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 JoVE Immunology and Infection

Tampone Metodo di campionamento per la rilevazione di Norovirus umana sulle superfici

1, 1, 1

1Division of Viral Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

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    Summary

    Cite this Article

    Park, G. W., Chhabra, P., Vinjé, J. Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces. J. Vis. Exp. (120), e55205, doi:10.3791/55205 (2017).

    Abstract

    norovirus umani sono una delle principali cause di un'epidemia di gastroenterite e sporadici in tutto il mondo. Poiché la maggior parte delle infezioni sono o diffondono direttamente per via da persona a persona o indirettamente tramite superfici ambientali o cibo, fomiti contaminati e superfici inanimate sono veicoli importanti per la diffusione del virus durante focolai di norovirus.

    Abbiamo sviluppato e valutato un protocollo utilizzando tamponi macrofoam per il rilevamento e la tipizzazione dei norovirus umani provenienti da superfici dure. Rispetto ai tamponi in fibra con punta o salviette antistatiche, tamponi macrofoam consentire il recupero virus (range 1,2-33,6%) dalle superfici dei sedili wc fino a 700 cm 2. Il protocollo include i passaggi per l'estrazione del virus dalle tamponi e ulteriore concentrazione dell'RNA virale utilizzando colonne di rotazione. In totale, 127 (58,5%) dei 217 campioni di tamponi che erano stati raccolti da superfici in navi da crociera e le strutture di assistenza a lungo termine in cui norovirus gastroenterite era statosegnalati risultati positivi per GII norovirus mediante RT-qPCR. Di questi 29 (22,8%) potrebbe essere genotipizzati con successo. In conclusione, l'individuazione di norovirus sulle superfici ambientali che utilizzano il protocollo che abbiamo sviluppato può aiutare a determinare il livello di contaminazione ambientale durante le epidemie, così come il rilevamento del virus quando i campioni clinici non sono disponibili; può anche facilitare il monitoraggio dell'efficacia delle strategie di bonifica.

    Introduction

    Norovirus umani sono una delle principali cause di un'epidemia e sporadici gastroenterite acuta in tutto il mondo 1, 2, 3. Il virus è estremamente contagiosa e la trasmissione avviene attraverso persona diretta all'interazione persona o indirettamente attraverso il contatto con alimenti contaminati, acqua o superfici ambientali. Norovirus può essere versato per lunghi periodi e prolungato la sopravvivenza del virus sulle superfici ambientali è stata documentata 1, 2, 3. Durante spargimento di picco, miliardi di particelle virali vengono rilasciati per grammo di feci e vomito contiene anche un numero sufficiente di particelle virali di causare infezioni 4, 5, 6, 7, 8,ef "> 9, 10. Inoltre, il trasferimento del virus tra le superfici inanimate e la pelle umana può facilmente verificarsi 2, 11, 12. Quindi, il monitoraggio della contaminazione ambientale può aiutare a indagini sui focolai e nel valutare l'efficacia di clean-up e procedure di disinfezione.

    Diversi protocolli di campionamento ambientali sono stati descritti per la rilevazione di rotavirus, colifago MS2, calicivirus felino (FCV), e batteriofago P22 13, 14, 15, 16. Tuttavia, le condizioni di validazione descritti in questi studi, tra cui essiccazione veloce (<1 ora) e piccole superfici (25 x 100 cm 2), potrebbero non rappresentare adeguatamente le impostazioni del campo. Inoltre, il basso livello di contaminazione di enviro previstosuperfici nmental richiedono protocolli che sono in grado di rilevare pochissime particelle virali.

    Abbiamo sviluppato un metodo di campionamento di superficie macrofoam-based per il rilevamento e la tipizzazione di norovirus. Questo metodo è stato validato nel corso di diversi focolai di norovirus. Il protocollo comprende 1) come raccogliere campioni di tampone da superfici ambientali (2) come mantenere meglio l'integrità dei campioni durante la raccolta e il trasporto al laboratorio, e 3) prove di laboratorio e la tipizzazione di norovirus.

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    Protocol

    1. Tampone campionamento nel campo

    1. Indossare un paio di guanti puliti.
    2. Misurare le dimensioni della zona di campionamento senza toccare la superficie con un nastro di misurazione o un righello. Cercare di stimare l'area nel modo più accurato possibile e compilare un modulo di rapporto (Tabella supplementare 1).
    3. Controllare il kit tampone per eventuali perdite e borse trasporto del campione etichetta e kit tamponi.
    4. Spostare il tampone attraverso l'area di campionamento come segue: un colpo in direzione orizzontale, un colpo in direzione verticale, ed un colpo in diagonale. Non tamponare una superficie maggiore di 700 cm 2.
    5. Posizionare ogni tampone in una provetta e stringere il tappo saldamente.

    2. il deposito e trasporto tamponi al Laboratorio

    1. Mantenere tamponi a 4 ° C per un massimo di 48 ore. Per una conservazione per periodi più lunghi, conservare i tamponi a -20 ° C (o -70 ° C).
    2. Conservare le provette a 0-4 ° C (vale a dire. , Usare impacchi freddi) in un contenitore isolato durante il trasporto al laboratorio e nave entro 24-48 ore di raccolta.

    3. Virus Concentrazione, virale RNA estrazione e purificazione

    NOTA: Tutte le fasi di centrifugazione utilizzare una centrifuga da tavolo a 5.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente, se non diversamente indicato. Prestare la massima attenzione quando si lavora con il tampone universale estrazione degli acidi nucleici (UNEX). Indossare occhiali o visiera.

    1. Etichettare una provetta 15 ml e una colonna RNA Midi per ogni campione. Includere un controllo di estrazione negativo in ogni esperimento.
    2. Per preparare la soluzione di lisi per 10 tamponi, miscelare 25 ml di tampone UNEX con 25 mL di PBST (PBS pH 7,2 contenente 0,02% Tween-80).
    3. Aggiungere 50 ml di sospensione colifago MS2 (10 6 PFU / ml) a 50 ml di soluzione di lisi.
    4. Posizionare un tampone in una provetta da 15 ml e aggiungere 5 ml di soluzione di lisi. Mescolare e incubare per 10 min a temperatura ambiente.
    5. Aggiungere 5 ml di etanolo al 100% in ogni provetta e vortex per 10 s.
    6. Rimuovere con cautela il bastoncino del tubo da 15 ml (contiene tampone UNEX) premendo delicatamente contro la parete della provetta per rimuovere il liquido in eccesso e poi scarta il tampone. I restanti volumi dovrebbero essere tra 9-10 ml.

    4. Midi Colonna virale Nucleic Acid Extraction

    1. Trasferire accuratamente 4,5 mL UNEX miscela / etanolo a partire dal punto 3.6 su una colonna midi, centrifugare e scartare il filtrato.
    2. Caricare altri 4,5 ml della stessa miscela sulla stessa colonna, centrifuga, e scartare il filtrato.
    3. Per il primo lavaggio, aggiungere 3,5 ml di etanolo al 70% sul Mezzogiorno della colonna, centrifugare e scartare il filtrato.
    4. Per il secondo lavaggio, aggiungere altri 3,5 ml di etanolo al 70% nella colonna Midi. Centrifuga e scartare il filtrato.
    5. Per la secca-spin, centrifugare le colonne Midi per eliminare ogni traccia di etanolo (che possono influenzare negativamente il recupero RNA virale).
    6. Porre la colonna Midi a un nuovo 15 ml provetta da centrifuga. Aggiungere 250 microlitri tampone di eluizione sulla colonna Mezzogiorno; attendere 1 minuto prima centrifugazione per ottenere il massimo recupero di RNA virale.
    7. Conservare l'acido nucleico estratto a -70 ° C o procedere immediatamente al punto 5.

    5. La concentrazione di acido nucleico virale Utilizzando RNA Clean and Concentrator Kit

    1. Aggiungere 500 ml di RNA Binding Buffer a 250 ml di RNA eluizione al punto 4.7 e vortex per 10 s.
    2. Aggiungere 750 microlitri di 100% di etanolo e vortex per 10 s.
    3. Etichettare una colonna di spin per ogni campione. Caricare il campione di 750 microlitri su una colonna di spin.
    4. Centrifugare le colonne di rotazione a 12.000 xg per 1 min. Gettare il flow-through.
    5. Caricare i restanti 750 ml su una colonna di spin e centrifugare a 12.000 xg per 1 min.
    6. Per il prelavaggio, aggiungere 400 microlitri di RNA Prep buffer per ogni colonna di spin e centrifugare a 12.000 xg per 1 min. Gettare il flow-through.
    7. Per il primo lavaggio, aggiungere 800 microlitri di RNA tampone di lavaggio in ogni colonna di spin e centrifugare a 12.000 xg per 1 min. Gettare il flow-through.
    8. Per il secondo lavaggio, aggiungere 400 microlitri di RNA tampone di lavaggio a girare colonna e centrifugare a 12.000 xg per 1 min. Gettare il flow-through.
    9. Per la secca-spin, centrifugare la colonna di selezione per eliminare ogni traccia di tampone di lavaggio a 12.000 xg per 2 minuti.
    10. Trasferire accuratamente colonna di selezione per un 1,5 ml provetta pulita.
    11. Aggiungere 25 microlitri tampone di eluizione su colonna di spin e incubare per 1 min a temperatura ambiente. Ciò aumenterà il recupero di RNA virale dalla colonna.
    12. Raccogliere RNA mediante centrifugazione la colonna di spin a 10.000 xg per 1 min.
    13. O procedere direttamente alla RT-qPCR (fase 6) o un negozio di RNA a -70 ° C.

    6. Mutiplex RT-qPCR Rilevazione di genogruppo I e II Norovirus, e colifago MS 2 (tabella integrativa 2)

    1. le superfici di lavoro pulito, pipettES, e centrifughe con la soluzione di decontaminazione RNase per ridurre possibili contaminazioni.
    2. Scongelare reagenti RT-qPCR sul ghiaccio. RNA disgelo sul ghiaccio (in una zona / camera separata).
    3. Determinare il numero di reazioni e aggiungere almeno il 10% più di essi (ad esempio se sono necessari 10 reazioni, fare miscela master per 11).
    4. Vortex singoli componenti Master Mix, ad eccezione di 25x RT-qPCR enzima, per 5 s. Mescolare accuratamente l'enzima muovendo il tubo con un dito.
    5. Brevemente componenti mix di master centrifuga per 5 s.
    6. Preparare la miscela master per il tempo reale di rilevamento RT-PCR di GI norovirus e GII secondo le istruzioni del kit e aggiungere primer e sonde oligonucleotidiche specifiche per norovirus in 1,5 ml provetta (Tabella supplementare 3).
    7. Mescolare il master mix pipettando 5-10 volte su e giù (vortex non è raccomandata). Aliquota 22 ml di master mix in ciascun pozzetto della real time PCR piastra da 96 pozzetti.
    8. Vortex RNA campioneper 5 secondi, e raccogliere da brevi (5 s) centrifugazione.
    9. Aggiungere 3 ml di RNA campione e GI e GII controlli positivi alla piastra RT-qPCR (seguire modello dalla tabella 2). Aggiungere 3 ml di nucleasi-Freewater nei pozzetti non-modello-controllo (NTC).
    10. Sigillare la piastra in tempo reale con pellicola adesiva ottica.
    11. centrifugare delicatamente la piastra in tempo reale a 1.300 xg per 1 min per rimuovere eventuali bolle d'aria o gocce di liquido che possono essere presenti nei pozzetti.
    12. Impostare un real-time PCR e strumento di set-up le seguenti condizioni termocicli: 1) step RT per 10 min. a 45 ° C (2) attivazione di Taq polimerasi, 10 min. a 95 ° C e (3) 45 cicli di 15 s a 95 ° C e 60 s a 60 ° C.

    7. La quantificazione di Norovirus in tampone campioni

    1. Verificare i risultati dei controlli positivi e negativi per convalidare i risultati RT-qPCR (Tabella supplementare 3).
    2. Determinare se ogni curva standard incontra ilvalori accettabili riportati nella tabella integrativa 2 e calcolare la deviazione standard generale per la curva standard utilizzando Equazione 1.
      (Equazione 1)% di efficienza = 100 x 10 (media Ct Values-Intercept) / Slope.
    3. Se il software termociclatore PCR non calcola la pendenza per ogni curva standard, determinare pendenza e R 2 valori di regressione utilizzando un software statistico (per esempio Excel, SPSS o SAS). Inoltre, calcolare l'efficienza% per curve standard seguenti equazione I
    4. Registrare il numero di RNA copie calcolato dal software termociclatore per tutti i campioni di prova basati su curve standard che soddisfano i criteri specificati nella tabella supplementare 4. Eseguire nuovamente tutti i campioni con le curve standard t cappello non soddisfano i criteri o hanno controlli falsi-positivi. Controllare i valori Ct di colifago MS2, che è stato aggiunto come controllo interno per monitorare l'inibizione della PCR.
    5. Determinare il numero totale di RNA copie per campione dallo moltiplicando il numero RNA copia calcolata al punto 7.2 dal rapporto tra il volume (25 a 50 mL) del totale eluente RNA a quella del RNA (da 3 a 5 mL) usato per la reazione RT-qPCR. In alternativa, calcolare la densità RNA dividendo il numero totale RNA copia per la superficie dell'oggetto (cm 2) analizzato.

    8. genotipizzazione di campioni in tempo reale RT-PCR positiva per Hemi annidata convenzionale PCR Amplification

    1. Preparare il primo turno di master mix per ogni set di primer del saggio RT-PCR (Tabelle integrativa 2 e 5).
    2. Aggiungere 5 ml di norovirus RNA positivo per 20 ml di master mix.
    3. Eseguire il RT-PCR con le seguenti condizioni: (1) RT passo per 30 minuti a 42 ° C (2) attivazione di Taq polimerasi, 15 min a 95 ° C, e (3) 40 cicli di 30 s a 95 ° C , 30 s a 50 ° C e 60 secondi a 72 ° C. Dopo 40 cicli, incubare per altri 10 min a 72 ° C.
    4. Preparare il secondo turno di mix mater per ogni set di primer del saggio RT-PCR (Tabelle integrativa 2 e 5).
    5. Aggiungere 23 ml master mix e aggiungere 2 ml di primo turno di RT-PCR prodotti (dal primo turno) ad ogni provetta (idealmente il prodotto primo turno deve essere diluito 1/10 in acqua RNase-free).
    6. Ripetere il punto 8.3.
    7. Preparare un gel di agarosio al 2% in EDTA 100 ml 1x Tris-acetato (40 mM Tris, 20 mM di acido acetico, e 1 mM EDTA, pH 8,3). Dopo dissoluzione agarosio riscaldando la miscela in un forno a microonde, aggiungere 10 ml di acido macchia nucleico per 100 ml di gel preparata dopo raffreddamento la miscela a 60-70 ° C, versare il gel e inserire i pettini. Lasciate che il gel accontentarsi di almeno 30 minuti.
    8. Mescolare 15 ml di ciascun prodotto RT-PCR con 3 ml di colorante di caricamento 6x. Carico 15 microlitri di ciascun campione e elettroforesi il gel di agarosio a 100 V per 1 ora.
    9. frammenti bersaglio Excise RT-PCR di dimensioni adeguate (330 bp per GI e 341 bp per GII) dal geld purificare RNA utilizzando un kit di estrazione del gel commerciale. Il prodotto di PCR purificato può essere utilizzato per Sanger sequenziamento.

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    Representative Results

    La figura 1 presenta un diagramma di flusso del protocollo di campionamento tampone. Questo protocollo è costituito da quattro fasi principali; 1) la raccolta dei campioni, 2) conservazione e il trasporto, 3) virale purificazione dell'RNA e concentrazione e 4) analisi RT-qPCR e genotipizzazione.

    Figura 1
    Figura 1: Diagramma di flusso del protocollo finale per il campionamento di superficie ambientale dei norovirus Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    La tabella 1 riassume i risultati di 34 campioni di tamponi che sono stati raccolti da una nave da crociera che aveva denunciato casi di sospetta gastroenterite norovirus durante un viaggio. tamponi sono stati estratti e TEsted in duplice copia per norovirus di multiplex real-time RT-qPCR. Diciassette (18,5%) i campioni sono risultati positivi tra cui 8 campioni da superfici in cabine dove i passeggeri con sintomi norovirus era rimasto e 9 dalle aree comuni della nave. Il numero di copie genomiche per campione sono stati calcolati a partire dai valori Ct (che andavano dal 16 al 31), utilizzando una curva standard di un norovirus trascrizione GII.7 RNA. Il numero mediano di copie di genoma da campioni di tamponi in cabina è stato del 3,6 log 10 (range: 2,4 - 4,5 log 10 copie di RNA), che era significativamente più alta rispetto alle copie di genoma da spazi comuni (range: 1,2-2,1 log10 copie genoma) ( P <0.001). Quattro (23,5%) dei campioni di tamponi positivi 17 erano in grado di sottoporre a genotipizzazione, e tutti i campioni avevano le sequenze GII.1 identici.

    Lido
    Luogo di swap ambientale raccolto un Valore Ct medio (# positivo del numero totale di campioni testati) Genotipo Norovirus RNA numero di copie per ogni campionato Area C
    Atrio corrimano 34.3 (1/2) GII 16
    cabina A sedile del water 31.4 (2/2) GII. B 31.217
    cabina A Rubinetto 37.5 (1/2) GII 491
    cabina A Maniglia della porta 35,0 (2/2) GII 2.675
    cabina A Telecomando 38.6 (2/2) GII.1 B 233
    Cabin B sedile del water 33.5 (2/2) GII.1 B 986
    Macchina del gelato 34.2 (2/2) GII 16
    Lido Condimenti Tabella 35.2 (1/2) GII 15
    Lido Table Top 35.3 (1/2) GII 14
    Pizzeria di superficie contatore 35.7 (1/2) GII 14
    principale della cambusa Fun-tempo macchina 37.1 (1/2) GII 64
    Distributore automatico superfici di contatto 38,8 (1/2) GII 18
    salone Crew Tastiera e mouse di superficie 36,8 (1/2) GII 80
    cabina C Rubinetto e maniglia della porta 31.6 (2/2) GII.1 B 26.458
    cabina C Telefono 36.4 (2/2) GII 1.035
    cabina C Tastiera 33,0 (2/2) GII 1.317
    Centro medico Appunti 36,0 (2/2) GII 113
    una cabina A, B e C è stato occupato da individui che erano stati clinicamente malati con sintomi gastoenteristis virali.
    B Quattro dei tamponi 17 GII-positivi potrebbero essere genotipizzazione.
    copie c RNA sono stati caluated sulla base di una curva standard di norovirus GII.7 trascritti di RNA.
    Nota: sopra la data sono stati leggermente modificati dall'articolo originale 6.

    Tabella 1: I risultati di 34 campioni di tamponi che sono stati raccolti da una nave da crociera che aveva denunciato casi di sospetta gastroenterite norovirus durante un viaggio.

    La Figura 2 mostra la relazione dei valori Ct determinati mediante RT-qPCR e la capacità di sequenza questi campioni. In totale, 127 su 217 tamponi sono risultati positivi per GII norovirus mediante RT-qPCR. I campioni hanno mostrato una vasta gamma (12-40) dei valori Ct. In totale, 29 (22,8%) dei campioni positivi RT-qPCR potrebbe sottoporre a genotipizzazione. dei campioni di tampone con valori Ct inferiori a 27 e compresi tra 28-31 sono stati genotipizzati a tassi del 100% e del 72,2% rispettivamente. Al contrario, solo il 22,0% e il 1,6% dei campioni di tamponi con valori Ct di 32-36 e 37-40, rispettivamente, prodotti ampliconi emi-nested che potrebbero essere riuscito a sequenziare.


    Figura 2: Risultati dello screening RT-qPCR e sequenziamento di tamponi che erano stati raccolti durante focolai di norovirus confermati. barre bianche rappresentano il numero di RT-qPCR tamponi positivi virus. acidi nucleici norovirus umani nei campioni positivi RT-qPCR sono stati amplificati con PCR emi-nested e poi sequenziato per la conferma di genotipizzazione. Nero bar e linea rappresentano il numero e la percentuale del genotipo confermato tamponi rispettivamente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    campo di valori ct Numero di campioni positivi RT-qPCR Numero (%) dei campioni sequenza confermata una
    20-23 4 3 (75)
    24-27 3 3 (100)
    28-31 18 13 (72.2)
    32-36 41 9 (22.0)
    37-40 61 1 (1.6)
    a) emi nested PCR

    Tabella 2: RT-qPCR e risultati genotipizzazione di tamponi.

    Numero di esempio LUOGO Descrizione di superficie Superficie (cm 2) Data / ora di prelievo del campione Clean (S / N) Se puliti, quello del disinfettante è stato utilizzato? </ Strong> Descrizione dettagliata del materiale di superficie e la posizione
    1 Room # 7-1302 Toilet Seat 700 cm 2 2016/06/26; 09:00 No non applicabile sedile del water [superfici superiori), e plastoc difficile
    2 Room # 7-1330 maniglia Telefono 500 cm 2 2016/06/26; 09:25 1.000 ppm candeggina plastica dura, tasto di gomma

    Tabella supplementare 1: Esempio di scheda di descrizione del campione.

    <td> 17
    genogruppo / virus Nome oligonucleotide di primer / sonda Sequenza 5 → 3 & #900; Riferimento
    GI Cog1F CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA 17
    Cog1R CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C 17
    G1SKF CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA 17
    G1SKR CCA ACC CAR CCA TTR TAC A 17
    Ring1E-probe FAM - TGG ACA GGR GAY CGC - MGBNFQ un Questo studio
    GII Cog2F AUTO GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG 17
    Cog2R TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA 17
    Ring2-iniettore TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT 17
    G2SKR CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT
    Ring2-probe Cy5 o QUASAR 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - BHQ2 b 17
    MS2 MS2F TGG CAC TAC CCC TCT TAT CCG TCA CG 18
    MS2R GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C 18
    Ms2p-probe HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA CAAGC - BHQ1 c 18
    una sonda TaqMan GI è 5'-etichettato con 6-carbossifluoresceina (FAM) e 3'-marcato con MGBNFQ (Minore-groove sito di legame)
    b sonda TaqMan GII è 5'-etichettato con Cy5 o Quasar 670 e 3'-etichettati con Black Hole quencher; Hole Quencher Nero (BHQ) 2 utilizzati a causa di disponibilità, BHQ 3 è preferito.
    Sonda c MS2 TaqMan è 5R17; -labeled con HEX e 5'-marcato con BHQ1

    Tabella integrativa 2: primer oligonucleotidi e sonde informazioni.

    Cog 2F (10 micron)
    Componente Volume per reazione (ml) concentrazione finale
    2x RT-PCR Buffer * 12.5 1x
    Priva di nucleasi acqua * 1.08 n / a
    Rilevamento Enhancer * 1.67 n / a
    Cog 1F (10 micron) 1 400 nm
    Cog 1R (10 micron) 1 400 nm
    Anello 1E-sonda (10 micron) 0.5 200 nm
    1 400 nm
    Cog 2R (10 micron) 1 400 nm
    Ring 2-sonda (10 micron) 0.5 200 nm
    MS2F (10 micron) 0.25 100 nM
    MS2R (10 micron) 0.25 100 nM
    Ms2p-sonda (10 micron) 0.25 100 nM
    2x RT-PCR enzima * 1 1x
    Volume Master Mix 22
    * Incluso nel tempo vero e proprio kit RT-PCR

    Tabella supplementare 3: miscela master per multiplex in tempo reale GI / GII / MS2 norovirus RT-PCR

    Tipo di controllo interpretazione dei risultati
    Campione controllo negativo Dovrebbe essere negativo
    controllo positivo Dovrebbe essere positivo
    campione negativo Il campione è negativo se ogni valore Ct non è rilevabile per GI / GII
    campione positivo valori Ct (GI / GII) di entrambi i replicati è <38; questo (arbitrariamente) cut-off deve essere determinata sperimentalmente per ciascun tempo reale piattaforma PCR e kit
    campione positivo Provvisorio Esempio è provvisoriamente positivo se il valore Ct (GI / GII) di una replica è <38
    controllo di processo interno (MS2) I campioni con un ciclo soglia (Ct) il valore di f ≥32o MS2 deve essere analizzato nuovamente diluito e 1/10 diluito.
    Parametro valore accettabile
    Curva standard utilizzando le trascrizioni di RNA norovirus R 2 > 0.97
    Efficienza 90% al 115%

    Tabella supplementare 4: Controlli da includere in ogni test RT-qPCR per la rilevazione dei norovirus nei campioni di tamponi ambientali.

    Componente concentrazione finale vol / RXN (ml)
    tampone 5x RT-PCR 1x 5.00
    miscela dNTP (10 mM) 0,4 mm 1.00
    miscela di enzimi (RT e Taq) 1.00
    Forward Primer un 0,5 micron 0.50
    Reverse Primer un 0,5 micron 0.50
    inibitore RNasi (20 U / ml) 20 U 1.00
    acqua priva di RNasi 11.00
    Volume totale 20.00
    un avanti e indietro set di primer per GI e GII gruppo sono Cog1F + G1SKR, e Cog2F + G2SKR, rispettivamente.
    Secondo turno RT-PCR
    Componente concentrazione finale vol / RXN (ml)
    tampone 5x RT-PCR < / Td> 1x 5.00
    miscela dNTP (10 mM) 0,4 mm 1.00
    miscela di enzimi (RT e Taq) 1.00
    Forward Primer B 0,5 micron 0.50
    Reverse Primer B 0,5 micron 0.50
    inibitore RNasi (20 U / ml) 20 U 1.00
    acqua priva di RNasi 14.00
    Volume totale 23.0
    b avanti e indietro set di primer per GI e GII gruppo sono G1SKF + G1SKR, e Ring2 Primer + G2SKR, rispettivamente.
    Nota: sopra informaion è stato leggermente modificato dall'articolo originale 19
    _content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Tabella supplementare 5: Hemi-annidato Master Mix RT-PCR.

    Fase I campionamento campo 1. Controllare kit macrofoam tampone (ad esempio, la data di scadenza, perdite di tubi, e tampone umidità)
    2. Tampone di superficie (superficie limite a ≤100 pollici 2 (645 cm 2))
    3. Inserire Tamponi nei tubi di trasporto, e serrare i tappi in modo sicuro per evitare perdite durante il trasporto
    Kit tampone 4. Mettere in una chiusura lampo-bag
    Fase II Trasporto del campione e lo stoccaggio 1. tamponi campionati devono essere conservati a -70 ° C (o -20 ° C)
    2. Trasportare tamponecampioni a laboratori a 0-4 ° C (freddo-pack) in un contenitore isolato e la spedizione in 48 ore di tamponi di raccolta
    Fase III RNA etraction 1. Controllare tampone di lisi (ad esempio, i dati di scadenza)
    2. Aggiungere MS2 come controllo interno in tampone di lisi prima di aggiungere 100% di etanolo
    La purificazione di RNA e la concentrazione 3. banco di laboratorio pulite e piccole apparecchiature che utilizzano soluzione di rimozione di RNA RNasi
    4. Cambiare i guanti frequentemente durante misure per evitare un RNA contaminazione incrociata
    Fase IV RT-PCR Assay (QA / QC) 1. Includere RNA quantificati norovirus trascrizione (GI e GII) per ogni test RT-qPCR per controllare le variazioni di valori Ct per ogni ciclo di PCR
    2.Utilizzare assenza di segnale MS2 per monitorare la presenza di inibitori della PCR

    Tabella supplementare 6: Lista di controllo per la procedura di campionamento ambientale del CDC.

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    Discussion

    Norovirus hanno una dose infettiva umana del 50% tra i 18 ei 10 3 20 particelle virali. Pertanto, anche la contaminazione di basso livello di superfici può costituire un rischio per la salute pubblica. Diversi aspetti del protocollo di campionamento tampone sono stati valutati tra cui: 1) diversi materiali tampone, 2) condizioni di conservazione tamponi durante il trasporto, 3) la concentrazione di RNA virale, e 4) colifago MS2 il controllo di estrazione interna.

    Fino a poco tempo, solo le prestazioni di tamponi in cotone, poliestere, nylon e salvietta antistatica) è stato valutato e proposto per l'uso sul campo 13, 14, 15, 21, 22. Di questi, tamponi di cotone sono stati raccomandati dal protocollo ISO 15216 per la rilevazione di norovirus e il virus dell'epatite A da superfici di preparazione degli alimenti e fomiti 23. Comemai, ci sono dati limitati sulle prestazioni sperimentazione di tamponi di cotone in condizioni di campo con grandi superfici high-touch, come le maniglie delle porte, computer e servizi igienici posti che sono stati spesso implicati nella trasmissione di norovirus 24, 25. Inoltre, la dimensione di queste superfici ambientali supera la capacità di tamponi con punta in fibra. Nel nostro studio, abbiamo dimostrato che i tamponi macrofoam, che hanno una grande testa del tampone rispetto ai tamponi in fibra punta, hanno tassi di recupero più elevati per norovirus umane durante il campionamento superfici ambientali con una superficie fino a 700 cm 2.

    Noroviruses in soluzione sono relativamente instabili a temperatura ambiente e richiedono almeno refrigerazione. Pertanto, il trasporto al laboratorio deve avvenire a 0-4 ° C entro 48 ore dopo la raccolta dei tamponi. Il volume di campione che può tipicamente essere testato in una reazione di PCR è molto più piccolo di quello della quantità dicampione dopo eluizione dal tampone (3-5 ml vs 5-10 ml) che, senza la concentrazione, riduce in modo significativo il tasso di positività. In virologia ambientale, polietilene glicole (PEG) è stato usato con successo per concentrare virus da grandi volumi di acque ambientali. Tuttavia, i volumi fino a 10 mL possono essere facilmente estratti e concentrati usando le colonne di spin Midi ai volumi a partire da 250 microlitri, e concentrate ulteriormente di 10 volte con elevato recupero utilizzando le colonne di spin.

    Sebbene RT-qPCR è il gold standard per una rivelazione sensibile e quantificazione norovirus, la sensibilità di questi test può essere facilmente influenzato dalla presenza di inibitori della PCR che sono co-estratto dai tamponi. Pertanto, l'inclusione di un controllo di estrazione come particelle virali colifago MS2, in un multiplex formato di PCR che rileva entrambi i norovirus e MS2, aiuta a monitorare la presenza di inibizione della PCR e di valutare variazioni tra i diversi esperimenti. </ P>

    Le variabili di prova di un metodo di convalida di laboratorio sono fondamentali per determinare il potere discriminante di un metodo di prova e sono ulteriormente tradotte in probabile rendimento campionamento campo del metodo. Prendendo condizione campo del mondo reale (ad esempio, il campionamento in ritardo, superfici più grandi fino a 700 cm 2) in considerazione, il limite di rilevamento per norovirus era 3,4 log 10 (acciaio inox) e 4 log 10 (sedile del water) copie norovirus per superficie campionata 6. Di conseguenza, i risultati tamponi negativi non sono definitivi che nessuna contaminazione virale è verificato. Le informazioni cliniche ed epidemiologiche della malattia norovirus trionfi sempre risultati ambientali 2, 6.

    I nostri dati da una nave da crociera hanno dimostrato che le superfici high-touch, come telefoni, tastiere di computer, e maniglie sono risultati positivi per norovirus nelle cabine dove la gentecon gastroenterite virale riportato era rimasto. Queste superfici sia diventato contaminati attraverso il contatto diretto o indiretto attraverso le goccioline prodotte durante sciacquone o episodi 6, 7, 8, 9, 10 vomito.

    In conclusione, l'individuazione di norovirus sulle superfici ambientali che utilizzano questo protocollo tampone di nuova concezione può aiutare a determinare il livello di contaminazione ambientale durante le epidemie, rilevare il virus quando i campioni clinici non sono disponibili e nel monitoraggio dell'efficacia delle pratiche di pulizia. Fibra punta tampone (cotone e rayon) basano i metodi di campionamento di superficie sono stati ampiamente utilizzati per studiare altri virus enterici (ad esempio rotavirus, adenovirus e) 27, 28, 29. Considerando l'altoefficienza di recupero per norovirus di tamponi macrofoam oltre quelle fibre punta tamponi 6, ci aspettavamo che i tamponi macrofoam saranno in grado di rilevare altri virus enterici come bene.

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    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Generic name for kits
    Macrofoam swab Premoistened EnviroMax Swab kit  Puritan 2588060PFUW
    RNA Lysis buffer  CDC UNEX buffer Microbiologics Cat No MR0501
    RNA extraction spin column Midi column Omega Biotek Cat No R6664-02
    RNA purification spin column Zymol RNA Clean and Concentrator kit  Zymo Research Cat No R1016
    Real time RT-PCR kit AgPath kit One-Step RT-PCR Kit Life Technologies Cat No 4387391
    Conventional RT-PCR kit Qiagen one step RT-PCR kit Qiagen kit Cat No 210212
    Gel extraction kit Qiagen QIAquick gel extraction kit Qiagen kit Cat No 28704 or 28706
    Coliphage MS2 ATCC Cat No 15597-B1
    RNA run-off transcripts
    Realtime PCR platform Applied Biosystems Model ABI 7500
    Optical 96-well reaction plate Thermo Scientific Cat No 4316813
    MicroAmp Clear Adhesive Film  Thermo Scientific Cat No 4306311

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