Kwantificering van bacteriële histidine kinase autofosforylering Met een Nitrocellulose bindingsassay

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fischer, J., Johnson, R. A., Boon, E. Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay. J. Vis. Exp. (119), e55129, doi:10.3791/55129 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Adaptieve respons is essentieel voor de overleving van bacteriën. Op te sporen en te reageren op veranderingen in het milieu, bacteriën gebruiken een stimulus-respons systeem bekend als tweecomponenten signalering. 1,2 In een typisch twee-componentensysteem, histidine kinase detecteert verwante stimulus, autophosphorylates de geconserveerde histidine residu vervolgens overdraagt fosfaat een geconserveerde aspartaat residu op de ontvanger domein van een response regulator eiwit. 3 Deze gebeurtenis veroorzaakt een verandering in de activiteit van de response regulator, die een stroomafwaarts effect stimuleert. 4,5 Aldus bacteriën kunnen detecteren en aanpassen aan wijzigingen in de lokale omgeving. Sommige tweecomponenten signaleringssystemen afwijken archetype. In sommige gevallen, de zintuiglijke domein van de histidine kinase is een stand-alone-eiwit, die direct detecteert de zintuiglijke en wijzigt kinase activiteit door middel van eiwit-eiwit interactie. 6-8 Echter, het fondsamental werkwijze en algemene rol van het systeem blijft hetzelfde. Tweecomponenten signalering is een alomtegenwoordige stimulus-respons systeem dat essentieel is voor bacteriële overleving en histidine kinasen spelen een belangrijke rol in de transductie van het signaal. 9

Ondanks het belang van histidine kinases bacteriële biologie, blijven ze slecht gekarakteriseerd. Dit komt door de inherente instabiliteit van phosphohistidine en het ontbreken van een praktische werkwijze voor het meten van autofosforylatie. Phosphohistidine meer labiele dan fosfoserine, fosfotreonine en fosfotyrosine. 10 Dus, technieken die vaak worden gebruikt om Ser / Thr / Tyr kinases analyseren gelden niet voor histidine kinases. 11 In vitro assays histidine kinases bestuderen grotendeels beperkt tot SDS PAGE-autoradiografie. 12,13 Bij deze werkwijze [γ- 32 P] -ATP geïncubeerd met de kinase en fosforylering van het kinase wordt geanalyseerd door polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) gevolgd door autoradiografie van het gel. Deze methode kan worden gebruikt voor het kinase autofosforylering en fosfotransfer van het kinase beantwoord regulator controleren. Deze werkwijze heeft opmerkelijke tekortkomingen. PAGE-gebaseerde testen zijn lage doorvoer en tijdrovend. Dergelijke beperkingen zijn niet bevorderlijk voor het karakteriseren van een eiwit en het vaststellen van de kinetische parameters. Een alternatieve methode voor het bestuderen histidine kinases die onlangs gepubliceerd werd gebruikt phosphohistidine antilichamen autofosforylering detecteren. 14 Hoewel deze methode heeft het voordeel van onderscheid tussen 1-en 3-phosphohistidine phosphohistidine, afhankelijk van de instrumentatie gebruikt voor detectie, kan deze methode niet over een groot dynamisch bereik of high bovenste detectiegrens. Er is dus behoefte aan een snellere, minder arbeidsintensief en meer gevoelige test die kan worden gebruikt om deze belangrijke eiwitten te bestuderen.

We beschrijven hier en demonstrate een zorgvuldig ontwikkeld nitrocellulose bindingstest die gebruikt kunnen worden om autofosforylering van gezuiverde bacteriële histidine kinases in vitro kwantificeren. Deze test is een hogere doorvoersnelheid en minder tijdrovend dan PAGE gebaseerde testen. De werkwijze gebruikt ook Cherenkov straling phosphohistidine kwantificering, die een hoge bovengrens van detectie en een groot dynamisch bereik heeft. De test kan worden gebruikt om kinetische parameters voor histidine kinases bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Let op: Dit protocol vereist een passende opleiding in het gebruik en de verwerking van radioactief materiaal. Gebruik de vereiste persoonlijke beschermingsmiddelen bij het uitvoeren van deze test, met inbegrip van beta-straling afscherming. Radioactief afval moet zorgvuldig worden behandeld, als grote hoeveelheden afval worden gegenereerd tijdens het wassen fase van het experiment. Zorg ervoor dat het afval wordt opgeslagen in een rechtopstaande container, zoals een grote emmer of een fles die zal niet gemakkelijk over worden geslagen of gemorst. Zodra het experiment wordt gesloten, zorgvuldig overdracht van alle vloeibare afvalstoffen op passende wijze gemerkt radioactief afval containers. Behandel alle materialen met zorg, en houdt een geigerteller in de buurt om de werkruimte op vervuiling controleren.

LET OP: Dit protocol is een herziene versie van een eerder gerapporteerde test van onze groep. 15 Phosphohistidine stabiliteit H 3 PO 4 moeten worden getest voor gekarakteriseerde histidine kinase voordat met deze methode. De phosphohistidine stvermogen test is eerder beschreven. 15 Een negatieve controle die geen kinase bevat moet worden opgenomen. Dit is noodzakelijk om het achtergrondsignaal van elk monster af te trekken en zorgen dat [γ- 32 P] -ATP voldoende uit het membraan gewassen.

1. Bereiding van reagentia en materialen

  1. Zuiver histidine kinases van bacteriecultuur voorafgaand aan het gebruik van deze test.
    1. Zuiver een histidine kinase (gen ID 1.189.383) uit Vibrio parahaemolyticus (EB101, ATCC 17.802) voor de ontwikkeling van deze test. Kloon het kinase in expressievector pET-23aHis-TEV behulp Ndel en Xhol restrictieplaatsen en voert plaatsgerichte mutagenese onder verkrijging van de mutant te construeren Vp1876 D499A.
    2. Transformeren van het plasmide in E. coli BL21 (DE3) pLysS en groeien cellen in TB medium bij 37 ° C. Supplement kweken met ampicilline (100 ug / ml) en chlooramfenicol (34 ug / ml) en onder roeren groeien(250 rpm) tot een OD 600 van 0,6.
    3. Induceren eiwitexpressie met IPTG tot een uiteindelijke concentratie van 25 uM en groeien kweken overnacht bij 16 ° C. Oogst cellen door centrifugeren (5000 x g), Lyse door sonicatie en centrifuge om cellulair afval (18.000 x g) te verwijderen.
    4. Zuiver het His-tag kinase met behulp van Ni-NTA agarose. Bevestig de zuiverheid door SDS-PAGE. Optimaliseer zuivering voor elk eiwit, en bevestig zuiverheid voorafgaand aan het gebruik van deze test.
  2. Bereid de 25 mM H 3 PO 4 wasoplossing. Tot 1 liter gedestilleerd gedeïoniseerd water, voeg H 3 PO 4 tot een eindconcentratie van 25 mM. De pH van de oplossing is ongeveer 2,0. Plaats 25 mM H 3 PO 4 op ijs.
  3. Bereid een 13x voorraadoplossing van 325 mM H 3 PO 4, te gebruiken om kinase reactie af te schrikken. De pH van de oplossing is ongeveer 1,5. Plaats 325 mM H 3 PO 4 op ijs.
    LET OP: H 3 PO 4
  4. Bereid een 4x reactiebuffer voorraadoplossing van 160 mM Tris-HCl pH 8,0, 600 mM KCI, 16 mM MgCl2 en 40% glycerol.
  5. Kwantificeren histidine kinase concentratie van gevestigde methoden eiwitconcentratie (Bradford, UV-Vis, etc.). 16,17 Bereid een histidine kinase oplossing met een concentratie die 4 maal de gewenste eindconcentratie. Voldoende signaal te verkrijgen, moet de uiteindelijke eiwitconcentratie in de reactie idealiter ten minste 5 uM.
  6. Bereid een 4x radiolabeled [γ- 32 P] -ATP oplossing met de juiste 4x concentratie ongemerkt ATP en gelabeld: ongelabelde verhouding voor het experiment.
    OPMERKING: De hoeveelheid [γ- 32 P] -ATP die moeten worden opgenomen in deze mix is afhankelijk van hoeveel [^7, - 32 P] -ATP uiteindelijk gespot voor elke reactie. We hebben voldoende signaal verkregen met de uiteindelijke concentraties in het gebied tussen 0,1-5 uCi per reactie. Het is belangrijk dat de aangegeven: ongelabeld ATP ratio voor alle reacties in een bepaald experiment constant gehouden. Seriële verdunningen moeten wanneer meerdere ATP concentraties worden naar wens worden gemaakt, omdat dit goed te houden het label: ongelabelde ATP-verhouding constant in alle concentraties. Final ATP concentraties typisch variëren van 10 uM tot minstens 1 mM, en elke concentratie worden getest in drievoud betrouwbare kinetische gegevens te verkrijgen.
  7. 96- goed dot blot apparaat
    1. Snij een 8 cm x 12 cm stuk nitrocellulose membraan (0,2 pm poriegrootte).
    2. Positie nitrocellulose in een dot blot apparaat, zodat het membraan sluit zodat de inrichting wordt gesloten en alle wells volledig onder het membraan. Indien correct gemonteerd, mag er geen luchtlekken zijn wanneer het vacuüm is applied.
    3. Om filtraat verzamelen, sluit het apparaat aan een secundaire zijarm kolf. Van het ventiel sluit adequate buis zodat de inrichting gemakkelijk kan worden gebruikt zonder kantelen secundaire kolf.
    4. Sluit de secundaire zijarm kolf met aspirator / vacuum bron.
    5. Testen of de inrichting volledig is afgedicht door een vacuüm aan de inrichting. Indien de inrichting correct is gemonteerd, wordt een sterke onderdruk aanwezig in alle wells. Alle slangaansluitingen kan worden gewikkeld in Parafilm of Saran wikkel om een ​​goede afdichting te garanderen.
    6. Eventueel, het vacuüm Pipetteer 100 ul reactiebuffer Onderzoekkolom in een. Het vacuüm moet sterk genoeg zijn om alle vloeistof te trekken door de put en op het membraan.
    7. Schakel vacuüm totdat alle monsters zijn klaar om te worden gespot op het membraan.

2. Reaction Initiatie en Afschrikken

  1. Mengen van reactiecomponenten
    1. Vóór initiatie, voor te bereiden alle vier de reactie componenten zoals 4x voorraad oplossingen: reactie buffer (zie paragraaf 1.4), histidine kinase (1,5), [γ- 32 P] -ATP (1.6), en DDH 2 O.
    2. Meng gelijke volumes reactiebuffer, histidine kinase en DDH 2 O. Laat deze reactiecomponenten equilibreren bij kamertemperatuur gedurende een korte tijd (10 min).
      NB: De uiteindelijke reactievolume is afhankelijk van of het experiment tijdsafhankelijke, enzym-afhankelijke, of substraat-afhankelijke. Tijdsafhankelijke reacties moet groter zijn, als meerdere aliquots van hetzelfde reactiemengsel genomen en afgeschrikt op het gewenste tijdstip. Het reactievolume is afhankelijk van het aantal gewenste tijdstippen. De bepaling wordt geoptimaliseerd voor elke plek op het nitrocellulose membraan om 30 ul van de reactie bevatten. Dus als 10 tijdstippen gewenst, het reactievolume moet minimaal 300 uL (een hoger volume als 330 pi de voorkeur in het geval van pipetteren fouten).Enzym en substraat-afhankelijke experimenten vereist kleiner reactievolume. Het reactievolume van deze experimenten kan zo klein als 30 pi zijn, aangezien dit het eindvolume die worden gespot op de nitrocellulose membraan.
    3. Om de reactie te initiëren, dient een hoeveelheid van [γ- 32 P] -ATP oplossing voor de reactie en meng door en neer te pipetteren. Volg verstreken reactietijd met een timer en laat de reactie doorgaan gedurende de gewenste tijd.
    4. Om de reactie te blussen, voeg 1/13 van het totale reactievolume ijskoude 325 mM H 3 PO 4 aan de reactie en meng door en neer te pipetteren. Als alternatief, voeg een hoeveelheid van het reactiemengsel tot 325 mM H 3 PO 4.
      Opmerking: De uiteindelijke concentratie van H 3 PO 4 moet 25 mM om de reactie voldoende blussen. Voeg bijvoorbeeld 2,5 ul 325 mM H 3 PO 4 tot 30 pi reactie of voeg 30 ul reactie 2,5 ui 325 mM H 3 PO <sub> 4. De uiteindelijke pH van de reactie ongeveer 4,0. Deze concentratie van H 3 PO 4 is getest en bevestigd aan de kinasereactie in deze buffer blussen zonder afbreuk phosphohistidine.
      1. Bijvoorbeeld, mix 7,5 ul 4x reactiebuffer, 7,5 pi 4x histidine kinase en 7,5 pl DDH 2 O. ingewijde reactie met 7,5 pi [γ- 32 P] -ATP. Schrik de reactie af met 2,5 pl 325 mM H 3 PO 4.
    5. Plaats onmiddellijk afgeschrikt reacties op ijs totdat alle reacties beëindigd.
      Opmerking: Om de efficiëntie te maximaliseren, is het raadzaam om een ​​reactie iedere 15 s of 20 totdat alle reacties geïnitieerd initiëren, en zodra de gewenste reactietijd is verstreken, doof één reactie om 15 of 20 jaren totdat alle worden gedoofd. Voor degenen die het gebruik van de test voor de eerste keer, kan een langere interval beter beheersbaar zijn.

3. Spotting of Veredelde Reacties op Nitrocellulose

  1. Begin vacuüm op 96-well dot blot apparaat
    1. Plaats de voorgemonteerde 96-well dot blot inrichting (paragraaf 1.7) in een tweede container. Dit flesje moet groot zijn dat de inrichting gemakkelijk worden gedemonteerd, aangezien de inrichting en membraan radioactieve na gebruik zal zijn.
    2. Toepassen vacuüm op het 96-well dot blot apparaat.
    3. Zodra de inrichting onder vacuüm voorzichtig pipet het afgeschrikte reactiemengsel direct op het nitrocellulosemembraan in elk putje. Herhaal dit totdat alle reacties op het membraan worden geladen. Aangezien de bindingscapaciteit van nitrocellulose (75-110 gg / cm 2) groter is dan de hoeveelheid histidine kinase dat wordt gespot, kan worden aangenomen dat bijna alle van de kinase bindt aan het membraan wanneer correct geplaatst.
      OPMERKING: Afhankelijk van de gebruikte apparatuur, moet erop worden gelet de nitrocellulose niet te doorboren. Vast dat alle reactie contact met th heefte nitrocellulose. Het is gemakkelijk voor sommige of alle van de reactie te houden aan de wanden van de put en de nitrocellulose niet bereikt.
    4. Was de putjes met 100 pl ijskoude 25 mM H 3 PO 4. Dit zal enige reactie volume die in de put kan gevangen aan het membraan te bereiken mogelijk te maken, zorgen voor volledige belading van alle reacties. Laat het gehele volume door het membraan stromen.
  2. Apparatuur demontage en nitrocellulose membraan overdracht
    1. Voorzichtig uit elkaar te halen het apparaat vóór het afsluiten van het vacuüm. Let erop dat zowel de inrichting en nitrocellulosemembraan radioactief momenteel. Gebruik geen apparaat onderdelen niet uit de secundaire container op dit moment.
    2. Met een pincet voorzichtig overdracht van de nitrocellulose membraan van de inrichting naar een houder van ongeveer 200 ml 25 mM ijskoude H 3 PO 4. Leg een deksel op de verpakking, zoals het wassen Radi zal zijnoactive. Op dit moment kan het vacuüm worden afgesloten.

4. Nitrocellulose Processing

  1. nitrocellulose wassen
    1. Plaats de houder met het wassen membraan op een rocker. Laat de folie schud gedurende 20 min.
    2. Na 20 min, voorzichtig giet de gebruikte wasoplossing in een grote emmer om te worden gebruikt voor de opslag van tijdelijke afval. Voeg 200 ml ijskoude 25 mM H 3 PO 4 aan het membraan en herhaal.
      OPMERKING: Ten minste drie 20 min wassingen nodig achtergrond [γ- 32 P] -ATP signaal van het membraan te verwijderen. Na de derde wasbeurt, test de gebruikte wasoplossing voor straling met een geigerteller. Verder wassen van het membraan zoals hierboven totdat geen signaal in de wasoplossing is beschreven.
  2. nitrocellulose drogen
    1. Nadat het membraan voldoende wordt gewassen, kan de membraan kort aan de lucht drogen. Dit duurt meestal 5 minuten of minder.

5. Blootstelling aan Storage Phosphor Screen

Opmerking: Deze sectie is optioneel. Het blootstellen van het membraan aan een fosforscherm is gunstig doordat het zorgt voor visualisatie van de intensiteit van radioactief gemerkte kinase in elke plek op het membraan. De relatieve intensiteit van deze plekken is recht evenredig met de hoeveelheid gefosforyleerd histidine kinase in elke plek. De intensiteit kan worden gekwantificeerd beeldverwerkingssoftware, en deze resultaten worden vergeleken met die gevormd uit hoofdstuk 7. Bovendien deze stap maakt kwaliteitscontrole. Afwijkingen waargenomen bij deze scan kan onregelmatige resultaten van scintillatietelling leggen.

  1. Fosforscherm voorbereiding
    1. Voorafgaand aan het membraan blootgesteld aan het fosforscherm opslag, het fosforscherm blootgesteld aan wit licht gedurende ten minste 5 min. Dit zorgt ervoor dat het resterende afbeelding die kan worden ingenomen door het scherm wordt gewist.
    2. Zorg ervoor dat het scherm schoonen droog. Indien nodig, reinig het scherm met een fosforscherm reinigingsoplossing door de fabrikant scherm goedgekeurd, en veeg droog.
  2. Nitrocellulose membraanpreparaat
    1. wikkelen zorgvuldig de droge nitrocellulose membraan in een dunne plastic folie om de resterende vocht te voorkomen dat schade aan het fosforscherm. Zorg ervoor dat er geen rimpels of bellen.
  3. Blootstelling aan fosforscherm
    1. Plaats de ingepakte nitrocellulose membraan in de opslag fosforscherm cassette, plaatst u het scherm naar beneden op het membraan, en sluit de cassette. Laat de cassette niet open of verplaats het membraan totdat het tijd is om het fosforscherm te scannen, zoals membraan verschuiven tijdens de blootstelling zal leiden tot een tweepersoonsbed of besmeurd beeld vast te leggen.
    2. Expose gedurende ten minste 4 uur, of zolang de fabrikant fosforscherm suggereert.
    3. Zodra belichting is voltooid, scant het fosforscherm en vastleggen van de afbeelding met een fosfor scanner.

6. Voorbereiding nitrocellulosemembraan voor scintillatietelling

  1. Ponceau S kleuring en ontkleuren
    1. Kort Dompel het nitrocellulose membraan Ponceau S kleuroplossing (0,1% Ponceau S (w / v) in 5% azijnzuur) gedurende 1-2 min. Bevochtig het gehele membraan met de vlek voorafgaand aan ontkleuren.
    2. Giet overtollige Ponceau S uit het membraan.
    3. Spoel de membraan met DDH 2 O totdat alleen de spots van de histidine kinase zijn gekleurd. Merk op dat deze procedure alleen werkt wanneer alle spots detecteerbare hoeveelheden eiwit.
      Opmerking: Deze stap is noodzakelijk om te bevestigen dat de kinase gebonden aan de nitrocellulose en dat eiwitbelading zelfs in alle spots. Ook kan de gevlekte kinase gemakkelijk worden geknipt uit het membraan.
  2. Het verwijderen van vlekken
    1. Met een schaar, uitgesneden elke plek op het nitrocellulose membraan. Het is niet noodzakelijk om perfect snijden AlonG de rand van de gebrandschilderde spot; indien het membraan voldoende werd gewassen, zal de achtergrond als gevolg van wisselende omvang van uitgesneden plekken te verwaarlozen zijn. Het is alleen belangrijk te snijden de gehele spot per reactie.
    2. Met behulp van een tang, zorgvuldig overbrengen elke plek in scintillatieflesjes. Nr scintillatiecocktail is nodig omdat de 32 P gemakkelijk detecteerbaar tsjerenkov-effect.
      LET OP: U kunt ter plaatse worden gesneden met behulp van een geslepen kurkboor. Verwijder elke plek uit de nitrocellulose met de kurk boor, en duw het in een scintillatieflesje met een pin. Bij deze methode worden de membraan niet te worden aangeraakt, verder minimaliseren van de blootstelling aan straling.
  3. Bepalen CPM / pmol [γ- 32 P] -ATP oplossing
    1. Spot verschillende verdunningen van [γ- 32 P] -ATP-oplossing (punt 1.5) op 1 cm x 1 cm pleinen van nitrocellulose. Kort aan de lucht drogen.
    2. Met behulp van een tang, zorgvuldig overbrengen elk vierkant in scintillatieflesjes. Nr scintillatiecocktail nodig. Deze monsters worden gebruikt om een ​​standaardcurve de CPM / pmol ATP oplossing te bepalen genereren.

7. scintillatietelling

  1. Laad alle flesjes scintillatieteller in scintillatieteller cassettes. Laad cassettes in scintillatieteller.
  2. Uitvoeren scintillatietelling programma CPM voor elk flesje te meten. Deze gegevens, samen met de CPM / pmol van de radioactief gemerkte ATP mix (uit paragraaf 6.3), kan worden gebruikt om de hoeveelheid gefosforyleerd kinase histidine aanwezig in elke plek, en dus de snelheid van autofosforylatie te berekenen. 18,19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een representatieve gegevens set werd gegenereerd die een beeld vastgelegd met een fosfor-imager (figuur 1), Ponceau S kleuring van de nitrocellulose membraan (figuur 2), en scintillatietelling data (figuur 3). Figuur 3A toont het enzym kinetische constanten in een Lineweaver-Burk plot. Deze resultaten werden verkregen met een gezuiverd histidine kinase van de gram-negatieve species Vibrio parahaemolyticus (gen ID 1.189.383). Het protocol dat wordt gebruikt om dit kinase te zuiveren is beschreven in paragraaf 1.1. De uiteindelijke kinase concentratie in het reactiemengsel was 7,5 pM. De uiteindelijke ATP-concentraties varieerden van 0 uM tot 1,28 mM. De [γ- 32 P] -ATP oplossing was 171,97 cpm / pmol ATP. Deze gegevens kunnen alle worden gegenereerd in één dag met de procedure die wij hebben beschreven.

/55129/55129fig1.jpg "/>
Figuur 1: Ponceau S kleuring van een nitrocellulosemembraan. Ponceau vlek die de kinase gebonden aan het nitrocellulosemembraan. Het membraan werd gespot met reacties die verschillende concentraties ATP, maar constante concentratie kinase. Geen eiwit gedetecteerd in de niet-kinase control spots (4 en 8 ste rij). Ponceau S kleuring oplossing bestond uit 0,1% Ponceau S (w / v) in 5% azijnzuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: fluorografie resultaten. Gescande beeld van een fosforscherm die waren blootgesteld aan een nitrocellulosemembraan. Het membraan werd gespot met reacties die constant kinase concentratie en verschillende concentraties van ATP. Elke concentratie werd getest in drievoud. Bij elke concentratie, werd een geen kinase meegeleverd (4 en 8 ste rij) aantonen dat radioactief gemerkt ATP volledig uit het membraan wordt verwijderd tijdens de wasstap. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: scintillatietelling data. A) Double-wederkerige plot van de autofosforylatie van histidine kinase. Het substraat afhankelijkheid curve gerealiseerd met scintillatietelling. Phosphohistidine vorming werd berekend met de helling van figuur 3B (CPM / pmol ATP), die ook gemaakt met scintillation spectrometrie. B) Standaard curve van de CPM / pmol ATP. De helling wordt gebruikt om de hoeveelheid phosphohistidine (pmol) in elk monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De nitrocellulose bindingstest we hebben beschreven heeft vele voordelen ten opzichte van eerder gebruikte werkwijzen om histidine kinases karakteriseren. In vergelijking met traditionele SDS / PAGE-autoradiografie gebaseerde, onze werkwijze hogere doorvoer en minder tijdrovend. Het nitrocellulosemembraan gemakkelijker te hanteren dan SDS gels en hoeft niet te worden vastgesteld. Ponceau kleuren van de nitrocellulose maakt de eiwitvlekken worden gevisualiseerd. Dit biedt een eenvoudige manier uit te snijden elke plek voor scintillatietelling, en bepalen dat eiwit laden is consistent in alle plekken. Scintillatietelling van elke vlek levert nauwkeurige resultaten die gemakkelijk kan worden omgezet in reactiesnelheid met de helling van de standaardcurve figuur 3B.

Hoewel het blootstellen van het nitrocellulosemembraan een opslag fosforscherm draagt ​​tijd de totale duur van het experiment, deze stap geeft inzicht in het succes van de blotting. Elkediscrepanties die worden opgemerkt in de scintillatietelling data kan mogelijk worden verklaard imago van de complementaire fosfor door. Indien bijvoorbeeld het membraan niet voldoende gewassen, zal het de fosfor die informatie onthullen. Fluorgrafie van het membraan wordt aanbevolen voor iedereen die van plan is deze test gebruikt, aangezien de resultaten van deze stap, waardevolle aanvullende informatie kan worden.

Een ander belangrijk voordeel van deze test is de mogelijkheid om gegevens van scintillatietelling genereren. Het uitsnijden van elk individueel plek voor scintillatietelling is te verkiezen boven het gebruik van image processing software om band intensiteit te kwantificeren, zoals meestal gedaan voor-PAGE gebaseerde testen. De bovengrens en dynamisch bereik voor detectie zijn veel hoger bij scintillatietelling. Het genereren van een standaard curve te bepalen de CPM / pmol ATP maken het gemakkelijk om de snelheid van de autofosforylatie berekenen op basis van de ruwe data. Met deze methode, we kan vaststellenpicomol gefosforyleerd product.

Ondanks de vele voordelen van onze werkwijze is niet zonder beperkingen. Onze methode maakt geen onderscheid tussen 1-phosphohistidine en 3-phosphohistidine. Hoewel phosphohistidine antilichamen kunnen worden gebruikt om onderscheid te maken tussen deze gefosforyleerde producten, onze werkwijze nog steeds het voordeel van het gebruik Cherenkov straling fosforylering kwantificeren. Cherenkov straling zorgt voor een groot dynamisch bereik en een hoge bovengrens van detectie. Afhankelijk detectie- hand antilichamen tegen phosphohistidine vorming kwantificeren kunnen last hebben van minder bovengrens en dynamisch bereik. Onze werkwijze is ook beperkt te worden gebruikt met gezuiverde eiwitten, en kan niet worden gebruikt gefosforyleerde kinasen te detecteren in vivo. Onze methode vereist radioactief gemerkt substraat, dat labs die niet uitgerust zijn voor radioactiviteit kan afschrikken. Uiteindelijk is deze methode is vooral geschikt voor laboratoria die reeds zijn uitgerust omradioactiviteit, en geïnteresseerd zijn in een hogere doorvoersnelheid en minder tijdrovend alternatief voor veelgebruikte SDS-PAGE technieken om histidine kinases te bestuderen. Degenen die studeren Ser / Thr / Tyr kinases kan ook deze methode om bruikbaar te zijn, ondanks de relatieve overvloed van alternatieve methoden voor het bestuderen van deze eiwitten.

Karakterisering van histidine kinases is lang ongrijpbaar ondanks de vooruitgang bij werkwijzen voor andere soorten kinases kwantificeren. Met deze assay kunnen we beginnen deze biologisch relevante nog slecht begrepen eiwitten te karakteriseren. Deze vooruitgang in de methodologie voor het kwantificeren van histidine kinase autofosforylering zal uiteindelijk het verbeteren van ons begrip van de twee-componenten signalisatie in bacterie. Deze test zal een waardevol instrument als het effect van prikkels en verwante eiwit-eiwit interacties op histidine kinase-activiteit in verschillende tweecomponenten signaalwegen verkennen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Onderwijs door de Graduate bijstand op gebieden van het nationale programma Need (P200A100044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphoric acid VWR AAAA18067-AP For quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris base RPI T60040-5000.0 Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chloride RPI P41000-2500.0 For kinase reaction buffer
Magnesium chloride RPI M24000-500.0 For kinase reaction buffer
Glycerol RPI G22020-4000.0 For kinase reaction buffer
5'-ATP Promega E6011 Kinase substrate
[γ-32P]-5'-ATP Perkin Elmer NEG002Z250UC  6,000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatus Bio-rad 1706545 For spotting reactions
Nitrocellulose Whatman 32-10401396-PK For spotting reactions
Ponceau S Sigma aldrich P3504-50G For staining nitrocellulose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
  2. Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, (2), 118-124 (2012).
  3. Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
  4. Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
  5. Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49, (5), 579-581 (1987).
  6. Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (15), 5891-5896 (2008).
  7. Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. Biochemistry. 46, (48), 13677-13683 (2007).
  8. Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
  9. Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7, (8), 626-633 (2000).
  10. Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32, (1), 145-156 (2007).
  11. Kee, J. -M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7, (1), 44-51 (2012).
  12. Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. Biochemistry. 33, (25), 7917-7924 (1994).
  13. Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276, (44), 41182-41190 (2001).
  14. Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162, (1), 198-210 (2015).
  15. Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465, (3), 331-337 (2015).
  16. Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7, (72), 248-254 (1976).
  17. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  18. Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131, (3413), 1608-1609 (1960).
  19. Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31, (6), 371-374 (1980).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics