Metodik för studier av horisontell genöverföring i
1Division of Biomedical Science, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 2Department of Basic Biomedical Science, Universidad Europea de Madrid, 3Human Biology Program, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba, 4Laboratory of Nosocomial Infections, Department of Bacteriology, Centro Nacional de MicrobiologÍa, Instituto de Salud Carlos III, 5Division of Microbiology, Department of Medicine, School of Medicine, Universidad Complutense, 6Biology of Gram-Positive Pathogens, Department of Microbiology, Institut Pasteur, Paris, France, 7ERL3526, CNRS, Paris, France
* These authors contributed equally

Published 3/10/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Vi beskriver här tre olika protokoll för undersökning in vitro av konjugation, transduktion, och naturlig transformation i Staphylococcus aureus.

Cite this Article

Copy Citation

Cafini, F., Thi Le Thuy, N., Román, F., Prieto, J., Dubrac, S., Msadek, T., et al. Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55087, doi:10.3791/55087 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En viktig egenskap hos den huvudsakliga opportunistiska human patogen Staphylococcus aureus är dess extraordinära förmåga att snabbt erhålla resistens mot antibiotika. Iska studier visar att S. aureus bär många virulens och resistensgener som finns i mobila genetiska element, vilket tyder på att horisontell genöverföring (HGT) spelar en avgörande roll i S. aureus evolution. Men en fullständig och detaljerad beskrivning av den metod som används för att studera HGT i S. aureus saknas fortfarande, särskilt när det gäller naturlig transformation, som nyligen har rapporterats i denna bakterie. Detta arbete beskriver tre protokoll som är användbara för in vitro undersökning av HGT i S. aureus konjugation, fagtransduktion och naturlig transformation. För detta ändamål, CFR-genen (kloramfenikol / florfenikol motstånd), vilket ger de fenikoler, Linkosamider, oxazolidinoner, pleuromutiliner, och streptogramin A (PhLOPSA) resistensgen fenotyp, användes. Att förstå de mekanismer genom vilka S. aureus överför genetiskt material till andra stammar är viktigt att förstå den snabba förvärv av motstånd och hjälper till att klargöra lägen för spridning redovisas i övervakningsprogram eller ytterligare förutsäga spridningsmoden i framtiden.

Introduction

Staphylococcus aureus är en kommensala grampositiv bakterie som naturligt bebor huden och näshålan hos människor och djur. Denna bakteriearter är den vanligaste orsaken till nosokomiala infektioner i sjukhus och vårdmiljöer. Dessutom har dess förmåga att utveckla resistens mot olika antimikrobiella föreningar gjorde förvaltning av infektioner orsakade av denna bakterie i en global angelägenhet.

Två huvudvägar som är involverade i spridningen av motstånds fenotyper är kända: den klonala spridningen av resistenta genotyper och spridning av genetiska faktorer bland bakterie poolen. I fallet med S. aureus, olika antibiotikaresistensgener (liksom virulensdeterminanter) har befunnits vara associerade med mobila genetiska element (MGEs) 1. Förekomsten av dessa element i genomet hos S. aureus indikerar att förvärv och överlåtelse av genetic material inuti bakteriepopulation skulle kunna spela en viktig roll för S. aureus anpassning och evolution.

Genetiskt material kan bytas genom tre välkända mekanismer för HGT i grampositiva bakterier: transformation, konjugation och fagtransduktion. Transformation innebär upptag av fritt DNA. Att förvärva främmande DNA, bakterieceller behöver utveckla en speciell fysiologisk fas: kompetensstadiet. När detta steg har nåtts, kompetenta celler har förmåga att transportera DNA in i cytoplasman, förvärva nya genetiska determinanter. I fallet med S. aureus, har förekomsten av naturlig transformation nyligen demonstrerats 2. I linje med detta har vår grupp belysa betydelsen av uttrycket av Suck faktorn (ett kryptiskt sekundär transkriptions sigma faktor) i kompetensutvecklingsstadium och om hur dess konstitutivt uttryck gör S. aureus kan reaching kompetensstadiet, vilket gör det möjligt för förvärv av resistenta fenotyper genom naturlig transformation 2.

Konjugering är en process som involverar överföring av DNA från en levande cell (donator) till en annan (mottagaren). Båda cellerna måste vara i direkt kontakt, så att det DNA som skall utbytas under det att den skyddas av särskilda strukturer, såsom rör eller porer. Överföring av DNA genom denna metod kräver den konjugativ maskiner. I S. aureus, är prototypen konjugativa plasmiden PGO1, som härbärgerar konjugativ operon Traa 3.

Fagtransduktion innebär överföring av DNA från cell till cell genom bakteriofag infektion och innebär förpackning av bakterie-DNA, i stället för viralt DNA, in i fag-kapsiden. De flesta av S. aureus isolat lysogenized av bakteriofager 1. Vid stressförhållanden, kan profager skäras ut från den bakteriella GENOMe och övergång till den lytiska cykeln.

Dessa är de tre väl kända mekanismer för DNA-överföring i S. aureus. Det finns några ytterligare överföringsmekanismer, såsom "pseudo-transformation" 2 och fag-liknande system i överföringen av patogenicitet öar 4. Nyligen en grupp rapporterade att "nanorör" är involverade i överföringen av cellulära material (inklusive plasmid DNA) mellan angränsande celler 5, 6, men en uppföljningsstudie har inte framgått av andra grupper hittills.

Detta arbete ger den nödvändiga metoden för att studera HGT i S. aureus ta itu med de tre viktigaste överföringsvägar konjugation, transduktion, och naturlig omvandling. De erhållna resultaten med dessa metoder användes för att studera överföringen av den gemensamma referensramen genen (kloramfenikol / florfenikol motstånd) blandS. aureus stammar 7. Dessa tre tekniker är mångsidiga verktyg för undersökning av MGE överföring i S. aureus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: De stammar och material som används i detta arbete är förtecknade i tabell 1 och tabell of Materials, respektive. I transmissions experiment N315 och KOL CFR -positiva derivat som används som givare av CFR genen (N315-45 och COL-45). Dessa stammar har tidigare erhållits genom konjugering, använder som donatorn en klinisk CFR -positivt Staphylococcus epidermidis stam (ST2), följer standarden konjugering protokoll (se nedan). Denna stam hyste CFR-genen på en pSCFS7 liknande plasmid 7.

1. Konjugering Användning av filterpassande Metod

OBS: Ett S. aureus N315-stammen som bär den cfr genen (N315-45) 7 (Cm ^) användes som donator. COL 8 eller Mu50 9 stammar (Tet R, Cm S) användes som mottagare. Dubbel-resistenta kolonier (Tet R, Cm ^) med förmåga att växa i närvaro av 32 mg / L av kloramfenikol plus 8 mg / L tetracyklin betraktades som förmodade transkonjuganter och analyserades för att bestämma närvaron av cfr genom koloni-PCR och för att bestämma den mottagare känslighet profil.

  1. Utför konjugering efter en tidigare beskrivna protokollet 10 med några ändringar:
    1. Förbereda 5 ml övernattskultur av givare och mottagare i tryptisk sojabuljong (TSB) medium (med och utan 32 mg / L kloramfenikol, respektive), med skakning vid 37 ° C.
    2. Justera den optiska densiteten (OD 600) av de övernattskulturer till en (OD 600 = 1,0) genom användning av färsk TSB-medium. Blanda 0,5 ml av givar kultur (N315-45) med 0,5 ml av mottagarens kultur (KOL eller Mu50). Tillsätt 1 ml PBS till blandningen.
    3. Överför blandningen av bakterier på ett 0,45 pm filter membran USIng ett vakuumpumpsystem.
    4. Sätta filtermembranen på ett får blodagarplatta. Inkubera vid 37 ° C under en dag.
      OBS: I detta steg, som är nödvändigt berikat medium för att tillåta tillväxt av dubbelresistenta celler.
    5. Ta ut filtermembranet från plattan och suspendera i 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Vortex väl att samla alla bakterier fästa på membranet.
    6. Göra en seriell 10-faldig utspädning av den bakteriella suspensionen genom användning av färsk TSB. Plattan 100 | il av de 0-10 -4 utspädda proven på TSB-agar (TSA) -plattor kompletterade med 32 mg / L kloramfenikol och 8 mg / L tetracyklin för urvalet av transkonjuganter. Plattan 100 | il av den utspädda suspensionen (10 -5 -10 -6) på TSA-plattor med enbart 8 mg / L tetracyklin för att räkna det totala antalet mottagare. Inkubera plattorna vid 37 ° C under 18-24 h.
    7. Analysera dubbelresistenta kolonier (förmodade transkonjuganter) för närvaron av CFr genen genom koloni-PCR 7 och deras mottaglighet profiler (antibiogram).
    8. Bestämma antibiogram genom att mäta den minimala inhibitoriska koncentrationen (MIC) av lämpliga antibiotika enligt standarden mikroutspädningsmetoden eller disk diffusionsmetod 11. Känsligheten profil av transkonjuganter måste vara identisk med mottagaren, med undantag för kloramfenikol (och andra föreningar som berörs av den gemensamma referensramen genen). Denna bestämning är nödvändig för att utesluta tetracyklinresistens utvecklats av donatorstam.

2. fagtransduktion

OBS: bakteriofag MR83a tillhör Siphoviridae familjen (laboratorie stock) användes i transduktionen experiment. N315-45 användes som jfr givare för fag-infektion. N315, COL, eller Mu50 stammar användes som mottagarna. Förvärvet av cfr bestämdes genom abbilitet av mottagande stammen att växa i närvaro av 32 mg / L kloramfenikol. Kolonier som växer under detta förhållande analyserades för att bestämma närvaron av cfr (genom koloni-PCR) och för att bestämma känsligheten profil för att utesluta eventuella föroreningar.

  1. Fag förstärkning på givaren
    1. Förbereda en över natten kultur av N315-45 i 5 ml näringsbuljong som kompletterats med 3,6 mM Ca 2 + (NBCaCl 2) vid 37 ° C med skakning (180 rpm).
      OBS: Kalcium krävs för faginfektion. Se Material tabell. Näringslösning från andra företag kan ha problem, såsom kalcium utfällning.
    2. Förbereda subkulturer genom spädning av övernattskultur 1: 1000 i en slutlig volym av 10 ml NBCaCl 2 i 50 ml glasflaskor eller glasflaskor. Växer bakterierna under 1 timme vid 37 ° C med skakning (180 rpm).
    3. Bered en serie utspädd fag MR83a i NBCaCl 2 medium (10 -2, 10 -3, 10 -4, 10 -5 och 10 -6). Tillsätt 20 pl av den utspädda fagen i bakteriekulturen. förbereder också en kontrollkultur utan faginfektion, som tjänar som den positiva kontrollen för bakteriecelltillväxt och kan användas för att bestämma den fag-titer nästa dag.
    4. Växer kulturerna vid 37 ° C med försiktig skakning (100 rpm) över natten.
      OBS: Cellerna kommer att växa i viss utsträckning när den infekterande fagen inte är i överskott; då kommer de in i lys fas på grund av fag förstärkning genom lytiska cykeln. Kulturen utan fag kommer att visa full tillväxt, medan kulturer med fag kommer att visa olika priser om öppenhet.
    5. Välja en eller två clearas odlingsflaskor med den högsta utspädningen av det tillsatta fagen.
    6. Överföra kulturer i 15 ml centrifugrör. Lägg 250 ul kloroform och blanda väl genom att vända rören.
    7. Centrifugera rören vid 5000
    8. Överföra supernatanterna till nya rör och förvara dem vid 4 ° C fram till användning.
      OBS: Fagen är stabil under åtminstone några månader, men lagra fagpreparation för länge minskar titer och transduktion effektivitet.
  2. Mätning av fag titer (fag plackanalys)
    1. Förbered näringsbuljong agar (agar 1,5%) medium; hålla den varm i ett vattenbad vid 55 ° C. Lägga autoklaverat 0,5 M CaCl2-lösning till mediet till en slutlig koncentration av 3,6 mM. Häll den i 90 mm petriskålar (NBCaCl 2 plattor).
    2. Förbereda en över natten kultur av N315 i 5 ml NBCaCl 2 vid 37 ° C med skakning; detta kan vara substituerad med kontrollkulturen som beskrivits ovan (steg 2.1.3).
    3. Tillsätt 10 pl av den övernattskultur i 200 pl NBCaCl 2 och jämnt den på NBCaCl två platta. Stoppa spridningen när ytan avatt plattan täcks med vätska. Låt plattan torka.
    4. Gör en seriespädning 1:10 (från 10 -5 -10 -10) av tidigare framställda fag (steg 2.1.8) med hjälp av NBCaCl 2 medium.
    5. Spot 3 pl av varje fag utspädning på plattan täckt med bakterier.
    6. Inkubera plattan över natten vid 30 ° C.
    7. Räkna placknummer och beräkna fag-titer med användning av följande ekvation: plackbildande enhet (pfu) / ml = Antal plack x utspädningsfaktor / spotted volym (3 x 10 -3 ml)
  3. fagtransduktion
    OBS: fagpool framställd i föregående steg (2.1.8) används för att testa transduktion av den cfr genen in i S. aureus-stammar. I detta experiment, stammarna N315, COL, eller Mu50 används som mottagarna.
    1. Förbereda övernattskultur av N315, COL, eller Mu50 i 5 ml NBCaCl 2 vid 37 ° C med skakning (180 rpm).
    2. Späd than fag i NBCaCl 2 till ~ 10 9 pfu / ml.
    3. I en 50 ml glasampull, blanda 500 | il av övernattskultur, 500 | il färskt NBCaCl 2, och 1 ml fag (~ 10 9 pfu / ml); den förväntade multiplicitet av infektion (MOI) får inte överstiga 1. Inkubera blandningen vid 37 ° C med försiktig skakning (100 rpm) under 30 min.
      OBS: Värmebehandling av mottagarceller strax före tillsatsen av fag (52 ° C under 2 min för att inaktivera de endogena restriktionsenzymer) kan öka effektiviteten 12.
    4. Tillsätt 50 pl av 20% Na 3 citrat. Fortsätta långsam skakning i 30 min vid 37 ° C.
      OBS: Na 3 citrat fungerar som en måttlig kelator av kalcium.
    5. Förbered smält hjärn-hjärtinfusion (BHI) agar (agar 1,5%) medium och hålla den i ett vattenbad vid 55 ° C.
    6. Överföra bakterien-fag blandningen till en 100 ml kolv, tillsätt 50 ml varmt BHI-agar kompletterad med 32 mg / L chloramphenicol och blanda väl. Häll blandningen i 90 mm petriskålar.
      OBS: Denna metod möjliggör detektering av ett litet antal växande kolonier (förmodade transduktanter).
    7. Inkubera plattan vid 37 ° C under 24-48 h.
    8. Ytterligare testa den genererade kolonier (transduktanter) för motstånd genom att överföra kolonier på nya BHI agarplattor kompletterade med 32 mg / L kloramfenikol. Bekräfta närvaron av den gemensamma referensramen genen genom koloni-PCR 7.

3. Naturliga Transformation

OBS: Den naturliga transformationstest i S. aureus utfördes genom att följa den metod som beskrivs i vår tidigare studie två. Den N315-derivatet, N2-2.1 2, 7, användes som mottagare. I denna stam, var suck lokus dupliceras så att konstitutivt uttrycker suck 2. for detailed anvisningar om hur du isolera suck-uttryckande kompetens varianter, se tidigare beskrivning 2. Om resistensmarkör som skall överföras inte är kloramfenikol, kan pRIT-suck (Cm ^) användas för att uttrycka suck, såsom beskrivits tidigare två. Renad plasmid eller hela DNA-extrakt från CFR -acquired S. aureus COL-45 7 används som donator-DNA för transformation.

  1. Framställning av donator DNA
    1. Odla COL-45 över natten med skakning vid 37 ° C i en 300 ml kolv innehållande 50 ml TSB kompletterad med 32 mg / L kloramfenikol. Kultur E. coli HST04 bärande pHY300 plasmiden (Tet ^) för att extrahera plasmid för kontrollförsöket.
      OBS: HST04 (dammen - / DCM -) saknar den DNA-metylas-generna 13. Andra konventionella stammar med DNA metylaser kan också vara brukd för att förbereda DNA-donator, på grund av att DNA-metylering tillståndet inte påverkar transformationseffektiviteten. Alternativt kan pT181 plasmid renas från S. aureus COL-stammen också användas som en positiv kontroll för transformationsanalys 2.
    2. Samla upp cellerna genom centrifugering (8000 xg i 10 minuter vid 4 ° C).
    3. Extrahera plasmider med användning av en plasmid DNA-extraktion kit eller en konventionell DNA-reningsmetod för att rena hela DNA.
    4. Kvantifiera det renade DNA genom spektrometer och hålla den vid 4 ° C fram till användning.
      OBS: Använd en ny DNA-preparat för transformationstest, vanligen mindre än en vecka gammal. Old DNA-beredningar minska effektiviteten av transformation.
  2. transformationstest
    1. Kultur mottagarcellen (N2-2.1) över natten i 5 ml TSB vid 37 ° C med skakning.
    2. Överför 0,5 ml av övernattskultur i ett 1,5 ml rör. Precipilätta cellerna genom centrifugering (10.000 xg i 1 min vid 4 ° C).
    3. Suspendera cellerna med 10 ml av CS2-medium i ett 50 ml rör.
      OBS: CS2 medium är en komplett syntetiskt medium som inducerar kompetens för naturlig transformation i S. aureus 2 (se mediet sammansättning i Material tabell). Andra vanliga laboratorie medier, såsom TSB eller BHI, är inte lämpliga för transformation 2, 13.
    4. Odla bakterier vid 37 ° C med skakning (180 rpm) tills den sena exponentiella fasen (ca 8 h).
    5. Skörda cellerna genom centrifugering (5000 x g under 5 min vid 4 ° C).
    6. Resuspendera cellerna i 10 ml färskt CS2 medium.
    7. Tillsätt 10 | j, g av renat plasmid eller genom-DNA (steg 3.1.4) till cellsuspensionen. Skaka vid 37 ° C och 180 rpm under 2,5 h.
      OBS: Kortare inkubationstider med DNA (<2,5 tim) resultera i lägre transformation frekvenser.
    8. Samla cellerna genom centrifugering (5000 x g under 5 min vid 4 ° C).
    9. Resuspendera cellerna i 10 ml av BHI-medium. Blanda cellsuspensionen med 90 ml smält BHI-agar (55 ° C) komplettera med 32 mg / L kloramfenikol (eller 5 mg / L tetracyklin i kontrollexperimentet). Häll blandningen i 90 mm petriskålar. Snabbt kyla och låta ägarn stelna.
    10. Inkubera plattorna vid 37 ° C i 2 dagar.
    11. Replikera genererade kolonier (transformanter) genom att överföra kolonierna (med tandpetare) till nya BHI agarplattor innehållande lämpliga antibiotika för att bekräfta deras motståndsegenskaper. Bekräfta den förvärvade resistensgenen (jfr eller tetM) genom koloni-PCR 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultaten representerade här har tidigare publicerats (anpassad från referens 7 med utgivarens tillstånd). Vi studerade den potentiella överföringsvägarna för cfr-genen, som orsakar låg nivå linezolid beständighet och uttrycket av PhLOPSA-resistens-fenotyp 14, 15 i S. aureus-stammar, genom att undersöka tre mekanismer av HGT.

Figur 1 visar resultaten som erhölls i konjugering analyser. Konjugering protokollet är användbar för överföring mellan arter (A) samt överföring inom arten (B), som ger liknande resultat genom att använda samma konjugativ vektor i olika konjugering donatorer. Effektiviteten för konjugering beräknas som Nº av transkonjuganter (kolonibildande enheter, eller CFU / ml) / Nº av mottagarceller (CFU / ml). De erhållna frekvenserna sträckte sig från 1 x 10 -6 till 1 x 10 -5, med liknande värden med S. epidermidis eller S. aureus som donator.

Resultaten är sammanfattade i tabell 2. cfr -acquired S. aureus kunde ytterligare överföra cfr genen till andra S. aureus-stammar genom konjugering liksom genom fagtransduktion. Men resultaten tyder på avsaknad av naturlig transformation för cfr överföring, även om det upptäcktes för en annan resistensmarkör (tetM genen på pHY300 plasmid).

Figur 1
Figur 1: Representation av mottagande och transconjugant CFU som erhållits i konjugering analyser. Den tydliga staplarna representerar de totala mottagande stammar som isolerats efter18-24 h av kultur i selektiva media för mottagande stammar. De fyllda staplarna representerar den totala dubbel resistenta stammar erhållna efter 18-24 timmar av kultur i selektiva media för transconjugant stammar. (A) mellan djurarter konjugativ analys. Staphylococcus epidermidis (SE45) användes som cfr donator, och Staphylococcus aureus N315-stammen användes som mottagare. Den N315-45 transconjugant stammen hyste CFR gen insatt i en pSCFS7 liknande plasmid. Denna stam användes såsom källa för cfr i transmissionsanalyser MRSA-to-MRSA. (B) MRSA-to-MRSA konjugering experiment. Den tidigare erhållna N315-45 användes som donator, och COL eller Mu50 stammar användes som mottagarna. Genomsnittsvärdena för två oberoende experiment visas med standardavvikelsen (SD). Klicka här för att se en störreversion av denna siffra.

stam namn Beskrivning referenskälla
bakterie~~POS=TRUNC stammar~~POS=HEADCOMP
SE45 Kliniska isolatated S. epidermidis 7
N315 pre-MRSA, KmR, ErmR 9
COL MRSA, bärande tetracyklinresistensgenen på pT181 plasmid 8
Mu50 MRSA, VISA 9
N315-45 derivat av N315, bärande jfr genen på en pSCFS7 liknande plasmiden erhållen från S. epidermidis genom konjugering 7
COL-45 derivative av KOL, bärande jfr genen på en pSCFS7 liknande plasmiden erhållen från S. epidermidis genom konjugering 7
RN4220-45 derivat av RN4220, bärande jfr genen på en pSCFS7 liknande plasmiden erhållen från S. epidermidis genom konjugering 7
N2-2.1 Suck aktiva cellen härrör från N315, vilket gör att cell naturlig kompetens för transformation 7
E. coli HST04 skador / dcm- pHY300 E. coli HST04 skador / dcm- (Takara) som bär tetracyklinresistens pHY300 plasmid 11
bakteriofager
MR83a Siphoviridae familjen laboratorie lager
MR83-45 fag MR83a packa en pSCFS7 liknande plasmid som bär jfr gen efter smittaion in N315-45 Den här studien

Tabell 1: Lista av stammar som används i detta arbete.

HTG Givare Mottagare Frekvens
Konjugation N315-45 COL 1,00 x 10 -6
N315-45 MU50 1,29 x 10 -5
transduktion N315-45 COL 1,00 x 10 -11
N315-45 MU50 3,68 x 10 -10
N315-45 N315 6,88 x 10 -10
Omvandling Plasmider (COL-45) N2-2.1 ULD
Hela DNA (COL-45) N2-2.1 ULD
pHY300 (kontroll) N2-2.1 6,52 x 10 -10

Tabell 2: HTG frekvenser i CFR gen transmission som i MRSA-to-MRSA experiment. Konjugativ överföring utvärderades med användning av N315 cfr -positiv derivatet (N315-45) som donator. Frekvensen för överföring i dessa experiment är uttryckt som den Nº av transkonjuganter / mottagarceller. Transduktion utvärderades med användning av transducerande fag MR83a, amplifierades från N315-45-stammen. Transduktion frekvensen beräknades som nº transduktanter / pfu. transformatortionsanalyser utfördes med användning av renat DNA (plasmid eller hela cellulärt DNA) som givare. Transformationsfrekvensen beräknades som antalet transformanter / mottagarceller. ULD: Under detektionsgränsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta arbete beskriver de tre stora metoder för att studera HGT av genetiska faktorer i S. aureus. Även överföring och konjugation har studerats i årtionden, förekomsten av naturliga transformation bara nyligen erkänts 2. Således är S. aureus utrustad med alla de tre stora typer av HGT och testa dem krävs för att klargöra de eventuella spridningsvägar genetiska faktorer. Syftet med detta arbete är att sammanställa fullständiga protokoll och ge praktisk information om de metoder som används i ett tidigare publicerat arbete 7. Även konjugering och överföringsprotokoll finns, är detta den första papper där en detaljerad transformationsprotokoll beskrivs.

Konjugering med hjälp av filter-parning metod är en enkel teknik och kan tillämpas på studier av konjugativ transfer i olika bakteriearter= "xref"> 7, 10. Genom att använda standardiserade inokulat, mottagare räknas efter 18-24 timmar att nå ett värde av ~ 10 9 CFU / ml. Transconjugant räknas är variabel, och värdena visar stark töj-till-stam beroende, men vanligtvis genomfördes en transconjugant område från 10 februari-10 MAJ erhålls när konjugeringen resultaten var positiva. Användning av det protokoll som ges här, var detektionsgränsen uppnås <10 transkonjuganter / ml. Denna gräns kan optimeras genom koncentrering av filter suspensionen.

Den naturliga transformationsprotokoll som beskrivs här ades i S. aureus N315-derivatstammar. Användningen av CS2 medium är kritisk för transformation, eftersom omvandlingen är omöjligt att spåra i andra standardlaboratorie medier, såsom TSB och BHI 13.

Användningen av långsiktiga lagrade plasmider (t.ex., pT181 och pHY300) som donatorn gav omkring en 10- till 50-faldig minskning av frekvensen (data visas ej), vilket tyder på att DNA-kvaliteten kan påverka transformationsfrekvens. Det är känt att nicked plasmider är inte lämpliga för naturlig transformation i B. subtilis 16.

DNA erhållet från både S. aureus och E. coli kan användas som donator i naturliga transformationsanalyser, vilket tyder på att ett restriktionsbarriär inte hämmar naturlig transformation. Vi observerade också samma transformationsfrekvensen mellan DNA framställt från E. coli HST04 (dammen - / DCM -) som saknar det DNA-metylas-generna och från JM109, som stöder idén att metyleringsstatus inte påverkar transformationsfrekvensen.

Det bör noteras att den transformationsfrekvensen detekteras genom användning av detta protokoll var låg (~ 10 -9 -10 -10), och de transformerbara stammar är begränsade till N315 derivatclass = "xref"> 2. Det är troligt att transformationseffektiviteten i S. aureus kan vara stamspecifika, vilket också har rapporterats i andra transformerbara bakterier 15, 16, 17. Ytterligare studier pågår för att förbättra transformationseffektiviteten; detta kommer att beskrivas på annat håll.

Fagtransduktion verkar vara den mest utbredda HGT mekanism S. aureus eftersom de flesta S. aureus isolat lysogenized av bakteriofager 18. Infektionen förmåga transducerande fag beror på värd känslighet och måste kontrolleras med plackanalys. En annan begränsning med fagtransduktion är storleken på DNA: t. Små DNA kan effektivt överföras, men DNA-fragment större än 45 kb kan inte packas i stafylokock fag huvudet 19. Emellertid har en ny jätte stafylokock fag nyligen been isolerad från omgivningen, och itcould möjligen kunna överföra större DNA-fragment 20.

Plackanalysen metod som beskrivs i detta arbete är lättare än den konventionella protokoll, där topp-agar används. Kräver dock den nuvarande metoden att bakteriecellerna är jämnt fördelade för att detektera små plack som genereras på ytan. För att uppnå helt jämn spridning, rekommenderar vi att sprida tillräckligt med volym av bakteriesuspensionen på agarytan, stoppa när vätskan täcker jämnt agarytan. Sedan torka plattorna i luftflödet i en ren bänk. Om det är nödvändigt att undvika lysogenization av transducerande fag, är en låg multiplicitet av infektion rekommenderas (MOI bör inte överstiga 1). Lysogenized celler kan särskiljas genom deras minskad känslighet för fag i plackanalysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth (TSB)  Becton Dickinson  211825
Brain Heart Infusion (BHI) Becton Dickinson  211059
Nutrient Broth No. 2 Oxoid CM0067
Sheep blood agar Eiken Chemical Co.,Ltd. E-MR96 Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. 
Agar powder Wako Pure Chemical Industries 010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) Wako Pure Chemical Industries 191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter Merck Milipore HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit QIAGEN 12243

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lindsay, J. A. Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus. IJMM. 300, 98-103 (2010).
  2. Morikawa, K., et al. Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).
  3. Caryl, J. A., O'Neill, A. J. Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci. Plasmid. 62, 35-38 (2009).
  4. Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).
  5. Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell. 144, 590-600 (2011).
  6. Dubey, G. P., et al. Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes. Dev cell. 36, 453-461 (2016).
  7. Cafini, F., et al. Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance. J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).
  8. Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures. Lancet. 1, 835-838 (1966).
  9. Kuroda, M., et al. Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 357, 1225-1240 (2001).
  10. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322, 1843-1845 (2008).
  11. Clinical Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically - Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. CLSI. Wayne, PA, USA. (2006).
  12. Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction. BioTechniques. 26, 892-894 (1999).
  13. Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus. J. Antibiot. (2015).
  14. Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).
  15. Ando, T., et al. Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer. Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).
  16. Evans, B. A., Rozen, D. E. Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae. ISME J. 7, 791-799 (2013).
  17. Wilson, D. L., et al. Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture. Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).
  18. McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated. Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).
  19. Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer. IJMM. 304, 103-109 (2014).
  20. Uchiyama, J., et al. Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage. ISME J. 8, 1949-1952 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats