En

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Azimi, M. S., Motherwell, J. M., Murfee, W. L. An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks. J. Vis. Exp. (120), e55183, doi:10.3791/55183 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Angiogenes, definieras som tillväxten av nya blodkärl från redan existerande kärl, involverar endotelceller, pericyter, glatta muskelceller, immunceller och samordning med lymfkärl och nerver. Multi-cell, flera system interaktioner nödvändiggör undersökning av angiogenes i en fysiologiskt relevant miljö. Således, medan användningen av cellkultur in vitro-modeller har gett mekanistiska insikter, är en vanlig kritik att de inte rekapitulera komplexiteten associerad med en mikrovaskulär nätverk. Syftet med detta protokoll är att visa förmåga att göra tidsförlopp jämförelser av intakta mikrovaskulära nätverk före och efter angiogenes stimulering i odlade råtta tarmkäxet vävnader. Odlade vävnader innehåller mikrovaskulära nätverk som upprätthåller deras hierarki. Immunhistokemisk märkning bekräftar närvaron av endotelceller, glatta muskelceller, pericyter, blodkärl och lymfkärl. I enddition, märkning vävnader med BSI-lektin kan time-lapse jämförelse av de lokala nätverksregioner före och efter serum eller tillväxtfaktor stimulering kännetecknas av ökad kapillär groning och kärltäthet. I jämförelse med vanliga cellodlingsmodeller, ger denna metod ett verktyg för endotelceller linjestudier och vävnadsspecifika angiogena läkemedel utvärdering i fysiologiskt relevanta mikrovaskulära nätverk.

Introduction

Mikrovaskulära nätverk tillväxt och ombyggnad är gemensamma nämnare för vävnadsfunktion, sårläkning och flera sjukdomar och en viktig process är angiogenes, definieras som tillväxten av nya blodkärl från existerande 1, 2. För vävnadsteknik nya fartyg eller utforma angiogena baserade terapier, förstå vikten av de cellulära dynamik inblandade i angiogenes är kritisk. Emellertid är denna process komplex. Den kan variera vid specifika ställen inom en mikrovaskulär nätverk och omfattar flera celltyper (dvs endotelceller, glatta muskelceller, pericyter, makrofager, stamceller) och flera system (lymfatiska nätverk och neurala nätverk). Även in vitro-modeller har bidragit enormt till att undersöka förhållandet mellan olika celler som är involverade i angiogenes 3, kan deras fysiologiska betydelse urholkas på grund av thei r begränsad komplexitet och det faktum att de inte är nära återspeglar ett in vivo scenario. För att övervinna dessa begränsningar, tredimensionella odlingssystem 3, ex vivo vävnadsmodeller 4, mikroflödessystem 5, 6, och beräkningsmodeller 7 har utvecklats och införts under de senaste åren. Det finns emellertid fortfarande ett behov av en modell med time-lapse kapacitet att undersöka angiogenes i intakta mikrovaskulära nät ex vivo. Etableringen av nya tidsförlopp modeller för angiogenesstudier med denna nivå av komplexitet kommer att ge ett ovärderligt verktyg för att förstå de bakomliggande mekanismer som reglerar angiogenes och förbättra behandlingar.

En tänkbar modell som gör det möjligt för ex vivo undersökning av angiogenes över en intakt mikrovaskulära nätverk är råtta tarmkäxet kulturmodell> 8. Under de senaste arbete har vi visat att blod och lymfatiska mikrovaskulära nätverk förbli livskraftig efter odling. Ännu viktigare, kan råttan tarmkäxet kulturmodell användas för att undersöka funktionella pericyte-endothelial cell interaktioner, blod och lymfatiska endotelceller anslutningar och time-lapse avbildning. Syftet med detta dokument är att ge våra protokoll för tidsförlopp avbildningsmetod. Våra representativa resultat dokumentera flera celltyper som återstår livskraftiga efter stimulering av angiogenes med serum och ge exempel på användning av denna metod för att kvantifiera vävnadsspecifika angiogena svar samt endotelceller spårning cellstudier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök och förfaranden godkändes av Tulane University Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).

1. Kirurgisk procedur Setup

  1. Autoklav instrument, kirurgisk utrustning och kulturmaterial före operation. Kirurgisk utrustning för varje råtta inkluderar: ett draperi, en drapera med färdigskurna hål (0,5 tum x 1,5 tum) i centrum, gasbinda kuddar, och ett absorberande underlägg. Kirurgiska instrument inkluderar: en skalpell med ett antal 10 blad, 2 par pincett, och ett par fina saxar. Kultur leveranser omfattar: ett draperi, en pincett, och beredd 6-brunnar skär med polykarbonatfilter.
  2. Sterilisera en plexiglasplattform, ett kirurgiskt stadium och en kirurgisk bänkutrymme med 70% etanol. Håll den kirurgiska steget i en steril skål tills användning.
    1. Skapa en kirurgisk skede genom att borra ett cirka 2 i med 1 i hål i mitten av en 100 mm odlingsskål. Använd sedan sandpapper för att jämnavassa kanter och lägga ett lager av silikon lim till hålets kanter för att skapa en upphöjd yta för vävnaderna.
    2. Alternativt utforma kirurgiska scenen med hjälp av CAD programvara och göra med 3-D utskrift (Figur 1).
  3. Placera en steril absorberande underlägg ner och lägga en plexiglasplattform ovanpå det. Placera duken, utan en pre-cut hål, över en uppvärmd dyna intill den absorberande underlägg.
  4. Pre-varm steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS), media och saltlösning till 37 ° C. Place media och PBS i separata odlingsskålar atop värmedynan och plats saltlösning i en 50 ml koniska rör intill den kirurgiska installationen.
  5. Se till att alla paket öppnas före början av operationen för att säkerställa steril hantering av alla material. En komplett lista över de gemensamma verktyg som används i detta förfarande är listade i Tabell över specifika kirurgiska material och verktyg.

2. Mesentery Tissue Skörd

  1. Använd vuxna Wistar-hanråttor (350 ± 25 g, 6 - 8 veckor gamla). Andra stammar och åldrar av råttor kan vara substituerad.
  2. Söva råttan via en intramuskulär injektion av ketamin (80 mg / kg kroppsvikt) och xylazin (8 mg / kg kroppsvikt). Bekräfta råttan är under narkos genom att nypa mellan tårna för att kontrollera om en reflex svar; det bör finnas någon. Förebyggande smärtlindring för denna terminal förfarande är inte nödvändigt.
  3. Raka buken och avlägsna kvarvarande håret med hårborttagningskräm. Torka bukhuden två gånger med 70% isopropylalkohol följt av povidon-jod. För dukarna kirurgen bör börja vid centrum av den kirurgiska platsen och flytta till utsidan av den preparerade ytan i en cirkulär sätt att de inte överlappar områden som tidigare har skrubbas med samma stycke av steril gasväv eller steril bomullspinne. Sedan överföra djuret till sterila kirurgiska installation och placera ovanpå plexiglas platform.
  4. Med hjälp av en skalpell blad, gör en 0,75 i - 1,25 i snitt i tarmen börjar en i under bröstbenet. Var noga med att inte punktera tarmen eller tarmkäxet (1 lagret av huden, ett lager av bindväv, och ett lager av muskler).
  5. Placera en duk med en pre-cut hål över snittet och placera en steril kirurgisk scen ovanpå duken. Se till att öppna linje med snittet. Använd sterila bomullspinne applikatorer för att lokalisera och dra ut ileum genom den kirurgiska scenen öppningen.
  6. Dra 6 - 8 mesenteriska fönster genom scenen med hjälp av bomullspinne applikatorer, och vara noga med att inte röra vid fönstren (Figur 1). Vävnader skördas typiskt från ileum regionen av tunntarmen med början nära blindtarmen. Håll utsatta vävnader fuktig med uppvärmd steril koksaltlösning som behövs med en steril spruta droppa lösningen.
  7. Euthanize råttan via intrakardiell injektion av pentobarbitalnatrium (0,2 ml per råtta). Innan du tar bort migsenteric fönster, se till råttan avlivades palperas hjärtat; Det bör inte finnas någon puls.
  8. Ta bort önskade tarmkäx vävnader genom att använda pincett för att ta fettkudden och fina sax för att klippa fönstret. Lämna en kant av fett (2 mm) runt fönstret. Tvätta vävnader gång värmde steril PBS och gång i media.
  9. Återgå exterioriserad ileum till bukhålan och avyttra djur enligt institutionens riktlinjer.

3. tarmkäx Tissue Culture för time-lapse Studies

  1. Överför autoklaveodlingsmaterial (se avsnitt 1.1) och vävnader till en steril laminärt flöde huva.
  2. Använd pincett för att överföra varje vävnad ovanpå ett polykarbonatfiltermembran. Grab vävnader genom fettkudden att undvika skador på kärl.
  3. Snabbt sprida vävnad med hjälp av fettkudden, var noga med att inte röra fönstret. Invertera insatsen med vävnaden in i bottnen av en 6-brunnsplatta och täck med 3 ml medium (Figur 1
  4. Upprepa steg 3,2-3,3 för varje vävnad och kultur i standardinkubatorbetingelser (5% CO2, 37 ° C) i upp till fem dagar.

4. time-lapse avbildning av tarmkäxet Tissue

  1. På dagen för avbildning, komplettera medierna i varje brunn med konjugerat BSI-lektin och inkubera under standardodlingsförhållanden under 30 minuter. Tvätta vävnader två gånger med lektin-fria medier. BSI-lektin fläck förblir synlig på tarmkäxet vävnaden för upp till 3 dagar i kultur.
  2. Överför plattan till en mikroskopställningen. Identifiera blod- och lymfkärl baserat på deras morfologi och nätverksstruktur.
  3. Leta upp en önskad nätverksområdet på varje vävnad och ta bilder. Ta del av bildläge för att säkerställa samma region kommer att fångas in för efterföljande bilder. Om du använder en motoriserad skede dokumentera koordinaterna.
  4. Återgå vävnader till inkubatorn och fortsätta att odla fram önskad slutpunkt. Upprepa steg från 4,1 till 4,3 efter behov beroende på önskad experimentell tidpunkter.

5. Tissue immunomärkning

  1. BSI-Lektin Labeling
    1. Inkubera vävnader under 30 min vid 37 ° C med 1:40 FITC-konjugerad lektin i medium (2,5 ml antikropplösning per brunn i 6-brunnars platta) följt av två sköljningar med media. För sköljningar, lägga till media och sedan omedelbart ersätta.
  2. Live / Dead Märkning
    1. Inkubera vävnader under 10 min vid 37 ° C med 1: 500 2 mM etidium homodimer-1 och 1: 500 1 mM kalcein AM i medium (2,5 ml antikropplösning per brunn i 6-brunnars platta) följt av två sköljningar med media.
  3. BSI-Lektin / NG2 Labeling
    1. Spread vävnader på ett mikroskop glede (1 - 2 vävnader / bild) och låt torka. Ta bort överflödigt fett med en skalpell genom att trycka ner ordentligt för att skära fettet.
    2. Fixa vävnader i kall metanol under 30 min vid -20 ° C. Tvätta vävnader med PBS (3 x 10 min).
    3. För primär antikroppsmärkning inkubera vävnader för en timme vid rumstemperatur med 1: 100 kanin-polyklonal NG2-antikropp och 5% normalt getserum (NGS). Tvätta vävnader med PBS (3 x 10 min).
    4. För sekundär antikroppsmärkning inkubera vävnader för en timme vid rumstemperatur med 1: 100 get-anti-kanin-CY2-konjugerad antikropp (GAR-CY2) och 5% NGS. Tvätta vävnader med PBS (3 x 10 min).
    5. Inkubera vävnader under 30 min vid rumstemperatur med 01:40 FITC-konjugerad lektin i PBS följt av två sköljningar med PBS. För sköljningar, lägga till PBS och sedan omedelbart ersätta.
    6. För att montera bilderna, omfattar vävnader med 50:50 PBS och glycerollösning och placera täck ovanpå. Täta glid kanterna med nagellack.
  4. LYVE-1 / PECAM Labeling
    1. Sprid vävnader på ett objektglas (1 - 2 vävnader / bild) och låt torka. Ta bort överflödigt fett med en skalpell genom att trycka ner ordentligt för att skära fettet.
    2. Fixa vävnader i kall metanol under 30 min vid -20 ° C. Tvätta vävnader med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
    3. För primär antikroppsmärkning inkubera vävnader för en timme vid rumstemperatur med 1: 200 musmonoklonal biotinylerad CD31-antikropp och en: 100 kanin polyklonal LYVE-1-antikropp i PBS + 0,1% saponin + 2% bovint serumalbumin (BSA) + 5% NGS . Tvätta vävnader med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
    4. För sekundär antikroppsmärkning, inkubera vävnader under 1 h vid rumstemperatur med 1: 500 CY3-konjugerad streptavidin antikropp och en: 100 GAR-CY2 i PBS + 0,1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. Tvätta vävnader med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
    5. För att montera bilder, täcka vävnader med 50:50 PBS och glycerollösning och placera en täck ovanpå. Täta glid kanterna med nagellack.
  5. BrdU / BSI-lektin Labeling
    1. Tillsätt 1 mg / ml BrdU till media och ersätta vävnad media med BrdU lösning. Inkubera i 2 h vid 37 ° C.
    2. Sprid vävnader på ett objektglas (1 - 2 vävnader / bild) och låt torka. Ta bort överflödigt fett med en skalpell genom att trycka ner ordentligt för att skära fettet.
    3. Fixa vävnader i kall metanol under 30 min vid -20 ° C. Tvätta vävnader med PBS (3 x 10 min).
    4. Denaturera vävnads DNA i 2 M HCl under 1 h vid 37 ° C. Tvätta vävnader i PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
    5. För primär antikroppsmärkning, inkubera vävnader under 1 h vid rumstemperatur med 1: 100 monoklonal mus-anti-BrdU i PBS + 0,1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. Tvätta vävnader med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
    6. För sekundär antikroppsmärkning, inkubera vävnader för en timme vid rumstemperatur med 1: 100 get-anti-mus-Cy3-konjugerad antikropp (GAM-Cy3) i PBS + 0,1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. Tvätta vävnader med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
    7. För att montera bilder, täck vävnader med 50:50 PBS och glycerollösning och placera täck ovanpå. Täta glid kanterna med nagellack.
  6. BSI-Lektin / CD11b märkning
    1. Sprid vävnader på ett objektglas (1 - 2 vävnader / bild) och låt torka. Ta bort överflödigt fett med en skalpell genom att trycka ner ordentligt för att skära fettet.
    2. Fixa vävnader i kall metanol under 30 min vid -20 ° C. Tvätta vävnader med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
    3. För primär antikroppsmärkning inkubera vävnader för en timme vid rumstemperatur med 1: 100 mus-anti-rått-CD11b i PBS + 0,1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. Tvätta vävnader med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
    4. För sekundär antikroppsmärkning inkubera vävnader för en timme vid rumstemperatur med 1: 100 GAM-Cy3 i PBS + 0,1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. Tvätta vävnader med PBS+ 0,1% saponin (3 x 10 min).
    5. Inkubera vävnader under 30 min vid rumstemperatur med 01:40 FITC-konjugerad lektin i PBS följt av två sköljningar med PBS.
    6. För att montera bilder, täck vävnader med 50:50 PBS och glycerollösning och placera täck ovanpå. Täta glid kanterna med nagellack.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter 3 dagar i odling, var vävnader märkt med en levande / död viabilitet / cytotoxicitet kit för att påvisa lönsamheten av mikrovaskulaturen i rått tarmkäxet kulturmodell (Figur 2A). Majoriteten av celler närvarande i tarmkäxet förblev viabla i kulturen där endotelceller identifieras baserat på deras läge i mikrovaskulära segment. Endotelcellproliferation bekräftades också av lektin / BrdU märkning (figur 2D). Glatta muskelceller och pericyte närvaro längs fartyg bekräftades med NG2 märkning (Figur 2B). Märkning av LYVE1 och PECAM identifieras förgrening lymfatiska och blod mikrovaskulära nätverk och bekräftade den underhålls lymfatiska kontra blod endotelceller fenotyp (figur 2C).

Time-lapse inslag i denna modell användes genom märkning av microvascular nätverk med BSI-lektin vid olika tidpunkter och att avbilda samma område inom nätverket över tid; denna förmåga är särskilt värdefulla för att undersöka vävnadsspecifika angiogena svar. Den komplettering av medium med 10% serum orsakade en robust angiogent svar efter 3 dagars stimulering. Dessutom har nya fartygssegment och kapillära groddar identifieras genom dag fem av stimulering (Figur 3). Time-lapse avbildningsmetod möjliggjorde kvantitativ jämförelse av nätverksområden före och efter stimulering (Figur 4). För denna representativa studie, som bekräftar våra tidigare resultat 9, var antalet fartyg per kärlområdet och antalet kapillära groddar per vaskulär område kvantifieras från en 4X bild per vävnad. Blodkärlssegment definierades som lektin-positivt blod endotel segment förekommer mellan två förgreningspunkter och kapillära groddar definierades som blinda slutade segment som härrör från en värdkärlet. Time-lapse jämförelse av nätverksregioner möjliggjorde också spårning av endotelceller segment (Figur 5) och identifiering av blod / lymfkärl mis-mönstring (Figur 6). Märkning av odlade vävnader för lektin och CD11b bekräftade dessutom närvaron av interstitiell residenta makrofager (Figur 7) i remodeling nätverk.

Figur 1
Figur 1. mesenteriala fönster lokaliserades genom att dra ut tunntarmen genom ett kirurgiskt stadium. Den kirurgiska etappen konstruerade och tillverkade av 3-D utskrift. Den elliptiska hål i centrum är cirka 2 i med 1 i (A). Mesenteriala fönstren spreds sedan ut på toppen av ett membran insats och insatsen vändes och placerades i en brunn (B). Skalstreck = 2 cm.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55183/55183fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Blodkärl förbli livskraftig i rått tarmkäxet kulturmodell. Live / Dead analys utförd efter odling visade en hög andel av levande celler (gröna) och döda celler (röda) särskilt längs blodkärlen (A). Tarmkäx vävnader märktes med lektin och anti-NG2 att identifiera pericyter (röd) tillsammans fartyg (grön) och bekräfta att olika typer av celler är närvarande i post-kultur vävnader (B). Vävnader också märkt mot PECAM / LYVE-1 för att identifiera blod (röd) fartyg från lymfatisk (grön) fartyg (C). För att undersöka om mikrovaskulära celler genomgå spridning i kultur, var tarmkäxet vävnader märkta med lektin / anti-BrdU . På kapillär segment märkta med lektin (grön), har flera celler bekräftades vara proliferativ (röd) (D). Skalstrecken = 100 ^ m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Time-lapse avbildning av råttans tarmkäxet möjliggör att observera mikrovaskulär ombyggnad under loppet av kulturen. En robust angiogent svar observerades efter 3 (B) och 5 dagar (C) av kulturen med 10% serumstimulering. Skalstrecken = 100 ^ m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

filer / ftp_upload / 55.183 / 55183fig4.jpg "/>
Figur 4. Mikrovaskulära nätverk på råtta tarmkäxet kulturmodell avbildades före och efter angiogenes. Jämförelse av samma nätverk märkt med lektin dag 0 och dag 3 (A, B) efter stimulering med 10% serum identifierar nya fartyg. Lektin etiketter också en population av oidentifierade interstitiella celler. Kvantifiering av kärltäthet (C, D) och antalet kapillära groddar per vaskulär område (E, F) bekräftade en ökning av både statistik för varje vävnad. C, E) före (dag 0) och efter (dag 3) jämförelser per vävnad. D, F) Jämförelse mellan dag 0 och dag 3 genomsnitt använder ett parat t-test bekräftade en signifikant skillnad i både det genomsnittliga antalet fartygssegment (p <0,0001) och det genomsnittliga antalet groddar (p <0,00001) per vaskulär area . Vita staplar representerar dag 0, och svarta staplar representerar dag 3. Values är medelvärden ± SEM. För detta representativ analys, var 13 vävnader skördas från 2 råttor. Skalstrecken = 100 ^ m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. råtta tarmkäxet kultur modellen kan användas för att undersöka kärl ö öde och införlivande i nätverk i närheten. Med time-lapse avbildning, vaskulära öar, definierat som kopplad endotelceller segment identifierades på dag 0 och deras anslutning till den närliggande nätverk bekräftades genom dag 3 efter angiogen stimulering. Tarmkäx vävnader stimulerades med bFGF (A, B) och VEGF / PDFG-BB (C, D). Ihåliga pilar visar kopplade segment på dag 0 och heldragna pilar representerar ö anslutning till nätverk. Pilspetsar ange läget för anslutningar mellan en kärl ön och nätverk i närheten. Skalstrecken = 100 ^ m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. Time-lapse bilder visa förmåga att observera lymfatiska och blodkärl mönstring. Lymfatiska (l) fartyg kan särskiljas från arterioler (a) och venoler (v) baserat på märkning morfologi på dag 0 (A). På dag 5 efter stimulering med 10% serum, är lymfatiska morfologi förlorad och fartyg verkar ha integrerats med de närliggande angiogena blodkärl (B). Skalstrecken = 100 ^ m. Klicka här för att se en störreversion av denna siffra.

figur 7
Figur 7. Makrofager kvar i odlade råtta mesenteriska vävnader. Lektin / CD11b samtidig märkning av vävnader odlade i 3 dagar med 10% serum tyder på att lektin positiva interstitiella celler är en undergrupp av makrofager. (A) En representant bild av BSI-lektin märkning. (B) CD11b märkning samma synfält. (C) Den sammanslagna bilden. Pilarna identifiera exempel på co-märkning. Skalstrecken = 100 ^ m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll dokumenterar en metod för att använda råtta tarmkäxet kulturmodell som ett ex vivo verktyg för time-lapse avbildning av mikrovaskulära nätverk tillväxt. Tidigare arbete i vårt laboratorium har etablerat användningen av vår modell för en) angiogenes 8, 2) lymfangiogenes 8, 3) pericyte-endothelial cell interaktioner 8, och 4) anti-angiogena drogtestning nio. Möjligheten för avbildning odlade råtta tarmkäxet vävnader vid flera tidpunkter erbjuder en kvantitativ analys för att utvärdera vävnadsspecifika tillväxtsvar och spårning av cell-cell interaktioner vid olika angiogena stimuli. Den ökade spridningen av endotelceller under angiogenes och närvaron av pericyter överensstämmer med vårt tidigare arbete 8 och validera dynamiska samspelet mellan flera celltyper under angiogenes i odlade råtta mesenteriska vävnader.

i cellodlings vitro-system, är råtta tarmkäxet kulturmodell unik eftersom tillväxt sker inom en intakt, verklig mikrovaskulära nätverket. Betrakta däremot aortaringanalys, som bildades för att studera angiogena groning från aorta segment i en kollagengel 10. Medan gro i aortaringen innebär flera celltyper, kapillära groddar växer ur utskurna segment av aorta, som skiljer sig mycket från in vivo scenario. Hjärnan skiva modell är en annan ex vivo-modell, men det är tomt på lymfkärl. Dessutom har hjärnan skiva modellen inte visat sig vara i stånd att tidsförlopp avbildning före och efter angiogen stimulering 11. En annan ex vivo-modell som har nyligen infört är näthinnan kulturmodell. Fördelen av näthinnan modellen är att angiogenes sker från intakt microvascunande nätverk inom vävnaden 12, 13. För dessa modeller, kan GFP-transgena möss stammar användas för att kunna observera kapillär groning med tiden, men tyvärr är musen tarmkäxet avaskulära 14, vilket eliminerar GFP-transgena möss tarmkäxet ersättning för råtta tarmkäxet, som används i vår modell. Vidare visar vi att en enkel lektin märkning av råtta tarmkäxet vävnader i odling är tillräckligt för att bestämma nätverkstillväxt vid olika tidpunkter och i jämförelse med den andra ex vivo-modeller, möjliggör samtidig observation av både blod och lymfatiska endotelceller vår modell.

BSI-lektin användes i detta dokument för att visualisera mikrovaskulära nätverk och upptäcka angiogena svar. Lektin är en proteinstruktur som binder till glykoproteiner på endotelceller och valdes för detta protokoll på grund av dess korta inkubationstiden jämfört med endotel AntibODY markörer. Lektin är billigare än antikroppar och det kräver inte fastställande; det kan också vara lätt blandas i odlingsmediet och ersattes med färskt media Efter inkuberingsperioden ändar. Medan framtida studier behövs för att belysa de potentiella effekterna av lektin märkningsteknik på den angiogena processen, vårt representativa resultat (Figur 4) visar att robusta angiogenes kan induceras och tidigare arbete 9 visar att angiogenes i lektin märkta nätverk kan hämmas genom att rikta Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). Antikropps markörer kan potentiellt användas som ett alternativ märkning när det finns ett behov av mer specifika markörer, eller när det finns ett behov av att undersöka andra celltyper som finns i de mikrovaskulära nät såsom glatta muskelceller, pericyter, och nerver. En annan potentiell metod för att visualisera celler skulle vara gentransfektion.

Fördelen med att använda time-lapse råtta tarmkäxet modell har uppmärksammats i de representativa resultat för detta protokoll. Jämförelsen av bilder före och efter behandling minskar frågor om variationen som påverkar icke-parade statistisk analys. Explantatet specifika svar varierade från 20% till 233% ökning av kärltäthet och från 40% till 3500% ökning av grodd densitet. De specifika orsaker till denna variation är fortfarande okända, men mäta tillväxt i samma vävnad med tiden fram förmågan att bekräfta vävnadsspecifika responser.

Jämförande analys av bilder vid olika tidpunkter under mikrovaskulär tillväxt gör det också möjligt för att spåra endotelceller. Till exempel har vårt labb identifierat vaskulära öar som endothelial cellsegment i närheten av mikrovaskulära nätverk som är bortkopplad från närliggande nätverk 15, 16. För att bekräfta att dessa öar ansluter till den närliggande nätverk som svar på angiogena stimuli, råttan tarmkäxet kulturmodell användes. Såsom visas i figur 5, var vaskulära öar spåras efter vävnads stimulering med basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) eller VEGF plus Platelet-Derived Growth Factor (PDGF). Vi har också visat liknande resultat efterserumstimulering (data visas ej här). Efter stimulering av angiogenes, kan ursprungligen kopplade kärl öar hittas kopplad till närliggande nätverk.

Andra potentiella tillämpningar av rått tarmkäxet kulturmodell skulle kunna utnyttja möjligheten att undersöka förhållandena mellan lymfatiska och blodkärlen och deras respektive endotelceller och spårning av interstitiell cell öde. Time-lapse bilder av samma mikrovaskulära nätverk före och efter stimulering med 10% serum i denna modell gav exempel på potentiella fartyg integrations lymfatiska till blod (Figur 6). Före stimulering, lymfatiska och blod vessels präglades baserat på fartyg morfologi. Efter stimulering, lymfatiska mot blodkärls identitet blev mindre tydlig. Potentialen för lymfatiska / blod endothelial cell interaktioner stöds av observationen av PECAM + / LYVE-1- blod endotelceller som förbinder med PECAM + / LYVE-1 + lymfatiska endotelceller (data visas inte här). Dessa observationer stödjer användning av råtta tarmkäxet kulturmodell för att undersöka lymfatiska / blod endotelceller plasticitet. Figur 6A belyser också lektin märkning av uppenbara interstitiella celler. Även om märkningen är inkonsekvent och heterogen från vävnad till vävnad, gör det betona närvaron av endogena vävnadsresidensceller. CD11b märkning av odlade vävnader (figur 7) antyder att dessa lektin-positiva interstitiella celler kan vara en undergrupp av makrofager. Med tanke på den framväxande intresset för makrofag inblandning i angiogenes 20, en ytterligare styrka imodell skulle vara dess användning för att spåra makrofager dynamik över tiden.

Likt andra ex vivo-modeller, är en strömbegränsning att studera angiogenes i råtta tarmkäxet kulturmodell bristen på blodflödet. Shear stress som orsakas av blodflödet har visat sig spela en roll i endotelceller morfologi och spridning samt angiogenes 17, 18, 19. För de representativa resultat som visas i figur 4, avsaknaden av skjuvspänningen ensamt kan ha varit tillräcklig för att inducera ett angiogent svar i de odlade näten. Men vi vet att på grundval av vår första offentliggörandet kännetecknar råtta tarmkäxet kulturmodell 8, att media tillskott orsakar ökad angiogenes jämfört med enbart media. Framtida studier som innehåller flödet i de odlade mikrovaskulära nätverk utan tvekan behövde närmare efterliknain vivo scenario. Potentiella metoder för att införliva flöde kan omfatta kanylenätverks utfodring arterioler eller ens kanyle ytterligare uppströms artärer inom fettet gränsen mesenteriala fönster. Trots avsaknaden av flödet, lönsamheten av flera celltyper, upprätthållandet av blod och lymfatiska mikrovaskulära nätverk, och celltillväxt under angiogenes stöder råtta tarmkäxet kulturmodell relativa ökad nivå av komplexitet jämfört med cellbaserade in vitro-modeller.

Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en enkel, reproducerbar ex vivo metod för avbildning av angiogena svar i intakta mikrovaskulära nätverk. Ett sådant förfarande erbjuder ett alternativ till cellbaserade in vitro-modeller för att utvärdera angiogena cell dynamiken på specifika platser i en nätverksmiljö. Metoden ger också ett nytt verktyg för att undersöka angiogenes, lymfangiogenes och blod / lymfatiska mis-smattraning samtidigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drape Cardinal Health 4012 12” x 12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps
Scalpel Handle Roboz Surgical Instrument RS-9843 Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length
Sterile Surgical Blade Cincinnati Surgical 0110 Stainless Steel; Size 10
Culture Dish (60 mm) Thermo Scientific 130181 10/Sleeve
Graefe Forcep (curved tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5135 Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length
Graefe Forcep (straight tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5130 Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8 mm Tip Width; 4" Length
Noyes Micro Scissor Roboz Surgical Instrument RS-5677 Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;
Straight, Sharp-Blunt Points; 13 mm Cutting Edge; 0.25 mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length
Gauze Pads FisherBrand 13-761-52 Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4" x 4" 12-Ply
Cotton-Tippled Applicators FisherBrand 23-400-124 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only
6-Well Plate Fisher Scientific 08-772-49 Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic
Sterile Syring 5 mL Fisher Scientific 14-829-45 Luer-Lok Tip
Sterile Bowl Medical Action Industries Inc. 01232 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use
6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) SIGMA Z681792-3EA 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile
Polycarbonate Filter Membrane SIGMA TMTP04700 Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain
Name Company Catalog Number Comments/Description
Beuthanasia Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 011168 Active Ingredient: Per 100 mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50 mg phenytoin sodium 
Ketamine Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Kateset 100 mg/mL
Xylazine LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Anased 100 mg/mL
Saline Baxter 2F7122
PBS Invitrogen 14040-133
MEM Invitrogen 11095080
PenStrep Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 16000-044
BSA Jackson ImmunoResearch 001-000-162
Saponin  SIGMA S7900-100G
Isopropyl Alcohol Fisher Scientific S25372
Povidone-Iodine Operand 82-226
Hydrochloric Acid SIGMA 320331
Methanol Fisher Scientific 67-56-1
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
FITC-conjugated Lectin SIGMA L9381-2MG
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody SIGMA AB5320
PECAM (CD31) Antibody BD Biosciences 555026
LYVE-1 Antibody AngioBio Co. 11-034
Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 111-585-144
Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 115-227-003
Streptavidin Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 016-160-084
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen L3224
Normal Goat Serum  Jackson ImmunoResearch 005-000-121
5-Bromo-2'-Deoxyuridine SIGMA B5002
Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine                        Clone Bu20a Dako M074401-8
Mouse Anti-Rat CD11b  AbD Serotec MCA275R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407, (6801), 249-257 (2000).
  2. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, (7070), 932-936 (2005).
  3. Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4, (4), 547-559 (2011).
  4. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5, (9), 1518-1534 (2010).
  5. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (37), 15342-15347 (2011).
  6. Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7, (12), e50582 (2012).
  7. Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19, (3), 184-191 (2012).
  8. Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, (2), H235-H245 (2013).
  9. Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10, (3), e0119227 (2015).
  10. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63, (1), 115-122 (1990).
  11. Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).
  12. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5, (10), 1659-1665 (2010).
  13. Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, (5), 2347-2355 (2010).
  14. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, (3), 588-612 (2006).
  15. Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108 (2013).
  16. Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7 (2012).
  17. Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3, (2), 143-165 (1996).
  18. Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212, (1), 244-251 (2007).
  19. Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8, (4), 229-241 (2001).
  20. Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23, (2), 95-121 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics