Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Azimi, M. S., Motherwell, J. M., Murfee, W. L. An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks. J. Vis. Exp. (120), e55183, doi:10.3791/55183 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

אנגיוגנזה, כהגדרתו צמיחה של כלי דם חדשים מכלי קיימים, כרוך לתאי אנדותל, pericytes, ותאי שריר חלק, תאי מערכת החיסון, ואת התיאום עם כלי הלימפה והעצבים. המולטי-התא, אינטראקציות רבות מערכתיות מחייבות חקירת אנגיוגנזה בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. וכך, בעוד השימוש במודלים תרבית תאים במבחנה סיפקו תובנות מכניסטית, ביקורת נפוצה היא כי הם לא לשחזר את המורכבות הקשורה רשת כלי הדם. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את היכולת לערוך השוואות זמן לשגות של רשתות כלי הדם ללא פגע לפני ואחרי גירוי אנגיוגנזה ברקמות לפדר עכברוש תרבותי. רקמות בתרבית מכילות רשתות כלי דם מקיים ההיררכיה שלהם. תיוג immunohistochemical מאשרת את נוכחותו של תאי אנדותל, תאי שריר חלק, pericytes, כלי הדם וכלי הלימפה. בddition, תיוג רקמות עם BSI-לקטינים מאפשר השוואת הזמן לשגות של אזורי רשת המקומיים לפני ואחרי הגירוי גורם בסרום או צמיחה מאופיינת הנבטה וצפיפות כלי נימים מוגברות. לשם השוואה למודלי תרבית תאים נפוצים, שיטה זו מספקת כלי ללימודי שושלת תא האנדותל וערכת תרופת angiogenic רקמות ספציפית ברשתות כלי דם רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית.

Introduction

צמיחת שיפוץ רשת כלי דם הם מכנים משותפים לתפקוד רקמות, ריפוי פצעים, ו פתולוגיות מרובות תהליך מפתח הוא אנגיוגנזה, כהגדרתו הצמיחה של כלי דם חדשים קיימים 1, 2. עבור הנדסת רקמות כלי דם חדש או בעיצוב טיפולים מבוססים angiogenic, הבנת חשיבות הדינמיקה הסלולר המעורבת אנגיוגנזה הוא קריטי. עם זאת, תהליך זה הוא מורכב. זה יכול להשתנות במקומות ספציפיים בתוך רשת כלי דם וכרוך סוגי תאים מרובים (כלומר תאי אנדותל, תאי שריר חלק, pericytes, מקרופאגים, תאי גזע) ומערכות מרובות (רשתות לימפטי רשתות עצביות). למרות מודלים במבחנה תרמו מאוד כדי לבדוק את הקשר בין תאים שונים המעורבים אנגיוגנזה 3, הרלוונטי הפיזיולוגית שלהם יכול להתערער בשל thei r מורכבות מוגבלות ואת העובדה שהם מקרוב אינם משקפים תרחיש vivo. כדי להתגבר על המגבלות האלה, מערכות תרבות תלת מימדי 3, לשעבר vivo מודלים רקמות 4, מערכות microfluidic 5, 6, ו מודלים חישוביים 7 פותחו שהונהגה בשנים האחרונות. עם זאת, יש עדיין צורך מודל עם יכולת הזמן לשגות לחקור אנגיוגנזה ברשתות פגעו כלי דם vivo לשעבר. הקמת מודלים חדשים זמן לשגות ללימודי אנגיוגנזה עם כי רמת המורכבות תספק כלי רב ערך כדי להבין את המנגנונים המסדירים אנגיוגנזה לשפר טיפולים.

מודל פוטנציאלי המאפשר חקירת vivo לשעבר של אנגיוגנזה ברחבי רשת כלי דם ללא פגע הוא מודל התרבות לפדר עכברוש> 8. בשנים אחרונה עבודה, אנחנו הוכחנו כי דם ורשתות כלי דם הלימפה להישאר קיימא אחרי התרבות. יתרה מכך, מודל תרבות העכברוש לפדר יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות תא פונקציונליות-אנדותל pericyte, דם וקשרי תא האנדותל הלימפה, הזמן לשגות הדמיה. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול שלנו שיטת הדמיה זמן לשגות. תוצאות הנציג שלנו לתעד את סוגי התאים המרובים שנותרו קיימא לאחר הגירוי של אנגיוגנזה עם סרום ולהציע דוגמאות לשימוש בשיטה זו לכימות תגובות angiogenic רקמות ספציפיות, כמו גם מחקרי מעקב תא האנדותל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים ואת ההליכים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת טוליין ועדת שימוש (IACUC).

1. הגדרת הליך כירורגי

  1. מכשירי חיטוי, ציוד כירורגי, ואספקת התרבות לפני הניתוח. חומרי מתכלים כירורגיים לכל חולדה כוללים: 1 וילון, 1 וילון עם חור חתוך מראש (0.5 x 1.5 ב) במרכז, פדי גזה, ו -1 underpad סופג. מכשירי ניתוח כוללים: 1 אזמל עם להב מספר 10, 2 זוגות של פינצטה, וזוג מספריים בסדר. אספקת תרבות כוללת: 1 וילון, 1 פינצטה, ומכין מוסיף 6-גם צלחת עם מסנני פוליקרבונט.
  2. לעקר פלטפורמת פרספקס, במה כירורגי ומרחב המעבדתיים כירורגית עם אתנול 70%. שמור על הבמה כירורגי בקערה סטרילי עד השימוש.
    1. צור הבמה כירורגי באמצעות קידוח של כ 2 ב -1 ב חור במרכז של צלחת תרבות 100 מ"מ. לאחר מכן, השתמש נייר זכוכית כדי להחליקכל קצוות חדים ולהוסיף שכבה של דבק סיליקון אל הקצוות של החור כדי ליצור משטח מוגבה עבור הרקמות.
    2. לחלופין, לעצב את הבמה כירורגי באמצעות תוכנת CAD ולהפוך ידי הדפסת 3-D (איור 1).
  3. מניחים underpad סופג סטרילית ושכב פלטפורמה פרספקס על גבי זה. מניח את הווילון, ללא חור חתוך מראש, על משטח לוהט ליד underpad סופג.
  4. פוספט שנאגר תמיסת מלח סטרילית טרום חם (PBS), מדיה מלוחה עד 37 מעלות צלזיוס. מדיה פלייס PBS במנות תרבות נפרדת על גבי כרית חימום ו מלוחים ומכניסים צינור חרוטי 50 מ"ל ליד ההתקנה כירורגית.
  5. ודא כל החבילות נפתחות לפני תחילת הניתוח כדי להבטיח טיפול סטרילי של כל החומרים. רשימה מלאה של הכלים הנפוצים המשמשים בהליך זה מפורט טבלת חומרים וכלים כירורגיים ספציפיים.

2. Mesenterקציר רקמות y

  1. השתמש חולדות Wistar זכר בוגר (350 ± 25 גרם; 6 - 8 שבועות של גיל). זנים אחרים וגילים של חולדות ניתן להחליף.
  2. להרדים חולדה באמצעות זריקה תוך שרירית של קטמין (80 מ"ג / ק"ג משקל גוף) ו xylazine (8 מ"ג / ק"ג משקל גוף). אשר את החולדה היא בהרדמה ידי צובט בין האצבעות כדי לבדוק לתגובה רפלקס; שם צריך להיות אף אחד. שיכוך כאבים מנעו עבור הליך מסוף זה לא הכרחי.
  3. לגלח את אזור הבטן ולהסיר שיער הנותרים באמצעות קרם להסרת שיער. נגב עור הבטן פעמיים עם אלכוהול איזופרופיל 70% ואחריו יוד povidone. עבור המגבונים שהמנתח צריך להתחיל במרכז של האתר כירורגית ולעבור מחוץ לאזור המוכן באופן מעגלי שלא חופף באזורים קרצפו בעבר עם אותה פיסת גזה סטרילי או מקלון צמר גפן סטרילי. ואז להעביר חית התקנת ניתוח סטרילי ולמקם גבי plat פרספקסטופס.
  4. באמצעות סכין אזמל, לבצע 0.75 ב - 1.25 ב חתך במעיים החל מיום 1 ב מתחת עצם החזה. היזהר שלא לנקב את המעי או לפדר (1 שכבת העור, 1 שכבה של רקמת חיבור, ו -1 שכבת השריר).
  5. מניח וילון עם חור חתוך מראש על החתך ומניח במה כירורגי סטרילי על גבי הווילון. ודא מיישרת הפתיחה עם החתך. השתמש applicators כותנה שקצו סטרילי לאתר ולשלוף את המעי דרך הפתח הבמה כירורגי.
  6. משוך 6 - 8 חלונות mesenteric באמצעות לבמה בעזרת אזניים, ולהיזהר לא לגעת חלונות (איור 1). רקמות בדרך כלל נקצרות מאזור המעי של המעי הדק מתחיל ליד cecum. שמור חשוף רקמות לחות עם מלח סטרילית חימם לפי הצורך באמצעות מזרק סטרילי לטפטף הפתרון.
  7. להרדים את העכברוש באמצעות הזרקת intracardiac של נתרן pentobarbital (0.2 מ"ל לכל חולדה). לפני ההסרה ליחלונות senteric, להבטיח העכברוש הוא מורדם על ידי מישוש הלב; לא אמור להיות שום דופק.
  8. הסר רקמות לפדר רצויות באמצעות פינצטה לתפוס את כרית השומן ומספריים בסדר לחתוך את החלון. השאר גבול של שומן (2 מ"מ) סביב החלון. לשטוף רקמות פעם חימם PBS סטרילי ופעם התקשורת.
  9. חזור מעי exteriorized אל חלל הבטן ולהיפטר מן החי על פי הנחיות מוסדיות.

3. תרבות רקמות לפדר ללימודים זמן לשגות

  1. אספקת העברת תרבות autoclaved (ראה סעיף 1.1) ורקמות כדי ברדס זרימה למינרית סטרילי.
  2. להשתמש בפינצטה כדי להעביר את כל רקמות על גבי קרום מסנן פוליקרבונט. רקמות תפוס על ידי כרית שומן כדי למנוע נזק בכלי הדם.
  3. במהירות להפיץ את הרקמות באמצעות כרית השומן, נזהר שלא לגעת החלון. הפוך את הכנס עם רקמה לתוך החלק התחתון של צלחת 6-היטב ומכסים 3 מ"ל של התקשורת (איור 1
  4. חזור על שלבי 3.2 - 3.3 כל רקמות ותרבות בתנאי חממה סטנדרטיות (5% CO 2, 37 מעלות צלזיוס) במשך עד 5 ימים.

4. זמן לשגות הדמיה של רקמות לפדר

  1. ביום ההדמיה, להשלים את התקשורת בכל טוב עם מצומדות BSI-לקטיני דגירה בתנאי תרבות סטנדרטיים למשך 30 דקות. לשטוף רקמות פעמים עם תקשורת לקטינים ללא. BSI-לקטינים הכתם יישאר גלוי על הרקמה לפדר עד 3 ימים בתרבות.
  2. מעביר את הצלחת על במת מיקרוסקופ. זיהוי כלי הדם הלימפה מבוסס על מבנה המורפולוגיה שלהם ברשת.
  3. אתר אזור רשת רצוי על כל רקמות לקחת תמונות. כדאי לשים לב במיוחד ההדמיהמיקום מנת להבטיח את אותה באזור יהיה בשבי עבור תמונות עוקבות. אם באמצעות במה ממונעת, לתעד את הקואורדינטות.
  4. חזור רקמות אל האינקובטור ולהמשיך תרבות עד לנקודת הסיום הרצויה. חזור על צעדי 4.1 - 4.3 דרוש תלוי בנקודות זמן ניסוי רצויות.

5. רקמות immunolabeling

  1. תיוג BSI-לקטינים
    1. דגירה הרקמות למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס 1:40 לקטינים FITC- מצומדות בתקשורת (פתרון נוגדנים 2.5 מ"ל לכל היטב צלחת 6-באר) ואחריו שני שטיפות עם התקשורת. עבור שטיפות, להוסיף מדיה ומיד להחליף.
  2. תיוג Live / Dead
    1. דגירה רקמות במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 1: 500 homodimer-1 ethidium 2 מ"מ ו 1: AM calcein 500 1 מ"מ בתקשורת (פתרון נוגדנים 2.5 מ"ל לכל היטב צלחת 6-באר) ואחריו שני שטיפות עם התקשורת.
  3. BSI-לקטינים / תיוג NG2
    1. רקמות מורח על מיקרוסקופ החליקודואר (1 - 2 רקמות / שקופית) ולאפשר לו להתייבש. הסר עודף שומן עם אזמל ידי לחיצה איתנה מטה שיחתוך את השומן.
    2. תקן רקמות מתנול קר במשך 30 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לשטוף רקמות עם PBS (3 x 10 דקות).
    3. תיוג נוגדן ראשוני דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: נוגדן 100 ארנב polyclonal NG2 ו -5% בסרום עז נורמלי (NGS). לשטוף רקמות עם PBS (3 x 10 דקות).
    4. תיוג נוגדנים משני דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 100 נוגדן נגד ארנב עז Cy2 מצומדות (GAR-Cy2) ו -5% NGS. לשטוף רקמות עם PBS (3 x 10 דקות).
    5. דגירה הרקמות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר 1:40 לקטינים FITC- מצומדות ב PBS ואחריו שני שטיפות עם PBS. עבור שטיפות, להוסיף PBS ומיד להחליף.
    6. כדי לעגן את השקופיות, לכסות רקמות עם 50:50 PBS פתרון גליצרול coverslip מקום על גבי. חותם את הקצוות שקופית באמצעות לק.
  4. LYVE-1 / תיוג PECAM
    1. מורחים רקמות על שקופיות מיקרוסקופ (1 - 2 רקמות / שקופית) ולאפשר לו להתייבש. הסר עודף שומן עם אזמל ידי לחיצה איתנה מטה שיחתוך את השומן.
    2. תקן רקמות מתנול קר במשך 30 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות).
    3. תיוג נוגדן ראשוני דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 200 עכבר נוגדנים CD31 biotinylated חד שבטיים ו 1: 100 ארנב polyclonal נוגדן LYVE-1 ב PBS + 0.1% saponin + 2% אלבומין בסרום שור (BSA) + 5% NGS . לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות).
    4. תיוג נוגדנים משני, דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 500 נוגדן streptavidin CY3 מצומדות ו 1: 100-Cy2 GAR ב PBS + 0.1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות).
    5. כדי להרכיב שקופיות, רקמות כיסוי עם 50:50 PBS פתרון גליצרול במקום coverslip על גבי. חותם את הקצוות שקופית באמצעות לק.
  5. BrdU / BSI-לקטינים תיוג
    1. הוסף 1 מ"ג / מ"ל ​​BrdU למדיה ולהחליף התקשורת רקמות עם פתרון BrdU. דגירה של 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. מורחים רקמות על שקופיות מיקרוסקופ (1 - 2 רקמות / שקופית) ולאפשר לו להתייבש. הסר עודף שומן עם אזמל ידי לחיצה איתנה מטה שיחתוך את השומן.
    3. תקן רקמות מתנול קר במשך 30 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לשטוף רקמות עם PBS (3 x 10 דקות).
    4. לפגל DNA רקמה 2 M HCl עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס. לשטוף רקמות saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות).
    5. תיוג נוגדן ראשוני, דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 100 העכבר חד שבטיים אנטי BrdU ב PBS + 0.1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות).
    6. תיוג נוגדנים משני, דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 100 עיזים אנטי עכבר נוגדנים Cy3 מצומדות (GAM-Cy3) ב- PBS + 0.1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות).
    7. כדי להרכיב שקופיות, רקמות כיסוי עם 50:50 PBS פתרון גליצרול coverslip מקום על גבי. חותם את הקצוות שקופית באמצעות לק.
  6. BSI-לקטינים / תיוג CD11b
    1. מורחים רקמות על שקופיות מיקרוסקופ (1 - 2 רקמות / שקופית) ולאפשר לו להתייבש. הסר עודף שומן עם אזמל ידי לחיצה איתנה מטה שיחתוך את השומן.
    2. תקן רקמות מתנול קר במשך 30 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות).
    3. תיוג נוגדן ראשוני דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 100 CD11b אנטי עכברוש העכבר ב PBS + 0.1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות).
    4. תיוג נוגדנים משני דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 100 GAM-Cy3 ב PBS + 0.1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. לשטוף רקמות עם PBSעלייה של 0.1% saponin (3 x 10 דקות).
    5. דגירה הרקמות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר 1:40 לקטינים FITC- מצומדות ב PBS ואחריו שני שטיפות עם PBS.
    6. כדי להרכיב שקופיות, רקמות כיסוי עם 50:50 PBS פתרון גליצרול coverslip מקום על גבי. חותם את הקצוות שקופית באמצעות לק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר 3 ימים בתרבות, רקמות תויגו עם ערכת cytotoxicity חי / מת הכדאיות / כדי להוכיח את הכדאיות של microvasculature במודל תרבות עכברוש לפדר (איור 2 א). רוב התאים הנמצאים לפדר נשארים קיימא בתרבות שבה תאי אנדותל זוהה על סמך המיקום שלהם במגזרי כלי דם. התפשטות תאים האנדותל גם אושרה על ידי תיוג לקטינים / BrdU (איור 2 ד). תא שריר חלק ונוכחות pericyte לאורך כלי אושרה עם תיוג NG2 (איור 2 ב). תיוג עבור LYVE1 ו PECAM זיהה הסתעפות לימפטי כלי דם דם רשתות ואשר את מתוחזק הלימפה לעומת פנוטיפ תאי דם האנדותל (איור 2 ג).

התכונה זמן לשגות של מודל זה נוצל על ידי תיוג microvaרשתות scular עם-לקטינים BSI בנקודות זמן שונות הדמיה באותו אזור בתוך הרשת לאורך זמן; יכולת זו היא בעל ערך במיוחד עבור חוקרת תגובות angiogenic רקמות ספציפיות. התוספת של תקשורת עם סרום 10% הגררה גם תגובה angiogenic חזקה לאחר 3 ימים של גירוי. בנוסף, מקטעי כלי חדשים וכרוב נימים זוהו על ידי ביום 5 של גירוי (איור 3). שיטת הדמית הזמן לשגות מותר עבור השוואת כמותית של אזורי רשת לפני ואחרי הגירוי (איור 4). לצורך המחקר נציג זה, אשר מאשש תוצאות הניסויים עד כה 9, מספר כלי השיט ליחידת שטח וסקולרית ומספר נבטים נימי ליחידת שטח וסקולרית כומתו מתמונה 4X אחד לכל רקמה. כלי מגזרי דם הוגדרו כמגזרי תא האנדותל דם לקטינים חיוביים נוכחיים בין שתי נקודות סניף וכרוב נימים הוגדרו עיוור הסתיים קטעים שמקורם כלי המארח. זמן לשגות השוואה של אזורי רשת מופעלת גם מעקב של מגזרי תא האנדותל (איור 5) וזיהוי של דם / כלי הלימפה mis-דפוסים (איור 6). תיוג של רקמות בתרבית למשך לקטינים ו CD11b בנוסף אישר את נוכחותו של מקרופאגים תושב ביניים (איור 7) ברשתות שיפוץ.

איור 1
איור 1. חלונות Mesenteric אותרו על ידי תלישה המעי הדק דרך הבמה כירורגי. השלב כירורגית תוכנן על ידי הדפסת 3-D. החור הסגלגל במרכז הוא כ 2 ב -1 ב (א). חלונות mesenteric היו אז פרושים על גבי להכניס קרום, ואת הכנס היה הפוך והכניס באר (B). סרגל קנה מידה = 2 ס"מ.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55183/55183fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. כלי דם להישאר קיימא במודל תרבות עכברוש לפדר. Assay חי / מת שבוצע לאחר התרבות הראה יחס גבוה של תאי חיים (ירוק) כדי תאים מתים (אדום) במיוחד לאורך כלי הדם (A). רקמות לפדר תויגו עם לקטינים ואנטי NG2, לזהות pericytes (אדום) לצד כלי שיט (ירוק) וכדי לוודא כי סוגים שונים של תאי נוכחים ברקמות-תרבות פוסט (B). רקמות גם תויגו נגד PECAM / LYVE-1 לזהות הדם (אדום) כלי מ הלימפה (ירוק) כלי (C). כדי לחקור אם תאי כלי הדם עוברים התפשטות בתרבות, רקמות לפדר תויגו עם לקטינים / אנטי BrdU . על מגזרי נימים שכותרתו עם לקטינים (ירוק), מספר תאים אושרו להיות שגשוג (אדום) (D). ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. הדמיה זמן לשגות של לפדר עכברוש מאפשר התבוננות שיפוץ כלי הדם במהלך התרבות. תגובת angiogenic חזקה נצפתה לאחר 3 (ב) ו -5 ימים (C) של תרבות עם גירוי סרום 10%. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

קבצים / ftp_upload / 55,183 / 55183fig4.jpg "/>
רשתות כלי הדם איור 4. במודל תרבות עכברוש לפדר הם צילמו לפני ואחרי אנגיוגנזה. השוואה באותה הרשת שכותרתו עם לקטינים ביום 0 ויום 3 (A, B) גירוי פוסט עם סרום 10% מזהה כלי חדש. לקטינים גם תוויות אוכלוסייה של תאי ביניים לא מזוהים. כימות צפיפות כלי (C, D) ומספר נבטים נימי ליחידת שטח וסקולרית (E, F) אישר גידול בשני הערכים של כל רקמות. C, E) לפני (יום 0) ואחרי (יום 3 השוואות) לכל רקמה. D, F) השוואה בין יום 0 ויום 3 ממוצעים באמצעות מבחן t מזווג אישר הבדל משמעותי הן את המספר הממוצע של מגזרים כלי (p <0.0001) ואת המספר הממוצע של נבטים (p <0.00001) ליחידת שטח וסקולרית . ברים לבנים מייצגים יום 0, ו פסים שחורים מייצגים יום 3. Values הם ממוצעים ± SEM. לניתוח נציג זה, 13 רקמות נבצרו 2 חולדות. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. מודל תרבות העכברוש לפדר יכול לשמש לחקירת גורלו אי וסקולרית ושילוב לתוך רשתות סמוכות. באמצעות הדמיה זמן לשגות, איים וסקולרית, מוגדר כמגזרים אנדותל מנותקים, זוהו ביום 0 וחיבורם לרשת הסמוכים אושרה על ידי גירוי 3 ביום שלאחר angiogenic. רקמות לפדר היו מגורה עם bFGF (A, B) ו VEGF / PDFG-BB (C, D). חיצי הולו להראות קטעים מנותקים ביום 0 וחצים מוצקים מייצגים קשר האי אל הרשתותk. ראשי חץ להצביע על המיקום של חיבורים בין אי וסקולרית והרשת הסמוכה. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
תמונות איור 6. זמן לשגות להדגים את היכולת להתבונן דפוסים הלימפה וכלי דם. ניתן להבחין כלי הלימפה (יב) מ arterioles (א) ו- venules (נ) המבוסס על מורפולוגיה תיוג על 0 יום (א). ביום 5 גירוי פוסט עם סרום 10%, מורפולוגיה הלימפה אבדה וכלי נראה שלב עם כלי הדם הסמוכים angiogenic (B). ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גדולגרסה של נתון זה.

איור 7
המקרופאגים איור 7. להישאר בהווה ברקמות mesenteric החולדה תרבותיות. שיתוף תיוג של רקמות לקטינים / CD11b בתרבית למשך 3 ימים עם 10% בסרום מראה כי תאי ביניים חיוביים לקטינים הם קבוצת משנה של מקרופאגים. (א) תמונה מייצגת של תיוג BSI-לקטינים. (ב) תיוג CD11b באותו שדה הראייה. (ג) תמונה הממוזגת. החיצים לזהות דוגמאות של שיתוף תיוג. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתעד שיטה לשימוש במודל תרבות עכברוש לפדר ככלי vivo לשעבר הדמיה זמן לשגות של צמיחה רשת כלי הדם. עבודה קודמת שנערכו במעבדה שלנו הקימה את השימוש במודל שלנו עבור 1) אנגיוגנזה 8, 2) lymphangiogenesis 8, 3) אינטראקציות תא pericyte-אנדותל 8, ו -4) תרופה אנטי-אנגיוגנזה בדיקות 9. יכולת הדמית רקמות לפדר עכברוש תרבותיים בנקודות זמן מרובות מציעה assay כמוני להערכת תגובות צמיחת רקמות ספציפיות ואת המעקב של אינטראקציות תאי תאים במהלך גירויי angiogenic שונים. הריבוי המוגבר של תאי אנדותל במהלך אנגיוגנזה ואת הנוכחות של pericytes עולה בקנה אחד עם המחקרים הקודמים שלנו 8 ולאמת את האינטראקציות הדינמיות בין סוגי תאים מרובים במהלך אנגיוגנזה ברקמות mesenteric החולדה תרבותיות.

= ילדה "jove_content"> לעומת דגמים בתרבית רקמה נפוצים במערכות תרבית תאים במבחנה, מודל תרבות העכברוש לפדר הוא ייחודי, משום צמיחה מתרחשת בתוך רשת כלי דם ללא פגע, אמיתית. שקול בניגוד assay את טבעת אבי העורקים, אשר הוקמה על מנת ללמוד הנבטה angiogenic מפלחים אבי העורקים בתוך ג'ל קולגן 10. בעוד הנבטה בטבעת אב העורקים כרוכים סוגי תאים מרובים, ניבט נימים לצמוח מתוך המגזרים הניכרים של אב העורקים, וזה מאוד שונה תרחיש vivo. המודל הפרוס המוח הוא עוד מודל vivo לשעבר, אבל הוא בטל של כלי הלימפה. יתר על כן, המודל הפרוס המוח לא הוכח להיות מסוגל הזמן לשגות הדמיה לפני ואחרי גירוי angiogenic 11. מודל אחר vivo לשעבר כי כבר הציג לאחרונה הוא מודל תרבות הרשתית. היתרון של מודל הרשתית הוא אנגיוגנזה מתרחשת בין microvascu ללא פגערשתות Lar בתוך הרקמה 12, 13. בדגמים אלה, זני עכברי GFP מהונדס יכולים לשמש כדי להיות מסוגל להתבונן נימי הנבטה לאורך זמן, אך למרבה הצער, לפדר העכבר הוא avascular 14, ומבטל את החילוף לפדר עכברי GFP-מהונדס עבור לפדר עכברוש, מנוצל כמו במודל שלנו. יתר על כן, אנו מראים כי תיוג לקטינים פשוט של רקמות לפדר עכברוש התרבות מספיק כדי לקבוע צמיחת רשת בנקודות זמן שונה בהשוואה האחרת לשעבר מודלי vivo, המודל שלנו מאפשר תצפית סימולטני של שני דם ותאי אנדותל הלימפה.

BSI-לקטינים שמשו במאמר זה לדמיין רשתות כלי דם וכדי לזהות תגובות angiogenic. לקטינים הוא מבנה חלבון שקושר גליקופרוטאינים על תאי האנדותל נבחר עבור פרוטוקול זה בגלל זמן הדגירה הקצר שלה לעומת antib אנדותלסמני ody. לקטינים הם זולים יותר מאשר נוגדנים והיא אינה דורשת תיקון; זה גם יכול להיות מעורב בקלות בתקשורת התרבות והחליף עם תקשורת טריה לאחר תום תקופת דגירה. בעוד מחקרים עתידיים נדרשים על מנת להבהיר את ההשפעות האפשריות של טכניקת תיוג לקטינים על תהליך angiogenic, תוצאות הנציג שלנו (איור 4) מראות כי אנגיוגנזה חזק ניתן מושרה ואת העבודה קודמת -9 מלמדת כי אנגיוגנזה ברשתות שכותרתו לקטינים יכולה להיות מעוכבת באמצעות מיקוד פקטור (vascular endothelial growth VEGF). סמנים נוגדן יכול לשמש פוטנציאל כגישה תיוג חלופי כאשר יש צורך סמנים ספציפיים יותר, או כאשר יש צורך לחקור סוגי תאים אחרים שנמצאים ברשתות כלי הדם כגון תאי שריר חלק, pericytes, והעצבים. שיטת פוטנציאל נוספת תאים חזותיים תהיה transfection גן.

היתרון של שימוש במודל לפדר עכברוש זמן לשגות כבר מסומן בתוצאות נציג בפרוטוקול זה. ההשוואה של תמונות לפני ואחרי הטיפול מפחית בעיות של השתנות המשפיעים ניתוח סטטיסטי לזווג שאינם. את התגובה החיסונית הספציפית explant נעה בין 20% ל -233% עלייה בצפיפות כלי דם מ -40% ל -3,500 עליית% בצפיפות ניבטת. הסיבות הספציפיות וריאציה זו אינן ידועות, אבל מדידת צמיחה באותה הרקמה לאורך הזמן להציג את היכולת לאשר תגובות רקמות ספציפיות.

ניתוח השוואתי של תמונות בנקודות זמן שונות במהלך צמיחת כלי דם מאפשר גם מעקב בתאי האנדותל. לדוגמא, המעבדה שלנו זיהתה אי וסקולרית כמגזרי תא האנדותל בקרבת רשתות כלי דם מנותקת מרשתות סמוכות 15, 16. כדי לאשר האיים האלה להתחבר רשתות הסמוכיםk בתגובה לגירויי angiogenic, מודל תרבות העכברוש לפדר היה בשימוש. כפי שניתן לראות בתרשים 5, איים וסקולרית אותרו לאחר גירוי רקמות עם בסיסי פיברובלסטים Growth Factor (bFGF) או VEGF בתוספת מטסיות Growth Factor (PDGF). גם הראינו תוצאות דומות בסרום גירוי פוסט (מידע לא מוצג כאן). לאחר הגירוי של אנגיוגנזה, האיים וסקולרית במקור המנותק ניתן למצוא מחוברים לרשתות סמוכות.

יישומים אפשריים אחרים של מודל תרבות העכברוש לפדר יכולים למנף את היכולת לחקור את יחסי הגומלין בין הלימפה וכלי דם ותאי האנדותל שלהם ואת המעקב של גורל תא ביניים. זמן לשגות תמונות של אותן רשתות כלי הדם לפני ואחרי גירוי עם סרום 10% במודל זה סיפק דוגמאות פוטנציאל הלימפה אל הדם שילוב כלי (איור 6). לפני גירוי, לימפטי Vess דםאלס נבדל המבוסס על מורפולוגיה כלי. לאחר גירוי, הלימפה לעומת זהות כלי דם הפכה פחות ברורה. פוטנציאל אינטראקציות תא הלימפה / דם האנדותל נתמך על ידי תצפית של PECAM + / LYVE-1- תאי דם האנדותל חיבור עם PECAM + / LYVE-1 + בתאי האנדותל הלימפה (מידע לא מוצג כאן). תצפיות אלו תומכים בשימוש במודל תרבות עכברוש לפדר על חקירת פלסטיות תא האנדותל הלימפה / דם. איור 6 א מדגיש גם את התיוג לקטינים של תאי ביניים נראים לעין. בעוד תיוג זו אינה עולה בקנה אחד והטרוגניות מרקמות לרקמות, היא עושה להדגיש את נוכחותם של תאים תושב רקמות אנדוגני. תיוג CD11b של רקמות תרבותיות (איור 7) עולה כי תאי ביניים לקטינים-חיוביות הללו יכולים להיות א-סט משנה של מקרופאגים. לאור ההתעניינות המתעוררים מעורב מקרופאג ב אנגיוגנזה 20, חוזק נוסף שלהמודל יכול להיות השימוש בו כדי לעקוב אחר הדינמיקה מקרופאג לאורך זמן.

בדומה מודלי vivo לשעבר אחרים, מגבלה נוכחית של לימוד אנגיוגנזה במודל תרבות העכברוש לפדר היא חוסר זרימת דם. מאמץ הגזירה הנגרמת על ידי זרימת דם הוכח לשחק תפקיד במורפולוגיה ובחלוקה של תאים האנדותל וכן אנגיוגנזה 17, 18, 19. לקבלת תוצאות הנציג מוצגות באיור 4, עדר מאמץ גזירה כי בו בלבד היה מספיק כדי לגרום לתגובת angiogenic ברשתות התרבותיות. עם זאת, אנו יודעים כי על פי הפרסום הראשוני שלנו המאפיין את מודל תרבות העכברוש לפדר 8, כי סיבות תוספי תקשורת גדלו אנגיוגנזה מול תקשורת לבד. מחקרים עתידיים חשובים להכניס זרימה בתוך רשתות כלי דם התרבותיות ללא ספק יש צורך יותר מקרוב לחקות אתבתרחיש vivo. גישות פוטנציאל תזרים שילוב עשויות לכלול cannulation של arterioles האכלת רשת או אפילו cannulation של עורקים במעלה נוסף בתוך גבול השומן של חלונות mesenteric. עם זאת, למרות חוסר הזרימה, את הכדאיות של סוגי תאים מרובים, החזקת הדם ורשתות כלי דם הלימפה, ובחלוקה של תאים במהלך אנגיוגנזה תומכת הרמה המוגברת ביחס של מודל תרבות העכברוש לפדר מורכבות בהשוואה לתא מבוססים במודלים חוץ גופייה.

לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה, לשחזור vivo לשעבר הדמיה תגובות angiogenic ברשתות כלי הדם ללא פגע. שיטה כזו מציעה אלטרנטיבת התא המבוססת במודלים במבחנה להערכת דינמיקת תא angiogenic במקומות ספציפיים בתוך סביבת רשת. השיטה גם מציעה כלי רומן לחקירת אנגיוגנזה, lymphangiogenesis ודם / הלימפה mis-להגנינג בו זמנית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drape Cardinal Health 4012 12” x 12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps
Scalpel Handle Roboz Surgical Instrument RS-9843 Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length
Sterile Surgical Blade Cincinnati Surgical 0110 Stainless Steel; Size 10
Culture Dish (60 mm) Thermo Scientific 130181 10/Sleeve
Graefe Forcep (curved tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5135 Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length
Graefe Forcep (straight tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5130 Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8 mm Tip Width; 4" Length
Noyes Micro Scissor Roboz Surgical Instrument RS-5677 Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;
Straight, Sharp-Blunt Points; 13 mm Cutting Edge; 0.25 mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length
Gauze Pads FisherBrand 13-761-52 Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4" x 4" 12-Ply
Cotton-Tippled Applicators FisherBrand 23-400-124 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only
6-Well Plate Fisher Scientific 08-772-49 Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic
Sterile Syring 5 mL Fisher Scientific 14-829-45 Luer-Lok Tip
Sterile Bowl Medical Action Industries Inc. 01232 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use
6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) SIGMA Z681792-3EA 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile
Polycarbonate Filter Membrane SIGMA TMTP04700 Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain
Name Company Catalog Number Comments/Description
Beuthanasia Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 011168 Active Ingredient: Per 100 mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50 mg phenytoin sodium 
Ketamine Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Kateset 100 mg/mL
Xylazine LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Anased 100 mg/mL
Saline Baxter 2F7122
PBS Invitrogen 14040-133
MEM Invitrogen 11095080
PenStrep Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 16000-044
BSA Jackson ImmunoResearch 001-000-162
Saponin  SIGMA S7900-100G
Isopropyl Alcohol Fisher Scientific S25372
Povidone-Iodine Operand 82-226
Hydrochloric Acid SIGMA 320331
Methanol Fisher Scientific 67-56-1
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
FITC-conjugated Lectin SIGMA L9381-2MG
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody SIGMA AB5320
PECAM (CD31) Antibody BD Biosciences 555026
LYVE-1 Antibody AngioBio Co. 11-034
Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 111-585-144
Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 115-227-003
Streptavidin Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 016-160-084
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen L3224
Normal Goat Serum  Jackson ImmunoResearch 005-000-121
5-Bromo-2'-Deoxyuridine SIGMA B5002
Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine                        Clone Bu20a Dako M074401-8
Mouse Anti-Rat CD11b  AbD Serotec MCA275R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407, (6801), 249-257 (2000).
  2. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, (7070), 932-936 (2005).
  3. Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4, (4), 547-559 (2011).
  4. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5, (9), 1518-1534 (2010).
  5. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (37), 15342-15347 (2011).
  6. Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7, (12), e50582 (2012).
  7. Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19, (3), 184-191 (2012).
  8. Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, (2), H235-H245 (2013).
  9. Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10, (3), e0119227 (2015).
  10. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63, (1), 115-122 (1990).
  11. Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).
  12. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5, (10), 1659-1665 (2010).
  13. Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, (5), 2347-2355 (2010).
  14. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, (3), 588-612 (2006).
  15. Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108 (2013).
  16. Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7 (2012).
  17. Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3, (2), 143-165 (1996).
  18. Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212, (1), 244-251 (2007).
  19. Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8, (4), 229-241 (2001).
  20. Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23, (2), 95-121 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics