方法基因水平转移的研究
1Division of Biomedical Science, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 2Department of Basic Biomedical Science, Universidad Europea de Madrid, 3Human Biology Program, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba, 4Laboratory of Nosocomial Infections, Department of Bacteriology, Centro Nacional de MicrobiologÍa, Instituto de Salud Carlos III, 5Division of Microbiology, Department of Medicine, School of Medicine, Universidad Complutense, 6Biology of Gram-Positive Pathogens, Department of Microbiology, Institut Pasteur, Paris, France, 7ERL3526, CNRS, Paris, France
* These authors contributed equally

Published 3/10/2017
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Immunology and Infection

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Summary

我们在这里描述了用于在金黄色葡萄球菌接合,转导,和自然转化的体外研究三种不同的协议

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Cafini, F., Thi Le Thuy, N., Román, F., Prieto, J., Dubrac, S., Msadek, T., et al. Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55087, doi:10.3791/55087 (2017).

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Abstract

主要的机会人类病原体葡萄球菌的一个重要特点是其非凡的快速获得耐药性的能力。基因组学研究表明, 金黄色葡萄球菌携带位于移动遗传元件许多毒力和抗性基因,这表明水平基因转移(HGT)起着金黄色葡萄球菌发展的关键作用。然而,用于研究HGT在金黄色葡萄球菌仍然缺乏,特别是关于天然转化,这已在该细菌最近报道的方法的一个完整和详尽的描述。这部作品描述了三个协议,它们对金黄色葡萄球菌的HGT 体外调查有用:结合,噬菌体转导和自然转化。为了这个目标,CFR基因(氯霉素/氟苯尼考电阻),赋予了Phenicols,林可酰胺类,恶唑烷酮,截短侧耳素和链阳性菌素A(PhLOPSA)-resistance表型,使用。理解,通过该金黄色葡萄球菌的遗传物质转移给其它菌株的机制是理解的快速采集电阻的必要,有助于澄清报告监视计划或以进一步预测在未来的扩展模式传播的模式。

Introduction

金黄色葡萄球菌是一种共生革兰氏阳性菌天然栖息人类和动物的皮肤和鼻腔。此细菌种类是在医院和医疗机构的医院感染的主要原因。此外,它的发展到不同抗微生物化合物抗性的能力已取得由这种细菌引起成全球关注的感染的管理。

参与性表型的扩散两个主要途径是已知的:抗性基因型的克隆传播和遗传因素的细菌池之间的传播。在金黄色葡萄球菌 ,不同的抗生素抗性基因(以及毒力决定)的情况下,已发现与移动遗传元件(MGEs)相关联的1。金黄色葡萄球菌的基因组中这些元素的存在表明根的采集和传输细菌群体内客位材料可以发挥对金黄色葡萄球菌的适应和发展的重要作用。

转化,接合和转导噬菌体:遗传物质可通过HGT三个众所周知的机制在革兰氏阳性菌进行交换。变换涉及游离DNA的摄取。为了获得外源DNA,细菌细胞需要制定一个特殊的生理阶段:竞争力的阶段。当达到这个阶段,感受态细胞是能够传输的DNA进入细胞质,获得新的遗传决定的。在金黄色葡萄球菌的情况下,自然转化的存在最近已经证明2。本着这一精神,我们小组已经阐明的叹息因子的表达在发展的能力阶段,其组成型表达如何呈现能够reachin的金黄色葡萄球菌的相关性(一个神秘的二次转录σ因子)克竞争力的阶段,这允许通过自然转化2收购耐药表型的。

缀合是涉及从一个活细胞(供体)到另一种(受体)DNA的传输的处理。两个小区必须是直接接触,从而允许同时通过特殊的结构,如管或孔被保护要交换的DNA中。的DNA通过该方法转移需要接合机械。在金黄色葡萄球菌 ,原型接合质粒是PGO1,它怀有接合操纵TRAA 3。

噬菌体转导涉及DNA的细胞通过噬菌体感染转移到细胞并意味着细菌DNA的包装,而不是病毒DNA,进噬菌体衣壳。大多数金黄色葡萄球菌分离株被噬菌体1溶源化。在应力条件下,原噬菌体可以从细菌染色体组中切除e和移到裂解周期。

这些是在金黄色葡萄球菌的DNA传输三种公知的机制。还有一些附加的传输机制,例如“伪转变”2和致病岛4的转移噬菌体样系统。最近,一组报道,“纳米管”是参与细胞材料(包括质粒DNA)的相邻小区5,6之间的转移,但后续的研究还没有从其他组出现为止。

这项工作提供了必要的方法,通过解决三个主要途径转移研究HGT在金黄色葡萄球菌 :接合,转导和自然转化。用这些方法所获得的结果被用来研究之间的CFR的基因的发送(氯霉素/氟苯尼考电阻)金黄色葡萄球菌菌株7。这三种技术是MGE传输的金黄色葡萄球菌的调查多用途工具。

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Protocol

注:在这项工作中使用的菌株和材料示于表1分别列出与材料的表 。在传输实验,N315和COL CFR的阳性衍生物被用作CFR的基因的供体(N315-45和COL-45)。这些菌株先前由缀合得到的,用作为供体的临床CFR的阳性金黄色表皮应变(ST2),按照标准缀合协议(见下面)。这株窝藏在pSCFS7般的质粒7 CFR基因。

1.共轭使用滤波器交配方法

注意:一个金黄色葡萄球菌 N315菌株携带CFR的基因(N315-45)7(厘米R)被用作供体。 COL 8或Mu50 9株(四环素R,厘米S)被用作收件人。双-抗性菌落(四环素R,厘米R)能够以32毫克/氯霉素加8毫克L存在下生长/ L四环素被视为推定转导和分析通过菌落PCR来确定CFR的存在,并确定收件人易感性。

  1. 以下先前描述的方案10提供了一些修改执行偶联:
    1. 制备5毫升的胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基(有和没有32毫克/升氯霉素,分别)供体和受体的过夜培养物,在37℃振荡。
    2. 通过使用新鲜TSB培养基调整过夜培养物以1(OD 600 = 1.0)的光密度(OD 600)。混合0.5mL的供体培养物(N315-45)的用0.5mL收件人培养的(COL或Mu50)。 1ml的PBS添加到混合物中。
    3. 细菌的混合物转移到0.45μm的滤膜USI纳克真空泵系统。
    4. 把滤膜上的绵羊血琼脂平板上。孵育在37℃下1天。
      注:在这一步骤,富集介质是必要的,以允许抗双细胞的生长。
    5. 从板中取出滤膜并在10ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)的暂停。涡流以及收集附着在膜上的所有细菌。
    6. 通过使用新鲜的TSB使细菌悬浮液的连续10倍稀释。板100微升上的TSB琼脂0-10 -4稀释的样品(TSA)平板上补充有32毫克/升氯霉素和8毫克/升四环素为转导的选择。板100微升稀释悬浮液(10 -5 -10 -6)到TSA平板单独用8毫克/升四环素的计数收件人的总数。孵育所述板在37℃下18-24小时。
    7. 对于比照的存在分析抗性双菌落(推定的转导结合体)菌落PCR 7和敏感性图(抗菌谱)R基因。
    8. 通过根据标准微量稀释法或纸片法11测定的适当的抗生素的最低抑菌浓度(MIC)测定抗菌素谱。在转导的易感性必须与接受者,除了氯霉素(和受CFR基因其他化合物)。这个决定是必要的,以排除由供体菌株开发的四环素抗性。

2.噬菌体转

注:属于长尾噬菌体科家族(实验室股票)噬菌体MR83a在转导实验中使用。 N315-45用作噬菌体感染的CFR的供体。 N315,COL,或Mu50菌株用作收件人。 CFR的收购是由AB确定受体菌株的ility在32毫克/升氯霉素的存在下生长。菌落在此条件下生长进行了分析,以确定CFR的存在(通过菌落PCR),并确定易感性排除潜在的污染。

  1. 捐助噬菌体放大
    1. 在5毫升营养肉汤中于37℃补充有3.6毫米的Ca 2+(NBCaCl 2)振荡(180转)制备N315-45的过夜培养。
      注:钙需要噬菌体感染。请参阅材料表 。从其他公司的营养肉汤可能具有问题,如钙沉淀。
    2. 在10mL NBCaCl 2的在50毫升玻璃烧瓶或玻璃小瓶,最终体积1000:通过稀释过夜培养1准备传代培养。振荡(180转)生长1小时的细菌在37℃。
    3. 准备一系列的稀释噬菌体MR83a在NBCaCl 2 MEDI微米(10 -2,10 -3,10 -4,10 -5和10 -6)。加入20μl的稀释噬菌体到细菌培养。还制备无噬菌体感染的控制培养,其用作细菌细胞生长的阳性对照,可以被用来确定第二天噬菌体滴度。
    4. 生长的培养物在过夜37℃温和振荡(100rpm)下。
      注:细胞会生长到一定程度时,感染的噬菌体是不超过;然后,他们将进入裂解阶段由于通过裂解周期噬菌体扩增。无噬菌体的文化将完全显示的增长,而噬菌体的文化会呈现不同的透明度率。
    5. 选择与添加的噬菌体的最高稀释一种或两种清零培养瓶中。
    6. 转移培养到15ml离心管中。加入250微升的氯仿和反相管调匀。
    7. 离心管在5000
    8. 转移上清液至新管,并将它们在4℃下储存直到使用。
      注:噬菌体是稳定至少几个月,但存储噬菌体制备太久降低了效价和转导效率。
  2. 测量噬菌体滴度(噬菌体斑块检测)
    1. 制备营养肉汤琼脂(1.5%琼脂)培养基;保持水浴在55℃的温水。蒸压的0.5M的CaCl 2溶液在培养基中加入了3.6毫摩尔的最终浓度。倒入90毫米培养皿(NBCaCl )。
    2. 准备N315的过夜培养在37℃5毫升NBCaCl 2的振荡;这可以用上述对照培养(步骤2.1.3)取代。
    3. 添加10微升过夜培养物于200微升NBCaCl 2和均匀分布其上NBCaCl 2板。停止扩频时的表面板覆盖有液体。让板干燥。
    4. 使用NBCaCl 2介质中预先准备的噬菌体(步骤2.1.8)的使串行1:10稀释(10 -5 -10 -10)。
    5. 现货3微升每个稀释度噬菌体覆盖上细菌的板块。
    6. 过夜孵育所述板在30℃。
    7. 计数噬斑数量,并使用下列公式计算噬菌体滴度:空斑形成单位(PFU)/ ml的=斑块数×稀释因子/斑体积(3×10 -3毫升)
  3. 噬菌体转
    注:在上一步(2.1.8)中制备的噬菌体池用于测试CFR基因转导到金黄色葡萄球菌菌株。在该实验中,菌株N315,COL,或Mu50用作收件人。
    1. 振荡(180转)制备N315,COL,或Mu50的5ml NBCaCl 2的过夜培养物在37℃。
    2. 稀释ŧ他NBCaCl 2噬菌体〜10 9 PFU /毫升。
    3. 在50ml玻璃小瓶中,混合500微升过夜培养物,将500μl新鲜NBCaCl 2,和1ml噬菌体(〜10 9 PFU / ml)的;感染的预期复数(MOI)不能在37℃超过1孵育的混合物轻轻摇动(100rpm)下进行30分钟。
      注:热处理受体细胞之前,为了在加入噬菌体(52℃,2分钟以灭活内源性限制性内切酶)可以提高效率12。
    4. 加入50微升20%的Na 3 -Citrate的。继续轻柔在37℃振荡30分钟。
      注:na 3 -Citrate作为钙的中等螯合剂。
    5. 制备熔融脑心脏浸液(BHI)琼脂(1.5%琼脂)培养基,并保持它在水浴在55℃。
    6. 细菌噬菌体混合物转移到100毫升烧瓶中,加入50毫升温的BHI琼脂补充有32毫克/升chloramphenicol,拌匀。将混合物倒入90 25mm培养皿。
      注意:此方法使少数生长的菌落(假定的转导)的检测。
    7. 孵育在37℃的板24-48小时。
    8. 由殖民地转移到补充32毫克/升氯霉素新的BHI琼脂平板上进一步测试阻力所产生的殖民地(转导)。确认CFR基因的菌落PCR 7的存在。

3.自然变换

注:在金黄色葡萄球菌的天然转化测定以下在我们以前的研究2中记载的方法进行。的N315衍生物,N2-2.1 2,7,被用来作为收件人。在这株, 感叹轨迹被复制,从而组成性表达的叹息2。对于DET关于如何隔离感叹表达能力的变种ailed程序,请参见以前的说明2。如果要传输的抗性标记不氯霉素,PRIT叹息(厘米R)可以用来表达感叹,如前面所述的2。纯化的质粒或从CFR的整个DNA的提取-acquired 金葡菌 COL-45 7被用作供体DNA进行转化。

  1. 供体DNA的制备
    1. 培育COL-45过夜在含有50毫升TSB的一个300ml的烧瓶中,在37℃振荡补充有32毫克/升氯霉素。文化的大肠杆菌 HST04携带pHY300 质粒(四环素 R)的提取为对照实验的质粒。
      注:HST04( - / DCM - )缺乏DNA甲基化酶基因13。用DNA甲基化酶其它常规菌株也可以是使用d,来制备DNA供体,因为DNA甲基化状态不影响转化效率。或者,从金黄色葡萄球菌 COL菌株纯化pT181的质粒也可以用作用于转化测定法2的阳性对照。
    2. 通过离心(在4℃下8000×g离心 10分钟)收集细胞。
    3. 提取使用质粒DNA提取试剂盒或常规DNA纯化方法以纯化整个DNA的质粒。
    4. 通过光谱仪定量纯化的DNA,并保持它在4℃下直到使用。
      注:使用的转化实验,通常不到一周龄一个新的DNA提取。古DNA制剂降低转化效率。
  2. 转化试验
    1. 文化受体细胞(N2-2.1)隔夜在5毫升TSB在37℃振荡。
    2. 转移0.5过夜培养毫升到1.5毫升管中。 Precipi通过离心(在4℃万xg离心 1分钟)优化射孔细胞。
    3. 悬浮细胞用10mL CS2介质的在50毫升管中。
      注:CS2介质是诱导能力为金黄色葡萄球菌 2天然转化(见材料表培养基组成)一个完整的合成培养基。其它标准实验室培养基,如TSB或BHI,不适合用于转化2,13。
    4. 生长于37℃的细菌以摇动(180转)直到晚指数期(约8小时)。
    5. 通过离心(在4℃下5000×g离心 5分钟)收获细胞。
    6. 悬浮细胞在10毫升新鲜CS2介质。
    7. 添加纯化的质粒或基因组DNA(步骤3.1.4)的10微克到细胞悬浮液。摇动在37℃和180rpm下2.5小时。
      注:潜伏期较短时间与DNA(<2.5小时),导致较低的TRANSFormation频率。
    8. 通过离心(5,000×g离心 5分钟,4℃)收集细胞。
    9. 悬浮细胞在10毫升BHI培养基的。混合细胞悬浮液用90毫升熔融BHI琼脂(55℃)的补充有32毫克/升氯霉素(在对照实验或5毫克/升四环素)。将混合物倒入90 25mm培养皿。迅速冷静,让琼脂凝固。
    10. 孵育在37℃下将板2天。
    11. 通过转移殖民地(使用牙签),以包含适当的抗生素,以确认其阻力特性的新BHI琼脂平板上复制产生的殖民地(转化)。确认所获取的抗性基因(CFRtetM)通过菌落PCR 7。

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Representative Results

这里所代表的结果已经公布以前(改编自基准7与出版商的许可)。我们研究的CFR的基因,这会导致低级别利奈唑胺抗性和PhLOPSA-抗性表型14,15的中金黄色葡萄球菌菌株的表达,潜在传输通路通过调查HGT的三种机制。

图1示出了在接合试验获得的结果。缀合协议是种间传输(A)中以及帧内物种传输(B)中是有用的,使用相同的共轭矢量在不同的接合供体给予类似的结果。缀合的效率被计算为转导的Nº(菌落形成单位,或CFU / ml)的受体细胞/Nº(CFU / ml)的。所获得的频率范围从1×10 -6至1×10 -5,在使用表皮葡萄球菌金黄色葡萄球菌作为供体相似的值。

结果总结于表2 CFR的 -acquired 金黄色葡萄球菌能够进一步通过缀合以及通过噬菌体转导的CFR的基因转移到其它金黄色葡萄球菌菌株。然而,结果表明没有用于CFR的透射自然转化的,虽然它是为一个不同抗性标记(在pHY300质粒tetM基因)进行检测。

图1
图1: 在接合试验获得收件人和转导的CFU的表示。清晰的条代表后分离总受体菌株培养18-24小时选择性媒体受体菌株。填充的条代表后选择性培养基培养18-24小时的转导菌株获得总双重耐药株。 ( )种间共轭法。 表皮葡萄球菌 (SE45)用作CFR的供体,和金黄色葡萄球菌 N315株被用作收件人。该N315-45转导应变窝藏插在pSCFS7般的质粒基因CFR。这个菌株被用作CFR中的MRSA对MRSA的传输测定的来源。 (B)中的MRSA对MRSA的接合实验。先前获得的N315-45用作供体和COL或Mu50菌株用作收件人。两个独立实验的平均值示与标准偏差(SD)。 请点击此处查看大图版本这个数字。

应变名 描述 参考源
细菌菌株
SE45 临床isolatated 表皮葡萄球菌 7
N315 预MRSA,卡那霉素,ErmR 9
COL 在pT181质粒MRSA,携带四环素抗性基因 8
Mu50 MRSA,VISA 9
N315-45 N315的衍生,携带CFR基因通过结合从表皮葡萄球菌获得pSCFS7般的质粒 7
COL-45 ðCOL的erivative,携带CFR基因通过结合从表皮葡萄球菌获得pSCFS7般的质粒 7
RN4220-45 RN4220的衍生,携带CFR基因通过结合从表皮葡萄球菌获得pSCFS7般的质粒 7
N2-2.1 从叹衍生N315活动单元格,允许转化细胞的自然能力 7
大肠杆菌 HST04 损坏 / DCM-pHY300 大肠杆菌 HST04 损坏 / DCM-(宝)携带四环素抗性质粒pHY300 11
噬菌体
MR83a 长尾噬菌体科家庭实验室股票
MR83-45 噬菌体MR83a包装携带CFR基因侵染后pSCFS7般的质粒离子进入N315-45 这项研究

表1: 在这项工作中使用的菌株的列表。

HTG 捐赠者 接受者 频率
共轭 N315-45 COL 1.00×10 -6
N315-45 MU50 1.29×10 -5
转导 N315-45 COL 1.00×10 -11
N315-45 MU50 3.68×10 -10
N315-45 N315 6.88×10 -10
转型 质粒(COL-45) N2-2.1 ULD
整体的DNA(COL-45) N2-2.1 ULD
pHY300(对照组) N2-2.1 6.52×10 -10

表2: 在MRSA对MRSA的实验获得 CFR的 基因传输 的HTG频率 使用N315 CFR阳性衍生物(N315-45)作为供体接合传输进行了评估。传输的在这些实验中的频率被表达为转导/受体细胞的Nº。使用转导噬菌体MR83a,从N315-45菌株扩增转导进行评价。转导频率计算为转导/ pfu的的Nº。 Transfor息检测均采用纯化DNA(质粒或整个细胞DNA)作为供体进行。转化频率被计算为转化体/受体细胞的数量。 ULD:下限值检测。

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Discussion

这个工作描述来研究的金黄色葡萄球菌的遗传决定的HGT三大方法。虽然转导,接合已经研究了数十年,自然转化的存在是最近才认可2。因此, 金黄色葡萄球菌配备所有HGT的三个主要模式的,和测试他们都需要澄清遗传决定的可能的传播途径。这项工作的目的是编制完成协议,并提供在以前发表的著作7采用的方法的实用信息。虽然共轭和转导协议可用,这是其中一个详细的转化方案描述第一纸张

使用滤波器交配方法缀合是一个简单的技术,可应用于不同的细菌物种接合转移的研究=“外部参照”> 7,10。通过使用标准化的接种,收件人计数后18-24小时达到〜10 9 CFU / mL的价值。转导数是可变的,并且值显示强应变对应变的依赖性,但通常,当共轭的结果呈阳性,得到10 2至10 5转导结合体的范围。使用这里提供的协议,检测所取得的限<10转导/毫升。这个限制可以通过浓缩过滤悬浮液进行优化。

这里所描述的自然转化协议,成立于金黄色葡萄球菌 N315-衍生株。使用CS 2介质的是用于转化的关键,因为变换是在其它标准实验室媒体,如TSB和BHI 13检测不到。

利用长期存储的质粒(例如,pT181和pHY300)作为供体导致约 10至50倍降低的频率(数据未显示),表明DNA质量可能影响转化频率。已知的是有缺口的质粒不适合在枯草杆菌 16天然转化

来自金黄色葡萄球菌大肠杆菌既获得的DNA可以用作在天然转化试验中供体,这表明限制阻挡不抑制天然转化。我们还观察到来自大肠杆菌 HST04制备的DNA之间是相同的转化频率( - / DCM - )缺乏所述DNA甲基化酶基因和来自JM109,支持的想法,甲基化状态不影响转化频率。

应当注意的是,通过使用该协议检测出的转化频率是低的(〜10 -9 -10 -10),和可变形的菌株被限制为N315衍生物类=“外部参照”> 2。它很可能是金黄色葡萄球菌的转化效率可以是菌株特异性的,如也已在其它可变形菌15,16,17报道。进一步研究,可在提高转化效率的进展;这将在别处描述。

噬菌体转导似乎是在金黄色葡萄球菌的最普遍的HGT机制,因为大多数金黄色葡萄球菌分离株被噬菌体18溶源化。传感噬菌体的感染能力取决于宿主易感性,需要通过噬菌斑测定法进行检查。噬菌体转导的另一个限制是该DNA的大小。小的DNA可以有效地传输,但DNA片段大于45 kb的不能在葡萄球菌噬菌体头19进行包装。然而,一种新型的巨葡萄球菌噬菌体最近bEEN与环境隔离,并且itcould可以想象能够传送大的DNA片段20。

在这项工作中所描述的噬斑分析方法比传统的协议,在使用顶琼脂容易。然而,本方法要求细菌细胞,以便检测该表面上产生微小的斑块中均匀分布。以实现在琼脂表面上的细菌悬浮液的完全甚至蔓延,我们建议扩频足够量,停止时的液体均匀地覆盖在琼脂表面。然后,干燥的空气流动将板在清洁台上。如果有必要,以避免转导噬菌体的溶原化,建议感染的低复数(感染复数不应超过1)。溶源化的细胞可以通过减弱易感性的噬菌斑测定来区分噬菌体。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)  Becton Dickinson  211825
Brain Heart Infusion (BHI) Becton Dickinson  211059
Nutrient Broth No. 2 Oxoid CM0067
Sheep blood agar Eiken Chemical Co.,Ltd. E-MR96 Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. 
Agar powder Wako Pure Chemical Industries 010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) Wako Pure Chemical Industries 191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter Merck Milipore HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit QIAGEN 12243

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References

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