منهجية لدراسة نقل أفقي جين في
1Division of Biomedical Science, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 2Department of Basic Biomedical Science, Universidad Europea de Madrid, 3Human Biology Program, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba, 4Laboratory of Nosocomial Infections, Department of Bacteriology, Centro Nacional de MicrobiologÍa, Instituto de Salud Carlos III, 5Division of Microbiology, Department of Medicine, School of Medicine, Universidad Complutense, 6Biology of Gram-Positive Pathogens, Department of Microbiology, Institut Pasteur, Paris, France, 7ERL3526, CNRS, Paris, France
* These authors contributed equally

Published 3/10/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

وصفنا هنا ثلاثة بروتوكولات مختلفة للتحقيق في المختبر من الاقتران، التنبيغ، والتحول الطبيعي في المكورات العنقودية الذهبية.

Cite this Article

Copy Citation

Cafini, F., Thi Le Thuy, N., Román, F., Prieto, J., Dubrac, S., Msadek, T., et al. Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55087, doi:10.3791/55087 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

واحدة سمة هامة من سمات رئيسية الممرض البشري الانتهازية المكورات العنقودية الذهبية هي قدرة غير عادية للاستحواذ بسرعة مقاومة للمضادات الحيوية. تكشف الدراسات الجينومية أن بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية يحمل العديد من الجينات الفوعة ومقاومة تقع في العناصر الوراثية المتنقلة، مما يشير إلى أن نقل الجينات الأفقي (HGT) يلعب دورا حاسما في تطور الذهبية س. ومع ذلك، وصفا كاملا ومفصلا عن المنهجية المستخدمة لدراسة HGT في العنقودية الذهبية لا يزال غير موجود، خاصة فيما يتعلق التحول الطبيعي، الذي تم الإبلاغ مؤخرا في هذه البكتيريا. يصف هذا العمل ثلاثة بروتوكولات التي هي مفيدة للتحقيق في المختبر من HGT في بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية: الاقتران، التنبيغ فج، والتحول الطبيعي. لتحقيق هذا الهدف، والجينات CFR (الكلورامفينيكول / المقاومة florfenicol)، الذي يضفي على Phenicols، Lincosamides، Oxazolidinones، Pleuromutilins، وStreptogramin ألف (PhLOPSأ) -resistance النمط الظاهري، تم استخدامها. فهم الآليات التي من خلالها بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية نقل المواد الوراثية لسلالات أخرى لا بد من فهم سرعة اكتساب المقاومة ويساعد على توضيح طرق نشر عنها في برامج المراقبة أو لمزيد من التنبؤ وضع تنتشر في المستقبل.

Introduction

المكورات العنقودية الذهبية هي موجبة الجرام البكتيريا المتعايشة التي تسكن بشكل طبيعي في الجلد، وتجويف الأنف من البشر والحيوانات. هذه الأنواع البكتيرية هي السبب الرئيسي للعدوى المستشفيات في المستشفيات ومرافق الرعاية الصحية. وعلاوة على ذلك، جعلت قدرته على تطوير مقاومة المركبات المضادة للميكروبات مختلفة إدارة الالتهابات التي تسببها هذه البكتيريا إلى الاهتمام العالمي.

ومن المعروف مسارين الرئيسية التي تشارك في انتشار الظواهر المقاومة: نشر نسيلي من المورثات المقاومة ونشر المحددات الوراثية بين تجمع البكتيريا. في حالة بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية، مختلف الجينات المقاومة للمضادات الحيوية (وكذلك محددات الفوعة) وقد وجد أن تترافق مع العناصر الوراثية المتنقلة (MGEs) 1. وجود هذه العناصر في الجينوم من بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية يشير إلى أن اقتناء ونقل الجنرالالمواد ETIC بين السكان البكتيرية يمكن أن تلعب دورا هاما لS. التكيف الذهبية والتطور.

المادة الوراثية يمكن تبادلها من خلال ثلاث آليات معروفة من HGT في البكتيريا إيجابية الجرام: التحول، الاقتران، والتنبيغ فج. ويشمل التحول امتصاص الحمض النووي مجانا. للحصول على الحمض النووي الأجنبية، تحتاج الخلايا البكتيرية لتطوير المرحلة الفسيولوجية الخاصة: المرحلة الكفاءة. عندما يتم التوصل إلى هذه المرحلة، والخلايا المختصة قادرة على نقل الحمض النووي في السيتوبلازم، والحصول على محددات وراثية جديدة. في حالة بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية، وجود تحول الطبيعي وقد أثبتت مؤخرا 2. وتماشيا مع هذا، وفقد مجموعتنا الضوء على أهمية التعبير عن عامل تنهد (النسخ الثانوي عامل سيغما خفي) في المرحلة اختصاص التنمية وكيف يجعل تعبيرها التأسيسي العنقودية الذهبية قادرة على reachinز مرحلة الكفاءة، والذي يسمح لاقتناء الظواهر المقاومة التي تحول الطبيعي 2.

الاقتران هو عملية تنطوي على نقل الحمض النووي من خلية حية واحدة (المانحة) إلى آخر (المستفيد). يجب أن يكون كل من الخلايا في اتصال مباشر، والسماح للالحمض النووي التي يتم تبادلها في حين محمي من قبل الهياكل الخاصة، مثل أنابيب أو المسام. نقل الحمض النووي عن طريق هذا الأسلوب يتطلب آلية اقترانية. في العنقودية الذهبية، البلازميد النموذج اقترانية هو PGO1، التي تؤوي في اقترانية الاوبرون TraA 3.

ويشمل فج التنبيغ نقل الحمض النووي من خلية إلى أخرى من خلال العدوى عاثية ويوحي التعبئة من الحمض النووي للبكتيريا، بدلا من الحمض النووي الفيروسي، في القفيصة فج. وlysogenized معظم العزلات بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية عن طريق البكتيريا 1. على ظروف الإجهاد، prophages يمكن رفعه من genom البكتيريةالإلكترونية والتحول إلى دورة حالة.

هذه هي الآليات الثلاثة المعروفة لنقل الحمض النووي في العنقودية الذهبية. هناك بعض آليات نقل إضافية، مثل "شبه التحول" (2) وأنظمة شبيهة فج في نقل الجزر المرضية 4. في الآونة الأخيرة، أفادت مجموعة واحدة "الأنابيب النانوية" تشارك في نقل المواد الخلوية (بما في ذلك البلازميد) بين الخلايا المجاورة لكن لم يظهر دراسة متابعة من المجموعات الأخرى حتى الآن.

ويوفر هذا العمل والمنهجية اللازمة لدراسة HGT في بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية عن طريق معالجة ثلاثة مسارات نقل رئيسية: الاقتران، التنبيغ، والتحول الطبيعي. واستخدمت نتائج التي تم الحصول عليها مع هذه المنهجيات لدراسة انتقال الجينات CFR (الكلورامفينيكول / المقاومة florfenicol) بينبكتريا المكورة العنقودية البرتقالية سلالات 7. هذه التقنيات الثلاث هي أدوات متعددة لتحقيق انتقال MGE في العنقودية الذهبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يتم سرد السلالات والمواد المستخدمة في هذا العمل في الجدول رقم 1 وجدول المواد، على التوالي. في التجارب نقل، استخدمت N315 والعقيد CFR المشتقات -positive الجهات المانحة من الجين CFR (N315-45 وCOL-45). تم الحصول على هذه السلالات من قبل الاقتران، وذلك باستخدام مثل المانحة معدل إماتة الحالات السريرية -positive Staphyloccocus البشروية سلالة (ST2)، بعد بروتوكول اقتران القياسية (أنظر أدناه). يضمر هذه السلالة الجين CFR على pSCFS7 مثل بلازميد 7.

1. الإقتران باستخدام أسلوب تصفية التزاوج

ملاحظة: إن سلالة بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية N315 تحمل الجين CFR (N315-45) 7 (سم R) وتستخدم الجهة المانحة. واستخدمت العقيد 8 أو 9 Mu50 سلالات (تيت سم S) كما المتلقين. مزدوج-واعتبرت المستعمرات مقاومة (تيت سم R) قادرة على النمو في ظل وجود 32 ملغم / لتر من الكلورامفينيكول بالإضافة إلى 8 ملغ / لتر من التتراسيكلين كما transconjugants المفترضة وتم تحليلها لتحديد وجود CFR بواسطة PCR مستعمرة وتحديد المتلقي خصائص الحساسية.

  1. أداء الاقتران بعد البروتوكول هو موضح سابقا 10 مع بعض التعديلات:
    1. إعداد 5 مل من الثقافة بين عشية وضحاها من المتبرع والمتلقي في زيتية الصويا مرق (TSB) متوسطة (مع أو بدون 32 ملغم / لتر الكلورامفينيكول، على التوالي)، مع اهتزاز عند 37 درجة مئوية.
    2. ضبط الكثافة الضوئية (OD 600) من الثقافات بين عشية وضحاها إلى 1 (OD 600 = 1.0) باستخدام المتوسطة TSB جديدة. خلط 0.5 مل من ثقافة المانحة (N315-45) مع 0.5 مل من ثقافة المتلقي (COL أو Mu50). إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني إلى الخليط.
    3. نقل خليط من البكتيريا على 0.45 ميكرومتر غشاء فلتر باليودنانوغرام نظام مضخة فراغ.
    4. وضع الأغشية مرشح على طبق من الأغنام أجار الدم. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 يوم.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، متوسطة المخصب ضروري للسماح للنمو خلايا مقاومة للمزدوجة.
    5. تأخذ بها غشاء مرشح من لوحة وتعليق في 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). دوامة جيدا لجمع كل البكتيريا تعلق على الغشاء.
    6. جعل المسلسل التخفيف 10 أضعاف من تعليق البكتيرية باستخدام TSB جديدة. لوحة 100 ميكرولتر من 0-10 -4 عينات المخفف على أجار TSB (TSA) لوحات تستكمل مع 32 ملغ / لتر الكلورامفينيكول و 8 ملغ / لتر التتراسيكلين لاختيار transconjugants. لوحة 100 ميكرولتر من تعليق المخفف (10 -5 -10 -6) على لوحات TSA مع 8 ملغ / لتر التتراسيكلين وحدها لحساب عدد من المتلقين. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة.
    7. تحليل المستعمرات مقاومة المزدوج (transconjugants المفترضة) لوجود قوات التحالفمورثات المقاومة التي كتبها مستعمرة PCR 7 وملامح قابليتها (المضادات).
    8. تحديد المضادات عن طريق قياس مقدار أقل تركيز مثبط (البلدان المتوسطة الدخل) من المضادات الحيوية المناسبة وفقا لطريقة microdilution أو نشر القرص القياسية طريقة 11. يجب أن يكون خصائص الحساسية من transconjugants متطابقة إلى المستلم، باستثناء الكلورامفينيكول (وغيرها من المركبات المتضررة من الجينات CFR). هذا التصميم لا بد من استبعاد المقاومة التتراسيكلين التي وضعتها سلالة المانحة.

2. فج تنبيغ

ملاحظة: MR83a الجراثيم التي تنتمي إلى (الأسهم مختبر) عائلة فيروسات سيفاوية استخدمت في التجارب ترنسدوكأيشن. وقد استخدم N315-45 كما المتبرع CFR للعدوى فج. استخدمت N315، العقيد، أو Mu50 سلالات كما المتلقين. تم تحديد اكتساب CFR من أساسهاility من سلالة المتلقي أن تنمو في وجود 32 ملغم / لتر الكلورامفينيكول. وقد تم تحليل المستعمرات تنمو في ظل هذا الشرط لتحديد وجود CFR (عن طريق مستعمرة PCR) وتحديد خصائص الحساسية لاستبعاد احتمال حدوث تلوث محتمل.

  1. تضخيم فج على المانحين
    1. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها من N315-45 في 5 مل من المرق المغذي تستكمل مع 3.6 ملي كا 2+ (NBCaCl 2) عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (180 دورة في الدقيقة).
      مطلوب الكالسيوم لعدوى فج: ملاحظة. انظر الجدول المواد. المغذيات مرق من شركات أخرى قد يكون القضايا، مثل هطول الأمطار الكالسيوم.
    2. إعداد الثقافات الفرعية عن طريق تمييع الثقافة بين عشية وضحاها 1: 1000 في الحجم النهائي من 10 مل من NBCaCl 2 في قوارير الزجاج 50 مل أو قوارير زجاجية. تنمو البكتيريا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (180 دورة في الدقيقة).
    3. إعداد سلسلة من MR83a فج مخففة في NBCaCl 2 ميديأم (10 -2، 10 -3، -4 10، 10 -5، و 10 -6). إضافة 20 ميكرولتر من فج المخفف في الثقافة البكتيرية. أيضا بإعداد ثقافة السيطرة من دون إصابة فج، والتي هي بمثابة مراقبة إيجابية لنمو الخلايا البكتيرية ويمكن استخدامها لتحديد عيار فج في اليوم التالي.
    4. تنمو الثقافات عند 37 درجة مئوية مع طيف تهز (100 دورة في الدقيقة) بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: هذه الخلايا سوف تنمو إلى حد ما عندما فج اصابة ليس في الزائدة؛ ثم، فإنها ستدخل حيز مرحلة تحلل بسبب التضخيم فج من خلال دورة التحللي. إن ثقافة دون فج تظهر النمو الكامل، في حين أن الثقافات مع فج سوف تظهر معدلات متميزة من الشفافية.
    5. اختيار واحد أو اثنين من قوارير ثقافة مسح وفقا لأعلى التخفيف من فج المضافة.
    6. نقل الثقافات إلى 15 مل أنابيب الطرد المركزي. إضافة 250 ميكرولتر من الكلوروفورم ومزيج دقيق من قبل قلب الأنابيب.
    7. أنابيب الطرد المركزي في 5000
    8. نقل supernatants لأنابيب جديدة وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: إن فج غير مستقر ما لا يقل عن بضعة أشهر، ولكن تخزين إعداد فج لفترة طويلة جدا يقلل من عيار والتنبيغ كفاءة.
  2. قياس عيار فج (فج فحص اللوحة)
    1. إعداد المواد الغذائية مرق أجار (1.5٪ أجار) متوسطة. إبقائه دافئا في حمام مائي عند 55 درجة مئوية. إضافة تعقيمها 0.5 M CaCl 2 حل على المديين المتوسط وتركيز النهائي من 3.6 ملم. سكبه 90 مم أطباق بتري (NBCaCl لوحات 2).
    2. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها من N315 في 5 مل من NBCaCl 2 عند 37 درجة مئوية مع الهز. هذا يمكن أن تكون بديلا للثقافة السيطرة المذكورة أعلاه (الخطوة 2.1.3).
    3. إضافة 10 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 200 ميكرولتر من NBCaCl 2 وتنتشر بشكل متساو على لوحة NBCaCl 2. وقف انتشار عند سطحوتغطي لوحة مع السائل. السماح لوحة جافة.
    4. جعل المسلسل 01:10 التخفيف (من 10 -5 -10 -10) من معدة مسبقا فج (الخطوة 2.1.8) باستخدام NBCaCl 2 متوسطة.
    5. بقعة 3 ميكرولتر من كل تخفيف فج على لوحة مغطاة البكتيريا.
    6. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
    7. عد أرقام البلاك وحساب عيار فج باستخدام المعادلة التالية: اللوحة تشكيل وحدة (PFU) / مل = عدد لويحات س عامل التخفيف / حجم رصدت (3 × 10 -3 مل)
  3. فج التنبيغ
    ملاحظة: تجمع فج أعدت في الخطوة السابقة (2.1.8) يستخدم لاختبار تنبيغ الجينات CFR في سلالات بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية. في هذه التجربة، سلالات تستخدم N315، العقيد، أو Mu50 كما المتلقين.
    1. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها من N315، العقيد، أو Mu50 في 5 مل من NBCaCl 2 عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (180 دورة في الدقيقة).
    2. تمييع رانه فج في NBCaCl 2 ~ 10 9 PFU / مل.
    3. في قارورة زجاجية 50 مل، مزيج 500 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها، 500 ميكرولتر من NBCaCl جديدة و 1 مل من فج (~ 10 9 PFU / مل). تعدد المتوقع من العدوى (وزارة الداخلية) يجب ألا يتجاوز 1. احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية مع طيف تهز (100 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: المعالجة الحرارية للخلايا المتلقي فقط قبل إضافة فج (52 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة لإبطال نشاط الإنزيمات تقييد endogeneous) قد يزيد من كفاءة 12.
    4. إضافة 50 ميكرولتر من 20٪ نا 3 -Citrate. مواصلة لطيف تهتز لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: نا 3 -Citrate بمثابة خالب معتدلة من الكالسيوم.
    5. إعداد ذاب ضخ الدماغ و القلب (BHI) أجار (1.5٪ أجار) المتوسطة والحفاظ عليه في حمام مائي عند 55 درجة مئوية.
    6. نقل خليط بكتيريا فج للقارورة 100 مل، إضافة 50 مل من أجار BHI الدافئة تستكمل مع 32 ملغ / لتر chloramphenicol، وتخلط جيدا. صب الخليط في أطباق بتري 90 مم.
      ملاحظة: هذه الطريقة يمكن الكشف عن عدد قليل من المستعمرات تبعها (transductants المفترضة).
    7. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة.
    8. وعلاوة على ذلك اختبار المستعمرات ولدت (transductants) للمقاومة عن طريق نقل المستعمرات على لوحات BHI أجار جديدة تستكمل مع 32 ملغ / لتر الكلورامفينيكول. تأكد من وجود هذا الجين CFR بواسطة PCR مستعمرة 7.

3. التحول الطبيعي

وأجري فحص التحول الطبيعي في بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية في أعقاب الطريقة الموصوفة في دراستنا السابقة 2: ملاحظة. مشتق N315، N2-2.1 كان يستخدم للمتلقي. في هذه السلالة، وتكرار موضع تنفس الصعداء وذلك لجوهري صريحة تنهد 2. لديتإجراءات ailed حول كيفية عزل المتغيرات الكفاءة، معربا عن تنفس الصعداء، يرجى الاطلاع على الوصف السابق 2. إذا كانت المقاومة علامة على أن يتم تحويلها ليست الكلورامفينيكول، pRIT-تنهد (سم R) يمكن استخدامها للتعبير عن تنفس الصعداء، كما هو موضح سابقا (2). البلازميد المنقى أو كله استخراج الحمض النووي من CFR -acquired يستخدم بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية COL-45 7 كما الحمض النووي المانحة للتحول.

  1. إعداد الحمض النووي المانحة
    1. زراعة COL-45 بين عشية وضحاها مع اهتزاز عند 37 درجة مئوية في قارورة 300 مل تحتوي على 50 مل مكتب تقييس الاتصالات تستكمل مع 32 ملغ / لتر الكلورامفينيكول. ثقافة كولاي HST04 pHY300 تحمل البلازميد (تيت R) لاستخراج البلازميد للتجربة السيطرة.
      ملاحظة: HST04 (السد - / DCM -) يفتقر إلى الحمض النووي methylase الجينات 13. سلالات التقليدية الأخرى مع methylases الحمض النووي يمكن أيضا أن يكون استخدامد لإعداد المانحة الحمض النووي، لأن الدولة الحامض النووي لا يؤثر على كفاءة التحول. بدلا من ذلك، pT181 البلازميد تنقيته من سلالة بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية العقيد يمكن أن تستخدم أيضا لمراقبة إيجابية للتحول فحص 2.
    2. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي (8000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية).
    3. استخراج البلازميدات استخدام عدة استخراج DNA البلازميد أو طريقة تنقية الحمض النووي التقليدية لتنقية الحمض النووي كله.
    4. تحديد الحمض النووي تنقيته بواسطة مطياف والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: استخدم إعداد الحمض النووي جديدة للمقايسة التحول، وعادة ما تكون أقل من أسبوع واحد من العمر. الاستعدادات قديم الحمض النووي تقلل من كفاءة التحول.
  2. التحول فحص
    1. ثقافة الخلية المستقبلة (N2-2.1) بين عشية وضحاها في 5 مل مكتب تقييس الاتصالات عند 37 درجة مئوية مع الهز.
    2. نقل 0.5 مل من الثقافة بين عشية وضحاها في أنبوب 1.5 مل. Precipiاألمد الخلايا بواسطة الطرد المركزي (10000 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجة مئوية).
    3. تعليق الخلايا مع 10 مل من CS2 المتوسط ​​في أنبوب 50 مل.
      ملاحظة: CS2 المتوسطة هو وسيلة الاصطناعية الكامل الذي يدفع الكفاءة من أجل التحول الطبيعي في بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية 2 (انظر تكوين المتوسط في الجدول مواد). وسائل الإعلام المختبر القياسية الأخرى، مثل تسب أو BHI، ليست مناسبة للتحول 13.
    4. تنمو البكتيريا عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (180 دورة في الدقيقة) حتى المرحلة الأسي في وقت متأخر (حوالي 8 ساعات).
    5. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي (5000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية).
    6. resuspend الخلايا في 10 مل من المتوسط ​​CS2 جديدة.
    7. إضافة 10 ميكروغرام البلازميد المنقى أو الحمض النووي الجينوم (الخطوة 3.1.4) إلى تعليق خلية. هزة عند 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة لمدة 2.5 ساعة.
      ملاحظة: مرة حضانة أقصر مع الحمض النووي (<2.5 ساعة) يؤدي إلى انخفاض transfترددات ormation الوقود النووي.
    8. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي (5000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية).
    9. resuspend الخلايا في 10 مل من BHI المتوسطة. مزيج تعليق الخلية مع 90 مل من أجار BHI ذاب (55 ° C) الملحق مع 32 ملغ / لتر الكلورامفينيكول (أو 5 ملغ / لتر التتراسيكلين في التجربة السيطرة). صب الخليط في أطباق بتري 90 مم. بسرعة بارد والسماح للأجار يصلب.
    10. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
    11. تكرار المستعمرات ولدت (transformants) عن طريق نقل المستعمرات (باستخدام المسواك) لوحات BHI أجار جديدة تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة التأكيد على خصائص مقاومتها. تأكيد الجينات المقاومة المكتسبة (CFR أو tetM) بواسطة PCR مستعمرة 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النتائج كانت الممثلة هنا تنطبق (مقتبس من مرجع 7 بإذن من الناشر). درسنا مسارات انتقال محتملة من الجين CFR، الذي يسبب مقاومة ينزوليد على مستوى منخفض والتعبير عن النمط الظاهري PhLOPSA مقاومة 14 و 15 في سلالات بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية، من خلال التحقيق في ثلاث آليات HGT.

ويبين الشكل 1 النتائج المتحصل عليها في المقايسات اقترانية. بروتوكول الاقتران هو مفيد للانتقال بين الانواع (A)، وكذلك نقل داخل الأنواع (B)، وإعطاء نتائج مماثلة باستخدام نفس ناقلات اقترانية في الجهات المانحة اقترانية مختلفة. ويتم احتساب كفاءة تصريف الافعال كما Nº من transconjugants (وحدات تشكيل مستعمرة، أو كفو / مل) / Nº من خلايا المتلقي (كفو / مل). وتراوحت الترددات التي تم الحصول عليها من 1 × 10 -6 إلى 1 × 10 -5، مع قيم مماثلة باستخدام البشروية اس ام اس الذهبية كما المتبرع.

وتتلخص النتائج في الجدول 2. CFR -acquired كانت العنقودية الذهبية قادرة على مواصلة نقل الجين CFR لسلالات بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية أخرى عن طريق الاقتران فضلا عن التنبيغ فج. ومع ذلك، تشير النتائج إلى عدم والتحول الطبيعي للانتقال CFR، على الرغم من أن تم الكشف عليه لعلامة مقاومة مختلفة (tetM الجينات في البلازميد pHY300).

شكل 1
الشكل 1: تمثيل CFUs المستفيدة وtransconjugant التي تم الحصول عليها في المقايسات اقترانية. تمثل الحانات واضحة مجموع سلالات المتلقي معزولة بعد18-24 ساعة من ثقافة في وسائل الإعلام الانتقائي للسلالات المتلقي. تمثل تملأ القضبان مجموع السلالات المقاومة نقرا مزدوجا تم الحصول عليها بعد 18-24 ساعة من ثقافة في وسائل الإعلام الانتقائي للسلالات transconjugant. (أ) فيما بين الأنواع فحص اقترانية. المكورات العنقودية البشروية (SE45) كان يستخدم المتبرع CFR، وكان يستخدم سلالة المكورات العنقودية الذهبية N315 دور المتلقي. تستشري في transconjugant سلالة N315-45 الجين CFR إدراجها في pSCFS7 مثل بلازميد. وقد استخدمت هذه السلالة كمصدر للCFR في المقايسات انتقال الجرثومة إلى هذه الجرثومة. (B) هذه الجرثومة إلى هذه الجرثومة التجارب اقترانية. تم استخدام N315-45 التي تم الحصول عليها في السابق باسم المانحة، واستخدمت ليتوانيا أو سلالات Mu50 كما المتلقين. وتظهر القيم متوسط ​​تجربتين مستقلة مع انحراف معياري (SD). الرجاء انقر هنا لعرض أكبرنسخة من هذا الرقم.

اسم سلالة وصف مصدر مرجعي
سلالات بكتيرية
SE45 السريرية البشروية S. isolatated 7
N315 قبل هذه الجرثومة، KMR، ErmR 9
COL هذه الجرثومة، تحمل التتراسيكلين الجينات المقاومة على pT181 البلازميد 8
Mu50 هذه الجرثومة، فيزا 9
N315-45 مشتق من N315، تحمل CFR الجينات في البلازميد pSCFS7 تشبه تم الحصول عليها من س. البشروية عن طريق الاقتران 7
COL-45 دerivative من العقيد، تحمل CFR الجينات في البلازميد pSCFS7 تشبه تم الحصول عليها من س. البشروية عن طريق الاقتران 7
RN4220-45 مشتق من RN4220، تحمل CFR الجينات في البلازميد pSCFS7 تشبه تم الحصول عليها من س. البشروية عن طريق الاقتران 7
N2-2.1 تنهد الخلية النشطة المستمدة من N315، مما يسمح للخلايا الخلايا المؤهلة للتحول 7
كولاي HST04 dam- / dcm- pHY300 كولاي HST04 dam- / dcm- (تاكارا) يحمل مقاومة التتراسيكلين pHY300 البلازميد 11
البكتيريا
MR83a عائلة فيروسات سيفاوية الأسهم مختبر
MR83-45 فج MR83a التعبئة البلازميد pSCFS7 مثل تحمل CFR الجين بعد تصيبأيون إلى N315-45 هذه الدراسة

الجدول 1: قائمة السلالات المستخدمة في هذا العمل.

HTG الجهات المانحة مستلم تكرر
اقتران N315-45 COL 1.00 × 10 -6
N315-45 MU50 1.29 × 10 -5
التوضيح N315-45 COL 1.00 × 10 -11
N315-45 MU50 3.68 × 10 -10
N315-45 N315 6.88 × 10 -10
تحويل البلازميدات (COL-45) N2-2.1 ULD
كله الحمض النووي (COL-45) N2-2.1 ULD
pHY300 (مراقبة) N2-2.1 6.52 × 10 -10

الجدول 2: ترددات HTG انتقال الجينات CFR التي تم الحصول عليها في التجارب الجرثومة إلى هذه الجرثومة. تم تقييم انتقال اقترانية باستخدام N315 CFR مشتق -positive (N315-45) كما المتبرع. وأعرب عن وتيرة نقل في هذه التجارب مثل Nº من transconjugants خلايا / المتلقي. تم تقييم تنبيغ باستخدام MR83a transducing فج وتضخيمها من سلالة N315-45. تم احتساب تردد التنبيغ كما Nº من transductants / PFU. Transforوأجريت فحوصات املعلومات باستخدام الحمض النووي النقي (البلازميد أو DNA الخلوي كله) والجهات المانحة. تم حساب وتيرة التحول حيث بلغ عدد خلايا transformants / المتلقي. ULD: تحت الكشف عن الحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا العمل الطرق الرئيسية الثلاث لدراسة HGT المحددات الوراثية في العنقودية الذهبية. على الرغم من أن التنبيغ والاقتران تم دراستها على مدى عقود، وجود تحول الطبيعي تم الاعتراف مؤخرا فقط 2. وهكذا، تم تجهيز العنقودية الذهبية مع كل من وسائط الثلاثة الرئيسية من HGT، واختبار كل منهم هو مطلوب لتوضيح مسارات نشر الممكنة من المحددات الوراثية. والهدف من هذا العمل هو تجميع البروتوكولات الكاملة وتوفير معلومات عملية عن المنهجيات المستخدمة في الأعمال المنشورة سابقا 7. وعلى الرغم من الاقتران والتنبيغ البروتوكولات المتاحة، وهذا هو الورقة الأولى التي يتم فيها وصف بروتوكول التحول تفصيلا.

اقتران باستخدام طريقة تصفية التزاوج هي تقنية بسيطة ويمكن تطبيقها على دراسة نقل اقترانية في الأنواع البكتيرية المختلفة= "XREF"> 7 و 10. باستخدام قائح موحد والمتلقي التهم بعد 18-24 ساعة تصل إلى قيمة 10 ~ 9 كفو / مل. التهم Transconjugant هي المتغير، وتظهر قيم قوي الاعتماد سلالة إلى سلالة، ولكن عادة، مجموعة transconjugant من 10 فبراير - 10 مايو تم الحصول عليها عندما كانت النتائج إيجابية الاقتران. باستخدام بروتوكول المقدمة هنا، كان الحد من الكشف حققت <10 transconjugants / مل. هذا الحد يمكن أن يكون الأمثل من خلال التركيز على تعليق التصفية.

تأسست بروتوكول التحول الطبيعي هو موضح هنا في بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية سلالات N315-مشابه. استخدام CS2 المتوسطة أمر بالغ الأهمية للتحول، منذ التحول غير قابل للكشف في وسائل الإعلام المختبر القياسية الأخرى، مثل تسب وBHI 13.

أدى استخدام البلازميدات المخزنة على المدى الطويل (على سبيل المثال، pT181 وpHY300) كما المتبرع في نحو 10- إلى 50 أضعاف انخفاض وتيرة (لا تظهر البيانات)، مما يشير إلى أن نوعية الحمض النووي يمكن أن تؤثر على وتيرة التحول. ومن المعروف أن البلازميدات رصدت ليست مناسبة للتحول الطبيعي في B. الرقيقة (16).

الحمض النووي التي تم الحصول عليها من كلا العنقودية الذهبية والإشريكية القولونية يمكن أن تستخدم الجهات المانحة في المقايسات التحول الطبيعية، مما يدل على أن حاجز التقييد لا تمنع التحول الطبيعي. نحن أيضا لاحظت نفس التردد التحول بين الحمض النووي أعدت من كولاي HST04 (السد - / DCM -) تفتقر إلى الحمض النووي methylase الجينات ومن JM109، ودعم فكرة أن وضع مثيلة لا يؤثر على وتيرة التحول.

وتجدر الإشارة إلى أن وتيرة التحول الكشف باستخدام هذا البروتوكول كان منخفضا (~ 10 -9 -10 -10)، وتقتصر على سلالات التحويلية لمشتقات N315الطبقة = "XREF"> 2. ومن المرجح أن كفاءة التحول في بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية يمكن أن تكون سلالة محددة، كما أيضا تم الإبلاغ في البكتيريا التحويلية الأخرى 15 و 16 و 17. مزيد من الدراسات جارية لتحسين كفاءة التحويل؛ وسوف نتناول هذا في أي مكان آخر.

يبدو فج التنبيغ ليكون آلية HGT الأكثر انتشارا في بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية لأن lysogenized معظم العزلات بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية عن طريق البكتيريا 18. القدرة إصابة فج transducing تعتمد على قابلية المضيف ويجب أن يتم فحصها من قبل فحص اللوحة. الحد آخر تنبيغ فج هو حجم الحمض النووي. الحمض النووي صغيرة يمكن نقلها بكفاءة، ولكن الحمض النووي شظايا أكبر من 45 كيلو بايت لا يمكن أن تكون معبأة في الرأس فج العنقودية 19. ومع ذلك، رواية فج العنقودية عملاق له مؤخرا بالتابعين معزولة عن البيئة، وitcould تصور أن يكون قادرا على نقل أكبر شظايا الحمض النووي 20.

طريقة وحة الفحص وصفها في هذا العمل هو أسهل من البروتوكول التقليدي، حيث يتم استخدام أعلى أجار. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب أن الخلايا البكتيرية تنتشر بالتساوي من أجل الكشف عن لوحات صغيرة ولدت على السطح. لتحقيق حجم تماما حتى نشر، نوصي نشر ما يكفي من تعليق البكتيرية على سطح أجار، ووقف عند يغطي السائل بالتساوي على سطح أجار. ثم، تجفيف لوحات في تدفق الهواء في مقعد نظيفة. إذا كان ذلك ضروريا لتجنب lysogenization من فج transducing، فمن المستحسن تعدد منخفضة من العدوى (يجب على وزارة الداخلية لا تتجاوز 1). خلايا Lysogenized يمكن تمييزها من خلال تقلص قابليتها للفج في فحص اللوحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)  Becton Dickinson  211825
Brain Heart Infusion (BHI) Becton Dickinson  211059
Nutrient Broth No. 2 Oxoid CM0067
Sheep blood agar Eiken Chemical Co.,Ltd. E-MR96 Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. 
Agar powder Wako Pure Chemical Industries 010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) Wako Pure Chemical Industries 191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter Merck Milipore HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit QIAGEN 12243

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lindsay, J. A. Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus. IJMM. 300, 98-103 (2010).
  2. Morikawa, K., et al. Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).
  3. Caryl, J. A., O'Neill, A. J. Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci. Plasmid. 62, 35-38 (2009).
  4. Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).
  5. Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell. 144, 590-600 (2011).
  6. Dubey, G. P., et al. Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes. Dev cell. 36, 453-461 (2016).
  7. Cafini, F., et al. Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance. J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).
  8. Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures. Lancet. 1, 835-838 (1966).
  9. Kuroda, M., et al. Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 357, 1225-1240 (2001).
  10. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322, 1843-1845 (2008).
  11. Clinical Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically - Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. CLSI. Wayne, PA, USA. (2006).
  12. Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction. BioTechniques. 26, 892-894 (1999).
  13. Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus. J. Antibiot. (2015).
  14. Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).
  15. Ando, T., et al. Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer. Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).
  16. Evans, B. A., Rozen, D. E. Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae. ISME J. 7, 791-799 (2013).
  17. Wilson, D. L., et al. Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture. Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).
  18. McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated. Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).
  19. Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer. IJMM. 304, 103-109 (2014).
  20. Uchiyama, J., et al. Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage. ISME J. 8, 1949-1952 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats