Disseksjon av det auditive Bulla i barsel Mus: Isolering av mellomøret Bein og histologisk analyse

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sakamoto, A., Kuroda, Y., Kanzaki, S., Matsuo, K. Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis. J. Vis. Exp. (119), e55054, doi:10.3791/55054 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I de fleste pattedyr, auditive ossicles i mellomøret, inkludert hammeren, ambolten og stigbøylen, er de minste bein. Hos mus, en benete struktur kalt auditive Bulla huser ossicles, mens auditive kapsel omslutter det indre øret, nemlig cochlea og halvsirkelformet kanalene. Murine ossicles er avgjørende for hørsel og dermed av stor interesse for forskere innen otolaryngology, men deres metabolisme, utvikling og evolusjon er svært relevant for andre felt. Endret beinmetabolisme kan påvirke hørselen funksjon hos voksne mus, og ulike gen-mangelfull mus viser endringer i morphogenesis av auditive ossicles i utero. Selv murine auditive ossicles er liten, er deres manipulasjon mulig hvis man forstår deres anatomiske orientering og 3D-struktur. Her beskriver vi hvordan å dissekere det auditive Bulla og kapsel av postnatal mus og deretter isolere enkelt ossicles ved å fjerne en del av bulla. Vi diskuterer også hvordan man emsengen bulla og kapselen i forskjellige retninger for å generere parafin eller frosne seksjoner egnet for fremstilling av langsgående, horisontale eller frontale deler av hammeren. Til slutt, nummerere vi anatomiske forskjeller mellom mus og menneskelige auditive ossicles. Disse metodene vil være nyttig i å analysere patologiske, utviklings- og evolusjonære aspekter av auditive ossicles og mellomøret hos mus.

Introduction

De tre auditive ossicles i mellomøret, nemlig hammeren, ambolten og stigbøylen, danner en pattedyr-spesifikk hørbar kjede som overfører lyden fra trommehinnen til det indre øret, eller cochlea 1,2. Hørselsfunksjonen kan evalueres i mus ved å måle Auditory hjernestammen Response (ABR) terskler 3-6, og vibrasjon av hammeren bak trommehinnen kan overvåkes ved hjelp av laser Doppler Vibrometry (LDV) 7. Ved å kombinere ABR, LDV, og forvrengning Product otoakustisk emisjon (DPOAE) målinger, kan mekanisk hørselstap bli diskriminert fra nevrofall 8.

Dyremodeller av øret forholdene er nødvendig, gitt viktigheten av å høre og øre helse til trivsel for pasienter i alle aldre. For eksempel er mellomørebetennelse en svært vanlig ørebetennelse sett i menneskelige spedbarn og barn, og alvorlige, akutte mellomørebetennelse og dens komplikasjoner kan oppstå hvis Condisjonen ikke behandles med passende antimikrobielle midler 9. Musemodeller av mellomørebetennelse kan være nyttig for å forstå patogenesen og i å utvikle behandlinger 10,11.

Murine ossicles, som (med unntak av goniale del av hammeren) er dannet av endochondral ossifikasjon 12,13, er svært relevant for studiet av beinmetabolisme og morphogenesis. For det første tillater deres lille størrelse med høy oppløsning analyse av ben med en intakt periosteum ved hjelp av røntgenstråle-fluorescens mikroskopi eller 14. For det andre, avvikende bein metabolisme, slik som overdreven eller mangelfull benresorpsjon, eller svekkede samspill mellom beinceller 15, kan analyseres som en potensiell bidragsyter til hørselstap 3,4,7. Tredje, unormal ossicle morphogenesis er rapportert i flere gen-mangelfull mus, for eksempel dyr mangler Hoxa2 16-19, Msx1 20-22, Prrx1 23, Goosecoid(GSC) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, Fgfr1 29, thyroid hormonreseptorer (Thra, Thrb) 5, BCL2 30 og andres 1,31, eller hos mus overekspresjon Hoxa2 32. Til slutt, til tross for sin lille størrelse, strukturer assosiert med ossicles som muskler 33 og ledd 34,35 er tilgjengelige.

Muse ossicles er mindre enn menneskelige ossicles, men det er verdt å merke seg at musen mellomøret er ikke en miniatyr versjon av sin menneskelige motstykke. For eksempel, i mus, den stapedial arterien, som passerer gjennom ringen av stigbøylen, vedvarer gjennom hele livet 36, mens det hos mennesker, forsvinner den embryoniske stapedial arterien under drektighetsperioden. I tillegg, morfologi av mus hammeren adskiller seg fra the human bone (se figur 6). I mus, omslutter det auditive (trommehinnen) bulla det luftfylte hulrom i mellomøret, mens det hos mennesker, mastoid luftceller sammensatt av trabekulært ben i tinningbenet huser ossicles snarere enn en bulla 37. I begge arter, det auditive kapsel (otic kapsel, benete labyrinten) omslutter sneglehuset og halvsirkelformet kanalene i det indre øret. Sammen og evolusjonsbiologi i mellomøret har blitt grundig anmeldt 38-40.

Protokollen nedenfor beskriver først hvordan å dissekere ut hørsels bulla og kapsel, som består hovedsakelig av mellomøret og det indre øre. Denne protokollen viser også hvordan å isolere hammeren, ambolten og stigbøylen fra det auditive bulla. Til slutt viser det hvordan å orientere auditive Bulla og kapsel for innebygging i forberedelse til vev seksjonering av auditive ossicles.

Protocol

Alle dyr prosedyrer utført i denne studien er godkjent av Keio-universitetet Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC - godkjenningsnummer: 09221) og følg institusjonelle retningslinjer for forsøk med dyr på Keio-universitetet for bruk av dyr i forskning. Menneske prøver ble isolert fra et kadaver donert til Anatomisk institutt, Keio University School of Medicine, og ble brukt i samsvar med institusjonelle bestemmelser.

1. Isolering av Auditory Bulla og Capsule

  1. Avlive mus i en krukke som inneholder en plattform over tørkepapir dynket i isofluran eller sevofluran til luftventilasjon opphører i mer enn en min og deretter utføre halshugging. Vær forsiktig for å unngå direkte kontakt av mus med gjennomvåt papirhåndklær.
  2. Lag en liten tverrgående snitt på ryggsiden av halsen og dra huden fra hverandre mot hode og hale med begge hender for å avdekke underliggende halsen muscle vev.
  3. Halshogge mus i nakken bruker 14 cm skarpe kirurgiske sakser.
  4. Peel huden helt mot nesen. Klipp av alle hud sammen med snuten og fortenner.
  5. Sett saks inn i munnen og kutte tyggemusklene på begge sider.
  6. Åpne kjeven nøye og ta ut tungen og underkjeven sammen.
  7. Bruke skarp saks, split skallen og skallebasis i to halvdeler langs midsagittal planet (figur 1A, B).
  8. Bruk pinsett, fjerner cerebrale og lillehjernen halvkuler og hjernestammen. Den auditive bulla og kapsel er plassert lateralt for lillehjernen og hjernestammen. Legg merke til at det auditive Bulla er videre lateralt for auditiv kapsel (figur 1C, D).
  9. Dissekere ut bulla og kapsel med det omkringliggende skallen bein (figur 1E).
  10. Overføre prøven til en skål inneholdende fosfatbufret saltoppløsning (PBS) pH 7,4 ved romtemperatur.
  11. Under en kikkert dissekere mikroskop Bruk pinsett til å dra fra hverandre de omkringliggende bein og saks for å klippe den løsnet grense rundt bulla og kapselen (figur 1F). De omkringliggende bein fjernes er basioccipital (ventral grensen), exoccipital (ventro-posterior grensen), supraoccipitale (bakre kant), interparietal, parietal (dorsal grensen), squamosal (dorso-anterior grensen), alisphenoid (anterior grensen), og basisphenoid (Antero-ventral grense) bein. Legg merke til at styliform prosessen (Sp), som støtter tromme åpningen av øretuben 41, er forskjellig fra den styloid fremgangstinningbenet.

2. Isolering av Auditory ossicles: Malleus, ambolten og stigbøylen

  1. Malleus
    1. Ved hjelp av både små saks og pinsett, fjerner en del av den ytre øregangen lateralt for sulcus tympanicus slik at trommehinnen er synlig (figur 2A, B).
    2. Ta del av trommehinnen og tromme bein nær malleal processus brevis (orbicular apophysis, se diskusjon), både på ventral (stiplet) og bakre (#) vegger (Figur 2C). Hammeren og tensor tympani muskel skal nå bli utsatt (figur 2D, E).
    3. Løft hammeren (figur 2F) og kutte tensor tympani muskler med den skrå kanten av en 27 G nål (figur 2G). Legg merke til at malleal manubrium fast festes til trommehinnen, som er sett i andre pattedyr.
    4. Ta av trommehinnen nøye fra manubrium, som er skjør. Fjern tromme bein å avsløre de tre auditive ossicles.
    5. Forskyve hammeren fra ambolten ved knokkelledd (figur 2 H).
    6. Isoler hammeren ved oppsprekking fremre prosessen på goniale.
  2. Ambolten og stigbøylen
    1. Isoler than ambolten ved å kutte av den bakre ligament av ambolten i den korte crus (figur 3A).
    2. Isolere stigbøylen ved å kutte av stapedial arterien nær stigbøylen med den skrå kant av en 27 G nål (figur 3B, C). Om nødvendig, kutte senen av stapedial muskelen på den muskulære prosessen med stigbøylen med nålen.
    3. Sett inn en synål (eller en merkepinne) inn i stenge foramen av stigbøylen og løft opp stigbøylen. Etter fjerning av stigbøylen, bør den ovale vindusåpningen være godt synlig (Figur 3D).

3. Inkludering av Auditory Bulla og Capsule

  1. Forberedelse for innebygging i parafinblokker
    1. Isoler bulla og kapsel som beskrevet i punkt 1.
    2. Skjær fremre enden av bulla (den styliform prosess) av med saks, senk bulla og kapselen i 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS ved 4 °C, og la fiksativ til å inngå bulla. Hvis luften blir fanget i bulla, fjern den med en nål og sprøyte. La bulla og kapsel i fiksativ ved 4 ° CO / N på en tube rotator.
      Forsiktig: PFA er giftig og må håndteres med forsiktighet.
    3. Vask en gang med PBS.
    4. Avkalk bulla og kapsel i en uke ved 4 ° C i 10% etylendiamintetraeddiksyre-dinatriumsalt-dihydrat (EDTA-2Na), 100 mM Tris-base, pH 7,0, i en 2 ml rør. Endre bufferannenhver dag.
    5. Vask en gang med PBS. Prøver som kan lagres i 70% etanol i vann ved 4 ° C. Eventuelt kan overføre til 70% etanol gjennom en gradert serie alkohol (30%, 50%, 70% i vann).
    6. På en vev prosessor, tørke prøvestykkene i en gradert serie av etanol-løsninger (70%, 2 x 95%, 3 x 100%, hver 1H), klart i xylen (4x, hver 1 time ved 40 ° C), og infiltrere prøver med smeltet parafinvoks 42. Eventuelt erstatning xylen med kommersiell vev rensing ogg løsning (f.eks Histo-Clear).
    7. Losse prøver fra prosessoren, og fjerne dem fra sine kassetter.
    8. På en vev embedding konsollsystem, eksemplarer sted i former fylt med smeltet parafinvoks. Fortsett til innebygging (§ 4).
  2. Forberedelse for innebygging i frosne blokker (Kawamoto film metode) 43
    1. Isoler bulla og kapsel som beskrevet i punkt 1.
    2. Skjær den fremre enden av bulla (den styliform prosessen) av med saks, dyppes bulla og kapselen i fiksativ (2% eller 1% PFA snarere enn 4% i PBS for å bevare antigenisitet) ved 4 ° C. Hvis luften er fanget i bulla, fjerne den ved hjelp av en nål og sprøyte. La bulla og kapsel i fiksativ ved 4 ° CO / N på en tube rotator.
    3. Vask bulla og kapsel raskt i PBS og umiddelbart fordype i flytende cryo-embedding forbindelsen ved 4 ° C.
    4. Viktig: Fjern luftbobler hvis noen i midtenog ytre øret gjennom aspirasjon av en nål, og ved å legge til innebygging forbindelsen med pinsett. Fortsett til innebygging (§ 4).

4. Prøveorientering og Inkludering

MERK: Hele bulla og kapselen må ordnes i en bestemt retning i løpet av innebygging å kutte ønskede deler. Prosedyrene er beskrevet nedenfor er vant til seksjon hammeren i ulike retninger.

  1. Langsgående (parasagittal) seksjonering av hammeren
    1. Sett den laterale siden av bulla eller ytre øregang ned i varm parafin (eller cryo-embedding sammensatte). Juster retningen slik at halsen og tverrgående lamina av hammeren er parallelle med den horisontale bunnen av forsenkningen tallerken (figur 4A - C). Legg merke til at trommehinnen er skråstilt i en vinkel på omtrent 30 ° i forhold til vertikalen i mus hodet (figur 4A, Figur 59 i Kampen
  2. Horisontal seksjonering av hammeren
    1. Plasser ryggkammen horisontalt i varm parafin (eller cryo-embedding sammensatte). Justere orienteringen av bulla og kapselen slik at halsen og tverrgående lamina av hammeren er vinkelrett i forhold til bunnen av forsenkningen tallerken (figur 4D - F).
  3. Frontal seksjonering (tverrsnitt) av manubrium og trommehinnen 5
    1. Plasser malleal manubrium i varm parafin (eller cryo-innstøping forbindelse) slik at det er vinkelrett i forhold til bunnen av forsenkningen fatet.
  4. Kjøl ned blokken til temperaturer passende å stivne parafinvoks på en vev embedding konsollsystem (alternativt bruke cryo-embedding forbindelsen i en tørris / heksan bad).
  5. Prosess vev blokk og kutte deler ved hjelp av rutinemessige prosedyrer. For eksempel, beis parafinsnitt med hematoxylin og eosin (H & #38, E), safranin O (for brusk), eller for tartrat-resistent sur fosfatase (TRAP) aktivitet (for osteoklaster) 3, eller ved immunhistokjemi. Undecalcified frysesnitt er egnet for merking av ben ved hjelp av fluorokromer 14, alizarin rød farging for kalsium, og immunfluorescens 42.

Representative Results

Denne protokollen presenterer en metode for å isolere ossicles fra musen auditive bulla. Først blir den bulla og kapselen dissekert ut som et enkelt stykke fra hodeskallen (figur 1). Den dissekert bulla blir deretter anvendt for å fremstille hammeren (figur 2) og ambolten og stigbøylen (figur 3). Landemerkene i det auditive Bulla og kapsel er styliform prosessen ved fremre enden av bulla, dorsal crest, anterior halvsirkelformet kanalen, og subarcuate fossa (figur 1F). Microcomputed tomografi (CT) avbildning avslører ossicles i det auditive Bulla samt optimale orientering for langsgående og horisontal seksjonering av disse ossicles (figur 4).

For langsgående parafin seksjonering av hammeren, ble det bulla og kapselen avkalkes i EDTA ved 4 ° C i en uke, innleiret i et paRaffin blokk i retningen som er vist i Figur 4 A - C, seksjonert i 4 mikrometer, og deretter farget ved hjelp av H & E. Hammeren festet til trommehinnen i det auditive Bulla avslørt pågå endochondral ossifikasjon på P14 (figur 5A). For å visualisere ny beindannelse, calcein (30 mikrogram / g kroppsvekt) ble peritonealt injisert i en P20 mus, og bulla og kapsel ble isolert 24 timer senere på P21. Prøven uten avkalking ble innleiret frosset og deretter cryosectioned 6 um ved hjelp av en klebende film basert på fremgangsmåten til Kawamoto 43. Etter nukleær farging med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol), ble det observert at delen under et fluorescens mikroskop. Calcein-signaler (grønn) avslørte ny bendannelse i hammeren (m), bulla og kapsel (figur 5B). For horisontal seksjonering av hammeren, ble det auditive Bulla isolert fra en 5-ukers gamle mus integrert frosset uten avkalking (fororientering se figur 4D - F), cryosectioned på 6 mikrometer ved hjelp av Kawamoto metode, og farges ved hjelp av H & E. Horisontal Seksjonering av malleal processus brevis (MPB) viser også cochlea (figur 5C).

En medial visning av de riktige auditive ossicles isolert fra en P31 mus viser typiske trekk ved muse hammeren, nemlig "gli-måke-fløyen-like" (eller persisk sverd-lignende 45) manubrium, en fremstående processus brevis (orbicular apophysis , se diskusjon), og den tverrgående plate (figur 6). Legg merke til at den fremre prosessen (processus anterior) ble brukket i disseksjon fremgangsmåte rundt goniale og ble skilt fra trommeringen (ectotympanic). Denne representative prøve oppviser et intakt incudomalleolar forbindelse mellom hammeren og ambolten, mens incudostapedial leddet er forskjøvet. Tendinous innsett inn i malleal ogstapedial muskulære prosesser kan påvises (Figur 6A, stjernetegn).

Figur 6B sammen mus og humane hørbar ossicles ved samme forstørrelse. Artsforskjeller, annet enn størrelse, inkluderer følgende. Den malleal manubrium er vinge som i mus, men klubb som hos mennesker. Vinkelen mellom den anatomiske aksen (eller rotasjonsaksen, linjen gjennom den fremre prosessen med hammeren og den korte prosessen med ambolten) og manubrium er mye mindre i mus, og de to er nesten parallelle, i motsetning til nesten vinkelrett hos mennesker 6,46-48. I menneskelige ossicles, vibrometric studier viser at incudo-malleolar joint er mobil i stedet for funksjonelt fast 49. Musen hammeren viser en bred, tynn og flat tverrgående lamina ikke tydelig hos mennesker 47. Hos mus, smelter processus anterior til membran bein, nemlig goniale og tympanic ring, mens hos mennesker på processus fremre reduseres til en liten spicule av ben 41. Stigbøylen av mus og mennesker er også forskjellig: i mus, er den fremre crus buet og bakre crus er mer rett, mens hos mennesker, er den fremre crus mer rett enn den bakre crus. Det er verdt å merke seg at hammeren hode i forhold til kroppsstørrelsen er massivt utvidet i arter som gullmoldvarper, viser betydelig variasjon i morfologiske mål relasjoner av "de minste" bones 48.

Figur 1
Figur 1. Disseksjon av Auditory Bulla og Capsule. (A) Skallen av en P31 mus er delt inn i høyre og venstre halvdeler. A, anterior; P, posterior; L, venstre; R, høyre. (B) Medial overflate av høyre halvdel av delt i to, flådd hode. Cx, cerebral cortex; Cb, lillehjernen; Bs, brainstem. D, rygg; V, ventral. (C) Fjerning av hjernen med pinsett. (D) Medial visning av hørsels kapsel i riktig skallen. Rygg crest (pilspisser) ligger mellom midten skallegrop (MCF) og bakre skallegrop (PCF) og skiller dorso-anterior og ventro-posterior overflater av auditiv kapsel. Scale bar, 2 mm. (E) Høyere forstørrelse av auditiv bulla og kapsel (medial visning). Co, cochlea; VII, ansikts nerve; VIII, nervus vestibulocochlearis; AC, anterior (superior) halvsirkelformet kanalen; Sf, subarcuate fossa, som huser lillehjernen paraflocculus. Scale bar, 1 mm. (F) Micrograph av isolerte auditiv bulla og kapsel (medial visning). Sp, styliform prosessen. Scale bar, 1 mm. (A - E), P31 mus. (F), P33 mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Disseksjon av hammeren. (A) ventrolateral visning av en rett auditiv bulla og kapsel. Sulcus tympanicus (ST, stiplet pil) er festestedet av trommehinnen. Benet lateralt for ST er en del av det ytre øre, og benet mediale til ST danner gulvet i mellomøret hulrom. A, anterior; P, posterior; D, rygg; V, ventral. (B) Se etter fjerning av den ytre øregang for å avsløre trommehinnen (TM) inkludert pars flaccida (Pf) og pars Tensa (PT). (C) Fjerning av deler av tromme bein (stiplede linjer og #) i nærheten av malleal processus brevis (MPB). m, hammeren; mM, malleal manubrium. Arrow, luftboble i mellomøret hulrom sett gjennom trommehinnen. (D) Exposed hammeren. Hammeren hode er indikert. prikketlinje indikerer ledd overflaten av ambolten. (E) sene av tensor tympani muskelen (TT) som er festet til hammeren. (F) Et tensor tympani trekkes når hammeren løftes. *, Muskuløs prosessen. (G) Tensor tympani kuttes ved hjelp av en nål. (H) Tre auditive ossicles etter fjerning av trommehinnen. Den incudo-malleolar felles er forstuet. m, hammeren; Jeg, ambolten; s, stigbøylen; Gå, goniale (smeltet til hammeren og tromme ring, TR). Alle skala barer, 0,5 mm. (A, H), P33 mus. (B - G), P31 mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Disseksjon av ambolten og stigbøylen. (A) og amboltenstigbøylen etter fjerning av hammeren. Den stapedial arterie (SA) passerer gjennom stigbøylen (e). Stiplet linje angir ledd overflaten av ambolten. Legg merke til at den korte crus (ICB, crus breve) av ambolten (i) fastsettes av bakre korsbånd (ikke vist). Stjerne, muskel prosess med stigbøylen. (B) stigbøylen etter fjerning av ambolten. Nålespissen brukes til å kutte stapedial arterie (SA). Arrow, blodstrømmens retning. Prikket linje angir leddflaten av stigbøylen. (C) Et stapedial arterie fjernes fra stigbøylen. X angir den kappede enden av stapedial arterie (SA). (D) Den ovale vindu (Ow, FENESTRA ovalis eller fenestra vestibuli) er synlig etter fjerning av stigbøylen. Rw, runde vinduet (fenestra rotunde eller fenestra cochleae). Skala barer, 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dennefigur.

Figur 4
Figur 4. Orientere Auditory Bulla og Capsule under bygge for Longitudinal (parasagittal, A - C) og horisontal (D - E) Seksjonering av Malleus. (A - C) Halsen og tverrgående lamina av hammeren er plassert parallelt til bunnen av fatet innebygging. (A) fra siden: mikro-CT-bilde for å vise innebygging av retten hammeren i bulla (pseudocolored blå). Hammeren og ambolten er pseudocolored grønt. Stiplet linje, ønsket skjæreplanet. Solid linje, bunnen av innebygging fatet. m, hammeren; pilspisser, rygg crest. M, medial; L, lateral; D, rygg; V, ventral. (B) Sett ovenfra: Micro-CT-bilde. Legg merke til at den fremre ende av bulla (styliform prosess) ble fjernet. jeg, ambolten. (C) Sett ovenfra: mikrograf (tatt med enfargefilter). AC, anterior (superior) halvsirkelformet kanalen; Sf, subarcuate fossa; Sp, styliform prosessen. A, anterior; P, posterior; D, rygg; V, ventral. (D - F) på processus brevis av hammeren er plassert vinkelrett i forhold til bunnen av fatet innebygging. (D) fra siden: Micro-CT-bilde for å vise innebygging av retten hammeren. Stiplet linje, ønsket skjæreplanet. Solid linje, bunnen av innebygging fatet. (E) Sett ovenfra: Micro-CT-bilde. mM, malleal manubrium. (F) Sett ovenfra: mikrograf (tatt med et fargefilter). Skala barer, 1 mm. Mikro-CT-bilder ble oppnådd ved et volumelement oppløsning av 5 um, som tidligere beskrevet 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Histologi. (A) H & E farging. Langsgående (parasagittal) delen av parafin-embedded riktig hammeren (m) i hørsels bulla (stiplet linje) på P14. TM, trommehinnen. (B) Calcein bein merking. Lengdesnitt av den frosne, undecalcified venstre hammeren (m) i hørsels bulla på P21. Counterstain, DAPI. (C) H & E farging. Horisontale delen av den frosne, undecalcified venstre malleal processus brevis (MPB) i hørsels bulla og kapsel (5 uker gamle mus). Co, cochlea. Skala barer, 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Medial View of Auditory ossicles. (A) Høyre auditive ossicles av P31 mus. A, anterior; P, posterior; D, rygg; V, ventral. Scale bar, 1 mm. hammeren hode (Caput mallei, capitulum mallei); hals (Collum mallei); lamina (tverrgående lamina); MM (manubrium mallei); svart stjerne (muskulær fremgangs hammeren); MPa (processus anterior, processus gracilis); MPB (processus brevis); incus kroppen (Corpus incudis); ICB (Crus breve, kort crus, kort prosess); ICL (Crus Longum, lang crus, lang prosess); IPL (processus lenticularis, linse prosess, Sylvian apophysis); stapes hode (Caput stapedis); hvit stjerne (muskulær fremgangsstigbøylen); SCA (Crus anterius, anterior CRU); SCP (Crus posterius, posterior CRU); basen (grunnlag stapedis, fotplate); SOF (stenge foramen, intercrural foramen). (B) Høyre auditive ossicles av en 76 år gammel menneskelig kvinne (Courtesy of Anatomisk institutt, Keio University School of Medicine). Ossicles av P31 mus (nederst til høyre) er avbildet på samme forstørrelse som brukes for menneske ossicles. bueed piler indikerer vinkelen mellom den anatomiske aksen og manubrium (stiplede linjer). Scale bar, 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Her presenterer vi en metode nyttig å isolere det auditive Bulla og kapsel i postnatal mus. Før P12, vev er skjør og kan bli skadet under isolasjon. Etter P12, kan det auditive Bulla og kapsel lett bli isolert fra omkringliggende vev. Dissekere bulla fra hodet før seksjonering har flere fordeler. Først postnatal kavitasjon og vekst av auditiv bulla skje mest aktivt fra P6 og utover, og er ferdig med P14 50. Den mesenchymale vev mellom trommehinnen og cochlea vegg er erstattet av luft gjennom kavitasjon prosessen. Den resulterende luften i mellomøret hulrom kan hindre kontakt mellom vev og væsker under fiksering, avkalking og innstøping. Det er lettere å fjerne luft fra den isolerte auditive bulla ved å kutte av fremre enden (styliform prosess) heller enn å prøve å gjøre det i unisolated bulla. For det andre er ikke vertikal orientering av hammeren (og trommehinnen)i hodet. Det er derfor lettere å seksjonen hammeren i ønskede plan ved å bygge den isolerte auditive Bulla og kapsel i en gitt retning.

Når isolert, hørbar bulla og kapsler er anvendbare for en rekke analyser. For eksempel, kan høy oppløsning røntgen mikro-CT åpenbare ben mikro morfologi såsom osteogene blodkar i hammeren 14. Den stereofluorescence dissekere mikroskop er et kraftig verktøy for å visualisere strukturer i å vurdere reporter mus som uttrykker fluorescerende proteiner i midten eller indre øret 33. I tillegg kan en rekke in vivo eller ex vivo fluorescens merkingsmetoder og hel montere immunfluorescens deteksjon foretas. Lett ark fluorescensmikroskopi er også nyttig for tre-dimensjonal analyse 51. Selv om det ikke er beskrevet her, ulike anatomiske strukturer assosiert med det auditive Bulla og kapsel som perifere nerver, blodårer, ogtrommehinnen i mellomøret kan også bli evaluert ved anvendelse av denne protokollen.

Merk at parafin seksjonering krever avkalking av bein vev før innebygging og derfor ikke tillater analyse av mineralisering. I motsetning til dette kan det Kawamoto filmmetode 43 som brukes for å fremstille frosne snitt utføres uten avkalking og er egnet for mineraliseringsstudier ved bruk av in vivo ben-merkingsteknikker eller spesielle flekker som Alizarin farging. Cryo-snittforhold skal være optimalisert ifølge basert på mus alder. For eksempel er en mindre kjølig temperatur inne i kryostaten kammeret anbefalt for eldre mus prøver å minimere skade på delene.

I mus, den korrekte betegnelsen for den prominente halvkuleformede utvekst av hammeren er "orbicular apophysis". Likevel har begrepet "processus brevis" blitt mye brukt til å indikere orbicular apophysis for mer then to tiår, særlig blant mus utviklings biologer 16,20,22-25. "Processus brevis" opprinnelig referert til den laterale fremgangsmåte (processus lateralis), som skiller seg fra den orbicular apophysis. Hos mennesker er en lateral fremgangsmåte som ligner en svakt konisk fremspring danner generelle linjen av tilknytning til trommehinnen, som strekker seg fra manubrium (ikke vist på figur 6B, mediale visning). I mus, er den laterale prosessen også en projeksjon av manubrium ved den motsatte ende til den umbo 48. Pars flaccida av trommehinnen er over side prosessen med hammeren. Orbicular apophysis er ikke tydelig i den menneskelige hammeren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tools/Equipment
Paper towel Daio Paper Corporation 703347 can be purchased from other vendors
Glass Jar Various can be purchased from other vendors
14 cm surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 91400-14 can be purchased from other vendors
Extra fine scissors-straight Fine Science Tools (F.S.T.) 14084-08 can be purchased from other vendors
Fine Forceps Angled 45° Fine Science Tools (F.S.T.) 11063-07 can be purchased from other vendors
Dissecting microscope Nikon SMZ800N for routine dissection
Dissecting microscope Nikon SMZ18 for movies 
Injection needle 27 G TERUMO NN-2719S
Syringe (1 mL) TERUMO SS-01T
Marking Pin Various
Tube rotator RT-50 TAITEC 0000165-000 can be purchased from other vendors
Cryostat Leica CM3050S http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/
TC-65 Tungsten blade Leica 14021626379 for Kawamoto's firm method
Stainless containers Leica for Kawamoto's firm method
Cryofilm type IIC Leica for Kawamoto's firm method
Silane coated slide (New Silane II) Muto Pure Chemicals 511617 can be purchased from other vendors
Cover glass Matsunami can be purchased from other vendors
Tissue processor Sakura Finetek VIP-5 can be purchased from other vendors
Tissue Embedding Console System Sakura Finetek Tissue-Tek TEC 5  can be purchased from other vendors
Sliding microtome for paraffin Yamato Kohki Industrial REM-710 can be purchased from other vendors
Path Blade+pro for hard tissue Matsunami PB3503C for paraffin section
Micro-CT RIGAKU R_mCT2 http://www.rigaku.com/en
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Isoflurane Maruishi pharmaceutical Co. Ltd
NaCl wako 191-01665 for PBS
KCl wako 285-14 for PBS
Na2HPO4 12H2O wako 196-02835 for PBS
KH2PO4 wako 287-21 for PBS
Paraformaldehyde (PFA, EM Grade) TAAB P001
EDTA-2Na wako 15111-45
Trizma base Sigma T1503-1KG
Super Cryoembedding Medium Leica for Kawamoto's firm method
Dry Ice Various for Kawamoto's firm method
Hexane wako 080-03423 for Kawamoto's firm method
Super Cryomouting Medium type R2 Leica for Kawamoto's firm method
Paraffin Sakura Finetek 781001A0107
Histo-Clear NDS HS-200
Calcein DOJINDO 340-00433
Hematoxylin  wako 131-09665
Eosin wako 051-06515

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mallo, M. Formation of the middle ear: recent progress on the developmental and molecular mechanisms. Dev Biol. 231, 410-419 (2001).
  2. Manley, G. A. An evolutionary perspective on middle ears. Hear Res. 263, 3-8 (2010).
  3. Kanzaki, S., Ito, M., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Resorption of auditory ossicles and hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. Bone. 39, 414-419 (2006).
  4. Kanzaki, S., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Bisphosphonate therapy ameliorates hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. J Bone Miner Res. 24, 43-49 (2009).
  5. Cordas, E. A., et al. Thyroid hormone receptors control developmental maturation of the middle ear and the size of the ossicular bones. Endocrinology. 153, 1548-1560 (2012).
  6. Dong, W., Varavva, P., Olson, E. S. Sound transmission along the ossicular chain in common wild-type laboratory mice. Hear Res. 301, 27-34 (2013).
  7. Kanzaki, S., et al. Impaired vibration of auditory ossicles in osteopetrotic mice. Am J Pathol. 178, 1270-1278 (2011).
  8. Qin, Z., Wood, M., Rosowski, J. J. Measurement of conductive hearing loss in mice. Hear Res. (2009).
  9. Klein, J. O. Is acute otitis media a treatable disease? N Engl J Med. 364, 168-169 (2011).
  10. Rosch, J. W., et al. A live-attenuated pneumococcal vaccine elicits CD4+ T-cell dependent class switching and provides serotype independent protection against acute otitis media. EMBO Mol Med. 6, 141-154 (2014).
  11. Li, X., et al. Otitis media in sperm-associated antigen 6 (Spag6)-deficient mice. PLoS One. 9, e112879 (2014).
  12. Rodríguez Vázquez, J. F., Mérida Velasco, J. R., Jiménez Collado, J. A study of the os goniale in man. Acta Anat (Basel). 142, 188-192 (1991).
  13. Tucker, A. S., Watson, R. P., Lettice, L. A., Yamada, G., Hill, R. E. Bapx1 regulates patterning in the middle ear: altered regulatory role in the transition from the proximal jaw during vertebrate evolution. Development. 131, 1235-1245 (2004).
  14. Matsuo, K., et al. Osteogenic capillaries orchestrate growth plate-independent ossification of the malleus. Development. 142, 3912-3920 (2015).
  15. Matsuo, K. Cross-talk among bone cells. Curr Opin Nephrol Hypertens. 18, 292-297 (2009).
  16. Rijli, F. M., et al. A homeotic transformation is generated in the rostral branchial region of the head by disruption of Hoxa-2, which acts as a selector gene. Cell. 75, 1333-1349 (1993).
  17. Mallo, M., Gridley, T. Development of the mammalian ear: coordinate regulation of formation of the tympanic ring and the external acoustic meatus. Development. 122, 173-179 (1996).
  18. O'Gorman, S. Second branchial arch lineages of the middle ear of wild-type and Hoxa2 mutant mice. Dev Dyn. 234, 124-131 (2005).
  19. Santagati, F., Minoux, M., Ren, S. Y., Rijli, F. M. Temporal requirement of Hoxa2 in cranial neural crest skeletal morphogenesis. Development. 132, 4927-4936 (2005).
  20. Satokata, I., Maas, R. Msx1 deficient mice exhibit cleft palate and abnormalities of craniofacial and tooth development. Nat Genet. 6, 348-356 (1994).
  21. Zhang, Z., et al. Malleal processus brevis is dispensable for normal hearing in mice. Dev Dyn. 227, 69-77 (2003).
  22. Houzelstein, D., Cohen, A., Buckingham, M. E., Robert, B. Insertional mutation of the mouse Msx1 homeobox gene by an nlacZ reporter gene. Mech Dev. 65, 123-133 (1997).
  23. Martin, J. F., Bradley, A., Olson, E. N. The paired-like homeo box gene MHox is required for early events of skeletogenesis in multiple lineages. Genes Dev. 9, 1237-1249 (1995).
  24. Yamada, G., et al. Targeted mutation of the murine goosecoid gene results in craniofacial defects and neonatal death. Development. 121, 3005-3012 (1995).
  25. Rivera-Pérez, J. A., Mallo, M., Gendron-Maguire, M., Gridley, T., Behringer, R. R. Goosecoid is not an essential component of the mouse gastrula organizer but is required for craniofacial and rib development. Development. 121, 3005-3012 (1995).
  26. Coré, N., et al. Tshz1 is required for axial skeleton, soft palate and middle ear development in mice. Dev Biol. 308, 407-420 (2007).
  27. Li, C., Scott, D. A., Hatch, E., Tian, X., Mansour, S. L. Dusp6 (Mkp3) is a negative feedback regulator of FGF-stimulated ERK signaling during mouse development. Development. 134, 167-176 (2007).
  28. Hwang, C. H., Wu, D. K. Noggin heterozygous mice: an animal model for congenital conductive hearing loss in humans. Hum Mol Genet. 17, 844-853 (2008).
  29. Calvert, J. A., et al. A missense mutation in Fgfr1 causes ear and skull defects in hush puppy mice. Mamm Genome. 22, 290-305 (2011).
  30. Carpinelli, M. R., et al. Anti-apoptotic gene Bcl2 is required for stapes development and hearing. Cell death dis. 3, e362 (2012).
  31. Chapman, S. C. Can you hear me now? Understanding vertebrate middle ear development. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1675-1692 (2011).
  32. Kitazawa, T., et al. Distinct effects of Hoxa2 overexpression in cranial neural crest populations reveal that the mammalian hyomandibular-ceratohyal boundary maps within the styloid process. Dev Biol. 402, 162-174 (2015).
  33. Wang, L., et al. Scleraxis is required for differentiation of the stapedius and tensor tympani tendons of the middle ear. J Assoc Res Otolaryngol. 12, 407-421 (2011).
  34. Amin, S., Tucker, A. S. Joint formation in the middle ear: lessons from the mouse and guinea pig. Dev Dyn. 235, 1326-1333 (2006).
  35. Amin, S., Matalova, E., Simpson, C., Yoshida, H., Tucker, A. S. Incudomalleal joint formation: the roles of apoptosis, migration and downregulation. BMC Dev Biol. 7, 134 (2007).
  36. Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of anatomy. 201, 15-29 (2002).
  37. Treuting, P. M., Dintzis, S. M. Ch. 22, Special senses: ear. Comparative Anatomy and Histology: A Mouse and Human Atlas. Treuting, P. M., Dintzis, S. M. 22, Academic Press. 419-432 (2012).
  38. Mallo, M., Schrewe, H., Martin, J. F., Olson, E. N., Ohnemus, S. Assembling a functional tympanic membrane: signals from the external acoustic meatus coordinate development of the malleal manubrium. Development. 127, 4127-4136 (2000).
  39. Anthwal, N., Joshi, L., Tucker, A. S. Evolution of the mammalian middle ear and jaw: adaptations and novel structures. Journal of anatomy. 222, 147-160 (2013).
  40. Takechi, M., Kuratani, S. History of studies on mammalian middle ear evolution: a comparative morphological and developmental biology perspective. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 314, 417-433 (2010).
  41. Henson, O. W. Jr Ch. 3, Comparative Anatomy of the Middle Ear. Handbook of Sensory Physiology. Keidel, W. D., Neff, W. D. Vol. 1, Auditory System. Anatomy, Physiology (Ear), Springer. Berlin Heidelberg. 39-110 (1974).
  42. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. Humana Press. (2003).
  43. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
  44. Kampen, P. N. V. Gegenbaurs Morphologiesches Jahrbuch. 34, W. Engelmann. 321-722 (1905).
  45. Lee, J. H., Park, K., Kang, T. C., Choung, Y. H. Three-dimensional anatomy of the temporal bone in normal mice. Anat Histol Embryol. 38, 311-315 (2009).
  46. Fleischer, G. Evolutionary principles of the mammalian middle ear. Adv Anat Embryol Cell Biol. 55, 3-70 (1978).
  47. Lavender, D., Taraskin, S. N., Mason, M. J. Mass distribution and rotational inertia of "microtype" and "freely mobile" middle ear ossicles in rodents. Hear Res. 282, 97-107 (2011).
  48. Mason, M. J. Of mice, moles and guinea pigs: functional morphology of the middle ear in living mammals. Hear Res. 301, 4-18 (2013).
  49. Willi, U. B., Ferrazzini, M. A., Huber, A. M. The incudo-malleolar joint and sound transmission losses. Hear Res. 174, 32-44 (2002).
  50. Richter, C. A., et al. Defects in middle ear cavitation cause conductive hearing loss in the Tcof1 mutant mouse. Hum Mol Genet. 19, 1551-1560 (2010).
  51. Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61, 382-395 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics