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Developmental Biology

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Azimi, M. S., Motherwell, J. M., Murfee, W. L. An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks. J. Vis. Exp. (120), e55183, doi:10.3791/55183 (2017).

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Abstract

एंजियोजिनेसिस, पूर्व मौजूदा जहाजों से नए रक्त वाहिकाओं के विकास के रूप में परिभाषित किया गया, endothelial कोशिकाओं, pericytes, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और लसीका वाहिकाओं और तंत्रिकाओं के साथ समन्वय शामिल है। बहु-सेल, मल्टी सिस्टम बातचीत एक physiologically प्रासंगिक वातावरण में angiogenesis की जांच की जरूरत है। इस प्रकार, जबकि इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल के उपयोग यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान की है, एक आम आलोचना यह है कि वे एक microvascular नेटवर्क के साथ जुड़े जटिलता पुनरावृत्ति नहीं है। इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य से पहले और सुसंस्कृत चूहा अन्त्रपेशी ऊतकों में angiogenesis उत्तेजना के बाद बरकरार microvascular नेटवर्क के समय चूक तुलना करने के लिए क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए है। संवर्धित ऊतकों microvascular नेटवर्क है कि उनके पदानुक्रम को बनाए रखने के होते हैं। Immunohistochemical लेबलिंग endothelial कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, pericytes, रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि। मेंddition, बीएसआई-लेक्टिन के साथ ऊतकों लेबलिंग से पहले और सीरम या वृद्धि कारक उत्तेजना में वृद्धि हुई केशिका अंकुरण और पोत घनत्व की विशेषता के बाद स्थानीय नेटवर्क क्षेत्रों के समय चूक तुलना में सक्षम बनाता है। आम सेल संस्कृति मॉडल की तुलना में, इस विधि endothelial सेल वंश के अध्ययन और physiologically प्रासंगिक microvascular नेटवर्क में ऊतक विशिष्ट एन्जियोजेनिक दवा मूल्यांकन के लिए एक उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

माईक्रवैस्कुलर नेटवर्क के विकास और remodeling ऊतक समारोह के लिए आम हरों, घाव भरने, और कई विकृतियों रहे हैं और एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया angiogenesis, मौजूदा वाले 1, 2 से नए रक्त वाहिकाओं के विकास के रूप में परिभाषित किया गया है। ऊतक नए जहाजों इंजीनियरिंग या एन्जियोजेनिक आधारित चिकित्सा डिजाइनिंग, सेलुलर angiogenesis में शामिल गतिशीलता के महत्व को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, इस प्रक्रिया जटिल है। यह एक microvascular नेटवर्क के भीतर विशिष्ट स्थानों पर भिन्न है और अनेक प्रकार की कोशिकाओं (यानी endothelial कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, pericytes, मैक्रोफेज, स्टेम सेल) और कई सिस्टम (लसीका नेटवर्क और तंत्रिका नेटवर्क) शामिल कर सकते हैं। हालांकि इन विट्रो मॉडल अलग angiogenesis 3 में शामिल कोशिकाओं के बीच संबंधों की जांच करने के लिए काफी योगदान दिया है, उनकी शारीरिक प्रासंगिकता उनके व्यापार के कारण कम आंका जा सकती है r सीमित जटिलता और तथ्य यह है कि वे निकट एक विवो परिदृश्य को प्रतिबिंबित नहीं करते। इन सीमाओं, तीन आयामी संस्कृति प्रणालियों काबू पाने के लिए 3, पूर्व vivo ऊतक मॉडल 4, सिस्टम microfluidic 5, 6, और कम्प्यूटेशनल मॉडल 7 विकसित किया गया है और हाल के वर्षों में पेश किया। हालांकि, अब भी समय चूक की क्षमता के साथ एक मॉडल बरकरार microvascular नेटवर्क पूर्व vivo में angiogenesis की जांच करने के लिए एक की जरूरत है। जटिलता के स्तर के साथ angiogenesis के अध्ययन के लिए नए समय व्यतीत हो जाने के मॉडल की स्थापना angiogenesis को विनियमित करने अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रदान करेगा और चिकित्सा में सुधार होगा।

एक संभावित मॉडल है कि एक अक्षुण्ण microvascular नेटवर्क भर में angiogenesis के पूर्व vivo जांच में सक्षम बनाता चूहा अन्त्रपेशी संस्कृति मॉडल है> 8। हाल ही में काम में, हम दिखा दिया है कि रक्त और लसीका microvascular नेटवर्क संस्कृति के बाद व्यवहार्य रहते हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात, चूहा अन्त्रपेशी संस्कृति मॉडल कार्यात्मक pericyte endothelial सेल बातचीत, रक्त और लसीका endothelial सेल कनेक्शन है, और समय चूक इमेजिंग जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस पत्र का उद्देश्य समय चूक इमेजिंग विधि के लिए हमारे प्रोटोकॉल प्रदान करना है। हमारे प्रतिनिधि परिणाम अनेक प्रकार की कोशिकाओं है कि सीरम के साथ angiogenesis की उत्तेजना के बाद व्यवहार्य रहते हैं और ऊतक विशिष्ट एन्जियोजेनिक प्रतिक्रियाओं के साथ ही endothelial सेल ट्रैकिंग अध्ययन बढ़ाता के लिए इस विधि का उपयोग करने का उदाहरण प्रस्ताव दस्तावेज।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों और प्रक्रियाओं Tulane विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. सर्जिकल प्रक्रिया सेटअप

  1. आटोक्लेव उपकरणों, शल्य चिकित्सा की आपूर्ति, और सर्जरी से पहले संस्कृति की आपूर्ति। प्रत्येक चूहे के लिए शल्य चिकित्सा की आपूर्ति में शामिल हैं: 1 कपड़ा, पूर्व में कटौती छेद के साथ 1 टांगना (0.5 x 1.5 में) केंद्र में, धुंध पैड, और 1 शोषक underpad। सर्जिकल उपकरणों में शामिल हैं: एक नंबर 10 ब्लेड के साथ 1 छुरी, चिमटी के 2 जोड़ी है, और ठीक कैंची की एक जोड़ी। संस्कृति की आपूर्ति में शामिल हैं: 1 कपड़ा, चिमटी की 1 जोड़ी, और पॉली कार्बोनेट फिल्टर के साथ 6 अच्छी तरह से थाली सम्मिलित तैयार किया।
  2. एक Plexiglass मंच, एक शल्य चरण और 70% इथेनॉल के साथ एक शल्य benchtop अंतरिक्ष जीवाणुरहित। उपयोग करें जब तक एक बाँझ कटोरा में शल्य चिकित्सा मंच रखें।
    1. एक 100 मिमी संस्कृति डिश के केंद्र में छेद में 1 से एक लगभग 2 में ड्रिलिंग से एक शल्य चिकित्सा मंच बनाएँ। अगले, सुचारू करने के लिए sandpaper का उपयोगकिसी भी तेज किनारों और छेद के किनारों के लिए सिलिकॉन गोंद की एक परत जोड़ने के ऊतकों के लिए एक उठाया सतह बनाने के लिए।
    2. वैकल्पिक रूप से, सीएडी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर शल्य चिकित्सा मंच डिजाइन और 3 डी प्रिंटिंग (चित्रा 1) द्वारा बनाते हैं।
  3. एक बाँझ शोषक underpad नीचे रखें और यह की चोटी पर एक Plexiglass मंच लेट गई। कपड़ा रखें, एक पूर्व में कटौती छेद के बिना, एक गर्म पैड शोषक underpad करने के लिए अगले ओवर।
  4. पूर्व गर्म बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), मीडिया और 37 डिग्री सेल्सियस तक खारा। प्लेस मीडिया और हीटिंग पैड और एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब शल्य सेटअप करने के लिए अगले में जगह खारा के ऊपर अलग संस्कृति बर्तन में पीबीएस।
  5. सुनिश्चित करें कि सभी संकुल सर्जरी की शुरुआत से पहले खोल रहे हैं सभी सामग्री की बाँझ हैंडलिंग सुनिश्चित करने के लिए सुनिश्चित करें। इस प्रक्रिया में इस्तेमाल आम उपकरणों की एक पूरी सूची में सूचीबद्ध हैं विशिष्ट शल्य चिकित्सा सामग्री और उपकरणों की तालिका।

2. MesenterY ऊतक कटाई

  1. उपयोग वयस्क पुरुष Wistar चूहों (350 ± 25 ग्राम, 6 - उम्र के 8 सप्ताह)। अन्य नस्लों और चूहों की उम्र प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  2. Ketamine (80 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) और xylazine (8 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) के एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के माध्यम से चूहे anesthetize। पुष्टि चूहे उंगलियों के बीच बन्द रखो एक पलटा प्रतिक्रिया के लिए जाँच करने से संज्ञाहरण के तहत है; वहाँ कोई नहीं होना चाहिए। इस टर्मिनल प्रक्रिया के लिए अग्रकय पीड़ानाश आवश्यक नहीं है।
  3. पेट क्षेत्र दाढ़ी और बालों को हटाने क्रीम का उपयोग कर शेष बालों को हटा दें। 70% isopropyl शराब povidone आयोडीन के द्वारा पीछा के साथ दो बार पेट की त्वचा साफ कर लें। पोंछे के लिए सर्जन शल्य साइट के केंद्र में शुरू करने और एक परिपत्र तरीके से तैयार किए गए क्षेत्र के बाहर करने के लिए कदम के रूप में क्षेत्रों है कि पहले बाँझ धुंध या बाँझ कपास झाड़ू के एक ही टुकड़े से झाड़ी दिया ओवरलैप नहीं करना चाहिए। तो बाँझ शल्य सेटअप करने के लिए पशु हस्तांतरण और plexiglass बेनी के ऊपर जगहप्रपत्र।
  4. पेट उरोस्थि नीचे में 1 शुरू करने में 1.25 चीरा में - एक स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग, एक 0.75 में बनाते हैं। आंत्र या अन्त्रपेशी (त्वचा की परत 1, संयोजी ऊतक की परत 1, और मांसपेशियों के 1 परत) पंचर करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
  5. चीरा पर एक पूर्व में कटौती छेद के साथ एक कपड़ा रखें और टांगना के ऊपर एक बाँझ शल्य चरण जगह है। चीरा के साथ खोलने संरेखित करता है सुनिश्चित करें। का पता लगाने और शल्य चिकित्सा मंच खोलने के माध्यम से लघ्वान्त्र बाहर खींचने के लिए बाँझ कपास इत्तला दे दी applicators का प्रयोग करें।
  6. कपास इत्तला दे दी applicators का उपयोग करते हुए मंच के माध्यम से 8 mesenteric खिड़कियां, और सावधान खिड़कियां (चित्रा 1) को छूने के लिए नहीं हो सकता है - खींचो 6। ऊतकों आम तौर पर अंधान्त्र के पास शुरू छोटी आंत के लघ्वान्त्र क्षेत्र से काटा जाता है। उजागर ऊतकों गरम बाँझ खारा समाधान के रूप में ड्रिप के लिए एक बाँझ सिरिंज का उपयोग जरूरत के साथ नम रखें।
  7. Pentobarbital सोडियम की intracardiac इंजेक्शन के माध्यम से चूहा (चूहे प्रति 0.2 एमएल) euthanize। मेरे को हटाने से पहलेsenteric खिड़कियां, सुनिश्चित चूहे दिल को छूकर euthanized है; कोई नाड़ी होनी चाहिए।
  8. वसा पैड और ठीक कैंची खिड़की में कटौती करने को हड़पने के लिए चिमटी का उपयोग करके वांछित अन्त्रपेशी ऊतकों निकालें। वसा (2 मिमी) खिड़की के आसपास की एक सीमा छोड़ दें। मीडिया में गर्म बाँझ पीबीएस में एक बार ऊतकों को धो लें और एक बार।
  9. उदर गुहा को exteriorized लघ्वान्त्र लौटें और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार पशु के निपटान के।

समय चूक अध्ययन के लिए 3. अन्त्रपेशी टिशू कल्चर

  1. स्थानांतरण autoclaved संस्कृति की आपूर्ति (खंड 1.1 देखें) और एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड के लिए ऊतकों।
  2. एक पॉली कार्बोनेट फिल्टर झिल्ली के ऊपर प्रत्येक ऊतक हस्तांतरण करने के लिए चिमटी का प्रयोग करें। वसा पैड से पकड़ो ऊतकों वाहिका को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए।
  3. मोटी जल्दी पैड का उपयोग कर, खिड़की को छूने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा ऊतक फैल गया। 6 अच्छी तरह से थाली के तल में ऊतक के साथ सम्मिलित पलटना और मीडिया के 3 एमएल (चित्रा 1 के साथ कवर
  4. 3.3 ऊपर से 5 दिनों के लिए प्रत्येक ऊतक और मानक इनक्यूबेटर परिस्थितियों में संस्कृति (5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस) के लिए - दोहराएँ 3.2 कदम।

4. अन्त्रपेशी ऊतक के समय चूक इमेजिंग

  1. इमेजिंग के दिन, संयुग्मित बीएसआई-Lectin के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक में मीडिया के पूरक और 30 मिनट के लिए मानक संस्कृति की शर्तों के तहत सेते हैं। ऊतकों लेक्टिन मुक्त मीडिया के साथ दो बार धोएं। बीएसआई-Lectin दाग संस्कृति में 3 दिन तक के लिए अन्त्रपेशी ऊतक पर दिखाई रहेगा।
  2. एक खुर्दबीन चरण के लिए थाली हस्तांतरण। उनकी आकृति विज्ञान और नेटवर्क संरचना के आधार पर रक्त और लसीका वाहिकाओं को पहचानें।
  3. प्रत्येक ऊतक पर एक वांछित नेटवर्क क्षेत्र का पता लगाने और चित्र लेने। इमेजिंग का ध्यान रखनाएक ही क्षेत्र सुनिश्चित करने के लिए स्थान बाद में छवियों के लिए कब्जा कर लिया जाएगा। एक मोटर चालित मंच का उपयोग करते हैं, तो निर्देशांक दस्तावेज़।
  4. इनक्यूबेटर ऊतकों लौटें और वांछित अंत बिंदु तक संस्कृति के लिए जारी है। दोहराएँ 4.1 कदम - 4.3 के रूप में वांछित प्रयोगात्मक समय बिंदुओं के आधार पर की जरूरत है।

5. ऊतक immunolabeling

  1. बीएसआई-Lectin लेबलिंग
    1. 1:40 मीडिया में FITC संयुग्मित लेक्टिन (6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 2.5 एमएल एंटीबॉडी समाधान) मीडिया के साथ दो rinses द्वारा पीछा के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ऊतकों को सेते हैं। rinses के लिए, मीडिया को जोड़ने और फिर तुरंत बदलें।
  2. लाइव / मृत लेबलिंग
    1. 1 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं ऊतकों: 500 2 मिमी ethidium homodimer-1 और 1: 500 मीडिया में 1 मिमी calcein AM (6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 2.5 एमएल एंटीबॉडी समाधान) मीडिया के साथ दो rinses द्वारा पीछा किया।
  3. बीएसआई-Lectin / NG2 लेबलिंग
    1. एक खुर्दबीन पर बिखरा हुआ ऊतकों गिरावटई (1 - 2 के ऊतकों / स्लाइड) और सूखे के लिए अनुमति देते हैं। मजबूती से नीचे दबाने वसा आबकारी करने से एक छुरी के साथ अतिरिक्त चर्बी हटाने।
    2. -20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ठंड मेथनॉल में ऊतकों को ठीक करें। पीबीएस (3 एक्स 10 मिनट) के साथ ऊतकों को धो लें।
    3. 100 खरगोश पॉलीक्लोनल NG2 एंटीबॉडी और 5% सामान्य बकरी सीरम (NGS): प्राथमिक एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए 1 के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊतकों सेते हैं। पीबीएस (3 एक्स 10 मिनट) के साथ ऊतकों को धो लें।
    4. माध्यमिक एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए 1 के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊतकों सेते: 100 बकरी विरोधी खरगोश CY2 संयुग्मित एंटीबॉडी (GAR-CY2) और 5% NGS। पीबीएस (3 एक्स 10 मिनट) के साथ ऊतकों को धो लें।
    5. 01:40 पीबीएस में FITC संयुग्मित लेक्टिन पीबीएस के साथ दो rinses द्वारा पीछा के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ऊतकों को सेते हैं। rinses के लिए, पीबीएस जोड़ने के लिए और फिर तुरंत बदलें।
    6. स्लाइड माउंट करने के लिए, और शीर्ष पर 50:50 पीबीएस के साथ ऊतकों ग्लिसरॉल समाधान और जगह coverslip को कवर किया। नेल पॉलिश का उपयोग स्लाइड किनारों को सील।
  4. LYVE-1 / PECAM लेबलिंग
    1. एक खुर्दबीन स्लाइड पर ऊतकों बिखरा हुआ है (1 - 2 के ऊतकों / स्लाइड) और सूखे के लिए अनुमति देते हैं। मजबूती से नीचे दबाने वसा आबकारी करने से एक छुरी के साथ अतिरिक्त चर्बी हटाने।
    2. -20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ठंड मेथनॉल में ऊतकों को ठीक करें। पीबीएस + 0.1% सैपोनिन (3 एक्स 10 मिनट) के साथ ऊतकों को धो लें।
    3. 200 माउस मोनोक्लोनल biotinylated CD31 एंटीबॉडी और 1: प्राथमिक एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए 1 के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊतकों सेते 100 खरगोश पॉलीक्लोनल LYVE -1 पीबीएस + 0.1% सैपोनिन + 2% गोजातीय सीरम albumin में एंटीबॉडी (बीएसए) + 5% NGS । पीबीएस + 0.1% सैपोनिन (3 एक्स 10 मिनट) के साथ ऊतकों को धो लें।
    4. 500 CY3 संयुग्मित streptavidin एंटीबॉडी और 1: पीबीएस + 0.1% सैपोनिन + 2% बीएसए + 5% NGS में 100 GAR-CY2 माध्यमिक एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए, 1 के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊतकों सेते हैं। पीबीएस + 0.1% सैपोनिन (3 एक्स 10 मिनट) के साथ ऊतकों को धो लें।
    5. 50:50 पीबीएस और ग्लिसरॉल समाधान के साथ स्लाइड, कवर ऊतकों माउंट और शीर्ष पर एक coverslip जगह के लिए। नेल पॉलिश का उपयोग स्लाइड किनारों को सील।
  5. BrdU / बीएसआई-Lectin लेबलिंग
    1. 1 मिलीग्राम / एमएल BrdU मीडिया में जोड़े और BrdU समाधान के साथ ऊतक मीडिया की जगह। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
    2. एक खुर्दबीन स्लाइड पर ऊतकों बिखरा हुआ है (1 - 2 के ऊतकों / स्लाइड) और सूखे के लिए अनुमति देते हैं। मजबूती से नीचे दबाने वसा आबकारी करने से एक छुरी के साथ अतिरिक्त चर्बी हटाने।
    3. -20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ठंड मेथनॉल में ऊतकों को ठीक करें। पीबीएस (3 एक्स 10 मिनट) के साथ ऊतकों को धो लें।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 2 एम एचसीएल में ऊतक डीएनए denature। पीबीएस + 0.1% सैपोनिन (3 एक्स 10 मिनट) में ऊतकों को धो लें।
    5. 100 मोनोक्लोनल माउस पीबीएस + 0.1% सैपोनिन + 2% बीएसए + 5% NGS में विरोधी BrdU: प्राथमिक एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए, 1 के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊतकों सेते हैं। पीबीएस + 0.1% सैपोनिन (3 एक्स 10 मिनट) के साथ ऊतकों को धो लें।
    6. माध्यमिक एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए, 1 के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊतकों सेते: 100 बकरी विरोधी माउस Cy3 संयुग्मित एंटीबॉडी पीबीएस + 0.1% सैपोनिन + 2% बीएसए + 5% NGS में (GAM-Cy3)। पीबीएस + 0.1% सैपोनिन (3 एक्स 10 मिनट) के साथ ऊतकों को धो लें।
    7. शीर्ष पर 50:50 पीबीएस के साथ स्लाइड, कवर ऊतकों और ग्लिसरॉल समाधान और जगह coverslip माउंट करने के लिए। नेल पॉलिश का उपयोग स्लाइड किनारों को सील।
  6. बीएसआई-Lectin / CD11b लेबलिंग
    1. एक खुर्दबीन स्लाइड पर ऊतकों बिखरा हुआ है (1 - 2 के ऊतकों / स्लाइड) और सूखे के लिए अनुमति देते हैं। मजबूती से नीचे दबाने वसा आबकारी करने से एक छुरी के साथ अतिरिक्त चर्बी हटाने।
    2. -20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ठंड मेथनॉल में ऊतकों को ठीक करें। पीबीएस + 0.1% सैपोनिन (3 एक्स 10 मिनट) के साथ ऊतकों को धो लें।
    3. प्राथमिक एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए 1 के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊतकों सेते: पीबीएस + 0.1% सैपोनिन + 2% बीएसए + 5% NGS में 100 माउस विरोधी चूहा CD11b। पीबीएस + 0.1% सैपोनिन (3 एक्स 10 मिनट) के साथ ऊतकों को धो लें।
    4. माध्यमिक एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए सेते हैं 1 के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊतकों: पीबीएस + 0.1% सैपोनिन + 2% बीएसए + 5% NGS में 100 GAM-Cy3। पीबीएस के साथ ऊतकों धो+ 0.1% सैपोनिन (3 एक्स 10 मिनट)।
    5. 01:40 पीबीएस में FITC संयुग्मित लेक्टिन पीबीएस के साथ दो rinses द्वारा पीछा के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ऊतकों को सेते हैं।
    6. शीर्ष पर 50:50 पीबीएस के साथ स्लाइड, कवर ऊतकों और ग्लिसरॉल समाधान और जगह coverslip माउंट करने के लिए। नेल पॉलिश का उपयोग स्लाइड किनारों को सील।

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Representative Results

संस्कृति में 3 दिनों के बाद, ऊतकों एक लाइव / मृत व्यवहार्यता / cytotoxicity किट चूहा अन्त्रपेशी संस्कृति मॉडल (2A चित्रा) में microvasculature की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करने के साथ लेबल रहे थे। अन्त्रपेशी में मौजूद कोशिकाओं के बहुमत संस्कृति जहां endothelial कोशिकाओं microvascular खंडों में उनके स्थान के आधार पर पहचान की गई व्यवहार्य में बने रहे। Endothelial सेल प्रसार भी लेक्टिन / BrdU लेबलिंग (चित्रा 2 डी) द्वारा पुष्टि की गई। चिकनी पेशी सेल और जहाजों के साथ pericyte उपस्थिति NG2 लेबलिंग (चित्रा 2 बी) के साथ की पुष्टि की थी। LYVE1 और PECAM के लिए लेबलिंग लसीका और रक्त microvascular नेटवर्क शाखाओं में पहचान की है और बनाम रक्त endothelial सेल phenotype (चित्रा -2) लसीका बनाए रखा पुष्टि की।

इस मॉडल के समय चूक सुविधा microva लेबलिंग द्वारा उपयोग किया गया थाअलग अलग समय बिंदुओं पर बीएसआई-लेक्टिन और समय के साथ नेटवर्क के भीतर एक ही क्षेत्र इमेजिंग के साथ scular नेटवर्क; इस क्षमता ऊतक विशिष्ट एन्जियोजेनिक प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। 10% सीरम के साथ मीडिया की पूरकता उत्तेजना के 3 दिन बाद एक मजबूत एन्जियोजेनिक प्रतिक्रिया का कारण बना। इसके अतिरिक्त, नई पोत क्षेत्रों और केशिका अंकुरित दिन 5 उत्तेजना की (चित्रा 3) द्वारा की पहचान की गई। समय चूक इमेजिंग विधि से पहले और (चित्रा 4) उत्तेजना के बाद नेटवर्क क्षेत्रों के मात्रात्मक तुलना के लिए अनुमति दी। इस प्रतिनिधि अध्ययन है, जो हमारे पिछले परिणामों की पुष्टि होती है 9 के लिए, नाड़ी क्षेत्र के प्रति जहाजों की संख्या और नाड़ी क्षेत्र के प्रति केशिका अंकुरित की संख्या ऊतक के प्रति एक 4X छवि से मात्रा गया। रक्त पोत क्षेत्रों लेक्टिन पॉजिटिव खून endothelial सेल दो शाखा अंक और केशिका अंकुरित के बीच उपस्थित क्षेत्रों के रूप में परिभाषित किया गया समाप्त हो गया अंधा के रूप में परिभाषित किया गया क्षेत्रों के एक मेजबान के पोत से होने वाले। नेटवर्क क्षेत्रों के समय चूक तुलना भी (चित्रा 5) endothelial सेल क्षेत्रों की ट्रैकिंग और रक्त / लसीका पोत गलत patterning की पहचान सक्षम (चित्रा 6)। लेक्टिन और CD11b के लिए सभ्य ऊतकों की लेबलिंग इसके अतिरिक्त remodeling नेटवर्क में (चित्रा 7) मध्य निवासी मैक्रोफेज की उपस्थिति की पुष्टि की।

आकृति 1
चित्रा 1. Mesenteric खिड़कियों के एक शल्य चिकित्सा मंच के माध्यम से छोटी आंत बाहर खींच कर स्थित थे। शल्य चिकित्सा मंच बनाया गया है और 3-डी प्रिंटिंग द्वारा किया गया था। केंद्र में अण्डाकार छेद लगभग 2 1 से में (ए) में है। Mesenteric खिड़कियों तो एक झिल्ली डालने के शीर्ष पर बाहर फैल रहे थे, और डालने उल्टे गया था और एक अच्छी तरह से (बी) में डाल दिया। स्केल बार = 2 सेमी।ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55183/55183fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. रक्त वाहिकाओं चूहा अन्त्रपेशी संस्कृति मॉडल में सक्षम रहते हैं। लाइव / मृत संस्कृति के बाद किया परख मृत कोशिकाओं (लाल) विशेष रूप से रक्त वाहिकाओं (ए) के साथ करने के लिए जीवित कोशिकाओं (हरा) के एक उच्च अनुपात से पता चला है। अन्त्रपेशी ऊतकों लेक्टिन और विरोधी NG2 साथ लेबल रहे थे, के साथ वाहिकाओं (हरा) pericytes (लाल) की पहचान करने और पुष्टि करने के लिए कोशिकाओं की है कि विभिन्न प्रकार के पोस्ट-संस्कृति के ऊतकों (बी) में मौजूद हैं। ऊतकों भी PECAM के खिलाफ लेबल थे / LYVE -1 लसीका से रक्त (लाल) के जहाजों की पहचान करने के लिए (हरा) वाहिकाओं (सी)। यदि microvascular कोशिकाओं संस्कृति में प्रसार से गुजरना की जांच करने के लिए, अन्त्रपेशी ऊतकों लेक्टिन / विरोधी BrdU साथ लेबल रहे थे । केशिका खंडों लेक्टिन (हरा) के साथ लेबल पर, एकाधिक कोशिकाओं proliferative (लाल) (डी) के होने की पुष्टि की गई। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा चूहा अन्त्रपेशी की 3. समय चूक इमेजिंग संस्कृति के पाठ्यक्रम पर microvascular remodeling के अवलोकन के लिए सक्षम बनाता है। एक मजबूत एन्जियोजेनिक प्रतिक्रिया के बाद 3 से 10% सीरम उत्तेजना के साथ संस्कृति का (बी) और 5 दिन (सी) मनाया गया। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 4. चूहा अन्त्रपेशी संस्कृति मॉडल में microvascular नेटवर्क से पहले और angiogenesis के बाद imaged थे। 10% सीरम के साथ दिन में 0 और दिन 3 (ए, बी) पर लेक्टिन के साथ लेबल एक ही नेटवर्क के बाद उत्तेजना की तुलना नए जहाजों को पहचानती है। लेक्टिन भी अज्ञात मध्य कोशिकाओं की आबादी लेबल। पोत घनत्व (सी, डी) और नाड़ी क्षेत्र (ई, एफ) प्रति केशिका अंकुरित की संख्या की मात्रा प्रत्येक ऊतक के लिए दोनों मीट्रिक में वृद्धि की पुष्टि की। सी, ई) इससे पहले (0 दिन) और बाद में (3 दिन) ऊतक प्रति तुलना। डी, एफ) की तुलना 0 दिन और दिन के बीच 3 एक बनती छात्र की टी परीक्षण का उपयोग औसत नाड़ी क्षेत्र के प्रति) पोत क्षेत्रों के दोनों औसत संख्या (पी <0.0001 और अंकुरित की औसत संख्या (पी <0.00001 में एक महत्वपूर्ण अंतर) इस बात की पुष्टि । सफेद सलाखों दिन 0 प्रतिनिधित्व करते हैं, और काली सलाखों के दिन 3. Valu प्रतिनिधित्वतों ± SEM के औसत हैं। इस प्रतिनिधि विश्लेषण के लिए, 13 ऊतकों 2 चूहों से काटा गया। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चूहा अन्त्रपेशी संस्कृति मॉडल 5. चित्रा पास के नेटवर्क में संवहनी द्वीप भाग्य और समावेश की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। समय चूक इमेजिंग, नाड़ी द्वीप समूह, कट endothelial क्षेत्रों के रूप में परिभाषित का उपयोग करना, 0 दिन पर पहचान की गई है और आसपास के नेटवर्क से अपने कनेक्शन 3 दिन के बाद एन्जियोजेनिक उत्तेजना से पुष्टि की गई। अन्त्रपेशी ऊतकों bFGF (ए, बी) और वीईजीएफ़ / PDFG-बी बी (सी, डी) के साथ प्रेरित किया गया। खोखले तीर 0 दिन पर काट दिया खंडों दिखाने के लिए और ठोस तीर networ द्वीप कनेक्शन का प्रतिनिधित्वकश्मीर। तीर एक संवहनी द्वीप और आसपास के नेटवर्क के बीच कनेक्शन के स्थान संकेत मिलता है। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 समय चूक छवियों लसीका और रक्त वाहिका patterning पालन करने की क्षमता प्रदर्शित करता है। लसीका (एल) वाहिकाओं धमनियों (क) और venules से प्रतिष्ठित किया जा सकता है (v) दिवस 0 (ए) पर लेबलिंग आकृति विज्ञान पर आधारित है। 10% सीरम के साथ दिन 5 पद-उत्तेजना पर, लसीका आकृति विज्ञान खो दिया है और जहाजों पास एन्जियोजेनिक रक्त वाहिकाओं (बी) के साथ एकीकृत है दिखाई देते हैं। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का संस्करण।

चित्रा 7
चित्रा 7. मैक्रोफेज सुसंस्कृत चूहे mesenteric ऊतकों में मौजूद रहते हैं। लेक्टिन / CD11b 10% सीरम के साथ 3 दिनों के लिए सुसंस्कृत ऊतकों के सह-लेबलिंग का सुझाव है कि लेक्टिन सकारात्मक मध्य कोशिकाओं मैक्रोफेज के एक सबसेट हैं। (ए) बीएसआई-लेक्टिन लेबलिंग के एक प्रतिनिधि छवि। देखने का एक ही क्षेत्र में (बी) CD11b लेबलिंग। (सी) मर्ज किए गए छवि। तीर सह लेबलिंग का उदाहरण पहचान। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल microvascular नेटवर्क के विकास के समय चूक इमेजिंग के लिए एक पूर्व vivo उपकरण के रूप में चूहा अन्त्रपेशी संस्कृति मॉडल का उपयोग करने के लिए एक विधि दस्तावेजों। हमारी प्रयोगशाला में पिछले काम 1 के लिए हमारे मॉडल) angiogenesis 8, 2) lymphangiogenesis 8, 3) pericyte endothelial सेल बातचीत 8, और 4) विरोधी एन्जियोजेनिक औषधि परीक्षण 9 के उपयोग की स्थापना की है। कई बिंदुओं पर समय सुसंस्कृत चूहा अन्त्रपेशी ऊतकों इमेजिंग के लिए क्षमता ऊतक विशेष विकास के हिमायती और विभिन्न एन्जियोजेनिक उत्तेजनाओं के दौरान सेल सेल बातचीत की ट्रैकिंग के मूल्यांकन के लिए एक मात्रात्मक परख प्रदान करता है। Angiogenesis के दौरान endothelial कोशिकाओं की वृद्धि की प्रसार और pericytes की उपस्थिति हमारे पिछले काम 8 के साथ संगत कर रहे हैं और सुसंस्कृत चूहे mesenteric ऊतकों में angiogenesis के दौरान कई प्रकार की कोशिकाओं के बीच गतिशील बातचीत मान्य।

इन विट्रो सेल संस्कृति प्रणालियों की तुलना में, चूहा अन्त्रपेशी संस्कृति मॉडल अद्वितीय है क्योंकि विकास एक अक्षुण्ण, असली microvascular नेटवर्क के भीतर होता है। इसके विपरीत में महाधमनी अंगूठी परख है, जो एक कोलेजन जेल के 10 में महाधमनी क्षेत्रों से एन्जियोजेनिक अंकुरण अध्ययन करने के लिए स्थापित किया गया था पर विचार करें। जबकि महाधमनी रिंग में अंकुरण अनेक प्रकार की कोशिकाओं शामिल है, केशिका अंकुरित महाधमनी, जो इन विवो परिदृश्य से बहुत अलग है की excised खंडों से बाहर हो जाना। मस्तिष्क टुकड़ा मॉडल एक और पूर्व vivo मॉडल है, लेकिन यह लसीका वाहिकाओं के शून्य है। इसके अलावा, मस्तिष्क टुकड़ा मॉडल से पहले और एन्जियोजेनिक उत्तेजना 11 के बाद समय चूक इमेजिंग के लिए सक्षम होना दिखाया नहीं गया है। एक अन्य पूर्व vivo मॉडल है कि हाल ही में शुरू की गई है रेटिना संस्कृति मॉडल है। रेटिना मॉडल का लाभ यह है कि angiogenesis बरकरार microvascu से होता हैऊतक 12, 13 के भीतर LAR नेटवर्क। इन मॉडलों के लिए, GFP ट्रांसजेनिक चूहों उपभेदों समय के साथ अंकुरण केशिका निरीक्षण करने के लिए सक्षम होने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन दुर्भाग्य से, माउस अन्त्रपेशी avascular 14 के रूप में हमारे मॉडल में उपयोग किया है, चूहा अन्त्रपेशी के लिए GFP ट्रांसजेनिक चूहों अन्त्रपेशी प्रतिस्थापन को नष्ट करने,। इसके अलावा, हम बताते हैं कि संस्कृति में चूहा अन्त्रपेशी ऊतकों की एक सरल लेक्टिन लेबलिंग अलग समय बिंदुओं पर और अन्य पूर्व vivo मॉडल की तुलना में नेटवर्क के विकास को निर्धारित करने के लिए पर्याप्त है, हमारे मॉडल दोनों के रक्त और लसीका endothelial कोशिकाओं के साथ अवलोकन के लिए अनुमति देता है।

बीएसआई-लेक्टिन इस पत्र में इस्तेमाल किया गया था microvascular नेटवर्क कल्पना और एन्जियोजेनिक प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए। लेक्टिन एक प्रोटीन संरचना है कि endothelial कोशिकाओं पर ग्लाइकोप्रोटीन को बांधता है और endothelial antib की तुलना में अपनी छोटी ऊष्मायन समय के कारण इस प्रोटोकॉल के लिए चयनित किया गया था हैody मार्करों। लेक्टिन एंटीबॉडी की तुलना में कम खर्चीला है और यह तय करने की आवश्यकता नहीं है; यह भी आसानी से संस्कृति मीडिया में मिलाया जाता है और ऊष्मायन अवधि समाप्त होने के बाद नए सिरे से मीडिया के साथ बदला जा सकता है। जबकि भविष्य के अध्ययनों एन्जियोजेनिक प्रक्रिया पर लेक्टिन लेबलिंग तकनीक के संभावित प्रभाव को स्पष्ट करने की जरूरत है, हमारे प्रतिनिधि परिणाम (चित्रा 4) का प्रदर्शन मजबूत angiogenesis प्रेरित किया जा सकता है और पिछले काम 9 दर्शाता है कि लेक्टिन लेबल नेटवर्क में angiogenesis को निशाना बनाने के माध्यम से हिचकते जा सकता है संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF)। एंटीबॉडी मार्करों संभावित या जब अधिक विशिष्ट मार्करों के लिए एक की जरूरत है एक वैकल्पिक लेबलिंग दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जब अन्य प्रकार की कोशिकाओं है कि इस तरह चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, pericytes, और नसों के रूप में microvascular नेटवर्क में मौजूद हैं जांच करने के लिए एक की जरूरत है। visualizing कोशिकाओं के लिए एक अन्य संभावित विधि जीन अभिकर्मक होगा।

समय चूक चूहा अन्त्रपेशी मॉडल का उपयोग करने का लाभ इस प्रोटोकॉल के लिए प्रतिनिधि परिणाम में प्रकाश डाला गया है। पहले और बाद में इलाज छवियों की तुलना परिवर्तनशीलता के मुद्दों को प्रभावित गैर बनती सांख्यिकीय विश्लेषण कम कर देता है। explant विशिष्ट प्रतिक्रियाओं पोत घनत्व में 20% 233% तक वृद्धि से और अंकुर घनत्व में 40% 3500% वृद्धि से विविध। इस बदलाव के लिए विशिष्ट कारण अज्ञात बने हुए हैं, लेकिन समय के साथ ही ऊतक में विकास को मापने के ऊतक विशिष्ट प्रतिक्रियाओं पुष्टि करने की क्षमता मौजूद है।

microvascular विकास के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर छवियों का तुलनात्मक विश्लेषण भी endothelial कोशिकाओं पर नज़र रखने के लिए अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, हमारी प्रयोगशाला microvascular नेटवर्क के आसपास है कि पास के नेटवर्क 15, 16 से काट रहे हैं में endothelial सेल क्षेत्रों के रूप में संवहनी द्वीपों की पहचान की है। इस बात की पुष्टि करने के लिए कि इन द्वीपों पास networ से कनेक्टएन्जियोजेनिक उत्तेजनाओं के जवाब में कश्मीर, चूहा अन्त्रपेशी संस्कृति मॉडल का इस्तेमाल किया गया था। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 5, नाड़ी द्वीपों बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) या वीईजीएफ़ प्लस प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक (PDGF) के साथ ऊतक उत्तेजना के बाद ट्रैक किए गए थे। हम भी इसी तरह के परिणाम के बाद सीरम उत्तेजना से पता चला है (डेटा यहाँ नहीं दिखाया गया है)। angiogenesis की उत्तेजना के बाद, मूल रूप से काट दिया संवहनी द्वीपों पाया जा सकता है पास के नेटवर्क से जुड़ा है।

चूहा अन्त्रपेशी संस्कृति मॉडल के अन्य संभावित अनुप्रयोगों लसीका और रक्त वाहिकाओं और उनके संबंधित endothelial कोशिकाओं और मध्य सेल भाग्य की ट्रैकिंग के बीच संबंधों की जांच करने की क्षमता का लाभ उठाने सकता है। पहले और इस मॉडल में 10% सीरम के साथ उत्तेजना के बाद ही microvascular नेटवर्क के समय चूक छवियों संभावित लसीका करने वाली रक्त वाहिनियों एकीकरण (चित्रा 6) के उदाहरण प्रदान की है। इससे पहले कि उत्तेजना, लसीका और रक्त Vessएल्स पोत आकृति विज्ञान के आधार पर प्रतिष्ठित किया गया। उत्तेजना के बाद, लसीका बनाम रक्त वाहिनियों की पहचान कम स्पष्ट हो गया। लसीका / रक्त endothelial सेल बातचीत के लिए संभावित PECAM के अवलोकन के द्वारा समर्थित है + / LYVE-1- रक्त endothelial PECAM के साथ जोड़ने की कोशिकाओं + / LYVE-1 + लसीका endothelial कोशिकाओं (यहाँ नहीं दिखाया डेटा)। इन टिप्पणियों लसीका / रक्त endothelial सेल प्लास्टिसिटी की जांच के लिए चूहा अन्त्रपेशी संस्कृति मॉडल के उपयोग का समर्थन। चित्रा 6A भी स्पष्ट मध्य कोशिकाओं के लेक्टिन लेबलिंग पर प्रकाश डाला गया। हालांकि इस लेबलिंग असंगत और ऊतकों को ऊतकों से विषम है, यह अंतर्जात ऊतक निवासी कोशिकाओं की उपस्थिति पर जोर देना है। सुसंस्कृत ऊतकों की CD11b लेबलिंग (चित्रा 7) से पता चलता है इन लेक्टिन पॉजिटिव मध्य कोशिकाओं मैक्रोफेज की एक उप-सेट किया जा सकता है। Angiogenesis 20 में बृहतभक्षककोशिका भागीदारी में उभरते ब्याज की अतिरिक्त ताकत को देखते हुएमॉडल समय पर बृहतभक्षककोशिका गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए इसके उपयोग हो सकता है।

ज्यादा अन्य पूर्व vivo मॉडल की तरह, चूहा अन्त्रपेशी संस्कृति मॉडल में angiogenesis का अध्ययन करने के लिए एक मौजूदा सीमा रक्त प्रवाह की कमी है। कतरें रक्त के प्रवाह की वजह से तनाव endothelial सेल आकृति विज्ञान और प्रसार के साथ ही angiogenesis 17, 18, 19 में एक भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। चित्रा 4 में प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणामों के लिए, कतरनी तनाव के अभाव अकेले सुसंस्कृत नेटवर्क में एक एन्जियोजेनिक प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त हो सकता है। हालांकि, हम जानते हैं कि हमारे प्रारंभिक प्रकाशन चूहा अन्त्रपेशी संस्कृति मॉडल 8 निस्र्पक पर आधारित है, कि मीडिया पूरकता कारणों angiogenesis अकेले मीडिया बनाम वृद्धि हुई है। सुसंस्कृत microvascular नेटवर्क के भीतर प्रवाह को शामिल भविष्य के अध्ययन निस्संदेह अधिक बारीकी से नकल करने की जरूरत हैविवो परिदृश्य में। को शामिल करने के प्रवाह की क्षमता दृष्टिकोण नेटवर्क खिला धमनियों की केन्युलेशन या mesenteric खिड़कियों की वसा सीमा के भीतर आगे नदी के ऊपर धमनियों की भी केन्युलेशन शामिल हो सकता है। हालांकि, प्रवाह की कमी के बावजूद, अनेक प्रकार की कोशिकाओं की व्यवहार्यता, angiogenesis के दौरान रक्त और लसीका microvascular नेटवर्क, और सेल प्रसार के रखरखाव के लिए इन विट्रो मॉडल में आधारित सेल की तुलना में जटिलता का चूहा अन्त्रपेशी संस्कृति मॉडल के रिश्तेदार स्तर में वृद्धि का समर्थन करता है।

अंत में, इस प्रोटोकॉल बरकरार microvascular नेटवर्क में एन्जियोजेनिक प्रतिक्रियाओं इमेजिंग के लिए एक सरल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पूर्व vivo विधि का वर्णन है। इस तरह की एक विधि एक नेटवर्क वातावरण के भीतर विशिष्ट स्थानों पर एन्जियोजेनिक सेल गतिशीलता के मूल्यांकन के लिए इन विट्रो मॉडल में स्थित सेल के लिए एक विकल्प प्रदान करता है। विधि को भी angiogenesis, lymphangiogenesis और रक्त / लसीका की जांच के लिए एक उपन्यास उपकरण प्रदान गलत गपशपनिंग एक साथ।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drape Cardinal Health 4012 12” x 12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps
Scalpel Handle Roboz Surgical Instrument RS-9843 Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length
Sterile Surgical Blade Cincinnati Surgical 0110 Stainless Steel; Size 10
Culture Dish (60 mm) Thermo Scientific 130181 10/Sleeve
Graefe Forcep (curved tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5135 Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length
Graefe Forcep (straight tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5130 Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8 mm Tip Width; 4" Length
Noyes Micro Scissor Roboz Surgical Instrument RS-5677 Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;
Straight, Sharp-Blunt Points; 13 mm Cutting Edge; 0.25 mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length
Gauze Pads FisherBrand 13-761-52 Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4" x 4" 12-Ply
Cotton-Tippled Applicators FisherBrand 23-400-124 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only
6-Well Plate Fisher Scientific 08-772-49 Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic
Sterile Syring 5 mL Fisher Scientific 14-829-45 Luer-Lok Tip
Sterile Bowl Medical Action Industries Inc. 01232 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use
6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) SIGMA Z681792-3EA 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile
Polycarbonate Filter Membrane SIGMA TMTP04700 Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain
Name Company Catalog Number Comments/Description
Beuthanasia Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 011168 Active Ingredient: Per 100 mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50 mg phenytoin sodium 
Ketamine Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Kateset 100 mg/mL
Xylazine LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Anased 100 mg/mL
Saline Baxter 2F7122
PBS Invitrogen 14040-133
MEM Invitrogen 11095080
PenStrep Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 16000-044
BSA Jackson ImmunoResearch 001-000-162
Saponin  SIGMA S7900-100G
Isopropyl Alcohol Fisher Scientific S25372
Povidone-Iodine Operand 82-226
Hydrochloric Acid SIGMA 320331
Methanol Fisher Scientific 67-56-1
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
FITC-conjugated Lectin SIGMA L9381-2MG
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody SIGMA AB5320
PECAM (CD31) Antibody BD Biosciences 555026
LYVE-1 Antibody AngioBio Co. 11-034
Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 111-585-144
Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 115-227-003
Streptavidin Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 016-160-084
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen L3224
Normal Goat Serum  Jackson ImmunoResearch 005-000-121
5-Bromo-2'-Deoxyuridine SIGMA B5002
Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine                        Clone Bu20a Dako M074401-8
Mouse Anti-Rat CD11b  AbD Serotec MCA275R

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References

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