכישת תמונה ל -100 A-סריקות לכל B-scan (מסגרת), 100 B-סריקות, ואת scanneמתח r לכסות ~ 0.28 מ"מ בכיוון x-רוחבי, ו -0 V לכיוון y-רוחבי. לחץ על הכפתור "התחל" בתוכנה לרכוש את נתוני רעש רקע רקע חיסור על ידי חסימת נתיב קרן המדגם עם בד כהה.
      הערה: 3 של 100 מסגרות ניתן להשתמש עבור רקע חיסור.
    4. פרמטרי סט של תוכנת רכישת נתונים 128 A-סריקות לכל B-scan, 4096 B-סריקות, ואת מתח הסורק לכסות ~ 0.28 מ"מ בכיוון x-רוחבי, ו -0 V לכיוון y-רוחבי. לחץ על הכפתור "התחל" בתוכנה לרכוש את תמונות M-mode הרוחבי על פני קטע A7 של צינור לב לטוס מעל אזור המשתרע 0.28 x 0.57 מ"מ 2 במשך כ -30 שניות.
    5. חסום את קורה ההדמיה באמצעות מטלית כהה בתהליך חיסכון הנתונים כדי למנוע חשיפה ממושכת של הלב לטוס אל אור ההדמיה.
    6. חזור על המדידה עבור 5 פעמים כדי לקבל מדידה אמינה של כיף הלבction.
    7. פרמטרי סט של תוכנת רכישת תמונה ל -400 A-סריקות לכל B-scan, 800 B-סריקות, ואת מתח הסורק לכסות ~ 1.7 מ"מ בכיוון x-רוחבי, ו ~ 4 מ"מ בכיוון y-רוחבי. הזז את הבמה בשני הכיוונים כדי להבטיח זבוב הפירות כולו ניתן הדמיה. לחץ על כפתור "התחל" בתוכנת לרכוש במערך אחד כדי להשיג תמונות של זבוב הפירות ב 3 מימדים. הערה: מבנה לטוס 3D יכול להיות שניתנו באמצעות תוכנת עמירה 3D
    8. השתמשו במברשת רכה רטובה כדי ללחלח לטוס מדודה בעדינות להסיר אותו משקופית הזכוכית. העבר אותו לתוך צינור נפרד עבור פיתוח מתמשך. לייבל הצינור עבור מחקר אורך דרך שלבי ההתפתחות הבאה.
  3. תמונת תסיסנית בשלבי גלמים
    הערה: כל זבובי פירות הוצאו הדמיה מן PD1 כדי PD5. כפי שניתן לראות את התרשים הזחל באיור 1b, לומן רחב נשאר A5 למגזרים A8 של הצינור לב דואר עד PD1. מ PD2, תא חרוטים מתחיל להתפתח בין A1 למגזרי A4. כדי לרכוש תמונות עקביות להקל על ניתוח לב, תמונות M-mode רוחביים התקבלו ממגזר A7 ב PD1, ומן מגזר A1 לאחר PD2, כמסומן באיור 1b.
    1. תסיסנית תמונה ב PD1
      הערה: תהיה תסיסנית puparium לבן עבור חלון זמן קצר (1 - 0 hr) במהלך PD1. חלון פעם הוא אידיאלי לביצוע הדמיה אופטית של גולם מוקדם כי תכלית השקיפות הגבוהה מובילה חדיר אור גבוה עבור הדמית OCM.
      1. כמו זבובי הפרות נמצאים על קיר הצינור כאשר הם הופכים גולם, להסיר את הגולם מן הצינורות בודדים עבור הדמית PD1 עם מברשת רכה רטובה, ולנקות את הגולם עם המברשת אם יש אוכל דבוק בגוף.
      2. הר זבוב הפרות בשקופית זכוכית קטנה ישירות עם המברשת הרטובה ולשמור בצד הגבה פונה כלפי מעלה (איור 1 א
      3. סר מים מופרזים מהצד של גוף הזבוב.
      4. שים את השקופית זכוכית על הבמה מדגם של מערכת OCM, שמירה על זבוב הפירות על גבי. מצא תמונה בזמן אמת ברורה של מגזר A7 של הלב לטוס ניצול אותה האסטרטגיה תארה במדידת הזחל.
      5. הגדר אותם הפרמטרים של התוכנה רכישת נתונים כאמור בסעיף 3.2, ותמונה פעימות בפלח A7 לרכוש תמונות M-mode ו 3D רוחבי.
      6. לאחר הדמיה, השתמש פינצטה למקום שקופיות זכוכית עם גולם בחזרה לתוך הצינור לתרבות רציפה.
    2. תסיסנית תמונה ב PD2 לשלבים PD5
      הערה: מאז הדגימה הופכת להיות יותר ויותר אטומים בשלבי הגלמים, עומק החדירה של מערכת ההדמיה יופחת.
      1. השתמש פינצטה להסרת s הזכוכית בזהירותLIDE רכוב עם זבוב ממרחק PD2 מהצינור הדמיה. בשעת PD2, קליפת הדגימה הופכת צהבהבה והגוף הופך להיות פחות שקוף לעומת PD1 (איור 1).
      2. שים את השקופית על הבמה מדגם של מערכת OCM.
      3. התאם את הבמה המדגמת להעביר את הזבוב לתוך מטוס המוקד של קרן הדמיה של מערכת OCM. מצא את הקצה הקדמי של צינור הלב עם תמונת OCM חתך בזמן אמת. זז ~ 50 מיקרומטר חזרה לכיוון האחורי כדי למצוא את קטע A1 של צינור הלב.
        הערה: בשלב זה של התפתחות הלב (PD2), תא חרוטי יהיה קטן מאוד ולא ניתן להכות.
      4. אסוף מערכי נתוני M-mode רוחביים ממגזר A1 וכן נתוני 3D תוך שימוש באותה השיטה כמו שלבי התפתחות קודמים.
      5. שים את השקופית חזרה לתחתית בזהירות לתרבות רציפה.
        הערה: בשעת PD3, הצבע של הדגימה במעטפת הוא כהה יותר, כי בשלב PD2. בשלב PD4, פסים שחורים can להיבחן בתוך הקונכייה של דגימות. כמה זבובים יתפתחו למבוגרים בשלב זה להיכנס ביום המחרת, בעוד שאחרים יתפתחו PD5. בשלב PD5, פסים שחורים הם אפילו יותר ברור לראות זבובי פירות. זבובים אלה יהפכו למבוגרים למחרת.
  4. תסיסנית תמונה בשלב למבוגרים
    הערה: בשלב המבוגר, זבובים נשיים וגבריים ניתן להבחין לפי גודל הגוף ואת הצבע של הבטן התחתונה. יש נקבה מבוגרת בגודל גדול יותר, בעוד זכרים קטנים וכהים בצבע בבטן התחתונה.
    1. קח את הצינור החוצה מהחממה כאשר זבוב הפירות מתפתח מבוגר, ולהעביר המבוגר לטוס בקבוקון ריק ~ 45 מ"ל.
    2. טובל את הקצה הסופג (~ 1 סנטימטר אורך, ~ 3 מ"מ קוטר) של שרביט לתוך ההרדמה, לשים את השרביט לתוך הבקבוקון, וחבר את הצינור עם מקבץ של כותנה לשמור בסוף ההרדמה ממש מתחת הכותנה הפקוקה וכדי Anesthetize לטוס במשך 3 דקות. משך ההרדמה תלוי בגודל של הזבוב, ועשוי להשתנות בין 2.5 כדי 3.5 דקות (למשל: זכר עבור 2.5 דקות, נקבה במשך 3 או 3.5 דקות).
    3. כן שקופית זכוכית עם חתיכת סרט דו צדדי.
    4. הזז את הזבוב מורדם לשקופית זכוכית עם הצד הגבי פונה כלפי מעלה באמצעות מברשת רכה.
    5. הפרד את הכנפיים בעזרת פינצטה ולתקוע את הכנפיים בקלטת תחת מיקרוסקופ כדי לתקן את הזבוב לחשוף באזור הלב הדמיה.
    6. תמונה לטוס ממגזר A1 של לב הזבוב (איור 1). בסוף הניסוי, זבובים עלולים להיות קורבן.

4. הדמית ניתוח 16

  1. לפתח תוכניות Matlab להמיר את הקבצים הבינאריים 2D and 3D שנאספו עם תוכנת רכישת תמונה לקבצי תמונה.
  2. השתמש ImageJ לזהות את האזור הצינור לב בתמונות M-mode רוחבי אלגוריתם מטה קסמים createa מסכה של אזור לב לכל תמונת M-mode רוחבי. מגזר באזור הרעול הפנים ולהשתמש אלגוריתם מציאת שיא לזהות את מיקומי הסיסטולי והדיאסטולי. חשב את שינויי לב בקוטר תלוי זמן מהתמונות הרוחביות M-mode.
  3. בהתבסס על בקטרי לב התלויים רכש זמן, לחשב את הפרמטרים של לב כגון משאבים אנושים, תקופת פעילות לב (CAP), בקוטר דיאסטולה סוף (EDD), בקוטר התכווצות הסוף (ESD), אזור דיאסטולה סוף (EDA), ולסיים באזור התכווצות ( ESA). חשבתי את הקיצור החלקי (FS) עם משוואה 1
  4. השתמש ImageJ לנתח את תמונות 3D OCM לדמיין את ההתפתחות המבנית של הלב לטוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הדמיה של הלב האורך נערך באמצעות זבובי פירות עם זן 24b-GAL4 / + בטמפרטורת החדר עם OCM. מדידות בוצעו L2, L3, ובאותו 8 במרווחים hr מ PD1 כדי PD4, ומבוגר יום 1 (AD1) כדי לעקוב אחר תהליך המטמורפוזה (טבלה 1). זחל, גולם מוקדם, גולם מאוחר זבובים בוגרים היו רכובים על שקופיות הזכוכית כפי שניתן לראות באיור 1 א. תכונות הקטע של הלב לזבובי זחל ובוגר הוצגו מצגי סכמטי באיור 1B.

במחקר התפתחותי זה, 4,096 מסגרות נרכשו ב -32 שניות עם מערכת OCM מנהגנו להתחקות אחר פעימות הלב של זבוב הפירות. כדי לשפר את דיוק מדידה, חמש מדידות חוזרות נלקחו מכל דגימה בכל שלב התפתחותי. נתוני 3D ניתן להשיג גם לראות את השינויים במבנה לב במהלך המטמורפוזה.

רוחבי M-mode ותמונות 3D היו ג reated עם תוכניות מותאמות אישית Matlab ו ImageJ. En תמונות פנים וחתכים ציריים נבנו גם מהנתונים רכשו כדי להמחיש את תהליך השיפוץ של הלב במהלך המטמורפוזה תסיסנית (איור 2). כדי לכמת את תפקוד הלב של זבובי פירות, באזור הלב היה מפולח באופן אוטומטי באמצעות תוכנית Matlab המנהג מכל 4096 מסגרות. קצב לב זבוב (HR) ניתן לכמת מתמונות OCM M-mode הרוחבי (איור 3 א). במהלך שלבי גלמים, בלב תסיסנית מפסיק לפעום מדי פעם 16. הצגנו פרמטר פונקציונלי לב חדש, תקופת פעילות לב (CAP) לכמת את היחס בין התקופה עם פעימת זמן ההדמיה הכוללת (איור 3 ב). EDD, ESD, EDA, ESA FS שמש גם לכמת את שינויי חדר לב בשני ממדים ציריים הרוחביים במהלך ההתפתחות תסיסנית. 16

תוכן "> בשלבי זחל, צינור הלב מתחיל בבית A8 באזור הבטן האחורי עם לומן רחב (A5 - A8 באיור 1B) ומסתיים A1 הקטע הגבה הקדמי בקוטר צר (T3 / A1 - A5 באיור 1B ). היה ממוקם מדיאלית dorsally וגדל גדול במהלך L2 (איור 2 א, ב) ו- L3 (איור 2 ג, ד). לאחר הזנת PD1, צינור הלב נצפה ריצת axially על גבי אוויר נע תא הלב בועה (ה איור 2, ו) בסביבות 10 -. 13 שעות מאוחר יותר, הבועה נעלמה לאחר היווצרות puparium ואת לומן הרחב הפך everted מאז צינור לב הקדמי היה ממוקם ventrally, הצינור בלב השלם היה בלתי נראה למעט באזור האחורי של. . תמונות OCM ~ 12 שעות לאחר היווצרות puparium מאוחר במהלך PD2, חדר הלב מיושרות בהדרגה לאורך בטן הגב, ואת החלק האחורי (A6 - A8) של הלב חוסל (ז איור 2, ח) 42,43. תא חרוטים החל לפתח ~ A1 - A4 קטע במהלך PD2 וגדל בגודל עד לשלב הבוגר (איור 2 i - מ ').

מלבד התבוננות שינויים מבניים, שינויים רבים תפקודיים נמצאו גם במהלך שיפוץ לב. התמונות M-mode שמוצג באיור 3 להוכיח כי דופק האטה משמעותית משלב הזחל לשלב גלמי, ולאחר מכן הגדילה בצורה ניכרת מן הגולם אל מבוגר. שינויי HR משמעותיים נצפו במהלך (איור 4 א) מחזור החיים. יתר על כן, בתקופת פעילות לב (CAP) נותחה עבור כל דגימות נמדד L2 כדי AD1 (איור 4 ב). כפי שניתן לראות בתרשים 4, HR מחזיקה ב ~ 277 פעימות לדקה (BPM) עבור L2 ו- L3. כשנכנס בשלבי הגלמים מוקדם יש ירידה ניכרת HR וכובע. HR מצטמצם ל -86 ± 11 פעימות לדקה בתחילת PD1, וממשיך לרדת ל 26 ± 8 BPM על ידי הדוארnd של PD1 סוף סוף מגיע לעצירה מוחלטת מוקדם PD2. תגלית מעניינת אחת היא התקופה הארוכה של חוסר פעילות לב נצפה סביב הבמה PD2 (~ 24 שעות - 48 שעות לאחר היווצרות puparium), התייחסו diastalsis התפתחותי לב כמו 16. בסוף PD2, מכות לסירוגין איטיות קורות חיים (HR 17 פעימות לדקה ± 6 עם CAP 5 ± 2). לאורך PD3 ו PD4, משאבי אנוש CAP גידול עד שמגיעים 392 ± 32 פעימות לדקה ו -95 ± 3% ביום הראשון של לשלב הבוגר (5 ימים לאחר תחילת השלב גלמי).

איור 1
איור 1. שם של תסיסנית בשלבים שונים וייצוג סכמטי של מטמורפוזה לב. (א) שמה של זחל, גלמים, ומבוגר WT (24b-GAL4 / +) זבובים על שקופיות זכוכית. (ב) ייצוג סכמטי של מטמורפוזה לב. חיצים אדומים על schemati זחל והבוגרc לציין את המיקומים הדמיה OCM M-mode עד PD1 24 שעות ובמשך נקודות בפעם הבאה, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. שינויים תסיסנית לב מורפולוגי. אן-פאס ותמונות OCM המודולרית צירית של WT תסיסנית להשיג בחנות (a, b) L2 (ג, ד) L3 (ה, ו) PD1 (ז, ח) PD2 (i, l) PD4 ו (k, m) מבוגר שלבים. תמונות M-mode של הלב תסיסנית התקבלו ממגזר A7 עד PD1 ומן המגזר A1 לשלבים הבאים. ברי המידה en תמונות חתך פנים ציריות מציינות 200 מיקרומטר ו -500 מיקרומטר, respectively. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. שינויים תפקודיים תסיסנית לב. (א) תמונות M-mode בשלבים התפתחותיים שונים המראים שינויים HR פני מחזור החיים. (ב) דוגמאות הוכחת תקופת פעילות לב חישוב (CAP). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. ניתוח כמותי של פרמטר פונקציונלי לבים ב WT זבובים בשלבים התפתחותיים שונים, כולל L2, L3, בשלבים גלמי ב 8 במרווחים hr, ו AD1. (א) HR. (ב) CAP. בר השגיאה של כל קבוצה מייצג את סטיית ההתקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

השלב ההתפתחותי
L2 L3 PD1 PD2 PD3 PD4 AD1
8 שעות 16 שעות 24 שעות 32 שעות 40 שעות 48 שעות 56 שעות 64 שעות 72 שעות 80 שעות 88 שעות
דגימת מספר 21 17 13 19 19 19 19 19 19 18 17 18 9 25

מספר טבלה 1. WT זבובי פירות נמדד בשלבים התפתחותיים שונים לחקר התפתחותית לב.

וידאו 1
מעקב וידאו 1. Heartbeat יחד זמני ממד שינוי קוטר לב קאמרי הקביל לאורך כיוון z (בכיוון הצירי) בתוך WT לטוס L2. הלב פועם יחסית מהר בקצב קבוע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.) p>

וידאו 2
מעקב וידאו 2. Heartbeat יחד זמני ממד שינוי קוטר לב קאמרי הקביל לאורך כיוון z (בכיוון הצירי) בתוך WT לטוס PD1. קל HR התחיל לרדת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)

וידאו 3
מעקב וידאו 3. של Heartbeat יחד זמני ממד שינוי קוטר לב קאמרי הקביל לאורך כיוון z (כיוון ציר הסיבוב) בתוך WT לטוס PD2. הלב הפסיק לפעום לחלוטין בזמן. התנודה של z-קוטר זמם נבעה רעש ההדמיה. Target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)

וידאו 4
מעקב וידאו 4. Heartbeat יחד הזמני מימד שינוי קוטר הלב הקאמרית מקבילים לאורך כיוון z (כיוון ציר הסיבוב) בתוך WT לטוס PD4. לאחר PD2, קל HR ו- CAP התחיל להגביר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)

וידאו 5
מעקב וידאו 5. Heartbeat יחד זמני ממד שינוי קוטר לב קאמרי הקביל לאורך כיוון z (כיוון ציר הסיבוב) ב זבוב WT ב AD1. הקל HR היא הגבוהה ביותר מבין כל השלבים והכובע היה כמעט 100%.rce.jove.com/files/ftp_upload/55002/video5.mp4 "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)

וידאו 6
טיוח מבני 3D וידאו 6. של זבוב זחל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

קצב פעימות לב המהיר של תסיסנית, עם HR מקסימום בסביבות 400 פעימות לדקה בשלבי זחל ובוגר, דורש מהירות גבוהה הדמיה כדי לפתור את הלב diastoles ו systoles (לא פחות מ -80 מסגרות / שנייה מבוסס על חוויות). בשל עובי דופן לב בקנה מידה קאמרי לב קטן בגודל מיקרון (5 - 10 מיקרומטר), ברזולוציה מרחבית גבוהה (טובה יותר מ -2 מיקרומטר) נדרש לפתרון מבני צינור לב. במחקר זה, רזולוציה גבוהה ומערכת OCM מהירות ultrahigh פותחה, שבו ספקטרומטר עם 600 שורות / מ"מ שידור צורם ומצלמת קו-סריקת פיקסל 2,048 היו בשימוש. שיעור A-סריקה של 20 קילוהרץ מסופק על ידי מצלמת הקו-סריקה. קצב הפריימים של 128 מסגרות / sec הוא מהיר מספיק כדי ללכוד את הדופק תסיסנית בשלבים התפתחותיים מרובים, כולל L2, L3, PD1, PD2, PD3, PD4, PD5, ומבוגר. מקור האור היה מקור אור supercontinuum רוחב הפס רחב עם אורך גל מרכזי ורוחב פס של ~ 800 ננומטר ו ~220 ננומטר בהתאמה וקבל החלטה צירית של ~ 1.3 מיקרומטר רקמות. מטרת 10X שמשה בזרוע המדגם לממש החלטה רוחבית של ~ 3.9 מיקרומטר. מאז צינור בלב תסיסנית הוא סביב 200 מיקרומטר מתחת לפני השטח הגבי, עומק הדמיה של מאות מטרים מיקרון נדרש. מראה מוט 45 ° יכול להיות מנוצל כדי ליצור קרן מדגם טבעתית ולהאריך את עומק מיקוד הדגימה 44. הרגישות ו -3 dB רול- off נקבעו 96 דציבלים 600 מיקרומטר, בהתאמה עם כוח הזרוע מדגם של ~ 9 mW. תכנית מחשב מותאם אישית שמשה לשלוט במערכת OCM ולנהל את המדידות. התמונות המבניות הלב והפרמטרים פונקציונליים השיגו להוכיח את ההיתכנות של שימוש OCM לאפיין את מורפולוגיה הלב כמותית ותפקוד של תסיסנית לאורך כל מחזור החיים כולו שלה.

נכון לעכשיו, מספר טכניקות אחרות משמשות גם תמונה קטנההחיה של לב מבנה או תפקוד, כגון טומוגרפיה ממוחשבת (CT), הדמיית תהודה מגנטית (MRI), ואולטרסאונד. OCM ומספקת פתרונות במרחב ובזמן גבוהים יותר מאשר טכניקות אלה, המאפשרת הדמיה של מבנים בסדר ודינמיקה מהר בלבבות חיים. מיקרוסקופיה Confocal היא טכניקה נוספת הדמיה בשימוש נרחב, אבל חדירת ההדמיה נמוכה ורכישת הסוכנים בניגוד הדמיה להגביל היישומים שלה בבעלי חיים. יחסית, OCM מאפשרת מהירות גבוהה הדמיה ללא תווית המאפשר הדמיה דינמיקה הלב מהר הלא פולשני בבעלי חיים קטנים. עם זאת, ישנם עדיין מגבלות של OCM. לדוגמה, את עומק הדמיה מסופק על ידי OCM מוגבל על ידי פיזור אור מכמה מאות מיקרונים לכ 1 מ"מ הרקמה תוך יש אולטרסאונד מעמקי החדירה של עד 10 ס"מ. לעומת מיקרוסקופיה confocal, OCM בעל מהירות גבוהה ועומק הדמיה טוב יותר, אבל עם רזולוציה נמוכה יותר וניגודיות מולקולרית עניה. יתר על כן, מערכת OCM הנוכחית שלנו היא based על מערכות גילוי ספקטרלי-מושלם. מהירויות הדמיה גבוהות יותר על בסיס הקוד נסחף OCM 45 עשויות לספק תמונות ברורות יותר של דינמיקה מהירה כמו פעימות הלב.

כדי לבצע מחקר אורך של פעימות הלב תסיסנית עם OCM, ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול. הזבובים יש לטפל בעדינות רבה בכל שלבי הניסוי. ניהול הזחל צריך להיות עדין במיוחד שכן הוא קל לפגוע הזחל, שעלולות להשפיע על מבנה הלב ותפקודו בשלבים התפתחותיים הבאים. הזבובים חייבים להיות ממוקמים על זכוכית המכסה ושלב ההדמיה בדיוק רב. גרוע זבובים שהוצבו יקשו לרכוש תמונות באיכות ועלול לגרום ערכי פרמטרי לב מבניים ותפקודיים סוטים. בנוסף, מבוגרי העברת זבובים ממבחנה אחת לאחרת, חיבור כדור צמר גפן צריך להיות מהיר מאוד כדי למנוע את בריחתם מהצינור.

מחקרים שונים עלפיתוח לב תסיסנית יכול להתבצע על ידי שינוי הפרוטוקול. הטמפרטורה שבה הזבובים הם מתורבתים ניתן להגדיל או ירד מ 25 ° C כדי לשנות את רמת ביטוי גני הלב ולשנות את תקופת פיתוח זבוב. על ידי הוספה כמה מרכיבים כגון שמן קוקוס או ATR לאוכל הרגיל, התפתחות הלב עשוי להשתנות. ניתן לבצע מחקרים ספציפיים סוג בר או זבובים מהונדסים. כאשר לומדים זבוב הפירות הלב פיתוח longitudinally, מרווחי זמן שונים שניתן להשתמש בהם כדי לבצע את המדידות OCM, למשל, מרווח 8 שעות יוכל לשמש בשלבים גלמי. בשל רגישות מוגבלת של מערכת OCM שלנו, הרבה רעש רבב אחיד נמצאת תמונות M-mode הרוחבי, אשר יכול להקשות לזהות אותות התכווצות לב כראוי עם תוכניות Matlab ו מפחית את היעילות של ניתוח נתונים. רגישות ניתן להגדיל על ידי שיפור ההתאמה בין מערכת OCM. אלגוריתמי סינון אופטימלייםמומלץ להסיר חלק של כתמים.

הפרוטוקול המתואר יושם ללמוד שתיקת orthologs יממה האנושי, dCry ו dClock מושרה פגמי לב תסיסנית. HRs מתחלש נצפו בשלבים התפתחותיים שונים, כולל זחל, גולם, ומבוגר 15,16. תפקידה של גני יממה בפיתוח לב התגלה, מה שעשוי להסביר את הקשר בין מחלות לב וכלי דם ודפוסי פעילות בנושא מחזור היממה. עתיר שומן-תזונה (HFD) הפרעות לב הנגרמת גם נחקרו על ידי ניתוח שינויים תפקודיים בלב זבובי פרות נמאסים עם HFD 15. מחקרים אלה הראו לא תסיסנית רק ככלי רב עוצמה במחקר ההתפתחותי של מבנה הלב ותפקודו, אלא גם את המשמעות של מחקר אורך הלב בהבנת מחלות אנושיות מולדות לאחר הלידה. פלטפורמת OCM תאפשר מגוון רחב של מחקרים עתידיים iהגן n הקשורים למחלות לב האדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
ImageJ National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223, (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223, (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15, (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37, (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11, (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12, (6), 064021 (2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91, (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76, (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5, (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178, (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22, (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246, (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22, (4), 6803213 (2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10, (9), e0137236 (2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425 (2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425 (2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299, (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41, (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9, (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15, (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2, (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -T., Chang, C. -Y., Su, M. -T., Kuo, W. -C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19, (1), 011014 (2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103, (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114, (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8, (3), 313 (2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15, (5), 056020 (2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4, (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6, (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22, (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1, (9), e1500639 (2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3, (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20, (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17, (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. Jr Laboratory culture of Drosophila. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. Drosophila: a laboratory handbook. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109, (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132, (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17, (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21, (15), 18021-18033 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics