간단한 교반 용기를 사용하여 알긴산 염 비즈에서 포유류 세포 캡슐화

Published 6/29/2017
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Bioengineering

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Summary

이 동영상과 원고는 단순 교반 용기를 사용하여 큰 배치로 생산할 수있는 0.5 % ~ 10 % 알긴산 염 비즈로 포유류 세포를 캡슐화하는 유제 기반 방법을 설명합니다. 캡슐화 된 세포는 시험 관내에서 배양 되거나 세포 치료 응용을 위해 이식 될 수 있습니다.

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Hoesli, C. A., Kiang, R. L., Raghuram, K., Pedroza, R. G., Markwick, K. E., Colantuoni, A. M., et al. Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel. J. Vis. Exp. (124), e55280, doi:10.3791/55280 (2017).

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Abstract

알기 네이트 비드에서의 세포 캡슐화는 시험 관내 뿐만 아니라 생체 내 면역 분리 위해 고정화 된 세포 배양 사용되어왔다. 췌도 소포 캡슐화는 동종 또는 이종 이식에서 랑게르한 생존을 증가시키는 수단으로서 광범위하게 연구되어왔다. 알지네이트 캡슐화는 일반적으로 노즐 압출 및 외부 겔화에 의해 달성됩니다. 이 방법을 사용하여, 노즐의 끝에 형성된 세포 함유 알지네이트 물방울은 물방울로 확산 될 때 이온 성 알지네이트 겔화를 유발하는 2가 양이온을 함유하는 용액에 빠지게된다. 노즐 팁에서의 액적 생성에 대한 요구는 용적 처리량 및 달성 될 수있는 알긴산 염 농도를 제한한다. 이 비디오는 포유류 세포를 70 % ~ 90 %의 세포 생존율을 갖는 0.5 %에서 10 %의 알지네이트로 캡슐화하는 확장 가능한 유화 방법을 설명합니다. 이 대체 방법에 의해, 세포 및 탄산 칼슘을 함유하는 알긴산 방울을 미네랄 오일,내부 칼슘 방출 및 이온 성 알기 네이트 겔화를 유도하는 pH의 감소로 낮아진다. 현재 방법은 유화 20 분 이내에 알지네이트 구슬의 생산을 허용합니다. 캡슐화 단계에 필요한 장비는 대부분의 실험실에서 사용할 수있는 단순 교반 용기로 구성됩니다.

Introduction

포유류 세포 캡슐화는 면역 거부 반응으로부터 이식 된 세포를 보호하거나 고정화 된 세포 배양을위한 3 차원 지지체를 제공하는 수단으로 광범위하게 연구되어왔다 2 , 3 , 4 . 알지네이트 구슬의 췌장 섬모 캡슐화는 동종 제 5 , 6 또는 이종 동물 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 개의 설치류에서 당뇨병을 역전시키는 데 사용되었습니다. 제 1 형 당뇨병을 치료하기위한 캡슐화 된 췌도 이식의 전임상 시험과 임상 시험이 진행 중이다 ( 13 , 14 , 15) . 이식 용도 또는보다 큰 규모의 경우체외 고정화 세포 생산, 노즐 기반 비드 발생기가 일반적으로 사용됩니다. 전형적으로, 알지네이트와 세포의 혼합물은 노즐을 통해 펌핑되어 2가 양이온을 함유하는 진탕 된 용액에 떨어지는 액 적이 형성되어 액적의 외부 겔화를 일으킨다. 동축 가스 흐름 ( 16 , 17) , 노즐 진동 ( 18) , 정전 반발력 ( 19) 또는 회전 와이어 ( 20) 는 노즐 팁에서 액적 형성을 용이하게한다.

기존의 비드 발생기의 주요 단점은 제한된 처리량과 적절한 비드 형성을 가져 오는 용액 점도 범위가 제한된다는 것입니다. 높은 유속에서, 노즐을 빠져 나가는 유체는 노즐 직경보다 작은 방울로 분열되어 크기 조절을 감소시킵니다. 다중 노즐 비드 발생기를 사용하여 처리량을 늘릴 수 있지만노즐 사이의 균일 한 유량 분포와 용액의 사용> 0.2 Pas는 문제가있다. 마지막으로 모든 노즐 기반 장치는 사용되는 노즐의 직경이 100 μm와 500 μm 사이 인 반면 섬의 ~ 15 %는 200 μm보다 클 수 있기 때문에 섬에 약간의 손상을 줄 것으로 예상됩니다 23 .

이 비디오에서는 드롭 다운 드롭 대신 단일 유화 단계에서 드롭 릿을 형성하여 포유류 세포를 캡슐화하는 대체 방법에 대해 설명합니다. 비드 생산이 간단한 교반 용기에서 수행되기 때문에,이 방법은 장비 비용이 저렴한 (~ 1 mL)에서 대규모 (10 3 L 범위) 비드 생산에 적합합니다. 이 방법은 비드 생성 시간이 짧은 ( 예 : 20 분) 넓은 알긴산 점도를 사용하여 구형도가 높은 비드를 생산할 수 있습니다. 이 방법은 원래 Poncelet et al에 의해 개발되었다 .엘. 25 , 26 및 DNA 27 , 인슐린 29 및 박테리아 30을 포함한 단백질 28 을 고정시키는 데 사용되었습니다. 우리는 최근에 췌장 베타 세포주 31 , 32 및 일차 췌장 조직 32를 사용하여 포유 동물 세포의 캡슐화에 이러한 방법을 적용했습니다.

이 방법의 원리는 미네랄 오일에 알지네이트 방울로 구성된 유 중수 에멀젼을 생성 한 다음 알긴산 방울을 내부 겔화시키는 것입니다 ( 그림 1 ). 먼저, 봉입 제 ( 예 : 세포)는 초기 공정 pH에서 낮은 용해도를 갖는 미세 입자 칼슘 염을 함유하는 알긴산 염 용액에 분산된다. 이어서 알긴산 염 혼합물을 교반 된 유기상에 첨가하여 보통 에멀젼의 존재하에 에멀젼을 생성시킨다.계면 활성제. 포유 동물 세포 캡슐화의 경우, 혈청에 존재하는 성분은 계면 활성제로 작용할 수 있습니다. 다음으로, 수성 상으로 분할되는 유용성 산을 첨가함으로써 칼슘 염을 가용화시키기 위해 pH를 감소시킨다. 미네랄 오일 / 물 분배 계수가 <0.005 33 인 초산은 오일에 미리 용해시킨 다음에 유상에 첨가하여 유상에 혼합하고 신속하게 수성 상에 분배한다. 그림 2 는 산성화 및 내부 겔화 단계에서 일어나는 화학 반응과 확산을 보여줍니다. 마지막으로, 캡슐화 된 세포는 상 전이, 원심 분리에 의한 상분리 촉진, 반복 된 세척 단계 및 여과에 의해 회수된다. 이러한 단계는 품질 관리 분석, 시험 관내 세포 배양 및 / 또는 캡슐화 된 세포의 이식을위한 비드 및 세포 샘플링에 의해 수행 될 수있다.


그림 1 : 포유 동물 세포를 캡슐화하는 유화 기반 공정의 개략도. 구슬은 처음에 알긴산 염, 세포 및 CaCO3 혼합물을 미네랄 오일 (도식의 1 단계와 2 단계)에 유화시켜 아세트산을 첨가하여 내부 겔화를 유발함으로써 생성됩니다 (3 단계). 이어서, 겔화 된 비드를 수성 완충액을 첨가하여 위상 반전 (단계 4), 원심 분리 및 오일 흡인 (단계 5), 및 여과 (단계 6)를 수행함으로써 오일로부터 분리 하였다. 마지막으로, 필터 상에 수집 된 비드 는 시험 관내 배양 또는 이식을 위해 세포 배양 배지로 옮겨진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 내부 겔화 동안 일어나는 반응 및 확산 단계. (1) 아세트산은 유기상에 첨가되고 대류에 의해 알지네이트 방울로 수송된다. (2) 아세트산은 수상으로 분리된다. (3) 물의 존재 하에서, 산은 해리하고 확산되어 진한 파란색으로 묘사 된 CaCO3 입자에 이른다. (4) H + 이온은 CaCO3에서 Ca2 + 이온과 교환되어 Ca2 + 이온을 방출한다. (5) 칼슘 이온은 미 반응 알지네이트를 만나 알지네이트 사슬의 이온 결합 가교 결합을 일으킬 때까지 확산한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

종래의 노즐 기반의 세포 캡슐과는 달리, 넓은 비드 크기 분포가 얻어진다이는 교반 된 유화에서 액적 형성의 메카니즘으로 인해이 공정으로부터 유래된다. 일부 응용 프로그램의 경우이 구슬 크기 분포가 문제가 될 수 있습니다. 예를 들어, 더 큰 조각의 세포가 작은 비드의 비드 표면에 노출 될 수 있습니다. 영양소 ( 예 : 산소)의 제한이 우려된다면 큰 구슬에서는 이러한 한계가 악화 될 수 있습니다. 교반 된 유화 방법의 장점은 평균 비드 크기가 유화 단계 동안 교반 속도를 변화시킴으로써 쉽게 조절 될 수 있다는 것이다. 광범위한 비드 크기 분포는 또한 캡슐화 된 셀 성능에 대한 비드 크기의 효과를 연구하기 위해 이용 될 수 있습니다.

유화 및 내부 겔화에 의한 포유류 세포 캡슐화는 비드 발생기가 장착되지 않은 실험실에 대한 흥미로운 대안입니다. 또한,이 방법은 사용자에게 처리 시간을 줄이거 나 매우 낮은 또는 매우 높은 알긴산 염 농도에서 비드를 생성하는 옵션을 제공합니다ations.

아래에 약술 된 프로토콜은 10mM 4- (2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) 완충액에서 제조 된 5 % 알긴산 염 용액 10.5mL에 세포를 캡슐화하는 방법을 기술한다. 알지네이트는 이식 등급 LVM (낮은 점도의 높은 만 뉴론 산 함량)과 MVG (중간 점도의 높은 guluronic acid 함량) 알지네이트의 50:50 혼합물로 구성됩니다. 최종 농도 24 mM의 탄산 칼슘이 물리적 가교제로 사용됩니다. 경질 미네랄 오일은 유기상을 구성하고 아세트산은 유제를 산성화하고 내부 겔화를 유발하는 데 사용됩니다. 그러나, 알지네이트 유형 및 조성뿐만 아니라 선택된 공정 완충액은 원하는 적용 32 에 의존한다. 다양한 알지네이트 유형 (물질 표 참조)이이 프로토콜을 사용하여 비즈를 생산하는 데 사용되었습니다.

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Protocol

1. 알긴산 염 용액, CaCO3 서스펜션 및 산성화 오일 준비

  1. 프로세스 버퍼와 매체를 준비하십시오.
    1. 10 mM HEPES, 170 mM NaCl을 사용하여 고농도 알긴산염 구슬을 생성하는 데 사용되는 일반적인 공정 완충액을 준비하십시오. pH를 7.4로 맞추십시오.
    2. 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 6 MM 글루타민, 100 U / ML 페니실린, 100 MG / ML streptomycin을 포함하는 Dulbecco의 수정 독수리 매체 (DMEM)를 사용하여 전형적인 문화 매체를 준비합니다.
  2. 구슬의 최종 원하는 농도의 1.17 배에서 알지네이트 원액을 준비합니다.
    1. 먼저 알긴산 염 분말의 적절한 양을 칭량하십시오. 예를 들어, 50:50 LVM 및 MVG 알긴산 염을 함유 한 5 % 알긴산 염의 최종 농도를 얻으려면 0.583g LVM 알긴산 염 분말과 0.583g MVG 알긴산 염 분말을 합하여 총 1.17g 알긴산 나트륨을 계량하십시오.
    2. autoc에 20 mL 공정 완충액 넣기자석 교반 접시에 유리 용기를 넣고 ~ 200 rpm으로 교반하십시오. 이 용액에 sodium alginate powder를 점차적으로 첨가하십시오.
    3. 용액을 저속으로 밤새 저어 준다. 필요한 경우 플라스크를 저어 플레이트에 고정시킵니다.
    4. 용액이 불완전하게 용해 되었다면, 병을 회전식 혼합기에 고정시키고 37 ℃에서 추가로 24 시간 동안 혼합을 계속하십시오.
    5. 절반 만 채워진 용기에서 30 분 동안 용액을 고압 증기 멸균하여 알지네이트 용액을 멸균하십시오. 솔루션을 검색하기 전에 온도가 60 ° C 이하로 떨어지게하십시오.
    6. 필요한 경우, 점도가 충분히 낮게 유지되면서 오토 클레이브 직후에 알지네이트 용액을 실온에 도달하기 전에 여과하여 입자를 제거하십시오.
  3. 내부 겔화에 대한 최종 원하는 농도의 21 배로 탄산 칼슘 현탁액을 준비합니다.
    1. CaCO3 분말의 무게를 잰다. 예를 들어, 광고d g CaCO 3 를 20 mL 공정 완충액으로 옮겨서 최종 겔 화제 농도로서 24 mM CaCO3를 얻는다.
    2. 30 분 동안 CaCO3 서스펜션을 오토 클레이브하십시오.
      참고 : CaCO 3 농도는 중탄산염 - CO 2 평형으로 인해 시간이 지남에 따라 변합니다. 10 캡슐화 절차 이상을 위해 동일한 스톡 CaCO3 서스펜션을 사용하지 마십시오.
  4. 유화 공정에 사용되는 교반 용기를 오토 클레이브합니다. 사용하기 전에 스피너 플라스크에 남아있는 응축수 흔적을 제거하십시오.
  5. 유화 공정 직전에 산성화 된 오일을 준비하십시오. 50 ML 원뿔 튜브에 배치 11 ML 미네랄 오일 당 44 μL 아세트산을 해산.
    참고 : 일반적인 실수는 아세트산의 불완전한 용해입니다. 소량의 아세트산을 피펫 팅하지 않도록하고 아세트산이 반복적으로 볼 텍싱되어 오일에 완전히 용해되도록하십시오.
    주의 : 아세트산은 독성이 있으며 휘발성 산. 이 시약을 흄 후드 아래에서 취급하고 유화 단계까지 아세트산 / 오일 용액을 밀폐 된 용기에 보관하십시오. 자세한 내용은이 시약의 MSDS 정보를 참조하십시오.
  6. 모든 솔루션은 세포 캡슐에 진행하기 전에 실온에 도달 할 수 있습니다.

2. 유화 및 내부 겔화에 의한 알긴산염 비드 생성

  1. 스피너 플라스크에 10 mL의 미네랄 오일을 넣고 낮은 회전 속도 ( 예 : 이 비디오에 사용 된 스피너 플라스크의 경우 250 rpm)에서 교반을 시작하십시오.
  2. 과정에 사용되는 세포가 접착 성 문화의 경우 세포를 정지시키기 위해 트립신을 적용하십시오. FBS 함유 배지 또는 트립신 억제제를 첨가하여 반응을 종결시키고 세포 계수를위한 샘플을 수집한다.
    1. 이전에 설명한대로 hemocytometer 또는 자동 셀 카운터를 사용하여 Trypan 블루 얼룩 후 세포 농도와 생존 능력을 결정ass = "xref"> 32.
  3. 300 XG에서 7 분 동안 세포를 원심 분리하고 세포 고정을위한 원하는 매체에 한번 그들을 씻으십시오. 이 배지에 FBS 나 소 혈청 알부민 (BSA)과 같은 유화제가 포함되어 있는지 확인하십시오. 예를 들어 10 % FBS가 포함 된 DMEM을 사용하십시오.
  4. 구슬에서 원하는 최종 농도의 10.5 배를 얻기 위해 동일한 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁하십시오.
  5. 9.9 mL의 알지네이트 용액에 10.5 배 농축 세포 저장 액 1.1 mL를 넣는다. 그런 다음 550 μL의 CaCO3 현탁액을 첨가하고 CaCO3가 고르게 분포되도록 살균 된 주걱으로 저어 준다.
  6. 즉시 알지네이트, 세포 및 CaCO 3 혼합물 10.5 mL를 주사기를 사용하여 진탕 오일에 옮긴다.
    참고 : 고점도 용액의 경우 공기 방울을 피하기 위해 혼합물을 매우 천천히 흡인하고 배출하십시오. 어떤 경우에는, 플라스크에 혼합물을 첨가하는 동안 교반을 멈추는 것이 바람직하다알지네이트는 임펠러 샤프트에 동반된다.
  7. 알지네이트, 세포 및 CaCO3 혼합물을 오일에 첨가 한 직후에 교반 속도를 증가시킨다.
    참고 : 여기에 사용 된 5 % LVM : MVG 알지네이트의 경우 시험 구내 배양에 적합한 직경 약 900 μm의 구슬을 생성하기 위해 1025 rpm의 회전 속도를가했습니다. 높은 회전 속도와 낮은 알긴산 염 농도는 이전의 출판물 25 , 32 에서 설명한 것처럼 평균 구슬 직경을 줄입니다. 임펠러 및 혈관 기하학의 약간의 변화뿐만 아니라 알긴산 염의 특성은 평균 구슬 직경에 큰 영향을 줄 수 있습니다. 혈관 형상 또는 알기 네이트 로트의 각 변화에 대해, 표면적 모멘트 평균 비드 직경과 회전 속도를 관련시키는 표준 곡선이 생성되어야한다.
  8. 타이머를 시작하고 알지네이트를 12 분 동안 유화시킵니다.
  9. 10 mL의 t그는 오일과 아세트산 용액을 사용하여 에멀젼을 산성화시키고, CaCO3를 용해시켜 알지네이트를 겔화 된 구슬로 물리적으로 가교 결합시킨다. 이 산성화 단계에 8 분을 허용하십시오.

3. 비드 복구

  1. 교반 속도를 400 rpm으로 줄입니다. 10 % 배지와 혼합 된 공정 완충액 40 mL를 첨가하여 pH를 증가시키고 상 전환을 일으킨다.
  2. 1 분 후 교반을 멈추고 혼합물을 50 mL 원심 분리 튜브로 옮긴다. 추가 20 ML 매체와 스피너 플라스크를 씻어 튜브에 추가합니다. 유상과의 비드 접촉을 최소화하기 위해 유상을 흡입하기 전에 스피너 플라스크에서 가능한 한 많은 수성 상을 흡인하십시오.
    참고 :이 단계에서 큰 구경 피펫 ( 예 : 25 mL 피펫)을 사용하고이 시점부터 구슬이 손상되지 않도록하십시오. 소량의 경우, 비드 서스펜션은 절단 된 피펫 팁으로 조작 할 수 있습니다. 팁을 얻으려면 가위로 피펫 팁 끝 부분을 자릅니다.눈 보호 장치를 착용하십시오.
  3. 비드 정착과 상 분리를 촉진하기 위해 630 xg에서 3 분 동안 튜브를 원심 분리하십시오.
  4. 파스퇴르 피펫으로 흡입하여 오일과 과도한 수용액을 제거하십시오.
  5. 매체로 적어도 한 번 비드를 씻으십시오. 40 μm 나일론 셀 스트레이너에서 비드 현탁액을 걸러 내고 스트레이너 아래에서 비드와 관련된 과도한 액체를 흡인하십시오. 멸균 주걱을 사용하여 매체의 알려진 볼륨에 구슬을 전송하십시오.
    참고 : 목표 최소 구슬 직경에 따라이 단계에서 더 작거나 더 큰 기공 크기 필터를 사용할 수 있습니다. 그러나 구슬의 손상을 방지하기 위해 서브 마이크론 기공 크기 필터를 통한 압력 구동 여과보다는 중력 여과가 권장됩니다.
  6. 볼륨 변위 (구슬을 추가 한 후 부피 - 구슬을 추가하기 전에 부피를 뺀 값)로 비드 부피를 측정하고 원하는 구슬 : 총 부피비 (일반적으로 1 : 5) 또는 구슬4 mL 배지. 이 시점부터 구슬이 손상되는 것을 피하기 위해 큰 보어 피펫을 사용하십시오.
  7. 체외 배양이나 이식 실험을 위해 캡슐화 된 세포를 T-flasks로 옮깁니다.

4. 품질 관리 및 응용

참고 : 캡슐화 된 세포 및 비드 품질을 보장하기 위해 프로세스 후의 비드 크기 분포 및 세포 생존을 정량화해야합니다. 추가 분석을 위해 비드 내에서 세포를 회수하기 위해 겔을 역전시키는 것이 일반적으로 수행된다.

  1. 구슬 크기 분포를 평가하기 위해 톨루이딘 블루 오로 염색합니다.
    1. 10 % 완전 배지가 들어있는 4 mL 공정 완충액에 0.5 mL 구슬을 넣습니다.
    2. 프로세스 버퍼에서 준비한 1 g / L 톨루이딘 블루 솔루션 500 μL를 추가합니다.
    3. 50 rpm의 회전 쉐이커 (rotary shaker)에있는 원추형 튜브에서 60 분 동안 인큐베이션한다.
    4. 10 % 완전 배지 및 담금질을 포함하는 5 mL 공정 완충액을 첨가한다비즈 니스 및 용액을 페트리 접시에 옮기고 저배율 현미경 또는 휴대용 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 얻습니다. 필요한 경우 손잡이가 달린 카메라로 이미지를 획득하기 전에 페트리 접시를 밝은 상자에 올려 놓아 대비를 강화하고 그림자를 피하십시오.
    5. 예를 들어 이미지 분석 프리웨어 36을 사용하여 앞서 설명한 32 와 같이 비드 크기 분포를 정량화하기 위해 이미지 분석을 수행하십시오.
  2. 세포 생존을 정 성적으로 평가하기 위해 죽은 세포를 확인하기 위해 ethidium homodimer를 사용하고 살아있는 세포를 확인하기 위해 calcein AM을 사용하여 세포를 염색합니다.
    1. 10 % 완전 배지를 포함하는 4 부피의 공정 완충액에 1 부피의 비드를 첨가한다.
    2. calcein 오전과 에티 디움 homodimer 주식 솔루션의 적절한 금액을 각각 4 μm의와 2 μm의 농도를 얻기 위해 추가합니다. 일부 비드 샘플에 시약 중 하나만 추가하여 단일 얼룩 컨트롤을 생성하십시오.
    3. 20 분 동안 얼음에 구슬을 품어.
    4. 구슬을 압축하지 않도록 O 링과 같은 스페이서를 사용하여 슬라이드와 커버 슬립 사이에 용액을 놓습니다.
    5. 형광 현미경으로 진행합니다. 형광 얼룩을 평가하기 위해 단일 얼룩 조절 장치를 사용하십시오. calcein AM (494/517 nm) 및 DNA에 결합 된 ethidium homodimer (528/617 nm)와 관련된 여기 / 방출 파장을 기반으로 적절한 형광 필터를 선택하십시오.
  3. 추가 분석을 위해 구슬에서 세포를 복구하려면 구연산염이나 다른 chelating 솔루션을 사용하여 알지네이트를 degel.
    1. pH 7.4에서 55 mM 구연산염, 10 mM HEPES 및 95 mM NaCl을 포함하는 증발 용액을 준비한다.
    2. 이 용액을 10 % 배지와 섞은 다음, 혼합물 9 mL에 1 mL 알긴산 염 비즈를 첨가하십시오.
    3. 20 분 동안 75 rpm의 교반으로 얼음 위에서 구슬을 탈기시킨다.
      참고 : 이제 세포를 분석에 사용하거나 degelled alginate solut에서 제거 할 수 있습니다이온. 예를 들어, degener 후 세포 생존 능력은 Trypan 블루 염색법으로 정량화 할 수 있습니다. 또는 세포를 원심 분리하고 세척 한 다음 mRNA, DNA 및 / 또는 단백질 샘플링 및 분석을 수행 할 수 있습니다.

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Representative Results

유화 및 내부 겔화 공정이 끝나면 초기 알긴산염 및 세포 혼합물 부피와 유사한 비드 부피가 회복되어야합니다. 구슬은 결함이 거의없는 구형이어야합니다 ( 그림 3 ). 구슬은 대구경 피펫을 통해 피펫 팅을 견딜 수있을만큼 충분히 강해야합니다. 높은 알긴산 염 농도에서 캡슐화 된 오일 또는 공기 방울이 구슬에서 관찰 될 수 있습니다. 이는 유화 단계 (유성 / 물 / 유성 이중 유제) 동안 알긴산 염료에 오일이 포획되어 발생하기 쉽습니다. 우리의 손에서,이 구슬은 구슬 부피의 작은 부분 (5 % 미만)을 나타 냈고, 구슬 회수 단계에서 오일을 흡입하는 동안이 구슬의 대부분이 제거되었습니다.

그림 3
그림 3 : 유화 및 내부 겔화 공정으로 얻은 캡슐화 된 βTC3 세포를 함유 한 대표적인 5 % 알긴산 염 비즈 5 x 106 개의 βTC3 세포 / mL 비드를 함유 한 5 % 알긴산 염 비즈의 위상차 이미지. 큰 사이즈로 보려면 여기를 클릭하십시오 . 이 그림의 버전.

얻어진 구슬의 크기는 균일하지 않을 것입니다 - 이것은 교반 된 유화액의 본질적인 특징입니다 ( 그림 4A ). 난류 유동에서의 유화 중, 압력 변동은 액적 ( 37 , 38) 을 파괴 시키며, 분산 된 상태에서 표면 장력과 점성력을 상쇄시킨다. 점성 세력은 분산상의 점도가 th의 점도보다 훨씬 높으면 무시할 수 없다.e 연속 단계. 최대 국소 에너지 소산 율이 용기의 평균 에너지 소산 율에 비례한다고 가정하면, 최대 안정 소적 직경 dmax (Kolmogorov 스케일보다 >>)는 다음과 같이 계산 될 수있다. 39 , 40 , 41 , 42
방정식 1
여기서 ρc 는 연속 상의 밀도, ε 는 용기의 평균 에너지 소산 률, σ 는 두 유체 간의 계면 장력, μd 는 분산상의 점도, C 는 비례 상수이다. 표면 장력이 점성 힘보다 우세하면 오른쪽은 C로 단순화되지만 점성 힘이 우세하면 다음과 같이 단순화됩니다.

교반 된 용기에서 난류 유동 계급에서 입력되는 에너지는 단위 부피당 투입량, N i 3 D i 2에 비례합니다. 여기서 N i 는 교반 속도이고 D i 는 임펠러 직경입니다. 따라서 식 1과 결합되고 상수 D i가 주어지면 표면 장력이 우세 할 경우 d maxN i -1.2 ( 그림 4B )에 비례 할 것으로 예측되지만 N i -0.75에 비례합니다. 구슬은 주요 유지력으로 우세합니다. 도 4b4c 는 계면 효과가 d로트 크기는 낮은 알긴산 염 농도를 나타내지 만 점성력은 높은 알긴산 염 농도 ( 예 : 표 3에 나온 알긴산 염 # 3의 경우 5 %)에서 더 지배적입니다. 실험적으로 dmax를 결정하는 것은 비현실적이므로, 일반적으로 dmax43에 비례하므로 직경 또는 표면적 모멘트 평균 직경 (d32)의 높은 분위 값 ( 예 : 95 분위수)이 대신 사용되었습니다.

셀을 캡슐화하기 전에 N 의 함수 인 d 32 의 곡선을 생성하는 것이 좋습니다 ( 그림 4B ). 이 커브는 원하는 평균 구슬 크기를 얻기 위해 적절한 N i 를 선택하는 데 도움이됩니다. 새로운 표준 곡선은 오일 또는 알긴산 염의 다른 배치에 대해 요구되거나, 알긴산 염 농도가변환이 수정됩니다. 혈관 기하 구조 및 알긴산 염 농도에 따라 비교적 넓은 범위의 평균 구슬 직경을 얻을 수 있어야합니다. 예를 들어 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 2 % (Hoesli 32 에서 그림 2C )에서 5 % 알지네이트 ( 그림 4 )를 사용하여 200 μm와> 1 mm 사이의 d 32 값을 얻을 수 있습니다.

그림 4
그림 4 : 구슬 크기 분포. ( A ) 톨루이딘 블루 O 염색 된 5 % 알긴산 염 비즈. 알긴산 염 # 1 및 # 2의 50:50 혼합물을 사용하여 1.5 % 및 5 % 알긴산 염 비즈에 대한 교반 속도 ( N i )의 함수로서 ( B ) d 32 를 결정 하였다 (표 2 참조). 5 % algi에 대한 단일 포인트가 표시됩니다.네드 구슬. ( C ) d 32 는 2 % 및 5 % 알긴산 염 # 3에 대한 N i 의 함수로 나타낼 수있다 (표 2 참조). 에러 막대는 샘플 (N> 150 비드) 내의 비드 크기의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유화 및 내부 겔화 공정으로부터의 세포 생존은 주로 세포가 겪는 pH 강하의 범위 및 기간에 의존한다. 이 비디오에 설명 된 과정을 사용하여 76 ± 2 % βTC3 세포 생존이 측정되었습니다 31 . 알지네이트 시딩 밀도 10 7 세포 / ML에 10 5 세포 / ML 알지네이트에 분산 세포를 캡슐 때, 모든 구슬은 세포를 포함해야합니다. 췌장 세포와 같은 세포 클러스터를 캡슐화 할 때, 구슬의 일부가 비워 질 수 있습니다와이. 그림 5 는이 프로세스를 사용하여 얻은 전형적인 라이브 세포 / 죽은 세포 얼룩 결과를 보여줍니다. 프로세스 버퍼 용량을 증가시키고 산성화 단계의 지속 기간을 감소시킴으로써보다 높은 세포 생존을 달성 할 수있다. 예를 들어, 90 ± 2 % MIN6 세포 생존은 프로세스 버퍼로 60mM MOPS (3- (N- 모르 폴리 노) 프로판 술폰산)를 사용하고 전체 공정 시간을 4 분 32 로 감소시킴으로써 이루어졌습니다. 그러나 생성 된 비드는 낮은 pH 31 에서 방출 된 Ca 2+ 양의 증가로 인해 60 mM MOPS 공정 완충액보다 10 mM HEPES 공정 완충액에서 유의하게 강했다. 짧은 MOPS 과정과 긴 HEPES 과정 모두 체외 배양 또는 이식 에서 > 2 주간 충분히 안정한 구슬을 생성해야합니다. 그러나, 낮은 칼슘 또는 높은 킬 레이터 농도를 갖는 용액에서 비드가 완전히 팽윤되거나 감겨있을 수있다 (예를 들어,, 칼슘이없는 인산염 완충 식염수).

체외 에서 성장 캡슐 MIN6 세포 들어, 가시 세포 응집체 체외 고정화 세포 확장 ~ 5 ~ 7 일 후에 형성하고 ~ 150 μm의 직경 spheroids는 2 주 후에 수확 수 있습니다. 알지네이트 고정화 세포의 성장 속도는 고정화되지 않은 배양액, 특히 알긴산 염 농도가 높은 겔론 산 함량이 높은 겔의 경우보다 낮을 것으로 예상된다.

그림 5
그림 5 : 프로세스 직후의 캡슐화 된 셀 ( A ) 살아있는 세포 (녹색, calcein 오전)와 죽은 세포 (적색, ethidium homodimer) 캡슐 세포의 얼룩. ( B ) 동일한 구슬의 위상차 이미지. MIN6 세포는 2 %12 분 유화, 8 분 산성화 및이 프로토콜에 설명 된대로 10 MM HEPES 버퍼를 사용하여 알지네이트 구슬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

내부 겔화 반응 동안 다양한 단계 ( 그림 2 )가 전체 반응 속도를 제한 할 수 있습니다. ~ 2.5 μm보다 큰 탄산 칼슘 입자의 경우, 탄산염 용해 속도는 속도 제한 26 , 44 로 나타났습니다. 내부 칼슘 방출을 유도하는 산성화 단계는 또한 세포 생존에 영향을 미치는 중요한 공정 변수로도 나타났습니다 32 . 따라서 내부 겔화를 유발하는 조건은 세포 생존뿐만 ​​아니라 비드 품질에도 중요합니다. 비드에 대한 최종 적용에 따라, 상이한 최적 공정 조건이 선택 될 수있다. 예를 들어, 높은 pH 강하 ( 예 : 알지네이트 용액을 완충시키는 10 mM HEPES 사용)는 구슬의 장기간 안정성이 중요한 이식 용도에 바람직합니다. 다른 한편, 더 낮은 pH 강하 ( 예 : 60 mM MOPS를 사용하여 buffe알지네이트 용액)은 시험 관내 적용에 바람직 할 수있다.

산성화의 수준과 지속 기간을 조정하는 것 외에도 다른 공정 수정이 계획 될 수 있습니다. 예를 들어, 다른 교반 용기 구성, 알긴산 염 농도, 공정 완충액, 유기 상 및 산성 화제가 사용될 수있다. 이전에 논의 된 바와 같이, 평균 구슬 크기는 유화 단계 중에 교반 속도를 변경하여 쉽게 조정할 수 있습니다. 또한 유화 시간이 길수록 구슬 크기가 작아 지지만 세포 생존력이 떨어질 수 있습니다. Poncelet et al. 25 , 26 , 45 및 Hoesli et al. 31 , 32 는 이러한 옵션 중 일부를 테스트하고 논의했습니다.

위에서 설명한 프로토콜의 약간의 변경은비드 생성, 비드 품질 및 세포 생존. 표 1 은 발생할 수있는 문제를 이해하고 해결하기위한 문제 해결 안내서를 제공합니다.

문제 일반적인 원인 제안 된 솔루션
임펠러는 알지네이트 또는 산 오일 첨가 중에 회전을 멈 춥니 다. 자기장이 적절한 혼합을 위해 불충분하거나 임펠러 샤프트가 잘못 정렬 됨 스피너 플라스크가 자성 판에 중심이 잘 맞는지 확인하고 알긴산 염 혼합물을 첨가하기 전에 최적의 위치에 판에 테이프로 고정하십시오. 매우 높은 교반 속도를 시험 한 다음 알긴산 혼합물을 첨가하기 전에 원하는 교반 속도로 줄입니다.
임펠러 샤프트가 잘 정렬되고 안정적인지 확인하십시오. 벨lco 스피너 플라스크의 경우, 스피너 플라스크 캡 양쪽의 볼트로 임펠러가 제 위치에 단단히 고정되었는지 확인하십시오. 임펠러의 움직임이 반경 방향으로 제한되어 있는지 확인하십시오 (임펠러가 샤프트에서 흔들리지 않아야 함).
구슬이 없습니다. 알지네이트가 부적절하게 유화되었다. 유화 중 알지네이트 미세 방울이 보이는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우, 유상 밀도 및 용기 형상 23 이이 프로토콜에서 설명한 것과 유사한지 확인하십시오. 충분한 국소 에너지 소산을 제공하지 않는 조밀 한 오일 상 또는 혈관 기하 구조는 적절한 알긴산 염 유화를 허용하지 않을 수있다.
구슬이 없습니다. 내부 겔화가 발생하지 않았다. 흔히있는 실수는 오일 단계에서 아세트산의 불완전한 용해입니다. 산성 오일 혼합물이 충분히 vortex되고 아세트산이 관찰되지 않도록주의한다.튜브의 바닥.
임펠러가 오일에 도달하지 않으면 알지네이트를 첨가하기 전에 더 많은 오일을 첨가 할 수 있습니다. 그러나 아세트산의 양은 다음 식에 따라 조정해야한다.
방정식 3
어디에 등식 4 1은 변형 전의 오일 / 물 비율 비이다 (예 : 10mL 오일 + 10mL 산 오일 중 10.5mL 알긴산 염의 경우 0.525). 등식 4 2는 프로토콜을 수정 한 후의 오일 / 물 위상 비이고, Dow는 두 단계 간의 아세트산 분배 계수이다. 이 분배 계수는 실험적으로 측정되거나 문헌에서 취한 값으로 근사화 될 수 있습니다. 예를 들어, 헵탄과 물 사이의 아세트산 분배 계수는 46 이다.
비드 없음또는 구슬이 기계적으로 불안정한 경우 알지네이트 용액의 제로 - 전단 점도는 0.004 Pa · s 이하 또는 112 Pa · s 초과이다. 알기 네이트 롯트의 배치 - 배치 다양성이 높기 때문에 알긴산 염 용액의 여러 농도의 점도를 측정하는 것이 좋습니다. 고점도 배치와 저점도 배치의 조합은 목표 점도에 도달하는 데 필요할 수 있습니다. 여기에 사용 된 5 % LVM 및 MVG 혼합물의 제로 전단 점도는 3.3 Pa · s이다. guluronic acid 블록 길이가 너무 짧거나 전체 사슬 길이가 짧은 알기 네이트는 겔 형성을 허용하지 않을 수 있음에 유의해야한다.
비즈가 너무 크거나 너무 작습니다. 유화 중 교반 속도가 너무 낮거나 너무 높기 때문에 사용 된 알긴산 염의 농도 나 점도가 너무 높습니다. 교반 속도를 높이거나 배플을 추가하여 난기류를 증가 시키면 비드 크기가 감소합니다. 알지네이트 농도, 온도이펙트, 용기 및 임펠러 형상 모두가 얻어진 비드 크기에 영향을 미친다.
깨진 구슬이 많이 관찰됩니다. 가혹한 비드 취급, 내부 겔화 단계 중 손상 또는 불충분 한 비드 강도. 비드에 기계적 손상은 내부 겔화가 시작되면 비드 파열로 이어질 수 있습니다. 산성화 단계 직전에 교반 속도를 줄이고 25 ML 피펫이나 절단 팁과 함께 1000 μL pipettes를 사용하여 부드럽게 처리되었는지 확인하십시오. 조심스럽게 취급하고 산성화 동안 교반을 줄여도 손상된 비드가 관찰되면 비드 강도가 부적절 할 수 있습니다. 이것은 불충분 한 guluronic acid 함량 또는 불완전한 gelling (예, 불충분 한 산성화) 때문일 수 있습니다.
낮은 세포 생존력 초기 공정 pH가 너무 높거나 최종 pH가 너무 낮음 포유류 세포 과정 생존은 pH 강하 및 산성화 시간을 제한함으로써 증가 될 수있다
작은 구슬에서 낮은 세포 생존력 불충분 한 알지네이트 용액 완충 능력 더 큰 pH 드롭은 큰 비드보다 작은 비드에서 이러한 비드의 더 큰 표면 / 부피 비율로 인해 예상됩니다. 에멀젼에 첨가 된 아세트산은 제한적이기 때문에, 더 높은 아세트산 농도는 동일한 CaCO3 농도에 대한 더 작은 비드에서 예측된다. 알지네이트 솔루션 버퍼링 용량 (예 : 10 MM HEPES 대신 60 MM MOPS를 사용)을 늘리면 작은 구슬 32 의 세포 생존율을 높일 수 있습니다. 셀 손실이 큰 작은 구슬은 큰 부피 손실을 발생시키지 않고 여과 또는 침전에 의해 선택적으로 제거 될 수 있습니다.
나는CaCO3 용해를 완료 불충분 한 산성화 또는 산성화 시간. 비드 안정성이 충분하다면이 문제는 문제가되지 않을 수도 있습니다. 불완전한 CaCO 3 용해는이 프로토콜 32 다음 큰 비드에서 관찰되었습니다. CaCO3의 용해 정도는 CaCO3 결정립 크기, 공정 중의 pH 강하, pH 강하 지속 시간 및 사용 된 알긴산 염 농도에 따라 달라질 수있다. 이 문제는 비드 기계적 안정성이 원하는 응용 분야에 충분하면 문제가되는 것으로 간주되지 않습니다. 비드 가교 결합을 증가 시키려면 CaCO3 입자가 충분히 작아야합니다 (~ 2.5 μm). CaCO3 현탁액을 초음파 처리하면 응집 된 입자를 파괴 할 수 있습니다 26 . 매우 낮은 또는 높은 알긴산 염 농도에서 CaCO3 농도의 조정이 필요할 수 있습니다. 마지막으로, 낮은 수준의 킬레이트 또는 용액2가 이온의 수준은 겔에서 Ca 2+ 의 점진적 손실을 초래할 것이다. 비드의 기계적 안정성이 점차 감소하는 경우, 비드 보관 또는 배양 완충액에> 2 mM Ca 2+ 가 포함되어 있는지 확인하십시오.

표 1 : 문제 해결 가이드. 문제, 예상 원인 및 잠재적 솔루션 목록.

포유류 세포의 시험 관내 배양 및 이식 응용을위한 유화 및 내부 겔화 공정의 잠재적 한계는 (1) 낮은 pH에 일시적으로 노출 될 필요성, (2) 잔유를 제거 할 필요성, (3) 다 분산 비드 크기 (4) 알지네이트 물방울 형성 ​​동안의 잠재적 전단 응력 및 (5) 외부 겔화 비드와 비교하여 내부 겔화 비드의 높은 다공성.

높은 세포 생존과 MIN6 및 βTC3의 기능이 획득되었습니다프로세스 최적화 후 32 . 그러나,이 과정은 더 많은 pH 민감성 세포에는 적합하지 않을 수 있습니다. 구슬에서 오일을 완전히 제거하는 것은 어려울 수 있으며 식품 의약품 안전청 (FDA)에서 승인 한 오일 유형이 최종 임상 적용에 필요합니다. 다 분산 된 비드 크기 분포는 완전한 세포 캡슐화 및 장기 세포 생존이 바람직한 면역 분리 응용 분야에 다소 문제가 될 수 있습니다. 작은 비드 크기가 세포 돌출부 48로 이어질 수있는 반면 큰 비드는 영양분 확산 및 / 또는 세포 기능을 방해 할 수 있습니다 35 , 49 . 다른 한편, 유화 공정은 단일 공정에서 작고 큰 비드를 생성함으로써 이식 후 세포 생존에 대한 비드 크기의 효과를 조사 할 수있는 흥미로운 기회를 제공합니다. 평균 비드 크기는 교반 속도 durin을 수정하여 쉽게 조정할 수 있습니다유화 단계 ( 그림 4 ). 마지막으로, 내부 겔화 된 비드의 높은 다공성은 또한 항체 및 사이토 카인과 같은 분자가 비드로부터 배제되어야하는 면역 단리에 유해 할 수있다. 그러나, 유화 공정은 또한 매우 농축 된 알기 네이트 용액으로부터의 비드 생성을 허용하여 알긴산 염 비드 공극 크기를 감소시킨다.

유화 및 내부 겔화 공정은 셀 캡슐화를 확대하거나 캡슐화기에 대한 액세스가 부족한 실험실을위한 노즐 기반 캡슐에 대한 흥미로운 대안입니다. 이 과정은 매우 희석되거나 매우 농축 된 알긴산 용액을 사용하여 알지네이트 비드에 세포를 고정시키는 강력하고 간단한 방법입니다. 고정화 된 세포로 수행 할 수있는 후속 실험의 일부는 세포 운명 결정에 대한 알지네이트 매트릭스의 효과를 결정하거나, 비드가 이식간에 어느 정도의 장벽을 제공 하는지를 결정하는 것이다d 세포 및 숙주 면역계에 영향을 미친다. 유화 및 내부 겔화 방법은 일차 섬을 큰 배치로 캡슐화하는 새로운 접근법을 제공합니다. 이 방법은 또한 다공성을 감소시켜 캡슐화 된 세포에 대한 항체 접근을 감소시킨 고도로 농축 된 알긴산 염 비즈에서의 세포 캡슐화를 가능하게한다. 따라서, 유화 및 내부 겔화 방법은 임상 적으로 관련된 양의 캡슐화 된 치료 용 세포를 생성하는 새로운 수단을 제공한다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

유화 공정에 대한 그녀의 토양 개발에 대한 질 오스본 (Jill Osborne)과 기술 지원에 대한 로렌 윌킨슨 (Lauren Wilkinson)에게 감사드립니다. Igor Laçik, Timothy J. Kieffer 박사 및 James D. Johnson 선생님의 의견과 협조에 감사드립니다. Diabète Québec, JDRF, ThéCell, 센터 연구 센터 (CQMF), 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC), 인간 섬 이식 및 베타 세포 재생 센터, 캐나다 줄기 세포 네트워크, 마이클 스미스 보건 연구 재단, 자금 지원에 대한 비용 및 비용 865

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and consumables
LVM alginate (transplantation-grade) Novamatrix Non-applicable Referred to as "alginate #1" in the results.
MVG alginate (transplantation-grade) Novamatrix Non-applicable Referred to as "alginate #2" in the results.
Alginate (cell culture-grade) Sigma A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity) A2033 is referred to as "alginate #3" in the results.
DMEM Life Technologies 11995-065
Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin Thermo Fisher Scientific SH3039603
Glutamine Life Technologies 25030
Penicillin and streptomycin Sigma P4333-100ML
HEPES, cell culture tested Sigma H4034-100G
NaCl Thermo Fisher Scientific S271-1
Fine-grain CaCO3 Avantor Materials 1301-01 After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.
Light mineral oil Thermo Fisher Scientific O121-4 Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use.
Glacial acetic acid Thermo Fisher Scientific A38-500 Handle with caution: refer to MSDS.
Sterile spatulas Sigma CLS3004-100EA
Sterile nylon cell strainers, 40 µm Thermo Fisher Scientific 08-771-1
Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) Sarstedt 86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001
Pasteur pipettes VWR 14673-043
Toluidine Blue-O Sigma T3260
Equipment
100 mL microcarrier spinner flasks Bellco 1965-00100 The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.
Magnetic stir plate with adjustable speed Bellco 7760-06005 The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.
Cell counter Innovatis Cedex AS20 This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.
LED light box Artograph LightPad® PRO This item can be replaced by other types of illuminators.
Handheld camera Canon PowerShot A590 IS A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.
Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters Olympus IX81 Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.
Image aquisition software Molecular Devices Metamorph A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.
Image analysis freeware CellProfiler Non-applicable A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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