자기 공명 영상을 이용한 실험용 뇌 말라리아 모델에서의 부종 발달 및 미세 혈관 병리학 적 추적

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Hoffmann, A., Helluy, X., Fischer, M., Mueller, A. K., Heiland, S., Pham, M., Bendszus, M., Pfeil, J. In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (124), e55334, doi:10.3791/55334 (2017).

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Abstract

Introduction

말라리아는 전 세계적으로 심각한 건강 문제입니다. 중증 말라리아는 부분적으로 뇌의 침범으로 특징 지어지며 흔히 예후가 나쁜 요인입니다. 대뇌 침범은 말라리아 전염이 심한 지역에서 5 세 미만의 어린이에게 흔히 발생하며 그 연령대에서 말라리아 관련 사망의 주요 원인을 나타냅니다. 공격적인 치료가 생명을 구할 수 있지만 특히 초기 단계의 뇌 말라리아의 검출은 어려울 수 있습니다. 뇌 말라리아와 관련된 병리학 적 과정은 심한 뇌의 부종으로 이어질 수있는 미세 혈관 파괴 및 뇌부종을 포함합니다. 이 기사에서는 실험적 대뇌 말라리아 (ECM)의 전체 뇌 생체 내 이미징을 허용하는 자기 공명 영상 (MRI) 프로토콜을 제시합니다. ECM이 중앙에서 어떻게 시작되는지에 대해서는 거의 알려지지 않았지만 전체 뇌 고해상도 이미징 방법은이 질병에서 널리 활용되지 못했습니다.신경계 또는 어떤 메커니즘이이 질병을 일으키는 지 확인하십시오. 생체 내 (in vivo) MRI는 전뇌를 포괄하며 ECM 병리를 더 잘 이해할 수있는 중요한 연구 도구입니다. MRI는 세계적 뇌 뇌 팽창을 평가할 수 있는데, 이는 최근 ECM뿐만 아니라 인간 대뇌 말라리아에서 중요한 사망 예측 인자로 인식되고 있습니다. 심한 뇌의 부종은 치명적인 질병에서 발생하며 ECM 모델과 인간 질병 (염증성 및 미세 혈관계 변화가 특징 인 질환) 사이의 여러 병리학 적 특징 중 하나를 나타냅니다. 4

치명적인 Plasmodium berghei ANKA 감염에 의해 CBA 또는 C57BL 생쥐에서 ECM을 유도 할 수 있습니다 . ECM의 발병은 전형적으로 감염 후 6 일에서 10 일 사이에 발생하며 피팅, 운동 장애, 호흡 곤란 및 혼수 상태를 초래하여 랩이드의 죽음. Rapid Murine Coma and Behavior Scale (RMCBS)은 ECM의 임상 증상을 평가하는데 도움이되는 점수입니다. 그것은 0에서 2까지 점수가 매겨진 10 개의 매개 변수로 구성되며 가능한 최대 점수는 20입니다. 6 최근에 ECM 마우스의 RMCBS 점수와 MRI로 입증 된 병리학 적 변화의 정도간에 좋은 일치를 보였습니다. 7 이 프로토콜에서 우리는 생쥐의 ECM 유도와 ECM이있는 마우스의 생체 내 자기 공명 영상을 설명합니다.

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Protocol

이 논문에서보고 된 모든 동물 실험은 실험 동물 학회 연맹 (FELASA) 카테고리 B 및 실험실 동물 과학 학회 (GV-SOLAS) 표준 지침에 따라 수행되었으며 카를 스루에 지역 독일 당국 (Regierungspräsidium Karlsruhe)의 승인을 받았습니다 , 독일). biosavety 레벨 2 모기 및 Plasmodium berghei ANKA sporozoite 작품에 적용됩니다.

1. 감염

  1. 해리 동물 에 15 분 동안 먹이를 줌으로써 Anopheles가 Plasmodium berghei ANKA로 모기를 감염 시킵니다 . 감염된 모기를 80 % 습도 및 21 ° C에 보관하십시오.
  2. 혈액 제 식사 후 17 일에서 22 일 사이에 우리 모기를 모돈에서 모으십시오. 그들을 마취하기 위해 얼음에 올려 놓으십시오.
  3. 포 셉를 사용하여 차가운 RPMI 매체 한 방울로 덮여 유리 슬라이드에 3-4 모기를 놓습니다. 현미경으로 슬라이드를 놓습니다.
  4. <포셉을 사용하여 모기를 머리와 몸 사이에 조심스럽게 펴십시오. 주사기와 바늘을 사용하여 침샘을 분리합니다. 나머지 모기와 함께이 과정을 반복하십시오.
  5. 유리 피펫으로 그들을 빨아하여 유리 슬라이드에서 타액 땀샘을 ​​수집하고 1.5 ML 원심 튜브에 그들을 수집합니다.
    참고 : 감염률에 따라 일반적으로 타액선 당 8,000 ~ 15,000 개의 감염성 포자 소체를 얻을 수 있습니다.
  6. 약 3 분 동안 원심 분리 튜브 내에 격리 된 타액선을 작은 플라스틱 스틱으로 박살 내고 침샘 조직에서 포자 소이 트를 분리합니다.
  7. 1,000 xg 및 4 ° C에서 3 분간 원심 분리하여 나머지 조직에서 포자 소체를 정제하십시오.
  8. sporozoites (SPZ)가 들어있는 상등액을 새로운 원심 튜브에 피펫을 넣고 Neubauer hemocytometer에서 정균 된 스포르 소 사이트를 센다.
  9. ph를 첨가하여 정제 sporozoites의 농도를 10,000 / mL로 조정osphate-buffered saline.
  10. 감염을 시작하기 위해 근친 교배 C57BL / 6 마우스의 꼬리 정맥에 총 1,000 개의 스포 로조 사이트 (0.1 mL)를 주입하십시오. 주사를 촉진하기 위해 C57BL / 6 마우스를 제지 장치에 넣고 꼬리를 따뜻한 (약 37 ° C) 물에 넣고 꼬리 정맥의 시각화를 돕습니다.
    참고 : 주사 자체는 몇 초 내에 수행 할 수있는 짧은 절차입니다.
  11. 1 일 1 회, SPZ 감염 후 3 일째부터 혈액 도말 기생충 혈증을 확인하십시오.
    참고 : Parasitemia 모니터링은 이전에 Mueller et al. 의 JoVE 기사에서 시각화되었습니다 . 8
  12. Sporozoite 주입 후 5 일째부터 Rapid Murine Coma and Behavior Scale (RMCBS) 점수로 하루에 한 번씩 마우스를 평가하십시오.
    참고 : 비디오 데모를 포함하여이 절차에 대한 자세한 설명은 Caroll 이 게시 했습니다. 6
  13. 평가RMCBS 점수 및 연구 과제에 따라 MRI 영상을 가진 마우스. 6

2. 자기 공명 영상 설정

  1. 무선 주파수 전송 용 볼륨 공진기와 4 채널 위상 배열 수신기 코일을 사용하여 9.4T 소형 동물 스캐너에서 MRI를 수행하십시오. 마우스의 체온을 유지하기 위해 온도 조절 수 욕조를 42 ° C로 설정하십시오.
  2. 쥐가 발가락에 더 이상 반응하지 않을 때까지 2 % 이소 플루 란과 압축 공기를 사용하여 챔버에서 마취를 유도하십시오. 마취를 1-1.5 %로 유지하십시오.
  3. 꼬리 정맥 카테터를 마우스의 꼬리 정맥에 삽입하십시오. 헤드 모션을 최소화하기 위해 머리 잠금 장치와 치아 바가 장착 된 동물 침대에 엎드린 자세로 놓고 MRI 용 마우스를 놓습니다. 쥐의 경추를 곧게 펴지 않도록주의하십시오.
  4. 꼬리 정맥 카테터에 조영제 분사 시스템 연결. Gd-DTPA (0.3 mmol / kg) 주사기로 채워진 주문형 주입 시스템을 사용하거나 Gd-DTPA (0.3 mmol / kg) 주사기에 연결된 PE 튜브를 사용하십시오.
  5. 양쪽 눈에 dexpanthenol 안 연고제를 바르십시오. 4 채널 위상 배열 수신기 헤드 코일을 마우스 헤드에 놓습니다. 호흡 패드를 마우스 뒤쪽에 놓고 호흡 모니터링 장치에 연결하십시오.

3. 이미징 프로토콜

참고 : 해결해야 할 연구 과제에 따라 아래 나열된 프로토콜에서 이미징 시퀀스를 선택하십시오. 나열된 모든 매개 변수는 MRI 소프트웨어에서 유효하지만 다른 소프트웨어 프로그램을 사용하는 경우 조정해야 할 수도 있습니다.

  1. 마우스 두뇌가 자석의 아이소 센터에 있는지 확인하기 위해 지역화 검사를 수행하여 시작하십시오.
  2. vasogenic 부종을 정 성적으로 평가하려면 다중 슬라이스 RARE 시퀀스를 선택하여 3D T2 강조 이미징을 사용하십시오.
    1. 다음 파일을 입력하십시오반복 시간 = 2.000 ms, 반향 시간 = 22 ms, 등방 해상도 = 0.1 mm, 시야 = 20 x 10 x 12 mm 3 ; 매트릭스 = 200 x 100 x 120, 플립 각도 = 90-180 °; (스핀 - 에코), 드문 팩터 = 8. 시퀀스를 시작하고 10 분 48 초 동안 기다린 후 원시 이미지를 얻습니다.
  3. vasogenic 부종을 정량적으로 평가하기 위해서는 다중 슬라이스, 다중 스핀 에코 시퀀스를 선택하여 T2 relaxometry를 수행하십시오.
    1. 반복 시간 = 3.100 ms, 에코 시간 = 8-136 ms, 8 ms 간격으로, 슬라이스 수 = 17, 슬라이스 두께 = 0.7 mm, 평면 해상도 = 0.116 mm x 0.116 mm, 시야 20 x 20 mm 2 , 매트릭스 = 172 x 172, 플립 각도 = 90-180도; (스핀 - 에코). 시퀀스를 시작하고 원시 이미지를 얻기 위해 8 분 53 초 동안 기다리십시오.
  4. vasogenic 부종과 세포 독성 부종을 정량적으로 평가하기 위해 확산 가중 영상 / 겉보기 확산 계수스핀 에코 EPI 확산 시퀀스를 선택하여 ADC (signal-finite) ADC 매핑.
    1. 반복 시간 = 3.400 ms, 에코 시간 = 20 ms, 슬라이스 두께 = 0.7 mm, 슬라이스 수 = 17, 확산 감응 방향의 수 = 30, b 값 = 1.500 s / mm2, δ = 3 ms , Δ = 9 ms, 부분 푸리에 인코딩 가속 계수 = 1.51, 시야 = 12 x 15 mm2, 매트릭스 = 96 x 128, 평면 해상도 = 0.125 mm x 0.117 mm, 플립 각 = 90-180도 및 포화 슬라이스 (sagittal)의 수 = 1. 시퀀스를 시작하고 원시 이미지가 획득 될 때까지 7 분 56 초 동안 기다리십시오.
  5. 미세 출혈을 평가하려면 3D T2 * 가중 이미징을 사용하십시오. 유량 보정 플래시 순서를 선택하십시오.
    1. MRI 소프트웨어에 반복 시간 = 2.000 ms, 에코 시간 = 22 ms, 등방 해상도 0.08 mm, 시야 = 32 x 15 x 8 mm 3 , 매트릭스 크기 = 400 x 188 x 100 및 f립 각도 = 12도. 시퀀스를 시작하고 원시 이미지를 얻기 위해 15 분 40 초 동안 기다리십시오.
  6. 동맥 개존 성을 평가하려면 3D FLASH 시퀀스를 선택하여 비행 관 혈관 조영술 시간을 사용하십시오.
    1. MRI 소프트웨어에서 반복 시간 = 16 ms, 에코 시간 = 3.5 ms, 슬라이스 두께 = 0.07 mm, 평면 내 해상도 = 0.104 x 0.104 mm, 시야 = 20 x 20 x 10 mm 3 , 매트릭스 = 192 × 192 × 142, 및 플립 각도 = 15도이다. 시퀀스를 시작하고 이미지가 획득 될 때까지 7 분 16 초 동안 기다리십시오.
  7. 혈액 - 뇌 장벽 파괴를 평가하려면 0.3 mmol / kg의 조영제 주입 전후에 3D T1 강조 영상을 사용하십시오. 전역 라디오 주파수 여기와 함께 라디오 주파수 버릇이없는 플래시 시퀀스를 선택하십시오.
    1. MRI 소프트웨어에서 다음 시퀀스 파라미터를 사용하십시오 : 반복 시간 = 5 ms, 반향 시간 = 1.9 ms, 등방 해상도 = 0.156 mm, 시야 20 x 18.7x 18.7 mm 3 , 행렬 128 x 120 x 120 및 플립 각 = 8.5 °. 시퀀스를 시작하고 이미지가 획득 될 때까지 1 분 14 초 기다립니다.

4. 이미지 처리 및 분석

  1. 혈액 뇌 장벽 파괴를 분석하기 위해 ImageJ의 산술 도구 또는 이미지 계산기 도구를 사용하여 향상된 T1 강조 이미지에서 3D 비 강화 T1 가중 이미지를 뺍니다. 혈액 뇌 장벽 파괴에 해당하는 신호 증가에 대한 빼기 이미지를 평가하십시오. 9
  2. 뇌의 부피를 분석하려면 기본 3D T1 또는 3D T2 가중치 데이터 세트를 사용하십시오. 세분화 편집기를 사용하여 후각 구배에서 소뇌로 뇌를 윤곽을 그립니다. 10
  3. 혈관성 부종
    1. T2 relaxometry 데이터를 MRI 소프트웨어로 처리하거나 비선형 최소 자승 적합 절차를 사용하십시오. 11 MRI sof를 사용하여 ADC 맵을 얻기 위해 확산 가중치 데이터 처리tware 또는 FDT 도구 상자 ( 재료 표 참조).
    2. 관심 영역을 다른 해부학 적 영역에 수동으로 배치하십시오.
      참고 : 중요한 뇌의 부종으로 인해 관심 부위의 자동 배치가 잘못 등록 될 수 있습니다. 선택된 해부학 적 영역의 T2 시간 및 ADC 값이 이러한 방식으로 얻어진다.
  4. 미세 출혈량을 분석하려면 세분화 편집기를 사용하여 T2 * 가중치 데이터 집합에 난상, 어두운 초점으로 나타나는 미세 출혈을 묘사하십시오.

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Representative Results

C57BL / 6 마우스에서 P. berghei ANKA 스포르 조제 감염 후 6 일에서 10 일 사이에 ECM의 첫 임상 증상이 관찰 될 수 있습니다. ECM은 감염된 마우스의 60 ~ 80 %에서 발병하며 24 ~ 48 시간 내에 빠르게 혼수 상태 및 사망으로 진행됩니다. 반대로, ECM이 발생하지 않는 마우스는 과증식으로 인해 심한 빈혈로 감염 후 2 주 후에 사망합니다. 12

MRI 이미징에서 ECM의 가장 초기 신호는 마우스의 후각 조직에 속하며 뇌의 사타구니 부분에 위치한 후각 구에서 볼 수 있습니다. (T2- 가중 영상, T2 이완도 및 확산 가중 영상에서의 T2 신호의 증가)는 초기의 혈관성 부종을 시사한다.질병의 중증도가 증가함에 따라 가벼운 질병 (RMCBS 점수 20-16)에 이미 존재하는 후각 구근에서 퍼지기 시작합니다. 상대적 T1 신호 이미지는 미묘한 혈액 뇌 장벽 파괴를 감지하는 데 도움이됩니다 ( 그림 1 ). 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 혈관 부종이 특정 방식으로 진행됩니다. 이러한 병리학 적 변화는 매우 심각한 질병 (RMCBS 아픔 9-0)에 도달 한 뇌간으로의 신경 모세포 이동 경로 인 주먹 철새 흐름을 따라 퍼졌습니다. T2 맵에서, 혈관성 부종의 심각성은 그림 2 에서 보여 지듯이 특정 해부학 적 영역으로 관심 부위를 끌어 냄으로써 정량화 할 수 있습니다. 각 영역에 대해 부종이 증가함에 따라 증가하는 T2 완화 시간을 얻을 수 있습니다. 혈관 형성 부종 및 혈액 - 뇌 장벽 파괴와 함께 ECM의 중증도가 증가함에 따라 뇌 팽창이 시작됩니다. 부종을 나타내는 뇌량은 중등도의 아픈 생쥐에서 유의하게 증가하기 시작한다( 그림 3 ).

미소 출혈 및 혈관 감수성 대조 (느린 흐름에 해당)의 증가와 같은 미세 혈관 병리는 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 혈관성 부종의 첫 징후 후 발생하며 T2 * 가중 영상으로 시각화 될 수 있습니다. Microhemorrhages는 우세하게 후각 망울에서 발생합니다 ( 그림 4 ). 미세 출혈의 수는 진행성 질환에 따라 증가합니다. 진행성 질환의 미세 출혈은 피질, 기저핵, 소뇌, 백질 및 뇌간에서도 분명합니다.

동맥 혈관 개존율 감소는 미세 혈관 변화와 동시에 거대 혈관 손상의 징후로 비행 중 혈관 조영술로 볼 수 있습니다. 뇌경색은 ECM에서 중요한 발견이 아닙니다. 그러나 매우 심각한 질병의 경우,ADC 감소가 확인되어 뇌 경색을 나타낸다.

그림 1
그림 1 : Blood-Barrier Barrier Disruption. ( A ) 대표적인 코로 날 3D T1 가중치 이미지. 후각 구의 중앙 영역에서 T1 신호의 증가가 보입니다. ( B ) 해당 T1 상대 신호 이미지 (T1 대비 대비 이미지에서 T1 대비 이미지를 뺀 것)에서 조영제 혈관 외 유출은 윤곽을 그리는 것이 더 쉽습니다. 조영제 혈관 외 유출은 대뇌 피질의 영역에서 볼 수 있습니다 (흰색 화살표). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : T2 Relaxometry. RMCBS 점수가 5 ( A )이고 기준선 스캔 ( B ) 인 중증 병이있는 마우스에서 다른 높이에있는 샘플 T2 맵은 컬러 스케일, 그레이 스케일 및 ROI가있는 회색 스케일로 컬러 오버레이로 표시됩니다. 진한 파란색 = RMS, 녹색 = 피질, 청록색 = 외부 캡슐, 황색 = 기저핵, 연한 파란색 = DMS, 주황색 = 시상, 빨간색 = 뇌간 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 두뇌 볼륨 측정. 적당히 아픈 마우스 (RMCBS 15-10)에서 뇌량이 유의하게 증가합니다. 10 마리의 마우스의 대표 값을 나타내었다. 데이터는 평균 표준 편차로 표시됩니다. 브래지어의 차이를 분석하기 위해 한 쌍의 Student 's t-test를 사용했습니다그룹간에 붓기가있다. 중등도 / 심하게 아픈 생쥐에서 뇌량은 기저치에 비해 유의하게 증가했다 (p = 0.021 / 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 미세 출혈. 혈액 단계 감염 ( A )이 시작되고 RMCBS 점수가 14 ( BC ) 인 감염 후 8 일에 마우스의 대표적인 T2 * 가중치 이미지가 표시됩니다. 첫 번째 이미지에서 미세 출혈은 보이지 않지만 ( A ), 두 번째 및 세 번째 이미지에서는 여러 가지 미세 출혈이 보이고, 후각 구의 우세가 있습니다 (B : 평면 코로나 이미지, C : 분절 미세 출혈이있는 3D 투영).

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Discussion

이 기사에서는 실험적인 대뇌 말라리아의 변화를 묘사하기위한 전체 뇌 MRI 프로토콜에 대해 설명합니다. 우리는 지금까지 말라리아 연구에서 MRI가 제대로 활용되지 않았으며 우리의 프로토콜이 다른 수사관을 도울 것이라고 희망합니다. 도움이 될 수있는 몇 가지 추가 점을 설명하고자합니다.

심하게 아픈 생쥐가 이미징 된 경우, 위치 결정이 중요합니다. 두개 내압이 증가하기 때문에 마우스는 사망에 취약하므로 자궁 경부가 펴지지 않아야합니다. 마취도 최소한으로 유지해야합니다. 가벼운 질병이있는 마우스를 이미징 한 경우 MRI의 가장 좋은 시점은 첫 번째 임상 증상이 예상되는 시점보다 12-24 시간 앞선 것입니다. ECM (RMCBS 점수 20)의 임상 징후가없는 마우스에서 후각 구내의 경미한 혈관 부종이 보입니다.

특정 연구 문제에 따라 MRI 프로토콜 자체의 길이를 조정할 수 있습니다. 최소한의 원초col는 혈관 형성 부종 및 미세 출혈 부하 / 미세 혈관 장애의 존재를 판단하기 위해 T2 강조 서열 또는 T2 이완 법 및 T2 * 가중 서열을 포함해야한다. 양질의 이미지를 얻으려면 모션 인공물을 최소한으로 유지해야합니다. 움직임은 마우스의 올바른 위치와 최소 60-80 회 / 분으로 호흡 속도를 유지함으로써 감소 될 것입니다.

intravital microscopy와 같은 다른 생체 내 이미징 방법은 세포 수준에서 ECM의 병리학 적 변화를 시각화하는 데 도움이됩니다. 14 , 15 , 16 , 17 MRI와 비교하여, intravital microscopy는 제한된 피질 영역만을 덮는 비용으로 높은 공간 분해능을 제공 할 수 있습니다. 대조적으로, MRI는 최대 80 μm의 해상도로 전체 뇌를 커버 할 수 있습니다. 따라서 MRI는 다음을 확인함으로써 추가 조사를 유도 할 수 있습니다.질병의 시작과 같은 질병의 단계뿐만 아니라 추가 방법론을 사용하여 평가할 수 있습니다. ECM에서의 MRI 소견은 인간 대뇌 말라리아에서 MRI로 검출 된 병리학 적 변화와 비교할 수 있습니다. 사람과 실험 대뇌 말라리아는 모두 유선 분야의 2 차 대뇌 경색과 같은 미세 혈관 병리뿐만 아니라 신경 발생 부위에서 혈관성 부종을 나타낸다. 백인과 회색 물질은 유사한 방식으로 영향을 받고 인간과 실험 뇌성 말라리아에서 뇌의 부종은 심한 질병의 뇌간을 포함하여 혼수 상태를 설명한다. 2 , 7

우리는 생체 내 이미징이 현재 대뇌 말라리아의 근본적인 병리 기전을 밝히는데 도움이되기를 희망합니다. 부종과 뇌의 부종이 생체 내에서 거의 보이지 않기 때문에생체 내에서 이러한 병리를 시각화 하는 것이 중요하며 새로운 치료법 및 예방 접종의 평가를 향상시키는 데 도움이 될 것입니다.

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Acknowledgements

미리 암 레이 닉 (Miriam Reinig)의 전문가 기술 지원은 감사하게 생각합니다. AH는 하이델베르그 대학 (University of Heidelberg)의 의과 대학의 박사후 연구원으로부터 기금을 받았다. MP는 Else-Kröner-Fresenius Foundation의 기념비에 의해 지원됩니다. AKM은 독일 감염 연구소 (DZIF)의 DZIF 아카데미에 의해 출산 휴가를받습니다. JP는 분자 의학 (HRCMM) 경력 개발 펠로우쉽을위한 하이델베르그 연구 센터의 수령인이다. 우리는 또한 sporozoite 운동의 모범적 인 영화를 제공 한 Julia M. Sattler와 Friedrich Frischknecht에게 감사를 표합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Baxter 1001747 for anesthesia
Dotarem Guebert 1086923 Gd-DTPA contrast agent; 0.5 mmol/mL
Amira (Image Processing Program) FEI Group Version Amira 5.3.2
MATLAB  The MathWorks, Inc., Release 2012b
FDT toolbox  FMRIB's Software Library http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html

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References

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