Kvantifisering av bakteriell histidin kinase Autofosforylering Ved hjelp av en Nitrocellulose bindingsanalyse

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fischer, J., Johnson, R. A., Boon, E. Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay. J. Vis. Exp. (119), e55129, doi:10.3791/55129 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Adaptiv respons er avgjørende for overlevelse av bakterier. For å oppdage og reagere på endringer i miljøet, bakterier bruke en stimulus-respons-system kjent som to-komponent signalering. 1,2 I en typisk to-komponent system, detekterer histidin kinase en beslektet stimulus, autophosphorylates dens konserverte histidin rester, og deretter overfører fosfat til en konservert aspartat rest på mottakeren domene av en reaksjon regulator protein. 3 Dette arrangementet utløser en endring i aktiviteten av responsen regulator, som stimulerer en nedstrøms effekt. 4,5 Således bakterier er i stand til å oppfatte og tilpasse seg endringer i det lokale miljøet. Noen to-komponent signalanlegg avvike fra denne arketypen. I noen tilfeller kan den sensoriske domenet til histidin-kinase er en frittstående protein, som direkte påviser sanseinntrykk og modifiserer kinaseaktivitet gjennom en protein-protein-interaksjon. 6-8 Men fondetamental prosess og generell rolle i systemet forblir den samme. To-komponent-signalering er et allestedsnærværende stimulus-reaksjonssystem som er nødvendig for overlevelse av bakterier, og histidin kinaser spiller en kritisk rolle i transduksjon av signalet. 9

På tross av betydningen av histidin-kinaser bakterielle biologi, de forblir dårlig karakterisert. Dette er på grunn av den iboende ustabilitet av phosphohistidine, og mangelen på en praktisk metode for måling av autofosforylering. Phosphohistidine er mer labil enn fosfoserin-, fosfotreoninmimetikumet, og fosfotyrosin. 10 Dermed teknikker som ofte brukes til å analysere Ser / Thr / Tyr kinaser er ikke aktuelt for histidin kinaser. 11 In vitro-undersøkelser for å studere histidin-kinaser har i stor grad vært begrenset til SDS-PAGE autoradiografi. 12,13 Ved denne metode [γ- 32P] -ATP inkuberes med kinase, og fosforylering av kinase blir analysert ved polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) etterfulgt av autoradiografi av gelen. Denne fremgangsmåten kan brukes til å overvåke kinase autofosforylering, samt fosfor fra kinase til en reaksjon regulator. Imidlertid har denne metoden merkbare feil. HOVED-baserte analyser er lav gjennomstrømning og tidkrevende. Slike begrensninger er ikke bidrar til å karakterisere et protein og å fastslå dens kinetiske parametre. En alternativ metode for å studere histidin-kinaser som ble publisert nylig benytter phosphohistidine antistoffer for påvisning av autofosforylering. 14 Selv om denne metoden har den fordelen av å skille mellom en-phosphohistidine og 3-phosphohistidine, avhengig av instrumenteringen som brukes for deteksjon, denne metoden kan ikke tilby et stort dynamisk område eller høy øvre grense for påvisning. Det er således et behov for en raskere, mindre arbeidskrevende og mer sensitiv analyse som kan brukes til å studere disse viktige proteiner.

Her beskriver vi og demonstrate en nøye utviklet nitrocellulosebindingsanalysen som kan brukes til å kvantifisere autofosforylering av rensede bakterielle histidin-kinaser in vitro. Denne analysen er høyere gjennomstrømning og mindre tidkrevende enn HOVED baserte analyser. Metoden benytter også tsjerenkovstråling for phosphohistidine kvantifisering, som tilbyr en høy øvre grense for deteksjon og et stort dynamisk område. Analysen kan anvendes for å bestemme kinetiske parametere for histidin-kinaser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Advarsel: Denne protokollen krever opplæring i bruk og håndtering av radioaktivt materiale. Bruk nødvendig personlig verneutstyr når du utfører denne analysen, inkludert betastråling skjerming. Radioaktivt avfall må håndteres forsiktig, da store mengder avfall genereres under vaskefasen av forsøket. Sørg for at avfallet lagres i oppreist beholder for eksempel en stor bøtte eller flaske som ikke vil bli lett veltet eller sølt. Når forsøket er avsluttet, nøye overføre alt flytende avfall til riktig merket radioaktive avfallsbeholdere. Håndter alle materialer med omhu, og holde en geigerteller i nærheten for å overvåke arbeidsområdet for forurensning.

MERK: Denne protokollen er en revidert versjon av en tidligere rapportert analyse fra vår gruppe. 15 Phosphohistidine stabilitet i H 3 PO 4 bør testes for eventuelle uncharacterized histidin kinase før du bruker denne metoden. Den phosphohistidine stanleggsprøve har blitt beskrevet tidligere. 15 En negativ kontroll som ikke inneholder kinase må inkluderes. Dette er nødvendig for å trekke fra bakgrunnssignalet fra hver prøve, og sørge for at [γ- 32P] -ATP er vasket tilstrekkelig fra membranen.

1. Utarbeidelse av reagenser og materialer

  1. Rens histidin kinaser fra bakteriekultur før du bruker denne analysen.
    1. Rense en histidin kinase (gen ID 1189383) fra Vibrio parahaemolyticus (EB101, ATCC 17802) for utviklingen av denne analysen. Klone kinase inn ekspresjonsvektor Dyre 23aHis-TEV hjelp Ndel og Xhol restriksjonsseter, og utføre seterettet mutagenese for å gi mutant konstruere Vp1876 D499A.
    2. Transform plasmidet inn i E. coli BL21 (DE3) pLysS, og vokse celler i TB media ved 37 ° C. Supplement kulturer med ampicillin (100 ug / ml) og kloramfenikol (34 ug / ml), og vokser under omrøring(250 rpm) til en OD 600 på 0,6.
    3. Indusere proteinekspresjon med IPTG til en sluttkonsentrasjon på 25 uM, og dyrke kulturer over natten ved 16 ° C. Høste cellene ved sentrifugering (5000 x g), lyse ved ultralydbehandling, og sentrifuger for å fjerne cellulært avfall (18 000 xg).
    4. Rense Hans-merket kinase bruker Ni-NTA agarose. Bekrefte renhet ved SDS-PAGE. Optimaliser rensing for hvert protein, og bekrefte renhet før du bruker denne analysen.
  2. Forbered 25 mm H 3 PO 4 vaskeløsning. Til 1 liter destillert avionisert vann, tilsett H 3 PO 4 til en sluttkonsentrasjon på 25 mM. PH-verdien for denne oppløsning er omtrent 2,0. Plasser 25 mm H 3 PO 4 på is.
  3. Fremstille en 13x stamløsning av 325 mM H 3 PO 4, som skal brukes for å slukke kinasereaksjonen. PH-verdien for denne oppløsning er omtrent 1,5. Plasser 325 mm H 3 PO 4 på is.
    MERK: H 3 PO 4
  4. Fremstille et 4 x reaksjonsbuffer lagerløsning inneholdende 160 mM Tris-HCl pH 8,0, 600 mM KCl, 16 mM MgCl2, og 40% glycerol.
  5. Kvantifisere histidin kinase konsentrasjon av etablert proteinkonsentrasjons metoder (Bradford, UV-Vis, etc.). 16,17 Forbered en histidin kinase oppløsning med en konsentrasjon som er 4 ganger den ønskede sluttkonsentrasjon. For å oppnå tilstrekkelig signal, bør den endelige proteinkonsentrasjonen i reaksjons ideelt sett være minst 5 uM.
  6. Forbered en 4x radiomerket [γ- 32P] -ATP løsning med riktig 4x konsentrasjonen av umerket ATP og merket: umerket ratio for forsøket.
    MERK: Mengden av [γ- 32P] -ATP som bør inkluderes i denne blandingen er avhengig av hvor mye [^7, - 32P] -ATP til slutt vil bli oppdaget for hver reaksjon. Vi har oppnådd tilstrekkelig signal med sluttkonsentrasjoner som varierer mellom 0,1 til 5 nCi pr reaksjon. Det er viktig at det er merket: umerket ATP-forholdet holdes konstant for alle reaksjoner i et gitt eksperiment. Serielle fortynninger bør gjøres når flere ATP-konsentrasjoner er ønskelig, da dette også holde merket: umerket ATP-forholdet konstant over alle konsentrasjoner. Endelige ATP-konsentrasjon varierer typisk fra 10 uM til minst 1 mm, og hver konsentrasjon bør bli analysert i triplikat for å få pålitelige kinetiske data.
  7. 96- vel dot blot apparat
    1. Skjær en 8 cm x 12 cm stykke nitrocellulosemembran (0,2 um porestørrelse).
    2. Stilling nitrocellulose i et dot-blot apparat, slik at membranen passer slik at anordningen er forseglet, og alle brønnene er fullstendig dekket av membranen. Hvis montert riktig, bør det ikke være noen luftlekkasje når vakuumet er ApplIED.
    3. For å samle filtratet koble anordningen til en sekundær side-arm kolbe. Fra ventilspindelen, kobler tilstrekkelig røret slik at anordningen kan godt brukes uten å tippe den sekundære kolben.
    4. Koble den sekundære side-arm kolbe til aspiratoren / vakuumkilde.
    5. Test at apparatet er helt forseglet ved anvendelse av vakuum på apparatet. Hvis apparatet er korrekt montert, vil en sterk vakuum være til stede i alle brønnene. Alle slangekoblinger kan pakkes inn i Parafilm eller Saran vikle å sikre en tett forsegling.
    6. Eventuelt, for å teste vakuum, pipette 100 ul reaksjonsbuffer i en brønn. Vakuumet bør være sterk nok til å trekke ut all væske gjennom brønnen og på membranen.
    7. Slå av vakuum inntil alle prøver er klar til å bli flekket på membranen.

2. Reaksjon Innvielse og Quenching

  1. Blanding av reaksjonskomponentene
    1. Før tt ig ngasjon, forberede alle fire reaksjonskomponentene som 4x stamløsninger: reaksjonsbuffer (se avsnitt 1.4), histidin kinase (1,5), [γ- 32P] -ATP (1,6), og DDH 2 O.
    2. Blande like volumer av reaksjonsbuffer, histidin kinase, og DDH 2 O. tillater disse reaksjonskomponentene til likevekt ved romtemperatur i en kort tid (10 min).
      MERK: Den endelige reaksjonsvolum er avhengig av om eksperimentet er tidsavhengig, enzym-avhengig, eller substrat-avhengig. Tidsavhengige reaksjoner må være større, for eksempel flere alikvoter blir tatt fra den samme reaksjonen og reaksjonen ble stoppet ved det ønskede tidspunkt. Reaksjonsvolumet vil være avhengig av antall tidspoeng som ønskes. Analysen blir optimalisert for hver flekk på nitrocellulosemembranen for å inneholde 30 pl av reaksjonen. Hvis således 10 tidspunkter er ønsket, må reaksjonsvolumet være minst 300 ul (et høyere volum, for eksempel 330 ul ville være å foretrekke i tilfelle av eventuelle feil pipettering).Enzym og substrat-avhengige eksperimenter kreve mindre reaksjonsvolumer. Reaksjonsvolumet for disse eksperimentene kan være så liten som 30 ul, da dette er det endelige volum som vil bli oppdaget på nitrocellulosemembranen.
    3. For å starte reaksjonen, tilsett en volum av [γ- 32P] -ATP-løsning til reaksjonsblandingen og bland ved å pipettere opp og ned. Spor forløpt reaksjonstid med timer og la reaksjonen forløpe i den ønskede tid.
    4. For å stanse reaksjonen, tilsett 1/13 av det totale reaksjonsvolum på is-kald 325 mM H 3 PO 4 til reaksjonsblandingen og bland ved å pipettere opp og ned. Alternativt kan legge til en alikvot av reaksjonsblandingen til 325 mM H 3 PO 4.
      NB: Den endelige konsentrasjonen av H 3 PO 4 bør være 25 mM til tilstrekkelig stanse reaksjonen. For eksempel legge 2,5 mL 325 mM H 3 PO 4 til 30 mL reaksjon, eller legge til 30 mL reaksjon på 2,5 mL 325 mM H 3 PO <sub> 4. Den endelige pH-verdi for reaksjonen er omtrent 4,0. Denne konsentrasjonen av H 3 PO 4 er testet og bekreftet å slukke kinasereaksjonen i denne bufferen uten å svekke phosphohistidine.
      1. For eksempel blande 7,5 mL 4x reaksjon buffer, 7,5 mL 4x histidin kinase, og 7,5 mL DDH 2 O. Initiere reaksjon med 7,5 mL [γ- 32P] -ATP. Stans reaksjonen med 2,5 pl 325 mM H 3 PO 4.
    5. Umiddelbart slukket reaksjoner på is inntil alle reaksjoner er avsluttet.
      MERK: For å maksimere effektiviteten, er det tilrådelig å sette i gang en reaksjon hver 15 eller 20 s inntil alle reaksjoner settes i gang, og når den ønskede reaksjonstiden har gått, slukke en reaksjon hver 15 eller 20 s til alle er slukket. For de som bruker analysen for første gang, kan en lengre intervall være mer håndterlig.

3. Spotting of slukket Reaksjoner på Nitrocellulose

  1. Begynn vakuum på 96-brønners dot blot-apparatur
    1. Plasser den formonterte 96-brønns dot blot apparat (avsnitt 1.7) inn i en sekundær beholder. Denne beholder bør være stort nok for at anordningen skal være lett demonteres, da anordningen, og membranen vil være radioaktiv etter bruk.
    2. Anvend vakuum til 96-brønns dot blot-apparat.
    3. Når apparatet er under vakuum, omhyggelig pipettér av den undertrykte reaksjon direkte på nitrocellulosemembran i hver brønn. Gjenta til alle reaksjoner er lastet på membranen. Siden bindingskapasiteten av nitrocellulose (75-110 ug / cm 2) er større enn mengden av histidin kinase som blir oppdaget, kan det antas at nesten alt av kinase binder til membranen når lastet på riktig måte.
      MERK: Avhengig av apparatet som brukes, må man passe på ikke å punktere nitrocellulose. Legg merke til at alle reaksjons har tatt kontakt med the nitrocellulose. Det er lett for noen eller alle av reaksjonen for å holde seg til veggene i brønnen, og ikke komme til nitrocellulose.
    4. Vask brønnene med 100 ul iskald 25 mM H 3 PO 4. Dette vil tillate en hvilken som helst reaksjonsvolum som kan ha blitt fanget i brønnen for å nå membranen, noe som sikrer fullstendig lasting av alle reaksjoner. La hele volumet til å strømme gjennom membranen.
  2. Apparater demontering og nitrocellulosemembran overføring
    1. Demontere nøye apparatet før du slår av maskinen. Være oppmerksom på at både apparatet og nitrocellulosemembran er radioaktive på dette tidspunktet. Ikke fjern noen apparater komponenter fra den andre posen på dette tidspunktet.
    2. Med pinsett, overføre nøye nitrocellulosemembranen fra apparaturen til en beholder med ca. 200 ml 25 mM iskald H 3 PO 4. Sett lokk på denne beholderen, som vaske vil være radioactive. På dette tidspunktet, kan støvsugeren slås av.

4. Nitrocellulose Processing

  1. nitro~~POS=TRUNC vask
    1. Plasser beholderen med vaske membran på en rocker. Tillate membranen å rist i 20 min.
    2. Etter 20 minutter, forsiktig dekanter brukt vaskeoppløsning i en stor bøtte som skal brukes for midlertidig lagring avfall. Tilsett 200 ml iskald 25 mM H 3 PO 4 til membranen og gjenta.
      MERK: Minst tre 20 min vaskinger er nødvendig for å fjerne bakgrunns [γ- 32P] -ATP signal fra membranen. Etter tredje vask, teste brukt vaskeløsningen for stråling med en geigerteller. Fortsett vasking av membranen som beskrevet ovenfor, inntil intet signal er til stede i vaskeløsningen.
  2. nitro~~POS=TRUNC tørking
    1. Etter at membranen er tilstrekkelig vasket, tillate membranen å kort lufttørke. Dette tar vanligvis 5 min eller mindre.

5. Eksponering for Storage Phosphor Screen

Merknad: Denne delen er valgfri. Å utsette membranen for et fosforskjerm er fordelaktig ved at den gjør det mulig for visualisering av intensiteten av radiomerket kinase i hvert enkelt sted på membranen. Den relative intensitet av disse flekker er direkte proporsjonal med mengden av fosforylert histidin kinase i hver enkelt flekk. Intensiteten kan kvantifiseres med bildebehandling, og disse resultatene kan sammenlignes med de som genereres fra seksjon 7. Videre gir dette trinnet for kvalitetskontroll. Unormalt sett i denne skanningen kan forklare uregelmessige resultatene fra scintillasjonstelling.

  1. Fosfor skjermen forberedelse
    1. Før utsette membranen til lagring fosfor-skjerm, utsette fosfor skjermen til hvitt lys i minst 5 min. Dette sikrer at eventuell rest bilde som kan bli holdt av skjermen er slettet.
    2. Sørg for at skjermen er renog tørr. Om nødvendig, rengjør forsiktig av skjermen med en fosforskjerm rengjøringsmiddel godkjent av skjermprodusenten, og tørk.
  2. Nitrocellulose membranpreparat
    1. pakk forsiktig tørr nitrocellulose membran i en tynn plastfolie for å hindre restfuktighet fra skade fosforskjerm. Pass på at det ikke er noen rynker eller bobler.
  3. Eksponering for fosfor skjerm
    1. Plasser innpakket nitrocellulose membran i lagring fosfor-skjerm kassett, plasser skjermen med forsiden ned på membranen, og lukk kassett. Ikke åpne kassetten eller flytte membranen før det er tid for å skanne fosfor-skjerm, som membran giring under eksponering vil føre til en dobbel eller utflytende bilde som skal fanges.
    2. Expose i minst 4 timer eller så lenge fosforskjerm produsenten antyder.
    3. Når eksponeringen er fullført, skanne fosfor skjermen og ta bildet med en fosfor skanner.

6. Klarnitrocellulosemembran for scintillasjonstelling

  1. Ponceau S farging og avfarging
    1. I korthet dyppe nitrocellulosemembranen i Ponceau S farging-oppløsning (0,1% Ponceau S (w / v) i 5% eddiksyre) i 1 - 2 minutter. Fukt hele membranen med flekken før avfarging.
    2. Dekanter overskudd av Ponceau S fra membranen.
    3. Skyll membran med DDH 2 O til bare flekker fra histidin kinase er farget. Merk at denne fremgangsmåten vil bare fungere hvis alle flekker inneholde påvisbare mengder protein.
      MERK: Dette trinnet er nødvendig for å bekrefte at kinase er bundet til nitrocellulose, og at protein lasting er til og med i alle flekker. Den gjør det også flekket kinase å være lett skjæres ut fra membranen.
  2. Kutte ut flekker
    1. Ved hjelp av saks, klippe ut hver spot på nitrocellulosemembranen. Det er ikke nødvendig å kutte helt Along kanten av farget flekk; hvis membranen ble vasket tilstrekkelig, vil bakgrunnen på grunn av varierende størrelse kuttet ut flekker være ubetydelig. Det er bare viktig å skjære ut hele sted for hver reaksjon.
    2. Bruk pinsett, overføre nøye hver spot i scintillasjonsglass. Ingen scintillasjonscocktail er nødvendig ettersom 32p er lett påvisbar ved tsjerenkovstråling.
      MERK: Alternativt kan stedet bli kuttet ut ved hjelp av en skjerpet kork borer. Fjern hvert sted nitrocellulose med kork borer, og skyv den inn i en scintillasjonsflaske med en pinne. Med denne metoden blir membranen ikke trenger å bli rørt ytterligere begrensning av stråleeksponering.
  3. Bestemme CPM / pmol [γ- 32P] -ATP løsning
    1. Spot flere fortynninger av [γ- 32P] -ATP oppløsning (avsnitt 1.5) på 1 cm x 1 cm kvadrater av nitrocellulose. I korthet lufttørke.
    2. Bruk pinsett, overføre nøye hver rute inn scintillationhetteglass. Ingen scintillasjons-cocktail er nødvendig. Disse prøvene vil bli brukt til å generere en standardkurve for å bestemme den CPM / pmol av ATP-løsning.

7. scintillasjonstelling

  1. Last alle scintillasjonsglass inn scintillasjonsteller kassetter. Laste kassettene inn scintillasjonsteller.
  2. Utfør scintillasjonstelling program for å måle CPM for hvert hetteglass. Disse data, sammen med CPM / pmol av den radioaktivt merkede ATP-mix (fra avsnitt 6.3) kan brukes til å beregne mengden av fosforylert histidin kinase tilstede i hver flekk, og således frekvensen av autofosforylering. 18,19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et representativt datasett ble generert med et bilde tatt med en fosforavbilder (figur 1), Ponceau S flekk av nitrocellulosemembranen (figur 2), og seinti data (figur 3). Figur 3A viser enzymkinetiske konstanter i et Lineweaver-Burk plot. Disse resultatene ble oppnådd ved bruk av et renset histidin kinase fra gram-negative Vibrio parahaemolyticus (gen ID 1.189.383). Den protokollen som brukes for å rense denne kinase er beskrevet i avsnitt 1.1. Den endelige kinase-konsentrasjonen i reaksjonsblandingen var 7,5 uM. De endelige ATP-konsentrasjoner varierte fra 0 mM til 1,28 mM. Den [γ- 32P] -ATP oppløsningen var 171,97 CPM / pmol ATP. Disse data kan alle bli generert på en enkelt dag ved å benytte prosedyren vi har beskrevet.

/55129/55129fig1.jpg "/>
Figur 1: Ponceau S farging av en nitrocellulosemembran. Ponceau flekk viser kinase bundet til nitrocellulosemembranen. Membranen ble flekket med reaksjoner inneholdende forskjellige konsentrasjoner av ATP, men konstant kinase konsentrasjon. Ingen protein er oppdaget i de ikke-kinase kontroll flekker (4. og 8. rad). Ponceau S farging oppløsning var sammensatt av 0,1% Ponceau S (w / v) i 5% eddiksyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: fluorografering resultater. Skannet bilde av en fosforskjerm som hadde vært utsatt for en nitrocellulosemembran. Membranen ble oppdaget med reaksjoner som inneholder constant kinase konsentrasjon, og forskjellige konsentrasjoner av ATP. Hver konsentrasjon ble testet i tre eksemplarer. Ved hver konsentrasjon ble en ikke-kinase kontroll inkludert (4. og 8. rad) for å vise at radiomerket ATP er fullstendig fjernet fra membranen under vasketrinnet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: scintillasjonstelling data. A) Dobbelt-resiproke plott av autofosforylering av histidin kinase. Substratet-avhengighet kurve ble generert fra scintillasjonstelling. Phosphohistidine dannelse ble beregnet ved hjelp av helningen av figur 3B (CPM / pmol ATP), som også ble dannet med scintillation spektrometri. B) Standard kurve av CPM / pmol av ATP. Skråningen er brukt til å beregne mengden av phosphohistidine (pmol) til stede i hver prøve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nitrocellulosen bindingsanalysen vi har beskrevet har mange fordeler i forhold til tidligere anvendte metoder for å karakterisere histidin-kinaser. I forhold til tradisjonelle SDS / PAGE-baserte autoradiografi, er vår metode høyere gjennomstrømning og mindre tidkrevende. Nitrocellulosemembranen er lettere å håndtere enn SDS-geler, og behøver ikke å være fast. Ponceau farging av nitrocellulose gjør det mulig for protein flekker å bli visualisert. Dette gir en enkel måte å kutte ut hver spot for scintillasjonstelling, og fastslår at protein lasting er konsistent på tvers av alle steder. Scintillasjonstelling av hver flekk gir nøyaktige resultater som lett kan konverteres til reaksjonshastigheten ved hjelp av helningen av den standardkurve er vist i figur 3B.

Selv utsette nitrocellulosemembranen til et lagringsfosforskjerm legger tid til den totale varigheten av forsøket, tilbyr dette trinnet innblikk i suksess for blotting. Noenavvik som er lagt merke til i de seinti data kan potensielt forklares med utfyllende fosfor bildet. Hvis, for eksempel, ble membranen ikke er tilstrekkelig vasket, vil fosfor bilde avsløre informasjonen. Fluorography av membranen er anbefalt for alle som planlegger å bruke denne analysen, som resultatene fra dette trinnet kan være en verdifull del av tilleggsinformasjon.

En annen betydelig fordel med denne analysen er evnen til å generere data fra scintillasjonstelling. Kutte ut hvert enkelt sted for scintillasjonstelling er å foretrekke å bruke av bildebehandlingsprogram for å kvantifisere bandet intensitet, som gjøres typisk for HOVED-baserte analyser. Den øvre grense og dynamisk område for deteksjon er langt høyere med scintillasjonstelling. Å generere en standardkurve for å bestemme den CPM / pmol ATP gjør det lett å beregne hastigheten av autofosforylering fra rådataene. Ved hjelp av denne metoden, er vi i stand til å nøyaktig oppdagepicomol av fosforylert produktet.

Til tross for de mange fordelene ved å bruke vår metode, er det ikke uten sine begrensninger. Vår metode skiller ikke mellom en-phosphohistidine og 3-phosphohistidine. Selv om phosphohistidine antistoffer kan brukes for å skille mellom disse fosforylerte produktene, har vår metode fremdeles den fordel av å utnytte tsjerenkovstråling å kvantifisere fosforylering. Tsjerenkovstråling gir et stort dynamisk område og høy øvre deteksjonsgrense. Avhengig av metoden for deteksjon, ved anvendelse av antistoffer for å kvantifisere phosphohistidine dannelse kan lide av en mindre øvre grense og dynamisk område. Vår fremgangsmåte er også begrenset til å brukes sammen med rensede proteiner, og kan ikke brukes for å påvise fosforylerte kinaser in vivo. Vår metode krever radiomerket underlaget, noe som kan avskrekke laboratorier som ikke er utstyrt for radioaktivitet. Til syvende og sist, er denne metoden mest egnet for laboratorier som allerede er utstyrt for å håndtereradioaktivitet, og er interessert i en høyere gjennomstrømning og mindre tidkrevende alternativ til ofte brukte SDS-PAGE-teknikker for å studere histidin kinaser. Dem som studerer Ser / Thr / Tyr-kinaser kan også finne denne metoden til å være nyttig, til tross for den relative overflod av alternative metoder for å studere disse proteiner.

Karakterisering av histidin kinaser har lenge vært unnvikende til tross for fremskritt innen metoder for å kvantifisere andre typer kinaser. Med denne analysen, kan vi begynne å karakterisere disse biologisk relevante ennå dårlig forstått proteiner. Dette avansement i metodikk for kvantifisering av histidin kinase autofosforylerings til slutt vil forbedre vår forståelse av to-komponent signalering i bakterier. Denne analysen vil være et verdifullt verktøy som vi utforsker effekten av beslektede stimuli og protein-protein interaksjoner på histidin kinase aktivitet i ulike to-komponent signalveier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av Department of Education gjennom Graduate Assistanse på områder av nasjonal Need program (P200A100044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphoric acid VWR AAAA18067-AP For quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris base RPI T60040-5000.0 Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chloride RPI P41000-2500.0 For kinase reaction buffer
Magnesium chloride RPI M24000-500.0 For kinase reaction buffer
Glycerol RPI G22020-4000.0 For kinase reaction buffer
5'-ATP Promega E6011 Kinase substrate
[γ-32P]-5'-ATP Perkin Elmer NEG002Z250UC  6,000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatus Bio-rad 1706545 For spotting reactions
Nitrocellulose Whatman 32-10401396-PK For spotting reactions
Ponceau S Sigma aldrich P3504-50G For staining nitrocellulose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
  2. Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, (2), 118-124 (2012).
  3. Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
  4. Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
  5. Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49, (5), 579-581 (1987).
  6. Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (15), 5891-5896 (2008).
  7. Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. Biochemistry. 46, (48), 13677-13683 (2007).
  8. Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
  9. Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7, (8), 626-633 (2000).
  10. Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32, (1), 145-156 (2007).
  11. Kee, J. -M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7, (1), 44-51 (2012).
  12. Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. Biochemistry. 33, (25), 7917-7924 (1994).
  13. Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276, (44), 41182-41190 (2001).
  14. Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162, (1), 198-210 (2015).
  15. Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465, (3), 331-337 (2015).
  16. Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7, (72), 248-254 (1976).
  17. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  18. Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131, (3413), 1608-1609 (1960).
  19. Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31, (6), 371-374 (1980).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics