기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

Developmental Biology

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Summary

여기, 우리는 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC) 문화 프로토콜, hPSCs CD34로 차별화 하는 데 사용 현재+ 조 혈 창시자. 이 방법은 단계 특정 조작 정식 WNT 신호 독점적으로 프로그램 중 하나는 확실 한 또는 원시 조 혈 세포를 지정 하려면 사용 합니다.

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Dege, C., Sturgeon, C. M. Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (129), e55196, doi:10.3791/55196 (2017).

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Abstract

재생 의학에 대 한 주요 목표 중 하나입니다 생성 및 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)에서 파생 된 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 유지 보수. 최근까지, HSCs로 hPSCs를 차별화 하는 노력 있다 주로 HSC 잠재력, 부족 하 고 대신 노 른 자 삭 조를 닮은 창시자 조 혈을 생성 하 게 됩니다. 이 결과 조 혈 창시자 다양 한 성인 조 혈 장애, 림프 성 계보의 특히 그의 질병 모델링 생체 외에서 유틸리티를 제한 수 있습니다. 그러나, 우리는 최근 우리 여기 개요 무대 관련 감독된 분화 프로토콜을 사용 하는 hPSCs에서 erythro-myelo-림프 multilineage 확실 한 조 혈 창시자를 생성 하는 방법을 설명 했습니다. 매트릭스-코팅 plasticware 지하실 멤브레인에 hPSCs의 효소 분리 통해 embryoid 몸 (EBs)이 형성 된다. EBs는 재조합 BMP4, 이후 GSK3β 억제 물, CHIR99021 확실 한 조 혈 모 프로그램에 지정 된 의해 mesoderm로 구분 됩니다. 또는, 기본 조 PORCN 억제 물, IWP2에 의해 지정 됩니다. 더 조는 재조합 VEGF의 추가 지원 조 혈 cytokines를 통해 구동 됩니다. 이 메서드를 사용 하 여 생성 결과 조 혈 창시자 질병 및 발달 모델링, 생체 외에서사용 될 가능성이 있다.

Introduction

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs) 인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 포괄로 정의 되 고 적절 한 성장 조건 하에서 자기 갱신을 받은 뿐만 아니라의 독특한 능력을가지고 또한, 모든 세포 유형으로 분화 하는 능력 3 개의 세균 층에서 파생 하는 그러나: endoderm, mesoderm, ectoderm1. 이러한 독특한 능력으로 인해 hPSCs 재생 의학, 질병, 모델링과 세포 기반 요법2에 대 한 큰 약속을 잡으십시오. 여러 셀 형식 hPSCs에서 성공적으로 분화 되어 있다, 하는 동안 한 가지 중요 한 문제는 독점적으로 성인 같은 hPSC 파생 된 조 혈 줄기 세포 (HSCs)와 최종 조 혈 창시자의 생체 외에서 사양입니다.

HPSCs에서 인간의 HSCs의 발전에 하나의 가능성이 장벽이 인간 배아3내에서 여러 조 혈 프로그램의 존재입니다. 나온다, "원시 조," 불리는 첫 번째 프로그램 extraembryonic 노 른 자 삭 조직에서 유래 하 고 erythroblast 창시자 (EryP-CFC), macrophages, 및 없으며 일시적 생산 최고의 특징 이다. 특히,이 프로그램은 HSCs, 상승 수 주지도 않습니다 그것을 일으키 다 T와 B 림프 창시자. 그러나, 노 른 자 삭은 뚜렷이 일으키 erythro 골수성 조상 (EMP4,5,6,,78) 같은 제한 된 확실 한 조 혈 창시자 그리고 erythroid 불충분 한 림프 액 multipotent 조상 (LMPP9). 그러나, EMPs도 LMPPs는 완전히 multipotent 또는 HSC 같은 engraftment 성인 받는 사람의 수입니다. 대조적으로, 나중에 개발, 고아 하 게 정의 된 "확실 한" 조 혈 모 프로그램은 HSC를 포함 하 여 모든 성인 조 혈 계보를 야 기한 적절 한 태아의 대동맥-생식-mesonephros 지역에 지정 됩니다. Hemogenic (그가) 내 피3,10,11에서에서 내 피-하-조 혈 전환을 통해 노치 종속 패션에서 발생 하는이 내 배아 확실 한 조 혈 모 세포의 사양 ,12,,1314. 재구성 능력, 외 잠재적인 multilineage 및 이러한 셀의 노치 의존을 사용할 수 있는 EMP (검토 참조3,13 LMPP에서 이러한 확실 한 조 혈 창시자를 구별 ).

에 따라 장치를 마더보드에 hPSCs에서 원시적이 고 확실 한 조 혈 사양 관리를 이해 하는 것입니다 가능성이 확실 한 조 혈 창시자 hPSC 라인의 다양 한 걸쳐의 재현 생산에 중요 한. 최근까지 multipotent 원시적이 고 확실 한 조 혈 창시자 분리 수 hPSC 차별화 프로토콜15,,1617,18, 존재 하지 않았다 19,20,21,22,23,,2425. 먼저 소 태아 혈 청 (FBS) 및 실질 공동 문화를 사용 하 여 많은 접근 원시적이 고 확실 한 조 혈 잠재적인15,16의 혼합물으로 hPSC 차별화의 조 혈 잠재력 설명 17,,1922,,2325. 더 많은 조 혈 혈 청 무료 프로토콜 항구 조 혈 잠재적인18,20,21, hPSCs에서 mesoderm의 사양에 대 한 신호 요구 사항 설명 그러나 24., 이러한 방법은 여전히 두 프로그램 전부의 다른 유형의 혼합물을 상승 했다, 임상 응용 및 이해 발달 메커니즘에 그들의 사용 제한 될 수 있습니다.

우리는 최근 ACTIVIN/NODAL 및 WNT 신호 hPSC 파생 mesoderm18,26에서에서 원시적이 고 확실 한 조 혈 사양에 대 한 단계-특정 신호 요구 사항을 설명 하는 데 이러한 연구에 내장 . 후자 이었다 특히 독특한 무대 관련 WNT 신호 조작의 그것의 사용 중 독점적으로 기본 또는 독점적으로 확실 한 조 혈 창시자26의 사양에 대 한 수 있습니다. Mesoderm 사양 중 정식 WNT 신호 IWP2 PORCN 억제제와 억제 CD43 지정에 결과+ EryP CFC 및 감지 림프 잠재력과 골수성 창시자. 예리한 대조에서는, 정식 WNT 신호 GSK3β 억제 물, CHIR99021와 차별화의 동일한 단계에서의 자극 감지 CD43의 완전 한 부재에 결과+ EryP-CFC, 동시에 선도 하는 동안에 CD34의 사양+CD43 그. 이 인구 보유 골수성, HBG-erythroid, 및 T-림프 잠재력을 표현. 이후 분석 CD7327,28 와 CD18428, 그리고 조 혈 잠재력의 표현 부족으로 그는 노치 종속28이 확인. 추가, 단일 셀 클론 분석 이러한 확실 한 조 혈 모 계보 multipotent 단일 셀28에서 파생 될 수 있는 시연 했다. 함께 찍은, 이러한 연구 단계 관련 WNT 신호 조작 순수 원시 조 혈 창시자, 또는 multipotent 노치 종속 확실 한 조 혈 창시자 지정할 수 나타냅니다.

여기, 우리는 그 독점적으로 기본 또는 최종 조 혈 창시자, 정식 WNT mesodermal 패턴, 그리고 그들의 다운스트림 조 혈 계보 중 신호 분석 실험의 조작을 통해 수익률 차별화 전략 개요. 이 프로토콜은 hPSCs 재생 의학 응용 프로그램에서 기본 또는 최종 조 혈 창시자의 생산에 관심이 수사에 큰 가치입니다.

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Protocol

1. 시 약

  1. 얻기 셀 라인; hESCs 또는 hiPSCs 1, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) 29, OP9 DL4 기질 30 , 31.
  2. 시 약 준비
    1. PBS에 젤라틴의 0.1 %w / v 솔루션을 준비. 압력가 마로 소독 하 여 살 균 하십시오 그리고 aliquoting 후 4 ° C에서 저장.
    2. 준비 젤라틴 코팅 plasticware
        입니다. 0.1% 젤라틴 용액의 1.5 mL와 코트 6-잘 요리. 실 온에서 15 분 동안 품 어. 즉시 사용 하기 전에, 나머지 젤라틴 솔루션 발음.
    3. 15 %v / v FBS와 항생제 1 x IMDM 여 MEF 미디어를 준비. 사용 전에 2 m L-글루타민 m와 400 µ M monothioglycerol (MTG) 보충 하 고 4에서 저장 ° c.
    4. 준비 20 %v / v 녹아웃 혈 청 교체 (KOSR) DMEM/F12의 솔루션으로 hPSC 문화 미디어, 1 x 비 본질적인 아미노산 (NEAA), 1 x 항생제, 55 μ M β-mercaptoethanol, 2 m L-글루타민, m 그리고 10 ng/mL bFGF. 2 µ m 필터를 소독 하 고 4 어둠 속에 저장 필터 ° c.
    5. 2 µ m 필터, aliquot, 소독 하 고 4에서 어둠 속에 저장 5 %v / v KOSR DMEM/F12 4mm HCl. 여과기의 솔루션으로 서 혈 청 자유로운 준비 세척 미디어 ° c.
    6. 게 1 mg/mL DNase 나 DNase를 용 해 하 여 솔루션 내가 얼음에 얼음 처럼 차가운, 살 균 이온을 제거 된 물으로 3-4 h. 필터 2 µ m 필터와 소독 및 보관-20에서 aliquots ° c.
    7. 준비 세척 미디어 중지 솔루션: 추가 10 %FBS 및 10 µ g/mL DNase 나. 정지 솔루션 준비 한다 사용 직전.
    8. 준비 (예를 들어, 라고도 매트 hereon matrigel) 지하실 멤브레인 매트릭스 혼합물 솔루션.
      참고: 모든 단계를 준비 하 고 매트 혼합물을 사용 하 여 수행 해야 얼음 또는 4 ° C. Thaw 하룻밤에 4 ° C에서 얼음 매트를 냉동. 10 mL을 추가 하 여 매트 1:1 희석 차가운 IMDM와 하룻밤에 4 ° C에서 얼음 냉 기. 추가 20 mL와 매트 혼합물을 희석 차가운 IMDM와 하룻밤에 4 ° C에서 얼음 냉 기. 미리 냉장된 튜브와 저장소 사용까지-20 ° C에서 약 수. 때 사용 하기 위해 준비, 4 ° c.에 하룻밤 매트 혼합물을 녹여
    9. 코트 매트
        세포 배양 배지.
        참고: 모든 단계 코팅 매트 플레이트의 얼음에 수행 되어야 합니다. 적어도 1 시간 동안-20 ° C에 미리 진정 6 잘하고 24-잘 접시. 때 코트 접시 준비 얼음에 넣어. 4 x 희석 매트, 제거 하 고 다시 어떤 초과 솔루션을 사용 하 여 각 잘 코트. 30-60 분 동안 얼음에 두고 과잉 매트 발음. 코팅의 72 h 이내 3 h. 사용의 최소 37 ° C 5% CO 2 인큐베이터에서 매트 코팅된 접시 건조.
    10. 10%의 솔루션을 준비 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 10 %w / v BSA 3-4 반장 4 병 빛 차단 및 저장소 2 µ m 필터와 소독 필터 4 ° C에서 얼음 처럼 차가운, 증류수, 이온을 제거 된 물에 용 해 하 여 ° c.
    11. 는 Ascorbic 산 성 솔루션을 준비합니다. 천천히 5 mg/mL 해결책 3-4 h. 소용돌이 해산 때까지 때때로 ice에 얼음 처럼 차가운, 증류수, 이온을 제거 된 물에 L-아 스 코르 빈 산의 분해. 필터 2 µ m 필터와 소독 및 보관-20에서 aliquots ° c.
    12. 과 IMDM:Ham의 솔루션을 제작 하 여 혈 청 무료 차별화 (SFD) 미디어 준비 ' s F-12, 0.5 %BSA, B27, 및 0.5 x N2 보충 x 1을 추가 합니다. 저장소 4 ° C. 추가 1 x L-글루타민, 50 µ g/mL 의약품, 400 µ M MTG, 150 µ g/mL 홀로 처리가 즉시 이전 사용.
    13. 제조 업체 당 줄기 세포 세럼 무료 문화 미디어 (예를 들어, StemPro, 라고도 SP34 hereon) 준비 ' s 지시. 저장소 4 ° C. 추가 1 x L-글루타민, 50 µ g/mL 의약품, 400 µ M MTG, 150 µ g/mL 홀로 처리가 즉시 이전 사용.
    14. 녹이는 콜라 ii 0.2 %w / v를 1:4 FBS:PBS 솔루션에서의 최종 농도에 0.2% 콜라 II 솔루션을 준비합니다. 적어도 15 분 2 µ m 필터 솔루션을 소독 및 보관-20에서 aliquots 필터에 대 한 37 ° C 물 목욕에 분해 ° c.
    15. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 버퍼를 준비 하는 5%의 솔루션으로 사용 하 여 즉시 이전 IMDM에서 FBS.
    16. Α-MEM, 20 %FBS, 2 m L-글루타민, m의 솔루션으로
    17. 준비 OP9 미디어 및 1 x 항생제. 2 µ m 필터와 소독을 4 저장 필터 ° c.
    18. 이전 aliquoted 3 mL 수량 또는 100 mL 병으로 스 기반 미디어 (예를 들어, MethoCult, 라고 멕 hereon)를 얻을. 100ml, MeC, 도착 시 사용 하는 경우 2.5 mL aliquots 14 mL 원뿔 튜브에 나눕니다.
      참고: 모든 aliquots aliquots 즉시 이전에 해빙 한다-20 ° C. 멕 매체에 저장 한다 사용.

2. HPSCs의 mesoderm 차별화

  1. 성장에서 hPSC 셀 라인 MEFs에 5% CO 2와 37 ° C 배양 기에서 70-80 %confluency.
    참고: hPSCs는 날카로운 undifferentiated 테두리 있어야.
  2. 준비 매트 코팅 plasticware 뿌리고는 hPSCs 전에 24 h.
    참고: 매트 코팅 6-잘 접시의 총 수는 hPSC 라인에 걸쳐 다릅니다. 일반적으로, 3 6 잘 요리 MEFs에 confluent hPSCs의 6-잘 접시 당 충분 하다. 얼마나 많은 매트 코팅 6 잘 요리 후속 차별점 사용 해야 확인 하려면 첫 번째 차별화 하기 전에 confluent hPSCs:MAT 웰 스 (1:4, 1:3, 1:2, )의 다른 비율
    1. 수행 재판 급지대 고갈.
      참고: 매트는 hPSCs에 도금 후 24 h 크기에 약 10-20 셀의 셀 덩어리와 함께 80-90% 합칠 되어야 합니다.
  3. HPSC 미디어를 발음 하 고 37 ° C 0.25% 트립 신-EDTA 각 1 분 Aspirate에 대 한 고 1 mL 중지 미디어를 각 잘 추가 1 개 mL를 추가. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 접시에서 셀 다쳤어요. 각 잘 1 mL 워시 버퍼 추가.
    1. 2 mL 혈 청 학적인 피펫으로와 triturate 3-5 번 셀의 큰 덩어리를 휴식과 50 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송. 5 분에 대 한 330 x g에서 hPSCs 원심
  4. 사용할 수 매트 코팅 plasticware의 당 2 mL에 해당 hPSC 미디어의 전체 볼륨에 셀을 resuspend. 2 mL/hPSCs의 잘은 plasticware를 추가 하 고 5% CO 2와 37 ° C 배양 기에서 밤새 품 어.
  5. 24 시간 후, 미디어를 발음 하 고 37 ° C 0.05 %1 분에 대 한 트립 신-EDTA 트립 신-EDTA를 발음 하 고 1 mL 중지 미디어 추가. 셀 스 크레이 퍼와 함께 적극적으로 세포를 다쳤어요. 각 잘을 1 mL 세척 미디어를 추가 합니다. 2 mL 혈 청 학적인 피펫으로 triturate 셀 1-2 회와 50 mL 원뿔 튜브에 전송. 5 분에 대 한 220 x g에서 세포를 원심
    참고: 트립 신-EDTA 치료 수 오의 시간의 길이ld는 각 hPSC 라인에 대 한 조사에 의해 결정 됩니다. 트립 신 처리 단일 셀 분리를 야기 하지 않고 가능한 오랫동안 적용 되어야 한다. 이 단계 매트 코팅 접시에서 모든 hPSCs를 분리 해야 하지만 단일 셀 분리 발생 하지. 결과 EBs는 평균 6-10의 세포, 이어야 한다.
  6. 미디어 발음. 5 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 부드럽게 20 mL 세척 미디어 셀 resuspend. 5 분에 대 한 220 x g에서 원심 분리기
  7. 부드럽게 하루 0 미디어 (표 1)에 EBs를 resuspend. 차별화 미디어 10 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 6-잘 낮은 부착 세포 문화 접시의 각 음에 포함 하는 EBs의 2 개 mL를 분배. 장소는 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 (멀티 가스) 인큐베이터에.
    참고: 0 미디어: SFD 미디어 10 ng/mL BMP4 보충 (표 1). HPSCs의 모든 두 접시, 한 6-잘 낮은 부착 세포 문화 접시 사용.
  8. 24 시간 나중에, 추가 2 mL 1 일 미디어 (표 1). 멀티 가스 인큐베이터에서 하룻밤 셀을 품 어.
    참고: 1 일 미디어: SFD 미디어 10 ng/mL BMP4와 각 음 (표 1)을 10 ng/mL bFGF 보충.
  9. 후, 18 h는 부드럽게 5 mL 혈 청 학적인 피펫으로와 스핀에서 100 x g 5 분 세척에 대 한 EBs를 수확 하 고 10 mL IMDM 전체 문화를 결합. 5 분 Aspirate는 미디어에 대 한 100 x g에서 스핀.
    참고: 파편 문화에 존재 합니다. 낮은 속도 (100 x g)에서 원심 분리 단계가 파편을 제거 합니다.
  10. 부드럽게 SFD 미디어 주 2 미디어 (표 1), 보충에 EBs를 resuspend 하 고 6-잘 낮은 부착 세포 배양 배지로 잘 당 2 mL를 분배. 30 h. 위해 37 ° C 멀티 가스 인큐베이터에서 품 어
    참고: 주 2 미디어: 10 ng/mL BMP4, 그리고 5 ng/mL bFGF, 그리고 적절 한 WNT 주 작동 근 또는 길 항 근 (표 1).
    1. 추가 3 µ M 확실 한 조 혈 창시자를 지정 하는 CHIR99021. 3 µ M 또는 추가 IWP2 및 1 ng/mL Activin A 원시 조 혈 창시자 지정.
  11. 계속 조 혈 原 사양 섹션 3.

3. CD34의 사양 + 조 혈 창시자

  1. 30 h 후 격리와 차별화의 3 일에 2 mL 혈 청 학적인 피펫으로 EBs. 50 mL 원뿔 튜브에 전송 및 5 분 부드럽게 resuspend와 IMDM의 10 mL로 씻어 330 x g에서 원심. 330 x g 5 분에 다시 세포를 원심
  2. 3 일 미디어 (표 2)에 EBs를 resuspend 하 고 낮은 부착 6 잘 플레이트의 각 음에 2 mL를 분배. 셀에 72 h. 위해 37 ° C 멀티 가스 화기를 품 어
    참고: 주 3 미디어: SP34, 15 ng/mL VEGF와 5 ng/mL bFGF (표 2) 보충. 차별화의 3 일에 수확 하는 미디어의 산도 (, 노란색-오렌지 미디어) 변경 크게 잘 당 더 많은 미디어를 추가 합니다. 또는 사용 하 여 적은 EBs 잘 당 하루 0.
  3. 후 72 h 외피의 각 음을 하루 6 미디어 (표 2)의 2 개 mL를 추가 합니다. 추가 48 h. 위해 37 ° C 멀티 가스 인큐베이터에서 품 어
    참고: 주 6 미디어: SP34 미디어와 15 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 200 ng/mL SCF, 4 IU EPO, 20 ng/mL 일리노이-6, 10 ng/mL IL-11, 50 ng/mL IGF-1 (표 2) 보충. 더 많은 미디어 단계 3.1에서에서 추가 된 경우 다음 추가 미디어의 상응 하는 금액 3.2 단계에서 최종 사이토카인 농도 동일 하 게 유지.
  4. 는 차별화의 날 8 CHIR99021 처리 EBs 격리합니다. 제 4 이동.
  5. IWP2-대우 EBs는 50 mL 원뿔 관으로 분화의 8 일에 수확 하 고 있다. 5 분에 대 한 330 x g에서 원심 분리기는 부드럽게 하루 8 미디어 (표 2)에서 resuspend. 낮은 부착 요리에서 37 ° C 5% CO 2 인큐베이터에서 24 h에 대 한 품 어. 제 4 이동.
    참고: 주 8 미디어: SP34 미디어 100 ng/mL SCF와 2 IU EPO, 10 ng/mL 일리노이-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL Flt3-L, 30 ng/mL IL-3 (표 2) 보충.

4. 효소 분리의 EBs 및 조 혈 原 절연

  1. 분리 혈 청 학적인 피펫으로 50ml 원뿔에 EBs 튜브. 5 분 Aspirate는 상쾌한 오프에 대 한 330 x g에서 원심 분리기.
  2. 는 EBs에 0.25 %Trypsin-EDTA의 2 개 mL를 추가합니다. 8 분 추가 5 ml 정지 솔루션의 37 ° C 물 욕조에 5 미 품에 대 한 소용돌이. 5 분 Aspirate는 상쾌한 오프에 대 한 330 x g에서 원심 분리기.
  3. 콜라 II의 5 ml에서는 EBs를 resuspend. 5 소용돌이 s 고 37 ° C 물 욕조에 품 어. 60 분, 5 소용돌이 후 s 정지 솔루션의 5 mL을 추가. 330 x g 5 분 Aspirate는 상쾌한 오프에서 스핀.
  4. 1 mL FACS 버퍼의 셀 resuspend. 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포를 전달 합니다. 이 모든 undissociated 세포 덩어리를 제거 합니다.
  5. 셀을 계산합니다. 14 mL 원뿔 튜브에 aliquot 1 x 10 6 셀. 330 x g 5 분 Resuspend에서 셀 FACS 버퍼에서 5 x 10 6 셀/mL의 농도에서 세포를 스핀. 흐름 cytometric 컬러 컨트롤에 대 한 각 조건에서 셀의 약 수와 수영장 10%. 어둠 속에서 얼음에 30 분에 대 한 항 체에서 세포를 품 어.
    : 참고 테이블의 자료에 fluorophore 조합 제안.
    1. IWP2에 대 한 치료 셀 안티 CD34 및 안티-CD43 항 체 사용.
    2. CHIR99021에 대 한 치료 셀 안티 CD34, 안티-CD43, 안티-CD73, 및 안티-CD184 항 체 사용.
  6. FACS 버퍼를 사용 하 여 두 번 셀 린스. 5 분 Resuspend 5 x 10 6 셀/mL의 최종 농도에 세포에 대 한 330 x g에서 회전.
  7. 분석 또는 격리 cytometry에 의해 세포입니다. 원시 조 혈 창시자에 대 한 분석 CD34 그리고 CD43 식 ( 그림 2A). 확실 한 조 혈 창시자에 대 한 그 격리 (CD34 + CD43 CD73 CD184 ) FACS ( 그림 2B)에 의해. 튜브 냉장된 FACS 버퍼를 포함 하는 셀을 수집.
  8. 에서 확실 한 조 혈 잠재력을 평가 하기 위해 그 절연, 내 피-하-조 혈 전환에 대 한 섹션 5 또는 7 T-림프 분석 결과 대 한 계속. 원시 조 혈 연합사 분석 실험, 계속 섹션 6.

5. 내 피-하-조 혈 전환

  1. 스핀 격리 된 CD34 + CD43 CD73 CD184 5 분에 대 한 330 x g에서 셀 Resuspend 그 셀에서 200, 000 셀/mL (미디어 표 2). 50 µ L aliquots 96 잘 낮은 부착 세포 문화 접시에 있는 셀을 배포 합니다. 품 어는 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 멀티 가스 인큐베이터에서 하룻밤 셀.
    참고: 그는 미디어: SP34 미디어 5 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 100 ng/mL SCF, 2 IU EPO, 10 ng/mL 일리노이-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL FLT3-L, 30 ng/mL 일리노이-3, 보충10 ng/mL BMP4, 20 ng/mL 쉬, 10 µ g/mL Angiotensin II, 및 2 × 10 5 셀/mL (표 2)에서 100 µ M Losartan 칼륨.
  2. 24 잘 매트 코팅 판 (단계 1.2.7.1 참조), 필요에 따라 준비.
  3. 셀 집계 합니다 6-10의 세포의 덩어리에 하룻밤. Reaggregated 셀 각 50 µ L 볼륨, 부드럽게 전송 셀 24-잘 매트 코팅 접시의 중앙에 다음 날 아침에. 셀 연결 된 때까지 4-6 시간, 37 ° C 멀티 가스 인큐베이터에 접시를 부드럽게 장소.
  4. 셀 연결 후 각 음을 신선한 그 미디어의 1 mL를 추가 합니다. 조 혈 모 세포를 볼 수 있습니다 때까지 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 멀티 가스 인큐베이터에 셀을 품 어 (일반적으로 5-7 일; 그림 2D)입니다. 아래 100 배 확대 가벼운 현미경을 사용 하 여 시각화.
  5. 부드럽게 셀에서 그 미디어를 제거 하 여 확실 한 조 혈 창시자를 수확. 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해이 미디어를 전달 하 고 수집 합니다. 에 잘 부착 세포 추가 0.5 mL 0.25% 세포를 트립 신-EDTA와 5 분 추가 0.5 mL 정지 솔루션을 각 영역에 대 한 37 ° C에서 품 어. 함께 모든 점착 풀을 동일한 40 µ m 셀 여과기를 통해 세포와 비 부착 한 세포를 통해 전달 합니다. 5 분에 대 한 330 x g에서 스핀
    1. 섹션 6에 진행이 대량 문화의 CFC 잠재력을 평가 하.
  6. 셀 FACS 버퍼에 두 번 세척. 5 분에 대 한 330 x g에서 회전
  7. Resuspend 5 x 10 6 셀/mL에 FACS 버퍼에 셀. 어둠 속에서 얼음에 30 분 동안 안티 CD45 및 안티 CD34 항 체와 세포 얼룩 (fluorophores 테이블의 재료에 제안).
  8. 셀 FACS 버퍼에 두 번 세척. 5 분에 대 한 330 x g에서 회전
  9. 격리는 CD34 + CD45 + FACS ( 그림 2E)에 의해 세포. 냉장된 FACS 버퍼에 셀 정렬.
  10. 확실 한 CD34 평가 + CD45 + 필요한 (CFC 분석 결과 제 6, 7, 림프 잠재력 또는 다른 탐정 시작 분석 결과)로 조 혈 창시자.

6. 연합사 분석 결과

  1. 녹여 CFC 분석 결과 대 한 사용 하는 각 샘플에 대 한 멕 aliquots.
  2. 멕 분석 (단계 4.5, 4.7, 5.5, 또는 5.9) 되도록 셀을 추가 합니다. 소용돌이 철저 하 고 제조 업체에 따라 기포 분산 될 때까지 5-10 분에 대 한 멕 문화 서 ' s 지시. 16를 사용 하 여 ½ 3 mL 주사기에 바늘 계기, 멕의 2 개 mL를 조심 스럽게 제거.
    참고: 일반적인 도금 밀도 범위 1000-20000 셀/mL, 예상된 조상 주파수에 따라에서.
  3. 신중 하 게, 1 mL 멕 셀 혼합 두 35 m m 조직 문화 접시의 각 분배. 균등 하 게 부드럽게 고 접시를 회전 하 여 35mm 요리에 MeC를 배포 합니다. 각 장소는 15 cm 조직 문화 접시에 위의 요리는 물으로 가득합니다. 37 ° C 5% CO 2 배양 기에서 품 어.
  4. 멕 문화 40 X 확대를 사용 하 여 가벼운 현미경을 사용 하 여 시각화. 얻은 다양 한 Cfc 계량. 분석 기본 연합사 분석 실험 ( 그림 2C) 도금 후 8-10 일. 도금 후 14 일 최종 연합사 분석 실험 분석. 대표 연합사 분석 결과 식민지 형태학 그림 2 층에서 볼 수 있습니다.

7. T 세포 분석 실험 설정 최종 조 혈 잠재적인 하

    ,100 m m 조직 문화 접시 30 합칠 때까지 세포 성장 OP9 DL4 31 ,
  1. 32.
    1. thaw OP9 DL4 세포 T 세포 분석 실험을 도금 하기 전에 72 96 h. 10 ml OP9 미디어 OP9 DL4 셀 resuspend 및 10 cm 격판덮개로 분배. 70-90% 합칠 때까지 37 ° C 5% CO 2 배양 기에서 성장.
    2. 100 mm 접시에서 OP9 DL4 세포를 수확 하는 미디어를 제거 하 고 추가 5 mL 0.25 %5 분에 대 한 트립 신-EDTA 5ml OP9 미디어와 트립 신 활동을 중지. 회전 5 분 Resuspend에 대 한 330 x g에서 셀 1 mL OP9 미디어에서에서 셀 및 셀.
      참고: 한 10 cm 접시 confluent OP9 DL4 셀의 얻을 것입니다 약 10 x 10 6 OP9 DL4 셀.
    3. 48 h T 세포 분석 실험, 플레이트 2 x 10 6 셀 12 mL OP9 이전 미디어 24-잘 접시 (0.5 mL/음). 37 ° C 5% CO 2 배양 기에서 성장.
  2. 2000-10000 셀 (으로 단계 4.5, 4.7, 5.5, 또는 5.9) 분석을 보충 OP9 미디어 OP9 DL4 셀의 1을 추가: 30 ng/mL SCF (처음 6 일의 경우에), 5 ng/mL 일리노이-7, 그리고 5 ng/mL FLT3 L. 품 어 37 ° C 5% CO 2 inc ubator입니다. 이 단계에서 발생 하는 미디어 변경.
  3. 모든 4-5 일, 6-잘 접시에 신선한 OP9 DL4 stromal 세포 T 세포 창시자 통로. 1 mL를 피펫으로 셀 triturate 고 수 풀 제거를 40 µ m 필터를 통해 전달 합니다. 미디어에서 5 분 Aspirate에 대 한 330 x g에서 회전 합니다. 5 ng/mL 일리노이-7 5 ng/mL Flt3-L, 및 신선한 OP9 DL4 셀에 보충 하는 신선한 OP9 미디어의 2 mL에 셀 resuspend.
    참고: 이전에 뿌리고, 48 h 12 ml OP9 미디어, 2 x 10 6 신선한 OP9 DL4 셀 접시 및 6-잘 접시에 2 mL/잘 배포.
  4. 적어도 21 일 후 공동 문화, 적극적으로 triturate는 세포와 세포 파편을 제거 하는 40 µ m 필터를 통해 전달. 5 분 동안 330 x g에서 회전 하 고는 상쾌한 발음.
  5. 셀 차가운 FACS 버퍼에 두 번 세척. 5 분에 대 한 330 x g에서 회전
  6. Resuspend 5 x 10 6 셀/mL에 FACS 버퍼에 셀. 얼룩 (조합 재료의 테이블에에서는 제안된 fluorophore) 어둠 속에서 얼음에 30 분 동안 안티 CD45, CD56 안티, 안티-CD4, 및 안티-CD8 항 체와 세포. 라이브/죽은 세포 얼룩 (DAPI, ) 분석에서 파편을 제거 하려면 적용.
  7. 셀 FACS 버퍼에 두 번 세척. 5 분에 대 한 330 x g에서 회전
  8. T-림프 구 창시자 ( 그림 3)의 존재를 평가 하기 위해 교류 cytometer를 사용 하 여 셀을 분석.

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Representative Results

HPSCs에서 원시적이 고 확실 한 조 혈 창시자의 유도 묘사한 회로도 그림 1에서 그림입니다. Mesoderm 정식 WNT 차별화, 조 혈 原 사양에 따라 2-3 일 동안 발생 하는 신호에 의해 패턴.

대표적인 흐름 cytometric 분석 및 스 분석 실험 조 혈 차별화 hPSC 파생 된 문화를 형성 하는 식민지는 그림 2에 표시 됩니다. IWP2 대우 차별화 문화 고유 CD34 보장할+CD43 와 CD34낮은 /CD43+ 인구, 그러나 CHIR 처리 차별화 문화 해야한다 < 1 %CD43+ 세포의 8 일 분화 (그림 2AB)26. CHIR 대우 문화 연합사 크게 없는 것 IWP2 조건 하루 9에 고립 된에서 파생 된 원시 조 혈 창시자 주로 기본 erythroid (EryP-CFC) 및 골수성 창시자 스 분석에 상승을 줄 것 이다 (그림 2CF)이이 단계에서 가능성이 있습니다. 대신,는 CD34+CD43 CHIR99021 치료에서 파생 하는- 인구는 이질적인 인구, 포함 된 내 피 창시자, CD34+CD43-CD73-CD184- 그가 ( 그림 2B) 때 FACS에 의해 분리, 처음 다음 라운드, refractile 비 부착 결과 내 피-하-조 혈 변화를 겪 습 (2D 그림, 왼쪽된 패널), 내 피 같은 세포의 단층을 형성 합니다 조 혈 모 세포 (그림 2D, 오른쪽 패널). 이 조 혈 모 세포 CD34, CD45 표현 위한 cytometry에 의해 평가 될 수 있다 (그림 2E). EHT 분석에서 고립 된 조 혈 창시자 스 분석 실험에 사용할 수 있으며 큰 버스트와 같은 erythroid 콜로 니 형성 단위 (BFU-E), 작은 erythroid 콜로 니 형성 단위 (CFU-E), 및 골수성 창시자 (CFU-M;을 그림 2 층)입니다.

그림 3 은 CHIR99021에서 파생 된 CD34에서 잠재적인 T-림프 구 분석 실험의 대표적인 흐름 cytometric 분석 묘사+CD43CD73CD184 조 혈 창시자 (그림 3A) IWP2 파생 (그림 3B) CD34+CD43 조 혈 창시자, OP9 DL4 공동 문화 21 일을 다음. 존재는 CD45의+CD56CD4+CD8+ CHIR 파생 창시자 인구는 입력된 CD34 내 확실 한 조 혈 잠재력+ 인구. CD34+ 그리고 CD43+ IWP2 파생 차별점에서 격리 하는 창시자 주지 않으면 상승 T-세포를 이러한 분화 조건18,26에서이 분석 결과에.

Figure 1
그림 1: 고 원시 조 혈 창시자의 사양에 대 한 프로토콜의 회로도. 주요 실험 단계 및 일정 하 고 원시 조 혈 창시자 EBs에서 차별화의 묘사 EBs는 날 0 매트 코팅 plasticware에 hPSCs에서 생성 됩니다. EBs는 BMP4 멀티 가스 인큐베이터에 들어 있는 SFD 미디어에서 재배 됩니다. 차별화의 주 1, 문화 미디어 BMP4와 bFGF 보충으로 먹인 다. 주 2, 미디어 변화 WNT 조작 원시 조 혈 창시자에 대 한 확실 한 조 혈 창시자 및 IWP2 CHIR99021 (CHIR)의 추가 통해 발생합니다. 하루 3, SP34, VEGF와 bFGF 보충 미디어 변경 됩니다. 하루 6, 문화 미디어 조 혈 cytokines와 보완으로 먹인 다. 원시 조 혈의 날 8 일, 미디어를 변경 하 고 셀 시 조 조 혈 모 세포 (HPC) 분석 결과 다음 24 h에 대 한 5% CO2 배양 기에 이동 됩니다. 확실 한 조 혈 사양, CD34의 8 일+CD43-CD73-CD184- 셀 FACS에 의해 격리 되며 확실 한 hemogenic 내 피 잠재력, 또는 T-림프 잠재력 (묘사 되지)에 대 한 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 차별화 문화와 원시 조 혈 창시자의 세대 분석. (A) IWP2 치료 8 일 EBs에서 원시 조 혈 창시자의 대표적인 흐름 cytometric 분석. (B) CHIR99021 치료 8 일 EBs에서 대표적인 흐름 cytometric 분석. Hemogenic 내 피 (그)를 식별 및는 CD34로 고립 된 수+CD43-CD73-CD184- 인구. (C)에서 IWP2-CHIR99021-하루 9 조 혈 창시자의 식민지 형성 잠재력 (CHIR) 치료 차별화 문화. n = 3, 오차 막대를 나타내는 뜻의 SD, 별표 표시 스튜던트 t-검정을 사용 하 여 통계적 의미 * * * p < 0.0001. 그 4 일 후 (왼쪽) 또는 7 + (오른쪽)의 일에 매트 코팅 plasticware 성장 세포를 절연 (D) 대표 사진. 원래 확대, 100 X입니다. 바 규모 = 100 µ m. (E) 대표 cytometry 문화의 9 일 후 확실 한 조 혈 창시자에서 CD34, CD45 식의. (F) 대표 사진 EryP CFC (왼쪽), CFU-M (중간), BFU-E 및 CFU-E (오른쪽)의 형태를 보여주는. 원래 확대, 40 X입니다. 바 규모 = 100 µ m 화살표 식민지 라는 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 확실 한 조 혈 잠재력의 분석. CHIR에서 파생 된 CD34의 T 림프 구 잠재력의 대표적인 흐름 cytometric 분석+CD43CD73CD184 조 혈 창시자 (A) 또는 (B) CD34 IWP2 파생 된+CD43 조 혈 창시자, OP9 DL4 셀과 공동 문화 후 28 일 샘플에서 T-림프 구 잠재력 CD45 100 이상의 경우 긍정적인 것으로 간주 됩니다+ 이벤트 감지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

나이 "항상" = > SFD 미디어 하루 0 주 1 주 2 확실 한 주 2 기본 BMP4 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL bFGF - 10 ng/mL 5 ng/mL 5 ng/mL Activin A - - - 1 ng/mL CHIR99021 - - 3 Μ M - IWP2 - - - 3 Μ M

표 1: SFD 기반 미디어 일 0 - 2.

SP34 미디어 3 일 주 6 8 일 그는
VEGF 15 ng/mL 15 ng/mL - 5 ng/mL
bFGF 5 ng/mL 5 ng/mL - 5 ng/mL
SCF - 200 ng/mL 100 ng/mL 100 ng/mL
EPO - 4 IU 2 IU 2 IU
일리노이-6 - 20 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL
IL-11 - 10 ng/mL 5 ng/mL 5 ng/mL
IGF-1 - 50 ng/mL 25 ng/mL 25 ng/mL
TPO - - 30 ng/mL 30 ng/mL
Flt-3 L - - 10 ng/mL 10 ng/mL
IL-3 - - 30 ng/mL 30 ng/mL
BMP4 - - - 10 ng/mL
쉬이 잇 - - - 20 ng/mL
Angiotensin II - - - 10 µ g/mL
Losartan 칼륨 - - - 100 Μ M

표 2: 일 3 SP34에 기초를 둔 미디어 - 8, 그는.

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Discussion

이 프로토콜 기본 또는 최종 조 혈 창시자의 분화에 대 한 빠른, 혈 청, 기질-없는 방법을 설명합니다. 기본 또는 최종 조 혈 창시자의 mesodermal 규격은 유일 하 게 정식 WNT 신호 전달의 분자 억제제를 이용 하는 우리의 프로토콜을 사용 하 여 안정적으로 얻을 수 있습니다. 반면 PORCN 억제제 IWP234 에 의해 WNT 억제 지정 원시 조 혈 mesoderm26단계 관련 WNT 활성화 GSK3β 억제제 CHIR9902133 에 의해 확실 한 조 혈 mesoderm 상승을 제공 합니다. 메모의이 방법은 튼튼하게 주지 않는다 상승 engraftable HSC 같은 인구 (표시 되지 않음). 그러나,이 방식으로 생성 하는 확실 한 조 혈 창시자는 그들의 잠재적인 미래에 변환 응용 프로그램을 강조 transgene 유도 engraftment 잠재적인35, 의무가 있습니다.

성공적인 hPSC 차별화 하는 중요 한 결정은 hPSCs에서 형성 되는 EBs의 초기 크기. EBs 주위 해야 이상적으로, 6-10 셀 크기에. Aberrantly 차별 문화는 EBs는 EB에서 부적 절 한 신호 활성화 때문에 아마도 너무 큰 경우 두 프로그램 전부의 혼합물을 지정할 수 있습니다. 차별화 문화 차별화의 첫 24 시간 내 최적의 EB 크기에 대 한 시각적으로 검열 되어야 한다. 또는,에서 hPSCs는 완전히 단일 셀에 연결 되어 있지 않으면는 hPSCs 대신 anoikis 세포 죽음36을 가난한 조 혈 차별화 인을 받 다.

IWP2 일 2와 3이 분화 프로토콜의 mesodermal 사양 중 사용 하는 경우 성공적인 차별화 독점적으로 원시 조 혈 창시자 상승을 줄 것 이다. 차별화의 날 8 일, 뚜렷한 CD34의 IWP2에서 파생 된 문화를 구성+CD43, CD34중간/낮은 CD43+, 그리고 CD34CD43+ 인구 (그림 2A). CD34중간/낮은 CD43+ 인구 생겨나게 기본 erythroid 및 골수성 창시자; CD34 동안CD43+ 인구 주로 생겨나게 제한 골수성 잠재적인18로 erythroid 창시자. 원시 조 혈 잠재력 EryP CFC (6 절)는 것 주로 태아 HBG26에 비해 배아 globin HBE 표현의 존재에 대 한 스 분석 결과 의해 확인 될 수 있다 28,37. CD43 마찬가지로, 존재+ 원시 조 혈 창시자18,,2326의 존재를 나타내기 위해이 단계에서 조 혈 창시자를 안정적으로 사용할 수 있습니다. CD43 식 원시 조 혈 프로그램18,,2326의 창시자를 독점 하지 않습니다 및 기본 조 혈을 평가 하기 위해 통계를 단독으로 사용할 수 없습니다 주목 해야한다 잠재적인, immunophenotype와 인간 노치 의존으로 EMP 남아 있다 새롭거나 (3에서 검토).

2와 차별화의 3 일 동안 mesodermal 패턴화 하는 동안 CHIR99021를 사용 하는 경우 독점적으로 확실 한 조 혈 창시자 인구 지정 됩니다. 분화 프로토콜의 날 8 일에 독특한 CD34의 CHIR99021에서 파생 된 문화를 구성+거의 아무 CD43 식26CD43 인구. CD34+CD43 인구는 조 혈, 정 맥, 그리고 동맥 잠재력과 구분 될 수 있는 그 셀 두 의 표현 부족 CD73 CD184 식에 따라 내 피 세포의 이종 인구 27,28. CD34을 보장할 때 확실 한 그는 격리 수준의 종속 내 피-하-조 혈을 받은 후 전환 (5)28 +CD45+ 조 혈 창시자 BFU-E 및 골수성 세포 증가 줄 것 이다 스, 하지만 하지 EryP CFC26,28 (그림 2). BFU E 식민지를 격리 하 고는 지 주로 표현 배아 HBE (표시 되지 않음)26,28, 에 비해 태아 globin HBG globin 분석에 대 한 평가 수 또한, 37. 림프 잠재력을 직접 평가 될 수 있다 반대로,에서 고립 된 그는, 노치 종속 내 피-하-조 혈 전환 OP9 DL4 기질18,,2628에서 발생. 그는이 방법으로 지정 된 확실 한 erythro-myelo-림프 창시자를는 클론 레벨28, 기능적으로 EMP 또는 LMPP 창시자3의 우리의 현재 이해에서 구별에서 포함 되어 있습니다. 같은 T 림프 HBG의 존재-erythroid 잠재적인, EryP CFC 잠재력의 부재와 결합 하 여 표현 안정적으로 hPSCs에서 확실 한 조 혈 명세를 나타내는 데 사용할 수 있습니다. 메모, 전적으로 HBG을 야기할 수 있는 창시자에 대 한 평가의-확실 한 잠재력으로, 위에서 설명한, 인간의 EMP와 신호 요구 사항이 유사한 정확 하 게 결정 하지 않을 수 있습니다, 하지 않은 erythroblasts을 표현 특징-날짜 (참조3에서 검토).

이 간단한 차별화 전략은 매우 강력한 독점적으로 원시의 생성 또는 독점적으로 확실 한 조 혈 창시자, 질병 환자 파생 Ipsc에서 두 프로그램의 비교 연구를 모델링을 활성화에 대 한 수 또는 유전자 수정 hPSCs입니다. 마찬가지로, 인간의 발달 과정 수 수 심문, 어떤 추가적인 신호 pathway(s)는 자기 갱신 용량, 그리고 확실 한 조 혈 창시자에서 따라서 HSC 같은 잠재력을 부여 하는 데 필요한 발견 등.

요약 하자면, WNT 조작 hPSCs mesodermal 패턴화 하는 동안 지정 기본 CD43+ 또는 최종 CD34+CD45+ 절연 hPSC 파생 조를 공부 하는 데 사용 될 수 있는 조 혈 창시자.

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Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgments

이 작품은 부의 내과, 혈액 부, 워싱턴 대학의과 대학에 의해 지원 되었습니다. CD는 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소에서 T32HL007088에 의해 지원 되었다. CMS는 혈액학 학술 상을의 미국 사회에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) Corning 10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated Gemini Bioproducts 100-500
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30396.03
L-glutamine, 200 mM solution Life Technologies 25030-081
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15070-063
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200056
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300054
Gelatin, porcine skin, Type A Sigma-Aldrich G1890
Alpha-MEM Life Technologies 12000-022
DMEM-F12 Corning 10-092-CV
Knock-out serum replacement Life Technologies 10828028 "KOSR"
Non-essential amino acids (NEAA) Life Technologies 11140050
b-mercaptoethanol, 55 mM solution Life Technologies 21985023
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
Fraction V, Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1605
Ham's F12 Corning 10-080
N2 supplement Life Technologies 17502048
B27 supplement, no vitamin A Life Technologies 12587010
Stempro-34 (SP34) Life Technologies 10639011 "SP34"
Growth factor reduced Matrigel Corning 354230 "MAT"
L-absorbic acid Sigma-Aldrich A4403
Human serum transferrin Sigma-Aldrich 10652202001
Monothioglycerol (MTG) Sigma-Aldrich M6145
Collagenase B Roche 11088831001
Collagenase II Life Technologies 17101015
DNaseI Calbiochem 260913
Phosphate Buffered Saline (PBS) Life Technologies 14190144
bFGF R&D Systems 233-FB
BMP4 R&D Systems 314-BP
Activin A R&D Systems 338-AC
VEGF R&D Systems 293-VE
SCF R&D Systems 255-SC
IGF-1 R&D Systems 291-G1
IL-3 R&D Systems 203-IL
IL-6 R&D Systems 206-IL
IL-7 R&D Systems 207-IL
IL-11 R&D Systems 218-1L
TPO R&D Systems 288-TP
EPO Peprotech 100-64
Flt-3 ligand (FLT3-L) R&D Systems 308-FK
CHIR99021 Tocris 4423
IWP2 Tocris 3533
Angiotensin II Sigma-Aldrich A9525
Losartan Potassium Tocris 3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 BD Biosciences 560650 Dilution 1:100; T cell assay
CD8 PE Clone RPA-T8 BD Biosciences 561950 Dilution 1:10; T cell assay
CD34 APC Clone 8G12 BD Biosciences 340441 Dilution 1:100; EHT assay
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 BD Biosciences 348801 Dilution 1:100; Hemogenic endothelium
CD43 FITC Clone 1G10 BD Biosciences 555475 Dilution 1:10; Hemogenic endothelium
CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 BD Biosciences 557833 Dilution 1:50; T cell assay
CD45 eFluor450 Clone 2D1 BD Biosciences 642284 Dilution 1:50; EHT assay
CD56 APC Clone B159 BD Biosciences 555518 Dilution 1:20; T cell assay
CD73 PE Clone AD2 BD Biosciences 550257 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
CD184 APC Clone 12G5 BD Biosciences 555976 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) BD Biosciences 564907 Dilution 1:10,000; T cell assay
OP9 DL4 cells Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034 Stemcell Technologies 4034 "MeC"
Milli-Q water purification system EMD Millipore
5% CO2 incubator Set at 37 C
Multigas incubator Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2
6 well tissue culture plate Corning 353046
24 well tissue culture plate Corning 353226
6 well low-adherence tissue culture plate Corning 3471
24 well low-adherence tissue culture plate Corning 3473
35 mm tissue culture dishes Corning 353001
Blunt-end needle, 16 gauge Corning 305198
3 cc syringes Corning 309657
5 mL polypropylene test tube Corning 352063
5 mL polystyrene test tube Corning 352058
15 mL polypropylene conical Corning 430791
50 mL polypropylene conical Corning 430921
2 mL serological pipette Corning 357507
5 mL serological pipette Corning 4487
10 mL serological pipette Corning 4488
25 mL serological pipette Corning 4489
Cell scrapers Corning 353085
2.0 mL cryovials Corning 430488
5 mL test tube with 40 µM cell strainer Corning 352235
40 µM cell strainer Corning 352340
Cell culture centrifuge
Biosafety hood
FACS AriaII or equivalent
LSRii or equivalent
FlowJo software TreeStar
Water bath Set at 37 C
0.22 µM filtration system Corning
Autoclave
4 C refrigerator
-20 C Freezer
-80 C Freezer

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References

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