Dissection de l'Auditory Bulla chez les souris postnatale: Isolation des os de l'oreille moyenne et l'analyse histologique

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Sakamoto, A., Kuroda, Y., Kanzaki, S., Matsuo, K. Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis. J. Vis. Exp. (119), e55054, doi:10.3791/55054 (2017).

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Abstract

Dans la plupart des mammifères, osselets de l'oreille moyenne, y compris le marteau, l'enclume et l'étrier, sont les plus petits os. Chez la souris, une structure osseuse appelée la bulle auditive loge les osselets, tandis que la capsule entoure auditif de l'oreille interne, à savoir la cochlée et les canaux semi-circulaires. osselets murins sont essentiels pour l'audition et donc d'un grand intérêt pour les chercheurs dans le domaine de otorhinolaryngologie, mais leur métabolisme, le développement et l'évolution sont très pertinentes pour d'autres domaines. Métabolisme osseux Altered peut affecter la fonction auditive chez les souris adultes, et diverses souris génétiquement déficientes en montrer les changements dans la morphogenèse des osselets in utero. Bien que osselets murins sont minuscules, leur manipulation est possible si l'on comprend leur orientation anatomique et structure 3D. Ici, nous décrivons comment disséquer la bulle auditive et de la capsule de souris postnatales et ensuite isoler osselets individuels en enlevant une partie de la bulle. Nous discutons également comment emlit la bulle et de la capsule dans des orientations différentes pour générer de la paraffine ou des coupes congelées convenant à la préparation de coupes longitudinales, horizontales ou frontales du marteau. Enfin, nous énumérons les différences anatomiques entre les souris et osselets humains. Ces méthodes seraient utiles dans l'analyse des aspects pathologiques, de développement et de l'évolution des osselets et l'oreille moyenne chez les souris.

Introduction

Les trois osselets de l'oreille moyenne, à savoir le marteau, l' enclume et l' étrier, forment une chaîne de mammifère auditif spécifique qui transmet le son à partir de la membrane du tympan de l'oreille interne ou cochlée 1,2. Fonction auditive peut être évaluée chez des souris en mesurant la réponse auditive du tronc cérébral (ABR) seuils 3-6, et les vibrations du marteau derrière la membrane tympanique peut être contrôlée en utilisant Laser Doppler Vibrométrie (LDV) 7. En combinant ABR, LDV et Distortion produit Otoacoustic Emission (ÉOAPD) mesures, la perte d'audition conductrice peut être discriminé de déficience neurosensorielle 8.

Les modèles animaux de conditions d'oreille sont nécessaires, étant donné l'importance de l'audition et de la santé de l'oreille pour le bien-être des patients de tous âges. Par exemple, l'otite moyenne est une infection de l'oreille très fréquemment observés chez les nourrissons et les enfants humains, et de graves, l'otite moyenne aiguë et ses complications peuvent se produire si les condition ne sont pas traités avec des antimicrobiens appropriés 9. Des modèles de souris de l' otite moyenne pourraient se révéler utiles dans la compréhension de la pathogenèse et le développement de traitements 10,11.

Osselets murins, qui (sauf pour la partie goniale du marteau) sont formés par ossification endochondrale 12,13, sont très pertinents pour l'étude du métabolisme osseux et de la morphogenèse. Tout d' abord, leur petite taille permet une analyse à haute résolution des os avec un périoste intact en utilisant des rayons X ou microscopie à fluorescence 14. Deuxièmement, le métabolisme osseux anormal, comme la résorption osseuse excessive ou déficiente, ou des interactions avec facultés affaiblies chez les cellules osseuses 15, peut être analysé comme un facteur potentiel de perte auditive 3,4,7. Troisièmement, la morphogenèse osselet anormale est signalée dans plusieurs souris génétiquement déficientes, comme les animaux dépourvus Hoxa2 16-19, Msx1 20-22, Prrx1 23, Goosecoid(Gsc) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (MKP3) 27, Noggin (Nog) 28, FGFR1 29, hormone thyroïdienne récepteurs (Thra, Thrb) 5, Bcl2 30 et autres 1,31, ou chez les souris surexprimant Hoxa2 32. Enfin, malgré leur petite taille, les structures associées à des osselets tels que les muscles et les articulations 33 34,35 sont accessibles.

osselets souris sont plus petits que osselets humains, mais il est intéressant de noter que l'oreille moyenne de la souris ne sont pas une version miniature de son homologue humain. Par exemple, chez la souris, l'artère stapédienne, qui passe à travers l'anneau de l'étrier, persiste tout au long de la vie 36, alors que chez l' homme, l'artère stapédienne embryonnaire disparaît pendant la gestation. En outre, la morphologie du marteau de souris diffère de celle du ièmee os humain (voir Figure 6). Chez les souris, la bulle auditive (tympanique) entoure la cavité de l' oreille moyenne remplie d' air, alors que chez les humains, les cellules mastoïdiennes composées d'os trabéculaire dans l'os temporal abrite les osselets plutôt que d' une bulle 37. Chez les deux espèces, la capsule auditive (capsule otique, labyrinthe osseux) entoure la cochlée et des canaux semi-circulaires de l'oreille interne. Biologie comparative et évolutive de l'oreille moyenne a été largement revu 38-40.

Le protocole ci-dessous la première décrit comment disséquer la bulle et de la capsule auditive, qui se composent principalement de l'oreille moyenne et l'oreille interne, respectivement. Ce protocole montre également comment isoler le marteau, l'enclume et l'étrier de la bulle auditive. Enfin, il montre comment orienter la bulle auditive et de la capsule pour l'incorporation dans la préparation pour la coupe des tissus du osselets.

Protocol

Toutes les procédures animales effectuées dans cette étude sont approuvés par l'Université Keio Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC - numéro d'homologation: 09221) et suivre les directives institutionnelles sur l'expérimentation animale à l'Université Keio pour l'utilisation des animaux dans la recherche. Les échantillons humains ont été isolés à partir d'un cadavre donné au département d'anatomie, École de médecine de l'Université de Keio, et ont été utilisés conformément aux règlements de l'établissement.

1. Isolement de Auditory Bulla et Capsule

  1. Euthanasier souris dans un bocal contenant une plate-forme au-dessus des serviettes en papier imbibées d'isoflurane ou sévoflurane jusqu'à la ventilation respiratoire cesse pendant plus d'une minute, puis effectuer la dislocation cervicale. Soyez prudent pour éviter le contact direct de la souris avec les serviettes en papier imbibées.
  2. Faire une petite incision transversale à la face dorsale du cou et tirez la peau à part vers la tête et la queue en utilisant les deux mains pour exposer mu du cou sous-jacenttissus SCLE.
  3. Décapitez souris à la région cervicale en utilisant 14 cm ciseaux chirurgicaux tranchants.
  4. peau Peel complètement vers le nez. Coupez toute la peau avec le museau et les incisives.
  5. Insérez des ciseaux dans la bouche et couper les muscles masséters des deux côtés.
  6. Ouvrez la mâchoire soigneusement et retirez la langue et la mâchoire inférieure ensemble.
  7. En utilisant des ciseaux pointus, crâne fendu et la base du crâne en deux moitiés le long du plan sagittal médian (figure 1A, B).
  8. En utilisant une pince, retirer les hémisphères cérébraux et cérébelleux et le tronc cérébral. La bulle auditive et de la capsule sont situés en dehors de la cervelet et le tronc cérébral. A noter que la bulle auditive est en outre latérale de la capsule auditive (figure 1C, D).
  9. Disséquer la bulle et de la capsule avec le crâne os environnant (figure 1E).
  10. Transférer le spécimen dans un récipient contenant un tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4 à température ambiante.
  11. Under une dissection microscope binoculaire, utilisez une pince pour séparer les os et les ciseaux pour couper autour de la frontière desserré autour de la bulla et de la capsule (figure 1F). Les os environnants enlevés sont le basioccipital (frontière ventrale), exoccipital (ventro-postérieur frontière), supraoccipital (frontière postérieure), interparietal, pariétal (dorsale frontière), squamosal (dorso-bord antérieur), alisphénoïde (frontière antérieure), et basisphénoïde os (frontière antéro-ventral). Notez que le processus de styliforme (Sp), qui prend en charge l'ouverture tympanique de la trompe d' Eustache 41, est distinct du processus styloïde de l'os temporal.

2. Isolement de Auditory Osselets: Malleus, enclume et l'étrier

  1. Marteau
    1. Avec les deux petits ciseaux et des pinces, retirer la partie du canal latéral auditif externe à l'tympanicus sulcus de telle sorte que la membrane tympanique est visible (figure 2A, B).
    2. Retirez une partie de la membrane tympanique et de l' os tympanique près du malleal brevis Processus (apophyse orbiculaire, voir Discussion), les deux à la ventrale ( en pointillés) et postérieur (#) murs (figure 2C). Le marteau et muscle du marteau doit maintenant être exposée (figure 2D, E).
    3. Soulevez le marteau (figure 2F) et couper le muscle tenseur du tympan avec le bord biseauté d'une G aiguille 27 (figure 2G). A noter que le manubrium malleal se fixe solidement à la membrane du tympan, comme on le voit chez les autres mammifères.
    4. Détacher la membrane tympanique soigneusement du manubrium, qui est fragile. Retirer l'os tympanique pour révéler les trois osselets.
    5. Disloquer le marteau de l'enclume à l'articulation osselets (figure 2H).
    6. Isoler le malleus en fracturant le processus antérieur au goniale.
  2. Enclume et l' étrier
    1. Isoler til incus en coupant le ligament postérieur de l'enclume à court crus (figure 3A).
    2. Isoler l'étrier en coupant l'artère stapédienne près de l'étrier avec le bord biseauté d'une G aiguille 27 (figure 3B, C). Si nécessaire, couper le tendon du muscle stapédien au processus musculaire de l'étrier avec l'aiguille.
    3. Insérez une aiguille à coudre (ou une broche de marquage) dans le trou obturateur de l'étrier et soulever l'étrier. Après avoir enlevé l'étrier, la fenêtre ouverture ovale doit être clairement visible (figure 3D).

3. Incorporation de Auditory Bulla et Capsule

  1. Préparation pour l' intégration dans des blocs de paraffine
    1. Isoler la bulle et de la capsule comme décrit dans la section 1.
    2. Coupez l'extrémité antérieure de la bulle (le processus de styliforme) avec des ciseaux, immergez la bulle et de la capsule dans 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS à 4 °C, et laisser fixateur d'entrer dans la bulle. Si l'air est emprisonné dans la bulle, l'enlever avec une aiguille et la seringue. Laissez la bulle et de la capsule dans le fixateur à 4 ° CO / N sur un rotateur de tube.
      Attention: PFA est toxique et doit être manipulé avec précaution.
    3. Laver une fois avec du PBS.
    4. Détartrer bulla et de la capsule pendant une semaine à 4 ° C dans 10% éthylènediaminetétraacétique sel disodique d'acide dihydrate (EDTA-2Na), 100 mM de base Tris, pH 7,0, dans un tube 2 mL. Changer le tampon tous les autres jours.
    5. Laver une fois avec du PBS. Les échantillons peuvent être stockés dans 70% d'éthanol dans l'eau à 4 ° C. Le cas échéant, le transfert à 70% d'éthanol à travers une série graduée d'alcool (30%, 50%, 70% dans l'eau).
    6. Un processeur de tissus, déshydrater les échantillons dans une série progressive de solutions d'éthanol (70%, 2 x 95%, 3 x 100%, chaque 1 h), claires dans le xylène (4x, chaque 1 h à 40 ° C) et infiltrer les échantillons avec la cire de paraffine fondue 42. En option, un substitut de xylène avec clearin tissu commercialg de solution (par exemple, Histo-Clear).
    7. Décharger spécimens du processeur, et les retirer de leurs cassettes.
    8. Sur un système de console de tissu intégrant, placer les échantillons dans des moules remplis avec de la cire de paraffine fondue. Passez à l'intégration (section 4).
  2. Préparation pour l' intégration dans des blocs congelés (méthode du film de Kawamoto) 43
    1. Isoler la bulle et de la capsule comme décrit dans la section 1.
    2. Coupez l'extrémité antérieure de la bulle (le processus de styliforme) avec des ciseaux, immergez la bulle et de la capsule dans un fixateur (2% ou 1% PFA plutôt que 4% dans du PBS pour préserver antigénicité) à 4 ° C. Si l'air est emprisonné dans bulla, retirez-le à l'aide d'une aiguille et la seringue. Laissez la bulle et de la capsule dans le fixateur à 4 ° CO / N sur un rotateur de tube.
    3. Laver bulla et capsule rapidement dans du PBS et plongez immédiatement dans le composé de cryo-enrobage liquide à 4 ° C.
    4. Important: Retirer les bulles d'air le cas échéant dans le milieuet l'oreille externe par aspiration par une aiguille, et en ajoutant le composé enrobage avec une pince. Passez à l'intégration (section 4).

4. Orientation de l'échantillon et Embedding

NOTE: L'ensemble bulla et capsule doivent être disposés dans une orientation particulière pendant l'enrobage pour couper les sections désirées. Les procédures décrites ci-dessous sont utilisées pour la section malleus dans diverses orientations.

  1. Longitudinale (parasagittale) tronçonnage du marteau
    1. Placez le côté latéral de la bulle ou conduit auditif externe dans la paraffine chaude (ou composé de cryo-enrobage). Ajuster l'orientation de telle sorte que le col et transversal lame du marteau sont parallèles au fond horizontal de la cuvette d'encastrement (figure 4A - C). On notera que la membrane du tympan est inclinée selon un angle d'environ 30 ° par rapport à la verticale dans la tête de la souris (figure 4A, la figure 59 Kampen
  2. Tronçonnage horizontale du marteau
    1. Placez la crête dorsale horizontalement dans la paraffine chaude (ou composé de cryo-enrobage). Ajuster l'orientation de la bulle et de la capsule de telle sorte que le col et transversal lame du marteau sont perpendiculaires au fond de la boîte d'encastrement (figure 4D - F).
  3. Tronçonnage Frontal (sections transversales) du manubrium et membrane tympanique 5
    1. Placer le manubrium malleal dans de la paraffine chaude (ou un composé de cryo-enrobage) de telle sorte qu'elle est perpendiculaire au fond de la cuvette enrobage.
  4. Refroidir le bloc à des températures appropriées pour durcir la cire de paraffine sur un système de console de tissu incorporation (en variante, utiliser le composé de cryo-enrobage dans un bain de glace / hexane sec).
  5. Processus bloc de tissu et sections coupées en utilisant des procédures de routine. Par exemple, des coupes de paraffine tache avec l'hématoxyline et l'éosine (H & #38; E), la safranine O (pour le cartilage) ou pour l' acide phosphatase (TRAP) Activité résistant aux tartrates (par les ostéoclastes) 3, ou par immunohistochimie. Cryosections décalcifiées sont appropriés pour l' étiquetage des os en utilisant fluorochromes 14, alizarine coloration rouge pour le calcium, et immunofluorescence 42.

Representative Results

Ce protocole présente une méthode pour isoler osselets du bulla auditif de la souris. En premier lieu , la bulle et la capsule sont disséqués en une seule pièce du crâne (figure 1). La bulle disséqué est ensuite utilisé pour préparer le marteau (figure 2) et l'enclume et l' étrier (figure 3). Monuments de la bulle auditive et de la capsule sont le processus de styliforme à l'extrémité antérieure de la bulle, la crête dorsale, canal semi - circulaire antérieure, et la fosse subarcuate (figure 1F). La tomographie (CT) d' imagerie par micro révèle osselets dans la bulle auditive, ainsi que des orientations optimales pour la coupe longitudinale et horizontale de ces corpuscules (figure 4).

Pour sectionner longitudinale de la paraffine du marteau, la bulle et la capsule ont été décalcifiés dans de l'EDTA à 4 ° C pendant une semaine, noyées dans une pabloc raffin à l'orientation représentée sur la figure 4 A - C, sectionné à 4 pm, et ensuite coloré en utilisant H & E. Le marteau attaché à la membrane tympanique dans la bulle auditive a révélé ossification endochondrale en cours à P14 (figure 5A). Pour visualiser une nouvelle formation osseuse, la calcéine (30 pg / g de poids corporel) a été péritonéale injecté dans une souris P20, et bulla et la capsule ont été isolés 24 h plus tard à P21. L'échantillon a été incorporé sans décalcification congelé puis cryosectioned à 6 um au moyen d' un film adhésif sur la base de la méthode de Kawamoto 43. Après coloration nucléaire avec DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole), la section a été observée sous un microscope à fluorescence. Signaux de calcéine (vert) ont révélé une nouvelle formation osseuse dans le malleus (m), bulla et capsule (figure 5B). Pour tronçonnage horizontale du marteau, la bulle auditive isolé à partir d'une souris 5 semaines d'âge a été intégré congelé sans décalcification (pour laorientation voir la figure 4D - F), cryosectioned à 6 pm en utilisant la méthode Kawamoto, et colorées en utilisant H & E. Tronçonnage horizontale du brevis malleal de Processus (MPB) montre également la cochlée (Figure 5C).

Une vue interne des osselets droites isolées d'une souris P31 présente des caractéristiques typiques de la malleus de la souris, à savoir la "glisse-mouette-aile-like" (ou persan 45 épée-like) manubrium, un brevis Processus important (apophyse orbiculaire , voir Discussion), et la lame transversale (figure 6). Notez que le processus antérieur (Processus antérieure) a été fracturé dans la procédure de dissection autour du goniale et a été séparé de l'anneau tympanique (ectotympanic). Cet échantillon représentatif présente un joint incudomalleolar intact entre le marteau et l'enclume, alors que l'articulation incudo-stapédienne est disloquée. insertions tendineuses dans le malleal etles processus musculaires stapédiens sont détectables (figure 6A, astérisques).

Figure 6B compare la souris et osselets humains au même grossissement. Les différences entre espèces, autres que la taille, sont les suivantes. Le manubrium malleal est aile comme chez la souris, mais le club-comme chez les humains. L'angle entre l'axe anatomique (ou l'axe de rotation, la ligne passant par le processus antérieur du marteau et de la courte apophyse de l'enclume) et le manubrium est beaucoup plus faible chez les souris et les deux sont à peu près parallèles, par opposition à peu près perpendiculairement 6,46-48 chez l' homme. Dans osselets de l' homme, des études révèlent vibrometric que l'articulation malléolaire incudo mobile et non fixe fonctionnellement 49. Le marteau de la souris présente un large, mince et plat lamina transversal pas apparent chez l' homme 47. Chez les souris, la partie antérieure de fusibles Processus aux os membraneux, à savoir le goniale et timbalesanneau de c, tandis que chez l' homme l'antérieur est réduit à Processus une petite spicules d'os 41. L'Etrier de souris et les humains diffèrent aussi: chez la souris, la branche antérieure est courbe et la branche postérieure est plus droite alors que chez les humains, la branche antérieure est plus droite que la branche postérieure. Il est intéressant de noter que la tête du marteau par rapport à la taille du corps est massivement agrandi en espèces telles que la taupe dorée, ce qui démontre une variabilité importante dans les relations allométriques de "les plus petits" os 48.

Figure 1
Figure 1. Dissection de l'Auditory Bulla et Capsule. (A) Le crâne d'une souris P31 est divisé en moitiés droite et gauche. A, antérieure; P, postérieure; L, à gauche; R, à droite. (B) de surface médiale de la moitié droite de la traversée, la tête à la peau. Cx, le cortex cérébral; Cb, cervelet; Hôtes, brainstem. D, dorsale; V ventrale. (C) L' élimination du cerveau avec une pince. (D) Vue médiale de la capsule auditive dans le crâne droit. La crête dorsale (pointes de flèches) se trouve entre la fosse moyenne du crâne (mcf) et fosse postérieure (pcf) et sépare dorso-surfaces antérieure et ventro-postérieur de la capsule auditive. Barre d'échelle, 2 mm. (E) un grossissement supérieur de bulla auditive et capsule (vue interne). Co, cochlée; VII, nerf facial; VIII, vestibulocochlear nerf; AC, antérieure (supérieure) canal semi-circulaire; Sf, fossa subarcuate, qui abrite le paraflocculus cérébelleuse. Barre d'échelle, 1 mm. (F) Microscopie de Bulla auditive isolé et capsule (vue interne). Sp, processus de styliforme. Barre d'échelle, 1 mm. (A - E), P31 souris. (F), P33 souris. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Dissection du Malleus. (A) Vue ventrolatérale d'un bulla auditif droit et de la capsule. Le sulcus tympanicus (ST, flèche en pointillés) est le site de fixation de la membrane tympanique. La partie latérale de l'os de la ST fait partie de l'oreille externe et la médiane de l'os de la ST constitue le plancher de la cavité de l'oreille moyenne. A, antérieure; P, postérieure; D, dorsale; V ventrale. (B) Vue après le retrait du conduit auditif externe pour révéler la membrane tympanique (TM) comprenant la pars flaccida (Pf) et pars tensa (Pt). (C) L' élimination des parties de l'os tympanique (lignes en pointillés et #) près de la malleal Processus brevis (MPB). m, malleus; mM, manubrium malleal. Flèche, bulle d'air dans la cavité de l'oreille moyenne vu à travers la membrane tympanique. (D) malleus Exposed. tête Malleus est indiquée. Pointéligne indique la surface articulaire de l'enclume. (E) tendon du muscle tenseur du tympan (TT) fixé au marteau. (F) Le tympanique tenseur est tiré lorsque le marteau est levé. * Processus musculaire. (G) Tensor tympanique est coupé à l' aide d' une aiguille. (H) trois osselets après le retrait de la membrane tympanique. L'articulation incudo-malléolaire est disloquée. m, malleus; i, incus; s, stapes; Allez, goniale (fusionné au marteau et tympanique anneau, TR). Toutes les barres d'échelle, 0,5 mm. (A, H), P33 souris. (B - G), P31 souris. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Dissection de l'enclume et l' étrier. (A) et Incusstapes après le retrait du marteau. L'artère stapédienne (SA) passe à travers l'étrier (s). La ligne pointillée indique la surface articulaire de l'enclume. Notez que le court crus (ICB, crus breve) de l'enclume (i) est fixé par le ligament postérieur (non représenté). Asterisk, processus musculaire de l'étrier. (B) Étrier après le retrait de l'enclume. la pointe d'aiguille est utilisée pour couper l'artère stapédienne (SA). Flèche, direction du flux sanguin. La ligne pointillée indique la surface articulaire de l'étrier. (C) L'artère stapédien est retiré de l'étrier. X indique la fin de l'artère stapédienne (SA) de coupe. (D) La fenêtre ovale (Ow, fenêtre ovale ou vestibulaire fenestra) est visible après le retrait de l'étrier. Rw, fenêtre ronde (fenêtre ronde ou cochlée fenestra). Les barres d'échelle, 0,5 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cettefigure.

Figure 4
Figure 4. Orienter l'Auditory Bulla et Capsule pendant Incorporation pour longitudinale (parasagittale, A - C) et horizontale (D - E) Sectionnement du Malleus. (A - C) Le col et transversal lame du marteau sont disposés parallèlement au fond d'encastrement plat. (A) Vue latérale: micro-CT image pour montrer l' incorporation du droit malleus dans la bulle (pseudocolored bleu). Le marteau et l'enclume sont pseudocolored vert. La ligne pointillée, le plan de coupe souhaité. La ligne continue, en bas d'encastrement plat. m, malleus; pointes de flèches, crête dorsale. M médian; L latéral; D, dorsale; V ventrale. (B) Vue de dessus: l' image Micro-CT. A noter que l'extrémité antérieure du (procédé styliforme) de la bulle a été enlevée. i, incus. (C) Vue de dessus: micrographie (prise avec unfiltre de couleur). AC, antérieure (supérieure) canal semi-circulaire; Sf, fossa subarcuate; Sp, processus de styliforme. A, antérieure; P, postérieure; D, dorsale; V ventrale. (D - F) La brevis Processus du marteau est placé perpendiculairement au fond d'encastrement plat. (D) Vue latérale: Image Micro-CT pour montrer l' incorporation du droit malleus. La ligne pointillée, le plan de coupe souhaité. La ligne continue, en bas d'encastrement plat. (E) Vue de dessus: l' image Micro-CT. mM, manubrium malleal. (F) Vue de dessus: micrographie (prise avec un filtre de couleur). Les barres d'échelle, 1 mm. Les images des micro-CT ont été obtenus à une résolution de voxels de 5 pm, 7 comme décrit précédemment. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. histologie. (A) coloration H & E. (Parasagittale) Coupe longitudinale du marteau de paraffine droite (m) dans la bulle auditive (ligne pointillée) à P14. TM, la membrane tympanique. (B) calcéine étiquetage des os. Coupe longitudinale du, malleus congelé décalcifié gauche (m) dans la bulle auditive au P21. Counterstain, DAPI. (C) coloration H & E. section horizontale de la brevis congelé, décalcifiées gauche malleal Processus (MPB) dans la bulle auditive et de la capsule (5 semaines vieille souris). Co, cochlée. Les barres d'échelle, 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Medial Vue de Auditory osselets. (A) osselets Droit de P31 souris. A, antérieure; P, postérieure; D, dorsale; V ventrale. Barre d'échelle, 1 mm. malleus tête (Caput mallei, Capitulum mallei); cou (Collum mallei); Strate (transversal lamina); mM (Manubrium mallei); astérisque noir (processus musculaire du marteau); mPA (Processus antérieur, Processus gracilis); MPB (Processus brevis); corps incus (Corpus de incudis); ICB (CRU breve, court crus, processus court); ICL (CRU longum, longtemps crus, long processus); ipl (Processus lenticularis, lenticulaire, Sylvian apophyse); tête stapes (Caput stapedis); astérisque blanc (processus musculaire de l'étrier); Sca (CRU anterius, crus antérieure); scp (CRU posterius, branche postérieure); base (stapedis de base, la platine de l'); Sof (Les foramen obturé, foramen intercrural). (B) osselets droit d'un 76-year-old femme humaine (Gracieuseté du Département d'anatomie, Keio University School of Medicine). Les osselets de P31 souris (en bas à droite) sont imagés au même grossissement que celui utilisé pour les osselets humaines. Curvflèches ed indiquent l'angle entre l'axe anatomique et manubrium (lignes en pointillés). Barre d'échelle, 2 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Ici, nous présentons une méthode utile pour isoler la bulle auditive et de la capsule chez les souris postnatales. Avant P12, les tissus sont fragiles et peuvent être endommagés lors de l'isolement. Après P12, la bulle auditive et de la capsule peuvent être facilement isolés des tissus environnants. Dissection de la bulle de la tête avant de sectionner présente plusieurs avantages. Tout d' abord, la cavitation postnatale et la croissance de la bulle auditive se produisent le plus activement de P6 partir et sont terminés par P14 50. Le tissu mésenchymateux entre la membrane tympanique et la paroi cochléaire est remplacé par l'air à travers le processus de cavitation. L'air résultant dans la cavité de l'oreille moyenne peut empêcher le contact entre les tissus et liquides pendant la fixation, la décalcification et l'intégration. Il est plus facile d'éliminer l'air de la bulle auditive isolée en coupant la fin (processus de styliforme) anterior plutôt que d'essayer de le faire dans le bulla non isolé. Deuxièmement, l'orientation du marteau (et la membrane tympanique) est pas verticaldans la tête. Il est donc plus facile à la section malleus dans des plans souhaités en intégrant la bulle auditive isolé et capsule dans une orientation donnée.

Une fois isolé, bulla et capsules auditives sont utiles pour de nombreuses analyses. Par exemple, une haute résolution X-ray micro-CT peut révéler osseuse microstructure morphologie tels que les capillaires ostéogéniques dans le malleus 14. Le stereofluorescence disséquant microscope est un outil puissant pour visualiser les structures dans l' évaluation des souris rapporteurs exprimant des protéines fluorescentes dans l'oreille moyenne ou interne 33. En outre, divers in vivo ou ex vivo par fluorescence méthodes de marquage et de détection de toute immunofluorescence montage pourrait être entreprise. Microscopie optique feuille de fluorescence est également utile pour l' analyse en trois dimensions 51. Bien que non décrit ici, diverses structures anatomiques associées à la bulle auditive et de la capsule tels que les nerfs périphériques, les vaisseaux sanguins, etla membrane tympanique dans l'oreille moyenne peut également être évaluée en utilisant ce protocole.

Notez que la paraffine tronçonnage nécessite décalcification des tissus osseux avant enrobage et donc ne permet pas l'analyse de la minéralisation. En revanche, la méthode du film Kawamoto 43 utilisé pour préparer des coupes congelées peut être effectuée sans décalcification et est adapté pour les études de minéralisation en utilisant des techniques in vivo os étiquetage ou coloration spéciale tels que Alizarine coloration. conditions Cryo-sectionnement doivent être optimisés selon fondée sur l'âge de la souris. Par exemple, une température inférieure fraîche à l'intérieur de la chambre de cryostat est recommandée pour les spécimens âgés de souris pour minimiser les dommages aux sections.

Chez la souris, le terme correct pour la saillie semi-sphérique importante du marteau est "apophyse orbiculaire". Néanmoins, le terme "brevis Processus" a été largement utilisé pour indiquer l'apophyse orbiculaire pour plus eune vingtaine d' années, en particulier chez les biologistes du développement de la souris 16,20,22-25. "Processus brevis" appelée à l'origine du processus latéral (Processus lateralis), qui diffère de l'apophyse orbiculaire. Chez l' homme, un processus latéral qui ressemble à une légère projection conique forme la ligne générale de l' attachement à la membrane tympanique, étendant à partir du manubrium (pas vu à la figure 6B, vue médiale). Chez les souris, le procédé latéral est également une projection du manubrium à l'extrémité opposée à l'ombilic 48. La pars flaccida de la membrane tympanique est au-dessus du processus latéral du marteau. apophyse Orbicular ne ressort pas dans le malleus humain.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tools/Equipment
Paper towel Daio Paper Corporation 703347 can be purchased from other vendors
Glass Jar Various can be purchased from other vendors
14 cm surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 91400-14 can be purchased from other vendors
Extra fine scissors-straight Fine Science Tools (F.S.T.) 14084-08 can be purchased from other vendors
Fine Forceps Angled 45° Fine Science Tools (F.S.T.) 11063-07 can be purchased from other vendors
Dissecting microscope Nikon SMZ800N for routine dissection
Dissecting microscope Nikon SMZ18 for movies 
Injection needle 27 G TERUMO NN-2719S
Syringe (1 mL) TERUMO SS-01T
Marking Pin Various
Tube rotator RT-50 TAITEC 0000165-000 can be purchased from other vendors
Cryostat Leica CM3050S http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/
TC-65 Tungsten blade Leica 14021626379 for Kawamoto's firm method
Stainless containers Leica for Kawamoto's firm method
Cryofilm type IIC Leica for Kawamoto's firm method
Silane coated slide (New Silane II) Muto Pure Chemicals 511617 can be purchased from other vendors
Cover glass Matsunami can be purchased from other vendors
Tissue processor Sakura Finetek VIP-5 can be purchased from other vendors
Tissue Embedding Console System Sakura Finetek Tissue-Tek TEC 5  can be purchased from other vendors
Sliding microtome for paraffin Yamato Kohki Industrial REM-710 can be purchased from other vendors
Path Blade+pro for hard tissue Matsunami PB3503C for paraffin section
Micro-CT RIGAKU R_mCT2 http://www.rigaku.com/en
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Isoflurane Maruishi pharmaceutical Co. Ltd
NaCl wako 191-01665 for PBS
KCl wako 285-14 for PBS
Na2HPO4 12H2O wako 196-02835 for PBS
KH2PO4 wako 287-21 for PBS
Paraformaldehyde (PFA, EM Grade) TAAB P001
EDTA-2Na wako 15111-45
Trizma base Sigma T1503-1KG
Super Cryoembedding Medium Leica for Kawamoto's firm method
Dry Ice Various for Kawamoto's firm method
Hexane wako 080-03423 for Kawamoto's firm method
Super Cryomouting Medium type R2 Leica for Kawamoto's firm method
Paraffin Sakura Finetek 781001A0107
Histo-Clear NDS HS-200
Calcein DOJINDO 340-00433
Hematoxylin  wako 131-09665
Eosin wako 051-06515

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