표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

1Division of Viral Diseases, Centers for Disease Control and Prevention
Published 2/06/2017
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Immunology and Infection

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Park, G. W., Chhabra, P., Vinjé, J. Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces. J. Vis. Exp. (120), e55205, doi:10.3791/55205 (2017).

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Abstract

인간의 noroviruses는 전염병이 전 세계적으로 산발적 위장염의 주요 원인입니다. 대부분의 감염이 어느 환경 표면 또는 음식을 통해 간접적으로 개인 대 개인 경로를 통해 직접 전파 또는 때문에, 오염 fomites과 무생물 표면은 노로 바이러스의 발생시 바이러스의 확산을위한 중요한 차량이다.

우리는 개발 검출 및 하드 표면에서 인간의 noroviruses의 입력에 대한 macrofoam 면봉을 사용하여 프로토콜을 평가 하였다. 섬유로 만들어진 면봉 또는 정전기 방지 물티슈에 비해 macrofoam 면봉는 최대 700cm 2의 변기 표면에서 바이러스 복구 (범위 1.2-33.6 %)을 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 스핀 열을 사용하여 바이러스 성 RNA의 면봉에서 바이러스의 추출과 더 집중하는 단계를 포함한다. 노로 바이러스 위장염이 있었다 유람선 및 장기 요양 시설의 표면에서 수집 한 217 면봉 샘플의 총, 127 (58.5 %)RT-qPCR에 의한 GII의 노로 바이러스 양성 반응보고했다. 이 29 (22.8 %)의 성공적 유전자형을 할 수있다. 결론적으로, 우리는 임상 샘플을 사용할 수없는 경우 바이러스의 검출뿐만 아니라 발생시 환경 오염의 수준을 결정하는데 도움이 될 수 개발 된 프로토콜을 사용하여 환경 표면 노로 바이러스의 검출; 또한 치료 전략의 효과의 모니터링을 용이하게 할 수있다.

Introduction

인간의 noroviruses는 전염병과 산발적 급성 위장염 전 세계적으로 1, 2, 3의 주요 원인이다. 이 바이러스는 매우 전염성이 전송은 사람의 상호 작용으로 또는 간접적으로 오염 된 음식, 물 또는 환경 표면과 접촉을 통해 직접 사람을 통해 발생합니다. Noroviruses는 장시간 흘리고 연장 환경면에서의 바이러스 생존 1, 2, 3에 설명 된 수있다. 피크 흘리는 동안 바이러스 입자 수십억 대변 그램 당 방출하고, 구토 같은 감염 4, 5, 6, 7, 8 일으키는 바이러스 입자의 충분한 개수를 포함EF "> 9,10. 또한 무생물 표면과 사람의 피부의 바이러스의 이동이 발생하기 쉬운 2, 11, 12. 따라서, 환경 오염의 모니터링이 발생 조사 돕기 및 정화의 효과를 평가할 수 있으며 소독 절차.

몇몇 환경 샘플링 프로토콜 로타 바이러스의 검출에 대해 설명되었지만, coliphage MS2, 고양이 calicivirus (FCV) 및 박테리오파지 P22 13, 14, 15, 16. 그러나, 고속 탈수 (<1 시간) 작은 표면적을 포함하여이 연구에 기술 검증 조건 (25 X 100cm 2), 적절 필드 설정을 표현하지 않을 수 있습니다. 또한 ENVIRO 낮은 오염 수준을 예상nmental 표면은 거의 바이러스 입자를 감지 할 수있는 프로토콜을 필요로한다.

우리는 노로 바이러스의 검출 및 입력을위한 macrofoam 기반 표면 샘플링 방법을 개발했다. 이 방법은 여러 노로 바이러스 발생시 검증되었습니다. 프로토콜이 포함 1) (2) 최선의 방법 실험실에 수집 및 운송 중에 샘플의 무결성을 유지하고, 노로 바이러스 3) 실험실 테스트 및 타이핑 환경면에서 면봉 샘플을 수집하는 방법에 대해 설명합니다.

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Protocol

필드 1. 면봉 샘플링

  1. 장갑의 깨끗한 쌍을 착용 할 것.
  2. 측정 테이프자를 사용하여 표면을 만지지 않고 샘플링 에리어의 크기를 측정한다. 가능한 한 정확하게 영역을 추정하고 보고서 양식 (보충 표 1)를 작성하려고합니다.
  3. 가능한 누출 및 라벨 샘플 수송 가방과 면봉 키트에 대한 면봉 키트를 확인합니다.
  4. 다음 샘플링 에리어 걸쳐 면봉 이동 : 수평 방향의 하나의 선, 세로 방향으로 하나의 스트로크와, 대각 방향에 하나의 획. 700cm 2보다 표면적이 큰 면봉하지 마십시오.
  5. 튜브에 각각 면봉을 놓고 안전하게 뚜껑을 조입니다.

실험실에 면봉 2. 보관 및 운송

  1. 최대 48 시간 동안 4 ° C에서 면봉을 유지합니다. 오랜 기간 동안 보관이 필요한 경우, -20 ° C에서 면봉을 저장 (또는 -70 ° C).
  2. 0-4 ℃에서 튜브를 유지 (즉,. 컬렉션의 24 ~ 48 시간 이내에 실험실 및 선박에 운송 중 절연 된 용기에) 콜드 팩을 사용합니다.

3. 바이러스 농도 바이러스 RNA 추출 및 정제

주 : 달리 명시되지 않는 한 모든 원심 분리 단계는 실온에서 5 분 동안 5,000 XG에서 테이블 탑 원심 분리기를 사용한다. 보편적 인 핵산 추출 (UNEX) 버퍼로 작업 할 때 추가로주의해야합니다. 고글 또는 안면 보호대를 착용하십시오.

  1. 한 15 ML의 튜브와 각 샘플에 대해 하나의 RNA 미디 열 레이블. 각 실험에 부정적인 추출 컨트롤을 포함합니다.
  2. 10 면봉 대한 분해 용액을 제조 PBST 25 mL로 UNEX 완충액 25 ㎖를 혼합하여 (0.02 %를 함유하는 PBS pH를 7.2 트윈 80).
  3. 용해 액 50 ㎖에 coliphage의 MS2 서스펜션 (10 6 PFU / μL) 50 μL를 추가합니다.
  4. 15 ㎖의 튜브에 면봉을 넣고 5 ml의 용해 액을 추가합니다. 혼합하고 실온에서 10 분 동안 배양한다.
  5. 10 초 동안 각 튜브와 소용돌이에 5 ml의 100 % 에탄올을 추가합니다.
  6. 조심스럽게 15 ML의 튜브에서 면봉을 제거 초과 액체를 제거하고 면봉을 폐기 튜브의 측면에 살짝 누르면 (이 UNEX 버퍼를 포함). 나머지 볼륨은 9 ~ 10 mL의 사이에 있어야한다.

4. 미디 열 바이러스 핵산 추출

  1. 조심스럽게 미디 컬럼, 원심 분리기에 단계 3.6에서 4.5 mL의 UNEX / 에탄올 혼합물을 전송하고, 여과 액을 버린다.
  2. 동일한 열, 원심 분리기에 같은 혼합물로부터 또 다른 4.5 mL로로드하고, 여과 액을 버린다.
  3. 제 씻지 미디 칼럼, 원심 분리기에 70 % 에탄올 3.5 mL를 추가하고, 여과 액을 버린다.
  4. 제 씻지 미디 컬럼에 70 % 에탄올의 또 다른 3.5 mL의 추가. 원심 분리기 여과 액을 버리고.
  5. 건조 스핀를 들어, 에탄올의 모든 흔적을 (부정적인 바이러스 성 RNA 복구에 영향을 미칠 수있는)을 제거하기 위해 미디 열을 원심 분리기.
  6. 새로운 15 ML의 원심 분리기 튜브의 미디 열을 놓습니다. 미디 칼럼에 250 μL 용출 버퍼를 추가; 가장 높은 바이러스 성 RNA 복구를 얻기 위해 원심 분리하기 전에 1 분 동안 기다립니다.
  7. -70 ° C에서 추출 된 핵산을 저장하거나 5 단계로 바로 진행합니다.

RNA 깨끗하고 집중 키트를 사용하여 바이러스 핵산의 5 농도

  1. RNA는 10 초 동안 위의 단계 4.7과 와동에 용출 된 RNA의 250 μL에 버퍼를 바인딩의 500 μL를 추가합니다.
  2. 10 초 동안 750 μL 100 %를 에탄올과 소용돌이를 추가합니다.
  3. 각 샘플에 대한 스핀 열 레이블. 스핀 칼럼에 750 μL 샘플을로드합니다.
  4. 1 분 동안 12,000 XG에 스핀 컬럼을 원심 분리기. 흐름 -을 통해 폐기하십시오.
  5. 1 분 동안 12,000 XG에 스핀 컬럼 및 원심 분리기 상에 남아있는 750 μL를로드합니다.
  6. 프리 워시를 들어, 1 분 동안 12,000 XG에서 각 스핀 컬럼 및 원심 분리기 400 μL RNA 준비 버퍼를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오.
  7. 첫 번째 세척를 들어, 1 분 동안 12,000 XG에서 각 스핀 컬럼 및 원심 분리기 800 μL RNA 세척 버퍼를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오.
  8. 두 번째 세척를 들어, 1 분 동안 12,000 XG에서 열 원심 분리기를 회전 400 μL RNA 세척 버퍼를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오.
  9. 건조 스핀를 들어, 2 분 동안 12,000 XG에 세척 버퍼의 모든 흔적을 제거하는 스핀 컬럼을 원심 분리기.
  10. 조심스럽게 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 스핀 컬럼을 전송합니다.
  11. 스핀 컬럼 상에 25 μL의 용출 완충액을 첨가하고 실온에서 1 분 동안 배양한다. 이 컬럼으로부터 RNA 바이러스의 회수를 증가시킬 것이다.
  12. 1 분 동안 10,000 XG에 스핀 컬럼을 원심 분리하여 RNA를 수집합니다.
  13. 어느 -70 ° C에서 RT-qPCR에 (6 단계) 또는 저장 RNA에 직접 진행합니다.

6. 유전자형 I의 Mutiplex RT-qPCR에 탐지 및 II Noroviruses 및 Coliphage MS 2 (보충 표 2)

  1. 청소 작업 표면 pipettES,의 RNase의 오염 제거 용액와 원심 분리기는 오염 가능성을 줄일 수 있습니다.
  2. 얼음에 RT-qPCR에 시약을 녹여. (별도의 영역 / 방에) 얼음에 해동 RNA.
  3. 반응의 수를 결정하고 적어도 10 % 이상을 추가 (열 반응이 필요한 경우, 예를 들면, 11의 마스터 믹스를 확인).
  4. 5 초 동안 25 배 RT-qPCR에 효소를 제외 소용돌이 개별 마스터 믹스 구성 요소. 조심스럽게 손가락으로 튜브를 쓸어 넘겨 효소를 혼합한다.
  5. 5 초 동안 간단히 원심 분리기 마스터 믹스 구성 요소.
  6. 키트 지침에 따라 노로 바이러스 GI과 GII의 실시간 RT-PCR 검출을위한 마스터 믹스를 준비하고 1.5 ml의 microcentrifuge 관 (보충 표 3)에서 노로 바이러스 특이 적 올리고 뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 추가합니다.
  7. 위아래로 5 ~ 10 회 피펫 팅하여 마스터 믹스 믹스 (텍싱하지 않는 것이 좋습니다). 실시간 PCR을 96 웰 플레이트의 각 웰에서의 마스터 믹스를 22 μL 분취.
  8. 소용돌이 샘플 RNA5 초 동안, 그리고 짧은 (5 초) 원심 분리하여 수집합니다.
  9. RT-qPCR에 판 (표 2에서 템플릿을 따라)에 샘플 RNA와 GI과 GII 양성 대조군의 3 μL를 추가합니다. 노 템플릿 제어 (NTC) 우물에 클레아 제-freewater의 3 μL를 추가합니다.
  10. 광학 접착제 필름 실시간 플레이트를 밀봉.
  11. 1 분 웰에 존재할 수있는 임의의 기포 또는 액체 방울을 제거하기 위해주의 깊게 1300 XG에서 실시간 플레이트를 원심 분리.
  12. 10 분 동안 1) RT 단계 : 실시간 PCR 장비 및 설정 다음 열 순환 조건을 설정합니다. Taq 중합 효소의 45 ° C (2) 활성화, 10 분에서. 95 ° C에서 및 (3) 95 ℃에서 15 초간 45 사이클, 그리고 60 ℃에서 60 초.

면봉 샘플에서 노로 바이러스의 7 정량화

  1. RT-qPCR의 결과 (보충 표 3)의 유효성을 검사 양성 및 음성 대조군의 결과를 확인합니다.
  2. 각각의 표준 곡선이 사항을 만족하는지 확인사용할 수있는 값은 보조 표 2에 주어진 수학 식 (1)를 사용하여 표준 곡선의 전체 표준 편차를 계산합니다.
    (식 1) %의 효율 = 100 × 10 (평균 코네티컷 값 절편) / 경사.
  3. PCR을 열 순환기 소프트웨어는 각각의 표준 곡선에 대한 기울기를 계산하지 않으면 기울기 R 통계 소프트웨어를 이용하여 회귀 2(예를 들어 엑셀, SPSS 또는 SAS)를 결정한다. 또한, 방정식 나는 다음과 같은 표준 곡선에 대한 %의 효율을 계산
  4. 보충 표 4에 명시된 기준에 맞는 표준 곡선에 기초하여 모든 테스트 샘플에 대한 열 순환기 소프트웨어에 의해 산출 된 RNA 카피 수를 기록한다. 기준을 충족하거나 거짓 양성 대조군이없는 표준 곡선 t 모자와 함께 어떤 샘플을 다시 실행하십시오. PCR 억제를 모니터링 할 수있는 내부 통제로 추가 된 coliphage MS2의 코네티컷 값을 확인합니다.
  5. RNA 카피 (P)의 총 개수를 결정는 RT-qPCR의 반응에 사용 된 RNA (3 μL 5)의 것과 총 RNA의 용출 부피 (25 내지 50 μL)의 비율로 단계 7.2에서 계산 된 RNA 복사 개수를 곱하여 ER 샘플. 대안 적으로, 분석 대상물의 표면적 (cm 2)에 의해 총 RNA 복사 개수를 분할함으로써 RNA 농도를 계산한다.

헤미 중첩 된 기존의 PCR 증폭에 의해 실시간 RT-PCR 긍정적 인 샘플의 8 유전자형

  1. RT-PCR 분석의 각 프라이머 세트에 대한 마스터 믹스의 첫 번째 라운드를 준비합니다 (보충 표 2, 5).
  2. 마스터 믹스 20 μL에 노로 바이러스 양성 RNA의 5 μL를 추가합니다.
  3. 다음과 같은 조건에서 RT-PCR을 실행하여, (1) 실온에서 95 ° C에서 Taq 중합 효소의 42 ° C (2) 활성화, 15 분에서 30 분 동안 단계, 및 (3) 95 ℃에서 30 초, 40주기 50 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 60 초. 40 사이클 후, 72 ℃에서 추가로 10 분 동안 배양한다.
  4. RT-PCR 분석 각각의 프라이머 세트 (보충 표 2와 5)에 대한 이잖아요 믹스의 두 번째 라운드를 준비합니다.
  5. 23 μL 마스터 믹스를 추가하고 각 튜브 (이상적으로 1 차 제품의 RNase없는 물에 1/10 희석한다)에 (첫 라운드에서) 1 라운드 RT-PCR 제품의 2 μL를 추가합니다.
  6. 단계를 반복 8.3.
  7. (PH 8.3에서 40 mM 트리스, 20 mM의 아세트산 및 1 mM의 EDTA) 100 ㎖ 1X 트리스 - 아세테이트 EDTA 2 % 아가 로스 겔을 제조. 전자 레인지의 혼합물을 가열하여 아가로 용해한 후, 60 ~ 70 ℃로 냉각 한 후, 혼합물을 제조 된 겔을 100㎖ 당 핵산 얼룩 10 μL를 추가 겔 붓고 콤 삽입. 겔은 적어도 30 분 동안 정착하자.
  8. 6X 로딩 염료 3 μL 각 RT-PCR 생성물의 15 μl를 섞는다. 로드 각 시료 15 μL 및 1 시간 동안 100 V의 아가로 오스 겔 electrophorese.
  9. 겔에서 적절한 크기 (GI 330 BP와 GII 341 BP)의 소비세 대상 RT-PCR 단편상업적 겔 추출 키트를 사용하여 RNA를 정제 거라고. 정제 된 PCR 생성물은 이제 생거 시퀀싱에 사용될 수있다.

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Representative Results

도 1은 면봉 샘플링 프로토콜의 흐름도를 나타낸다. 이 프로토콜은 네 가지 주요 단계로 구성; 1) 샘플 수집, 2) 시료의 저장 및 수송, 3) 바이러스 성 RNA의 정제 및 농도 4) RT-qPCR의 분석 및 유전자형.

그림 1
그림 1 : 노로 바이러스의 환경 표면 샘플링에 대한 최종 프로토콜의 차트 흐름 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1은 항해 중 의심되는 노로 바이러스 위장염의 사례를보고했다 유람선에서 수집 된 34 면봉 샘플의 결과를 요약 한 것입니다. 면봉 표본 추출 하였다 TE멀티 플렉스 실시간 RT-qPCR에 의한 노로 바이러스에 대한 중복 STED. 세븐틴 (18.5 %) 샘플은 노로 바이러스의 증상이있는 승객이 배에 공용 공간에서 체재하고 9했다 통나무 집의 표면에서 8 샘플을 포함 양성. 샘플 당 게놈 사본의 수는 노로 바이러스 GII.7 RNA 전 사체의 표준 곡선을 사용하여 (16 31였다) 중부 표준시 값으로부터 계산 하였다. 공통 영역 (범위 : 1.2-2.1 로그 10 게놈 사본)의 게놈 복사본보다 유의하게 높았다 - (4.5 로그 (10) RNA로 복사 2.4 범위), (통나무 집에서 면봉 샘플에서 게놈 사본의 평균 수는 3.6 로그 10 살 P <0.001). 17 긍정적 면봉 샘플 포 (23.5 %)의 유전자형을 할 수 있었고, 모든 샘플이 동일 GII.1 서열을 가졌다.

리도
위치 환경 스왑 모은 코네티컷 평균 값 (시험 샘플의 총 수의 양 #) 유전자형 노로 바이러스 RNA는 샘플 영역 C에 따라 번호를 복사
아트리움 손잡이 34.3 (1/2) GII (16)
캐빈 A를 변기 31.4 (2/2) GII. 31217
캐빈 A를 수도꼭지 37.5 (1/2) GII 491
캐빈 A를 문 손잡이 35.0 (2/2) GII 2,675
캐빈 A를 리모콘 38.6 (2/2) GII.1의 B (233)
캐빈 B 변기 33.5 (2/2) GII.1의 B 986
아이스크림 기계 34.2 (2/2) GII (16)
리도 표 양념 35.2 (1/2) GII (15)
리도 테이블 탑 35.3 (1/2) GII (14)
피자 집 카운터 표면 35.7 (1/2) GII (14)
메인 갤리 재미있는 시간 기계 37.1 (1/2) GII (64)
자판기 만질 표면 38.8 (1/2) GII (18)
승무원 라운지 키보드 표면 및 마우스 36.8 (1/2) GII (80)
캐빈 C 수도꼭지와 문 손잡이 31.6 (2/2) GII.1의 B 26458
캐빈 C 전화 36.4 (2/2) GII 1,035
캐빈 C 건반 33.0 (2/2) GII 1,317
의료 센터 클립 보드 36.0 (2/2) GII (113)
오두막 A는, B와 C는 바이러스 gastoenteristis 증상과 임상 적으로 병이 있었다 개인에 의해 점령되었다.
B 17 GII 양성 면봉 샘플 중 4 유전자형을 할 수있다.
C RNA 복사본은 노로 바이러스의 GII.7의 RNA 전 사체의 표준 곡선에 따라 caluated했다.
참고 : 날짜보다 약간 원래의 제 6 조에서 수정되었습니다.

표 1 : 항해 중 의심되는 노로 바이러스 위장염의 사례를보고했다 유람선에서 수집 된 34 면봉 샘플의 결과.

도 2는 RT-qPCR에 이들 샘플 시퀀스 능력에 의해 결정 코네티컷 값의 관계를 나타낸다. 총 127 (217) 중 면봉 샘플은 RT-qPCR에 의한 GII의 노로 바이러스 양성 반응. 샘플은 코네티컷 값의 넓은 범위 (12-40)을 디스플레이. 총, RT-qPCR에 긍정적 인 샘플의 29 (22.8 %)의 유전자형을 할 수있다. 코네티컷 값 27 이하 및 28 ~ 31 사이의 범위와 면봉 샘플은 각각 100 %와 72.2 %의 비율로 유전자형했다. 대조적으로, 단지 22.0 % 및 32-36 및 37-40의 코네티컷 값이 면봉 샘플의 1.6 %는, 각각 성공적으로 시퀀싱 될 수 헤미 중첩 증폭 물을 생산했다.


그림 2 : RT-qPCR에 검사 및 확인 노로 바이러스 발병 동안 수집했다 면봉 샘플 시퀀싱 결과. 흰색 막대는 RT-qPCR에 긍정적 면봉 샘플 바이러스의 개수를 나타낸다. 그 RT-qPCR에 긍정적 인 샘플에서 인간의 노로 바이러스 핵산 헤미 - 중첩 된 PCR 분석을 사용하여 증폭 한 다음 유전자형의 확인을 위해 서열했다. 블랙 바, 라인 수 및 유전자형의 비율이 각각 면봉 샘플을 확인 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

CT 값 범위 RT-qPCR에 긍정적 인 샘플의 수 순서 확인 샘플의 수 (%)을
20-23 4 3 (75)
24-27 3 (100)
28-31 (18) 13 (72.2)
32-36 (41) 9 (22.0)
37-40 (61) 1 (1.6)
A) 헤미는 PCR 중첩

표 2 : RT-qPCR에와 면봉 샘플의 유전자형 결과.

샘플 수 위치 표면의 설명 표면 면적 (cm 2) 시료 채취 날짜 / 시간 청소 (Y / N) 정리하면, 어떤 소독제를 사용 하였다 <?> / 강해 표면 재질과 위치의 자세한 설명
1 룸 # 7-1302 변기 700cm 2 2016년 6월 26일; 오전 9시 아니 해당 사항 없음 변기 [상면) 및 하드 plastoc
룸 # 7-1330 전화 핸들 500cm 2 2016년 6월 26일; 오전 9시 25분 1,000 ppm의 표백제 하드 플라스틱, 고무 버튼

보충 표 1 : 샘플 설명 양식의 예.

<TD> (17)
유전자형 / 바이러스 이름 올리고 뉴클레오티드 프라이머 / 프로브 순서 5 → 3 & #(900); 참고
미군 병사 Cog1F CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA (17)
Cog1R CTT AGA CGC 고양이 고양이 CAT TYA C (17)
G1SKF CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA (17)
G1SKR CCA ACC의 CAR CCA TTR TAC (17)
Ring1E 프로브 FAM - TGG ACA GGR 게이 CGC - MGBNFQ a를 이 연구
GII Cog2F CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG (17)
Cog2R TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA (17)
Ring2 프라이머 TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT (17)
G2SKR CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT
Ring2 프로브 CY5 또는 QUASAR 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - BHQ2의 B (17)
MS2 MS2F TGG CAC TAC CCC TCT CCG TAT TCA CG (18)
MS2R GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C (18)
MS2P 프로브 HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA CAAGC - BHQ1의 C (18)
GI의 TaqMan 프로브는 6 카르복시 (FAM)와 3'-표시 MGBNFQ (마이너 - 홈 결합 부위)와 함께-5' 표지
B GII의 TaqMan 프로브 Cy5에 또는 퀘이사 (670)과 함께 5 '가 표지되어 3'-라벨 블랙 홀 끄는와; 이용 가능 여부에 따라 사용되는 블랙 홀 소광 (BHQ)이 2, BHQ 3가 바람직하다.
C MS2의 TaqMan 프로브 5R입니다(17);로 표지 된 HEX 및 BHQ1와 5'-표시

보충 표 2 : 올리고 뉴클레오티드 프라이머 및 프로브 정보를 제공합니다.

코그 2 층 (10 μM)
구성 요소 반응에 따라 볼륨 (μL) 최종 농도
배 RT-PCR 버퍼 * 12.5 1 배
클레아없는 물 * 1.08 N / A
검출 증강 * 1.67 N / A
코그 층 (10 μM) 1 400 nm의
코그 1R (10 μM) 1 400 nm의
링 1E-프로브 (10 μM) 0.5 200 nm의
1 400 nm의
코그 2R (10 μM) 1 400 nm의
링 2 프로브 (10 μM) 0.5 200 nm의
MS2F (10 μM) 0.25 100 nm의
MS2R (10 μM) 0.25 100 nm의
MS2P 프로브 (10 μM) 0.25 100 nm의
배 RT-PCR 효소 * 1 1 배
마스터 믹스 볼륨 (22)
* 실시간 RT-PCR 키트에 포함

보충 표 3 : 다중 실시간 GI / GII / MS2 노로 바이러스 RT-PCR을위한 마스터 믹스

컨트롤의 종류 결과 해석
견본 음성 대조군 부정적인해야한다
양성 대조군 긍정적이어야한다
부정적인 샘플 각 코네티컷 값이 GI / GII에 대한 발견 할 수없는 경우 샘플 음
긍정적 인 샘플 모두 복제의 CT 값 (GI / GII)은 <38; 이것은 (임의로) 컷오프 각 실시간 PCR 플랫폼 및 키트 실험적으로 결정되어야
미정 양의 샘플 샘플은 하나의 복제의 코네티컷 값 (GI / GII) 인 경우 임시 긍정적이다 <38
내부 프로세스 제어 (MS2) ≥32 F의 임계 사이클 샘플 (CT) 값또는 MS2는 희석 재검사해야하며 1/10 희석.
매개 변수 허용되는 값
표준 곡선 노로 바이러스의 RNA 전 사체를 사용하여 R 2 > 0.97
능률 115 % 90 %

보충 표 4 : 환경 면봉 샘플에서 노로 바이러스의 검출을위한 각각의 RT-qPCR에 시험에 포함 제어합니다.

구성 요소 최종 농도 권 / RXN (μL)
배 RT-PCR 버퍼 1 배 5.00
dNTP 믹스 (10 mM)을 0.4 밀리미터 1.00
효소 믹스 (RT와의 Taq) 1.00
앞으로 프라이머 0.5 μM 0.50
역방향 프라이머 0.5 μM 0.50
의 RNase 억제제 (20 U / μL) 20 U 1.00
의 RNase없는 물 11.00
총 양 20.00
앞으로 및 GI과 GII 그룹에 대한 프라이머 세트를 역은 각각 Cog1F + G1SKR 및 Cog2F + G2SKR 있습니다.
두 번째 라운드 RT-PCR
구성 요소 최종 농도 권 / RXN (μL)
배 RT-PCR 버퍼 < / TD> 1 배 5.00
의 dNTP 믹스 (10 mM)을 0.4 밀리미터 1.00
효소 믹스 (RT와의 Taq) 1.00
앞으로 프라이머 0.5 μM 0.50
역방향 프라이머 0.5 μM 0.50
의 RNase 억제제 (20 U / μL) 20 U 1.00
의 RNase없는 물 14.00
총 양 23.0
B 앞으로 GI과 GII 그룹에 대한 프라이머 세트를 역은 각각 G1SKF + G1SKR 및 Ring2 프라이머 + G2SKR 있습니다.
참고 : 안내 전화보다 약간 원래의 제 19에서 수정
1 "> 보충 도표 5 : 헤미 - 중첩 된 RT-PCR 마스터 믹스 :"유지 - together.within 페이지를 = FO "_content.

위상 I 이 필드를 샘플링 1. macrofoam 면봉 키트 (예를 들어, 유효 기간, 튜브 누설 및 면봉 습기)
2. 면봉 표면 (제한 표면적 ≤100 인치 2 (645cm 2)에)
3.는 전송 튜브에 면봉 및 운송 중에 누출 방지 안전 캡을 조
애 가방에서 4. 면봉 키트
단계 II 샘플 운송 및 보관 1. 샘플링 면봉이 저장되는 -70 ° C ~ (또는 -20 ° C)
2. 운반 면봉수집 면봉의 48 시간 내에 절연 컨테이너 선박에 0-4 ° C (콜드 팩)에서 실험실에 샘플
단계 III RNA의 etraction 1. 용해 완충액 (예를 들면, 유효 데이터)
2. 100 % 에탄올을 추가하기 전에 용해 버퍼에 내부 통제로 MS2 추가
RNA 정제 및 농축 3. 면도 실험실 벤치 RNA의 RNase 제거 용액을 이용하여 소형 장치
RNA의 교차 오염을 방지하기 자주 단계 중 4. 변경 장갑
단계 IV RT-PCR 분석 (QA / QC) 1. 각 PCR 실행을위한 코네티컷 값의 변화를 제어하기 위해 각각의 RT-qPCR에 분석을위한 정량 노로 바이러스의 전사 RNA를 (GI과 GII)를 포함
2.PCR 억제제의 존재를 모니터링하는 MS2 신호의 부재를 사용하여

보충 도표 6 : CDC의 환경 샘플링 절차에 대한 점검.

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Discussion

Noroviruses 18 10 3 바이러스 입자 20 ~ 50 %의 인간 감염 복용량을 가지고있다. 따라서, 표면도 낮은 수준의 오염은 공중 보건 위험을 초래할 수 있습니다. 내부 대조군으로서 추출 운송 중 1) 면봉 다른 재료, 2) 저장 조건 면봉 3) 바이러스 성 RNA 농도, 4) coliphage MS2 : 면봉 샘플링 프로토콜의 여러 측면을 포함하여 평가 하였다.

최근까지,면, 폴리 에스테르, 나일론 등) 닦아 대전에서 만든 면봉의 성능을 평가했다 및 필드 사용 13, 14, 15, 21, 22에 대해 제안했다. 이들 중, 면봉은 노로 바이러스 간염 음식 준비 표면과 fomites (23)로부터의 바이러스의 검출을위한 ISO 15216 프로토콜에 의해 권장되고있다. 방법지금까지 자주 noroviruses (24), (25)의 전송에 연루되어 같은 문 손잡이, 컴퓨터, 변기 큰 하이 터치 표면 필드 조건에서 면봉의 테스트 성능에 제한적인 데이터가있다. 또한 이러한 환경면의 크기는 섬유로 만들어진 면봉의 용량을 초과한다. 우리의 연구에서, 우리는 700cm 2까지 지역과 환경 표면을 샘플링 할 때 섬유 팁 면봉보다 더 큰 면봉 머리를 macrofoam 면봉은, 인간의 노로 바이러스에 대한 높은 회수율을 가지고 있음을 보여 주었다.

솔루션 Noroviruses은 주위 온도에서 상대적으로 불안정하고 적어도 냉각에 필요합니다. 따라서, 실험실에 배송비는 면봉의 수집 후 48 시간 이내에 0-4 ° C에서 발생한다. 일반적으로 PCR 반응에서 테스트 될 수있는 샘플의 부피의 양보다 훨씬 작다샘플 농도 않고, 크게 양성 속도를 감소, 면봉 (5 ~ 10 mL의 대 3-5 μL)에서 용출 후. 환경 바이러스학에서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 환경 물 다량의 바이러스를 농축 성공적으로 사용되어왔다. 그러나, 최대 10 ㎖에 볼륨을 쉽게 추출하여 250 μL의 낮은 볼륨에 미디 스핀 열을 사용하여 농축하고, 더 높은 복구를 사용하여 스핀 열이 10 배 농축 될 수있다.

RT-qPCR에 민감한 탐지 및 노로 바이러스의 정량화를위한 ​​골드 표준이기는하지만,이 분석의 민감도는 쉽게 면봉 샘플로부터 공동 추출 PCR 억제제의 존재에 의해 영향을받을 수있다. 따라서 MS2뿐만 아니라 둘 노로 바이러스를 검출하는 멀티 플렉스 PCR 형식 이러한 coliphage MS2 바이러스 입자로서 추출 제어의 포함은 PCR 억제의 존재를 모니터링하고 다른 실험 간의 변동을 평가하는 것을 돕는다. </ P>

실험실 검증 방법의 시험 변수는 시험 방법의 차별적 전력을 결정하는 것이 중요하며, 상기 방법의 가능성 필드 샘플링 성능으로 변환된다. 실제 필드 상태를 가지고 (예를 들어, 최대 700cm (2)의 큰 표면적 지연 샘플링) 계정으로는, 노로 바이러스에 대한 검출 한계는 3.4 로그 (10) (스테인레스) 및 4- 로그 10 (변기) 면당 복사 노로 채취 6. 따라서, 부정적인 면봉 결과는 더 바이러스 오염이 발생하지 않습니다 것을 확정되지 않습니다. 노로 바이러스 질병의 임상 및 역학적 정보는 항상 6, 환경 조사 결과 2를 압도.

유람선에서 우리의 데이터는 전화기, 컴퓨터 키보드, 문 등의 하이 터치 표면이 통나무 집 어디 사람 노로 바이러스에 양성 반응을 처리하는 보여 주었다보고 된 바이러스 성 위장염이 머물렀다. 이들 표면은 화장실 수세 또는 구토 에피소드 6, 7, 8, 9, 10 중 제조 방울 통해 간접적으로 직접적인 접촉을 통하여 오염 된 또는 하나.

임상 샘플이 가능하고 세정 방법의 유효성을 모니터링하지 않을 때 결론적 발생시 환경 오염의 수준을 결정하는데 도움이 될 수 새롭게 개발 면봉 프로토콜을 사용하여 환경 표면 노로 바이러스의 검출은, 바이러스를 검출한다. 섬유 (예를 들면 로타 바이러스 및 아데노 바이러스) 27, 28, 29면 샘플링 방법이 널리 다른 장내 바이러스를 조사하기 위해 사용 된 기초 면봉 (면과 레이온)를 스쳐. 높은 고려그 섬유를 통해 macrofoam 면봉의 노로 바이러스에 대한 회수 효율은 우리가 macrofoam 면봉뿐만 아니라 다른 장내 바이러스를 감지 할 수있을 것으로 예상, 면봉 6을 냈습니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Generic name for kits
Macrofoam swab Premoistened EnviroMax Swab kit  Puritan 2588060PFUW
RNA Lysis buffer  CDC UNEX buffer Microbiologics Cat No MR0501
RNA extraction spin column Midi column Omega Biotek Cat No R6664-02
RNA purification spin column Zymol RNA Clean and Concentrator kit  Zymo Research Cat No R1016
Real time RT-PCR kit AgPath kit One-Step RT-PCR Kit Life Technologies Cat No 4387391
Conventional RT-PCR kit Qiagen one step RT-PCR kit Qiagen kit Cat No 210212
Gel extraction kit Qiagen QIAquick gel extraction kit Qiagen kit Cat No 28704 or 28706
Coliphage MS2 ATCC Cat No 15597-B1
RNA run-off transcripts
Realtime PCR platform Applied Biosystems Model ABI 7500
Optical 96-well reaction plate Thermo Scientific Cat No 4316813
MicroAmp Clear Adhesive Film  Thermo Scientific Cat No 4306311

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References

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