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 JoVE Immunology and Infection

Swab Méthode d'échantillonnage pour la détection des norovirus humains sur les surfaces

1, 1, 1

1Division of Viral Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

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    Summary

    Cite this Article

    Park, G. W., Chhabra, P., Vinjé, J. Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces. J. Vis. Exp. (120), e55205, doi:10.3791/55205 (2017).

    Abstract

    Les norovirus humains sont une cause majeure de l'épidémie et la gastro-entérite sporadique dans le monde entier. Parce que la plupart des infections sont soit répartis directement par la voie de personne à personne ou indirectement par l'intermédiaire de surfaces ou de la nourriture de l'environnement, matières contaminées et les surfaces inanimées sont des véhicules importants pour la propagation du virus au cours des flambées de norovirus.

    Nous avons développé et évalué un protocole utilisant des tampons de macromousse pour la détection et le typage des norovirus humains des surfaces dures. Comparé avec des tampons de fibres à pointe ou des lingettes antistatiques, des tampons de macromousse permettent la récupération du virus (plage de 1,2 à 33,6%) des surfaces de siège de toilette jusqu'à 700 cm 2. Le protocole comporte les étapes d'extraction du virus à partir des tampons et une plus grande concentration de l'ARN viral en utilisant des colonnes de centrifugation Au total, 127 (58,5%) des 217 échantillons de frottis qui avaient été recueillies à partir de surfaces à bord des navires de croisière et les établissements de soins de longue durée où norovirus gastro-entérite avait étérapporté testé positif pour GII norovirus par RT-qPCR. 29 d'entre eux (22,8%) pourrait être génotypés avec succès. En conclusion, la détection des norovirus sur des surfaces environnementales en utilisant le protocole que nous avons développé peut aider à déterminer le niveau de contamination de l'environnement pendant les épidémies, ainsi que la détection du virus lorsque les échantillons cliniques ne sont pas disponibles; il peut également faciliter le suivi de l'efficacité des stratégies d'assainissement.

    Introduction

    Les norovirus humains sont une cause majeure de l' épidémie et de gastro - entérite aiguë sporadique dans le monde entier 1, 2, 3. Le virus est extrêmement contagieux et la transmission se fait par personne directement à l'interaction personne ou indirectement par le contact avec des aliments contaminés, l'eau ou des surfaces environnementales. Les norovirus peuvent être versées pour des périodes prolongées et prolongé la survie du virus sur des surfaces environnementales a été documentée 1, 2, 3. Au cours de l' excrétion de pointe, des milliards de particules virales sont libérées par gramme de fèces, vomi et contient également un nombre suffisant de particules virales pour causer une infection 4, 5, 6, 7, 8,ef "> 9, 10. En outre, le transfert du virus entre les surfaces inanimées et la peau humaine peut se produire facilement 2, 11, 12. Par conséquent, la surveillance de la contamination de l' environnement peut aider dans les enquêtes sur les éclosions et à évaluer l'efficacité du nettoyage et procédures de désinfection.

    Plusieurs protocoles d'échantillonnage ont été décrits pour la détection du rotavirus, le coliphage MS2, calicivirus félin (FCV) et P22 du bactériophage 13, 14, 15, 16. Cependant, les conditions de validation décrites dans ces études, y compris la dessiccation rapide (<1 h) et de petites surfaces (25 x 100 cm 2), peuvent ne pas représenter adéquatement les paramètres sur le terrain. En outre, le faible taux de contamination de enviro attendueles surfaces nnement exigent des protocoles qui sont capables de détecter de très peu de particules virales.

    Nous avons développé une méthode d'échantillonnage de surface à base macromousse pour la détection et le typage des norovirus. Cette méthode a été validée lors de plusieurs éclosions de norovirus. Le protocole comprend 1) la manière de recueillir des échantillons d'écouvillons des surfaces environnementales (2) la façon de maintenir la meilleure intégrité des échantillons lors de la collecte et l'expédition au laboratoire, et 3) les tests de laboratoire et le typage des norovirus.

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    Protocol

    1. Swab échantillonnage dans le domaine

    1. Porter une paire de gants propres.
    2. Mesurer la taille de la zone d'échantillonnage sans toucher la surface en utilisant un ruban à mesurer ou d'une règle. Essayez d'estimer la superficie aussi précisément que possible et de remplir un formulaire de rapport (tableau supplémentaire 1).
    3. Vérifiez le kit de prélèvement pour les fuites éventuelles et le transport des sacs de prélèvement de l'étiquette et des kits d'écouvillon.
    4. Déplacer l'écouvillon dans la zone d'échantillonnage comme suit: un coup dans le sens horizontal, d'un seul coup dans le sens vertical, et d'un seul coup dans une direction diagonale. Ne pas tamponner une aire de surface supérieure à 700 cm2.
    5. Placez chaque écouvillon dans un tube et serrer le bouchon.

    2. Stockage et transport des écouvillons au laboratoire

    1. Maintenir des tampons à 4 ° C pendant jusqu'à 48 heures. Si le stockage pendant de longues périodes est nécessaire, stocker les tampons à -20 ° C (ou -70 ° C).
    2. Gardez les tubes à 0-4 ° C (c.. , Utiliser des compresses froides) dans un contenant isolé pendant le transport vers le laboratoire et le navire en 24-48 h de collection.

    3. Virus Concentration, Viral RNA Extraction et purification

    NOTE: Toutes les étapes de centrifugation utiliser une centrifugeuse de dessus de table à 5000 xg pendant 5 min à température ambiante, sauf indication contraire. Soyez très prudent lorsque vous travaillez avec le tampon universel extraction d'acide nucléique (UNEX). Porter des lunettes ou un écran facial.

    1. Repérer un 15 tube de ml et une colonne ARN Midi pour chaque échantillon. Inclure un contrôle négatif d'extraction dans chaque expérience.
    2. Pour préparer la solution Lysis pour 10 écouvillons, mélanger 25 ml de tampon UNEX avec 25 ml de PBST (PBS pH 7,2 contenant 0,02% de Tween-80).
    3. Ajouter 50 pi de coliphage MS2 suspension (10 6 UFP / ul) à 50 ml d' une solution de lyse.
    4. Placer un écouvillon dans un tube de 15 ml et ajouter 5 ml de solution Lysis. Mélanger et incuber pendant 10 min à température ambiante.
    5. Ajouter 5 ml d'éthanol à 100% à chaque tube et vortexer pendant 10 secondes.
    6. Retirez délicatement l'écouvillon du tube de 15 ml (il contient du tampon UNEX) pressant doucement contre le côté du tube pour éliminer l'excès de liquide, puis jeter l'écouvillon. Les volumes restants doivent être compris entre 9-10 mL.

    4. La colonne Midi Nucleic Acid Extraction virale

    1. Transférez soigneusement 4,5 mélange / éthanol UNEX mL de l'étape 3.6 sur une colonne midi, centrifugeuse et jeter le filtrat.
    2. Chargez encore 4,5 ml du même mélange sur la même colonne, centrifugeuse, et jeter le filtrat.
    3. Pour le premier lavage, ajouter 3,5 ml de 70% d'éthanol sur le Midi colonne, centrifugeuse et jeter le filtrat.
    4. Pour le second lavage, ajouter un autre 3,5 ml d'éthanol à 70% sur la colonne Midi. Centrifugeuse et jeter le filtrat.
    5. Pour le sèche-spin, centrifuger les colonnes Midi pour éliminer toute trace d'éthanol (ce qui peut affecter négativement votre récupération de l'ARN viral).
    6. Placer la colonne Midi dans un nouveau tube de 15 ml de la centrifugeuse. Ajouter 250 pi de tampon d'élution sur la colonne Midi; attendre 1 min avant centrifugation pour obtenir la meilleure récupération de l'ARN viral.
    7. Stocker l'acide nucléique extrait à -70 ° C ou procéder immédiatement à l'étape 5.

    5. Concentration virale acide nucléique en utilisant l'ARN propre et Concentrateur Kits

    1. Ajouter 500 pi de RNA Binding Buffer à 250 pi d'ARN élué à l'étape 4.7 ci-dessus et vortex pendant 10 s.
    2. Ajouter 750 pi 100% d'éthanol et vortex pendant 10 s.
    3. Etiqueter une colonne spin pour chaque échantillon. Chargez l'échantillon de 750 pi sur une colonne de spin.
    4. Centrifuger les colonnes de centrifugation à 12 000 x g pendant 1 min. Jeter l'écoulement.
    5. Chargez les 750 pi restants sur une colonne et centrifuger à 12000 xg pendant 1 min.
    6. Pour le pré-lavage, ajouter 400 pi de tampon ARN Prep à chaque colonne et centrifuger à 12000 xg pendant 1 min. Jeter l'écoulement.
    7. Pour le premier lavage, ajouter 800 ul d'ARN tampon de lavage à chaque colonne et centrifuger à 12000 xg pendant 1 min. Jeter l'écoulement.
    8. Pour le second lavage, ajouter 400 ul d'ARN tampon de lavage pour faire tourner la colonne et centrifuger à 12 000 xg pendant 1 min. Jeter l'écoulement.
    9. Pour le sèche-spin, centrifuger la colonne de centrifugation pour éliminer toute trace de tampon de lavage à 12.000 xg pendant 2 min.
    10. transférer soigneusement la colonne de spin à un tube propre de 1,5 ml.
    11. Ajouter un tampon d'élution de 25 ul sur la colonne de centrifugation et laisser incuber pendant 1 minute à température ambiante. Cela permettra d'accroître la récupération de l'ARN viral à partir de la colonne.
    12. Recueillir l'ARN par centrifugation de la colonne de centrifugation à 10.000 g pendant 1 min.
    13. Soit passer directement à RT-qPCR (étape 6) ou de l'ARN du magasin à -70 ° C.

    6. Mutiplex RT-qPCR Détection de génogroupe I et II norovirus, et Coliphage MS 2 (tableau complémentaire 2)

    1. surfaces de travail propres, pipettes, et les centrifugeuses avec une solution de décontamination RNase pour réduire la contamination possible.
    2. Décongeler réactifs RT-qPCR sur la glace. ARN Thaw sur la glace (dans une zone / pièce séparée).
    3. Déterminer le nombre de réactions et d' ajouter au moins 10% de plus d'entre eux (par exemple , si 10 réactions sont nécessaires, faire master mix pour 11).
    4. Vortex composants individuels maître de mixage, à l'exception de 25x RT-qPCR enzyme, pendant 5 s. Mélanger soigneusement l'enzyme en tapotant le tube avec un doigt.
    5. En bref maître centrifugeuse composants de mélange pour 5 s.
    6. Préparer le mélange maître pour la détection par RT-PCR en temps réel des GI norovirus et GII selon les instructions du kit et ajouter des amorces et des sondes oligonucléotidiques spécifiques à norovirus dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse (tableau complémentaire 3).
    7. Mélanger le mélange maître par pipetage 5-10 fois haut et en bas (tourbillonnement est pas recommandé). Aliquoter 22 pi du mélange maître dans chaque puits de PCR en temps réel plaque de 96 puits.
    8. ARN de l'échantillon de Vortexpendant 5 secondes, et de recueillir par une brève (5 s) centrifugation.
    9. Ajouter 3 ul d'échantillon d' ARN et GI et des contrôles positifs GII à la plaque de RT-PCR quantitative (suivi du modèle tableau 2). Ajouter 3 pi de nucléase-freewater dans les puits sans matrice de contrôle (CNT).
    10. Sceller la plaque en temps réel avec un film adhésif optique.
    11. centrifuger soigneusement la plaque en temps réel à 1300 xg pendant 1 min pour éliminer les bulles d'air ou de gouttes liquides qui peuvent être présents dans les puits.
    12. Mettre en place un temps réel de l'instrument PCR et de mise en place des conditions thermocyclage suivantes: 1) étape de RT pendant 10 min. à 45 ° C (2) l'activation de la polymérase Taq, 10 min. à 95 ° C et (3) 45 cycles de 15 s à 95 ° C et 60 s à 60 ° C.

    7. Quantification des norovirus dans des échantillons écouvillon

    1. Vérifiez les résultats des contrôles positifs et négatifs pour valider les résultats de RT-qPCR (tableau complémentaire 3).
    2. Déterminer si chaque courbe standard répond à lades valeurs acceptables indiquées dans le tableau complémentaire 2 et calculer l'écart - type global de la courbe standard en utilisant l' équation 1.
      (Équation 1)% d' efficacité = 100 x 10 (moyenne Ct Valeurs-Intercept) / Slope.
    3. Si le logiciel de cycleur thermique PCR ne calcule pas la pente pour chaque courbe standard, déterminer la pente et R 2 valeurs par régression en utilisant un logiciel statistique (par exemple Excel, SPSS ou SAS). En outre, le calcul du rendement de% pour les courbes standard suivantes équation I
    4. Notez le nombre de copies d'ARN calculées par le logiciel thermique du cycleur pour tous les échantillons à tester en fonction des courbes standard qui répondent aux critères spécifiés dans le tableau complémentaire 4. Relancez tous les échantillons avec des courbes standard t chapeau ne répondent pas aux critères ou des contrôles faux positifs. Vérifier les valeurs Ct de coliphage MS2, qui a été ajouté en tant que contrôle interne pour contrôler l'inhibition PCR.
    5. Déterminer le nombre total de copies d'ARN per échantillon par la multiplication du nombre de copies d'ARN calculé lors de l'étape 7.2 par le rapport entre le volume (25 à 50 pi) de l'éluant de l'ARN total à celle de l'ARN (3 à 5 ul) utilisé pour la réaction RT-PCR quantitative. En variante, le calcul de la densité de l' ARN en divisant le nombre total de copies d'ARN par la surface d'objet (cm2) analysée.

    8. génotypage des échantillons en temps réel RT-PCR positifs par imbriquée Amplification PCR conventionnelle Hemi

    1. Préparer le premier tour de mélange maître pour chaque ensemble amorce de l'essai de RT-PCR (Tableaux supplémentaires 2 et 5).
    2. Ajouter 5 pi de norovirus ARN positif à 20 pi de mélange maître.
    3. Exécuter la RT-PCR dans les conditions suivantes: (1) étape de RT pendant 30 min à 42 ° C (2) l'activation de la Taq polymérase, 15 min à 95 ° C, et (3) 40 cycles de 30 s à 95 ° C, , 30 s à 50 ° C et 60 secondes à 72 ° C. Après 40 cycles, incuber pendant 10 min supplémentaires à 72 ° C.
    4. Préparer le second tour de mater mélange pour chaque ensemble amorce de l'essai de RT-PCR (Tableaux supplémentaires 2 et 5).
    5. Ajouter 23 ul mélange maître et ajouter 2 pi de produits de RT-PCR du premier tour (de premier tour) à chaque tube (idéalement le produit du premier tour doit être dilué au 1/10 dans de l'eau sans RNase).
    6. Répétez l'étape 8.3.
    7. Préparer un gel d'agarose à 2% dans de l'EDTA 100 ml 1x Tris-acétate (Tris 40 mM, acide acétique 20 mM et EDTA 1 mM, à pH 8,3). Après dissolution de l'agarose par chauffage du mélange dans un four à micro-ondes, ajouter 10 pi de colorant d'acide nucléique pour 100 ml de gel préparé après refroidissement du mélange à 60-70 ° C, verser le gel et insérer les peignes. Laissez le gel reposer pendant au moins 30 min.
    8. Mélanger 15 pi de chaque produit de RT-PCR avec 3 pi de 6x colorant de chargement. Charge 15 pi de chaque échantillon et l'électrophorèse du gel d'agarose à 100 V pendant 1 h.
    9. fragments cible d'accise RT-PCR de taille appropriée (330 pb pour GI et 341 pb pour GII) de l'un de gelD purifier l'ARN en utilisant un kit d'extraction de gel commercial. Le produit de PCR purifié peut maintenant être utilisé pour le séquençage de Sanger.

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    Representative Results

    La figure 1 présente un organigramme du protocole tampon d'échantillonnage. Ce protocole se compose de quatre étapes principales; 1) la collecte d'échantillon, 2) le stockage et le transport d'échantillons, 3) la purification de l'ARN viral et de la concentration, et 4) l'essai de RT-PCR quantitative et génotypage.

    Figure 1
    Figure 1: Organigramme du protocole final pour l' échantillonnage de surface environnementale des norovirus S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Le tableau 1 résume les résultats de 34 échantillons de frottis qui ont été recueillies à partir d' un navire de croisière qui avait signalé des cas présumés de gastro - entérite à norovirus pendant un voyage. Les écouvillons ont été extraits et tested en double pour norovirus par multiplex en temps réel RT-qPCR. Dix-sept (18,5%) des échantillons testés positifs dont 8 échantillons de surfaces dans les cabines où les passagers présentant des symptômes de norovirus ont séjourné et 9 des zones communes sur le navire. Le nombre de copies génomiques par échantillon ont été calculés à partir des valeurs Ct (qui variaient de 16 à 31) en utilisant une courbe standard d'une transcription ARN GII.7 norovirus. Le nombre médian de copies du génome à partir d' échantillons de frottis dans les cabines était de 3,6 log 10 (intervalle: 2,4 - 4,5 log 10 copies d' ARN), qui était significativement plus élevé que les copies du génome des zones communes (gamme: 1.2 à 2.1 log 10 copies du génome) ( P <0,001). Quatre (23,5%) des 17 échantillons de frottis positifs ont pu être génotypés, et tous les échantillons avaient des séquences GII.1 identiques.

    Piscine
    Lieu d' échange environnemental recueilli un Valeur Ct moyenne (# positif du nombre total d'échantillons testés) Génotype Norovirus ARN nombre de copies par zone échantillonnée c
    Atrium Rampes 34,3 (1/2) GII 16
    cabine A Siège de toilette 31,4 (2/2) GII. b 31217
    cabine A Robinet 37,5 (1/2) GII 491
    cabine A Poignée de porte 35,0 (2/2) GII 2675
    cabine A Télécommande 38,6 (2/2) GII.1 b 233
    Cabin B Siège de toilette 33,5 (2/2) GII.1 b 986
    Machine à glace 34.2 (2/2) GII 16
    Piscine Tableau Condiments 35,2 (1/2) GII 15
    Piscine Dessus de la table 35,3 (1/2) GII 14
    Pizzeria surface de comptoir 35,7 (1/2) GII 14
    principal Galley Fun Machine-temps 37.1 (1/2) GII 64
    Distributeur automatique Surfaces touchables 38,8 (1/2) GII 18
    salon de l'équipage Clavier et souris Surface 36,8 (1/2) GII 80
    cabine C Robinet et poignée de porte 31,6 (2/2) GII.1 b 26458
    cabine C Téléphone 36,4 (2/2) GII 1035
    cabine C Clavier 33,0 (2/2) GII 1317
    Centre médical Presse-papiers 36,0 (2/2) GII 113
    une cabine A, B et C a été occupé par des personnes qui avaient été cliniquement malades avec des symptômes de gastoenteristis virales.
    b Quatre des échantillons de frottis 17 GII-positifs pourraient être génotypés.
    copies c ARN ont été caluated basée sur une courbe standard de norovirus GII.7 transcrits d'ARN.
    Note: ci - dessus ce jour ont été légèrement modifiée de l'article original 6.

    Tableau 1: Résultats de 34 échantillons de frottis qui ont été recueillies à partir d' un navire de croisière qui avait signalé des cas de suspicion de gastro - entérite à norovirus au cours d' un voyage.

    La figure 2 montre la relation entre les valeurs de Ct déterminées par RT-PCR quantitative et la capacité de sequencer ces échantillons. Au total, 127 sur 217 échantillons de frottis testés positifs pour le norovirus GII par RT-qPCR. Les échantillons affichent une large gamme (12-40) des valeurs Ct. Au total, 29 (22,8%) des échantillons positifs RT-qPCR pourraient être génotypés. Les écouvillons avec les valeurs Ct inférieures à 27 et compris entre 28-31 ont été génotypés à des taux de 100% et 72,2%, respectivement. En revanche, seulement 22,0% et 1,6% des échantillons d'écouvillon avec des valeurs Ct de 32-36 et 37-40, respectivement, produits amplicons hémi-imbriquée qui pourraient être séquencées avec succès.


    Figure 2: Résultats du dépistage RT-qPCR et le séquençage d'échantillons d'écouvillon qui avaient été recueillies lors des épidémies de norovirus confirmées. Les barres blanches représentent le nombre de RT-qPCR virus échantillons de frottis positif. acides nucléiques norovirus humains dans ces échantillons positifs RT-qPCR ont été amplifiés en utilisant un dosage PCR semi-nichée, puis séquencés pour la confirmation de génotypage. Des barres noires et ligne représentent le nombre et le pourcentage de génotype confirmé écouvillons, respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    plage de valeurs Ct Nombre d'échantillons positifs RT-qPCR Nombre (%) d'échantillons de séquence a confirmé une
    20-23 4 3 (75)
    24-27 3 3 (100)
    28-31 18 13 (72,2)
    32-36 41 9 (22,0)
    37-40 61 1 (1,6)
    a) hémi PCR nichée

    Tableau 2: RT-qPCR et les résultats de génotypage des échantillons de frottis.

    Numéro d'échantillon EMPLACEMENT Description de la surface Surface (cm 2) Date / heure de la collecte d'échantillons Clean (Y / N) Si nettoyé, ce désinfectant a été utilisé? </ Strong> Description détaillée du matériau de surface et de l' emplacement
    1 Chambre # 7-1302 Siège de toilette 700 cm 2 26/06/2016; 09h00 Non n'est pas applicable Toilettes siège [surfaces supérieures), et plastoc dur
    2 Chambre # 7-1330 Poignée de téléphone 500 cm 2 26/06/2016; 09h25 Oui 1000 ppm eau de Javel Plastique dur, bouton en caoutchouc

    Tableau complémentaire 1: Exemple de formulaire de description de l' échantillon.

    <td> 17
    génogroupe / virus Nom oligonucléotide amorce / sonde Séquence 5 → 3 & #900; Référence
    GI COG1F CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA 17
    Cog1R CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C 17
    G1SKF CTG CCC GAA ATS GTA AAT GA 17
    G1SKR CCA ACC CAR CCA TTR TAC A 17
    Ring1E-sonde FAM - TGG ACA GGR GAY CGC - MGBNFQ un Cette étude
    GII Cog2F CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG 17
    Cog2R TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA 17
    Ring2 amorce TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT 17
    G2SKR CCR NCF GCA TRH CCR TTR TAC AT
    Ring2-sonde Cy5 ou QUASAR 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - BHQ2 b 17
    MS2 MS2F TGG CAC TAC CCC TCT GCC TAT TCA CG 18
    MS2R GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C 18
    MS2P-sonde HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA CAAGC - BHQ1 c 18
    une sonde GI TaqMan est 5'-marquée avec 6-carboxyfluorescéine (FAM) et 3 'marqué avec MGBNFQ (Minor-groove site de liaison)
    b sonde GII TaqMan est 5'-marqué avec Cy5 ou Quasar 670 et 3 'marqué avec Black Hole quencher; Black Hole Quencher (BHQ) 2 utilisé en raison de la disponibilité, BHQ 3 est préférable.
    sonde c MS2 TaqMan est 5R17; marqué au HEX et 5'-marqué avec BHQ1

    Tableau complémentaire 2: amorces et sondes oligonucléotidiques information.

    Cog 2F (10 uM)
    Composant Volume par réaction (ul) La concentration finale
    2x RT-PCR Buffer * 12.5 1 fois
    exempte de nucléase de l'eau * 1.08 n / a
    Détection Enhancer * 1,67 n / a
    Cog 1F (10 uM) 1 400 nm
    Cog 1R (10 uM) 1 400 nm
    Anneau 1E-sonde (10 uM) 0,5 200 nm
    1 400 nm
    Cog 2R (10 uM) 1 400 nm
    Ring 2-sonde (10 uM) 0,5 200 nm
    MS2F (10 pM) 0,25 100 nm
    MS2R (10 uM) 0,25 100 nm
    MS2P-sonde (10 uM) 0,25 100 nm
    2x enzyme RT-PCR * 1 1 fois
    volume de Master Mix 22
    * Inclus dans le temps réel kit RT-PCR

    Tableau complémentaire 3: Master mix pour multiplex GI en temps réel / GII / MS2 norovirus RT-PCR

    Type de contrôle interprétation des résultats
    Échantillon contrôle négatif Devrait être négative
    Contrôle positif Devrait être positif
    échantillon négatif L'échantillon est négatif si chaque valeur Ct est indétectable pour GI / GII
    échantillon positif valeurs Ct (GI / GII) des deux répétitions est <38; ce (arbitrairement) de coupure doit être déterminée expérimentalement pour chaque temps réel de la plate-forme PCR et kit
    échantillon positif provisoire L'échantillon est provisoirement positif si la valeur Ct (GI / GII) d'une répétition est <38
    contrôle de processus interne (MS2) Les échantillons ayant un cycle de seuil (Ct) valeur de ≥32 fou MS2 devrait être retesté non dilué et dilué 1/10.
    Paramètre valeur acceptable
    Courbe standard en utilisant des transcrits d'ARN de norovirus R 2 > 0,97
    Efficacité 90% à 115%

    Tableau complémentaire 4: Commandes à inclure dans chaque test de RT-qPCR pour la détection des norovirus dans les échantillons d'écouvillons environnementaux.

    Composant La concentration finale vol / rxn (ul)
    5x tampon de RT-PCR 1 fois 5,00
    mélange de dNTP (10 mM) 0,4 mM 1.00
    mélange de l'enzyme (RT et la Taq) 1.00
    Amorce d' un 0,5 pm 0.50
    Amorce d' un 0,5 pm 0.50
    inhibiteur de RNase (20 U / ul) 20 U 1.00
    eau libre Rnase- 11.00
    Volume total 20.00
    un avant et arrière ensembles d' amorces pour GI et le groupe GII sont COG1F + G1SKR et Cog2F + G2SKR, respectivement.
    Deuxième tour RT-PCR
    Composant La concentration finale vol / rxn (ul)
    5x tampon de RT-PCR < / Td> 1 fois 5,00
    mélange de dNTP (10 mM) 0,4 mM 1.00
    mélange de l'enzyme (RT et la Taq) 1.00
    Amorce b 0,5 pm 0.50
    Amorce b 0,5 pm 0.50
    inhibiteur de RNase (20 U / ul) 20 U 1.00
    eau libre Rnase- 14.00
    Volume total 23,0
    b avant et arrière ensembles d' amorces pour GI et le groupe GII sont G1SKF + G1SKR et Ring2 amorce + G2SKR, respectivement.
    Note: ci - dessus informaion a été légèrement modifiée de l'article original 19
    _content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Tableau complémentaire 5: Hemi-RT-PCR nichée Master mix.

    La phase I Échantillonnage sur le terrain 1. Vérifiez kits macromousse écouvillon (par exemple, la date d'expiration, les fuites de tube et tige moiteur)
    2. Swab surface (surface limite à ≤100 pouce 2 (645 cm 2))
    3. Placer écouvillons dans les tubes de transport, et serrer les bouchons en toute sécurité pour éviter les fuites lors de l'expédition
    4. Placez le kit de l'écouvillon dans un sac ziploc
    La phase II Le transport et le stockage des échantillons 1. Les tampons testés doivent être stockés à -70 ° C (ou à -20 ° C)
    2. Transport écouvillonéchantillons au laboratoire à 0-4 ° C (froid-packs) dans un récipient isolé et expédiées sous 48 heures de tampons de collecte
    Phase III ARN etraction 1. Vérifier tampon de lyse (par exemple, les données d'expiration)
    2. Ajouter MS2 comme un contrôle interne dans le tampon de lyse avant d'ajouter 100% d'éthanol
    Purification de l' ARN et de la concentration 3. Nettoyer banc de laboratoire et du petit matériel en utilisant une solution d'élimination d'ARN RNase
    4. Changer de gants fréquemment lors des mesures pour éviter un ARN contamination croisée
    Phase IV RT-PCR Assay (QA / QC) 1. Inclure ARNs quantifiés de norovirus de transcription (GI et GII) pour chaque essai de RT-qPCR pour contrôler les variations de valeurs Ct pour chaque essai PCR
    2.Utilisez absence de signaux MS2 pour surveiller la présence d'inhibiteurs de PCR

    Tableau complémentaire 6: Liste de contrôle pour la procédure d'échantillonnage de l' environnement de CDC.

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    Discussion

    Les norovirus ont une dose infectieuse humaine de 50% entre 18 et 10 3 particules virales 20. Par conséquent, la contamination même de bas niveau des surfaces peut poser un risque pour la santé publique. Plusieurs aspects du protocole écouvillon d'échantillonnage ont été évalués, y compris: 1) différents matériaux écouvillon, 2) écouvillons de condition de stockage pendant le transport, 3) la concentration de l'ARN viral, et 4) coliphage MS2 que le contrôle de l'extraction interne.

    Jusqu'à récemment, seuls les performances des tampons en coton, le polyester, le nylon et lingette antistatique) a été évaluée et proposés pour une utilisation sur le terrain 13, 14, 15, 21, 22. Parmi ceux - ci, des cotons - tiges ont été recommandées par le protocole ISO 15216 pour la détection des norovirus et l' hépatite A partir de surfaces et fomites 23 préparation des aliments. Commentjamais, il existe peu de données sur la performance de l' essai des tampons de coton dans des conditions de terrain avec de grandes surfaces touchées telles que les poignées de porte, les ordinateurs et les sièges de toilette qui ont été fréquemment impliqués dans la transmission des norovirus 24, 25. En outre, la taille de ces surfaces de l'environnement est supérieure à la capacité des tampons de fibres à bout. Dans notre étude, nous avons démontré que des tampons de macromousse, qui ont une tête de tige plus grand que les tampons de fibre-tip, ont des taux plus élevés de récupération pour les norovirus humains lors de l' échantillonnage des surfaces environnementales avec une superficie de 700 cm 2.

    Norovirus en solution sont relativement instables à température ambiante et nécessitent au moins réfrigération. Par conséquent, l'expédition vers le laboratoire devrait se produire à 0-4 ° C dans les 48 h après le prélèvement des écouvillons. Le volume d'échantillon qui peut typiquement être testé dans une réaction de PCR est bien inférieure à celle de la quantité deéchantillon après élution de l'écouvillon (3-5 pi vs 5-10 mL) qui, sans concentration, réduit de manière significative le taux de positivité. En virologie de l'environnement, le polyéthylène glycol (PEG) a été utilisé avec succès pour concentrer les virus de grands volumes d'eaux d'environnement. Cependant, les volumes jusqu'à 10 ml peuvent être facilement extraites et concentrées en utilisant des colonnes de centrifugation Midi à des volumes aussi faibles que 250 pi, et plus concentrés 10 fois avec un taux de récupération en utilisant des colonnes de spin.

    Bien que RT-qPCR est l'étalon-or pour la détection sensible et la quantification des norovirus, la sensibilité de ces essais peut être facilement affectée par la présence d'inhibiteurs de PCR qui sont co-extrait à partir des échantillons de frottis. Par conséquent, l'inclusion d'un contrôle d'extraction tel que des particules virales coliphage MS2, dans un format de PCR multiplex qui détecte les norovirus ainsi que MS2, aide à contrôler la présence d'inhibition de la PCR et à évaluer la variation entre les différentes expériences. </ P>

    Les variables de test d'une méthode de validation en laboratoire sont essentielles pour déterminer la puissance discriminatoire d'une méthode d'essai et sont en outre traduits dans la performance probable d'échantillonnage sur le terrain de la méthode. Prenant condition de champ du monde réel (par exemple, l' échantillonnage retardé, de plus grandes surfaces allant jusqu'à 700 cm 2) en compte, la limite de détection pour les norovirus était de 3,4 log 10 (en acier inoxydable) et 4 log 10 (siège de toilette) copies norovirus par surface échantillonnés 6. Par conséquent, les résultats négatifs des écouvillons ne sont pas définitives qu'aucune contamination virale est survenue. Les informations cliniques et épidémiologiques de la maladie norovirus l' emporte toujours sur les résultats environnementaux 2, 6.

    Nos données à partir d'un navire de croisière ont montré que les surfaces touchées tels que les téléphones, les claviers d'ordinateur, et poignées de porte ont été testés positifs pour le norovirus dans les cabines où les gensavec la gastro-entérite virale signalée était resté. Ces surfaces ont été contaminés soit par contact direct ou indirectement par l' intermédiaire des gouttelettes produites lors de chasse d'eau ou les épisodes 6, 7, 8, 9, 10 vomissements.

    En conclusion, la détection des norovirus sur des surfaces environnementales en utilisant ce protocole de tige nouvellement développé peut aider à déterminer le niveau de contamination de l'environnement pendant les épidémies, détecter le virus lorsque les échantillons cliniques ne sont pas disponibles et dans le suivi de l'efficacité des pratiques de nettoyage. Fiber basculé écouvillon (coton et rayonne) sur la base des méthodes d'échantillonnage de surface ont été largement utilisés pour étudier d' autres virus entériques (par exemple , le rotavirus et adénovirus) 27, 28, 29. Compte tenu de la plus élevéeefficacité de récupération pour les norovirus des écouvillons macromousse sur ces fibres à bout tampons 6, nous nous attendions à ce que les tampons de macromousse seront en mesure de détecter d' autres virus entériques ainsi.

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    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Generic name for kits
    Macrofoam swab Premoistened EnviroMax Swab kit  Puritan 2588060PFUW
    RNA Lysis buffer  CDC UNEX buffer Microbiologics Cat No MR0501
    RNA extraction spin column Midi column Omega Biotek Cat No R6664-02
    RNA purification spin column Zymol RNA Clean and Concentrator kit  Zymo Research Cat No R1016
    Real time RT-PCR kit AgPath kit One-Step RT-PCR Kit Life Technologies Cat No 4387391
    Conventional RT-PCR kit Qiagen one step RT-PCR kit Qiagen kit Cat No 210212
    Gel extraction kit Qiagen QIAquick gel extraction kit Qiagen kit Cat No 28704 or 28706
    Coliphage MS2 ATCC Cat No 15597-B1
    RNA run-off transcripts
    Realtime PCR platform Applied Biosystems Model ABI 7500
    Optical 96-well reaction plate Thermo Scientific Cat No 4316813
    MicroAmp Clear Adhesive Film  Thermo Scientific Cat No 4306311

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