Una Cámara de microfluidos Modelo de Flujo de Transfusión de Plaquetas y hemostasia Medidas de deposición de plaquetas y la formación de fibrina en tiempo real

Bioengineering
 

Summary

En este trabajo se describe un modelo experimental de la hemostasia que mide simultáneamente la función plaquetaria y la coagulación. Plaquetas y fibrina de fluorescencia se mide en tiempo real, y la tasa de adhesión plaquetaria, la tasa de coagulación, y el inicio de la coagulación se determinan. El modelo se utiliza para determinar las propiedades procoagulantes de plaquetas bajo flujo en concentrados para la transfusión.

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Six, K. R., Devloo, R., Van Aelst, B., Vandekerckhove, P., Feys, H. B., Compernolle, V. A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time. J. Vis. Exp. (120), e55351, doi:10.3791/55351 (2017).

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Abstract

modelos de microfluidos de la hemostasia evaluar la función plaquetaria en condiciones de cizallamiento hidrodinámico, pero en presencia de anticoagulantes, este análisis se limita únicamente a la deposición de plaquetas. La intrincada relación entre Ca 2+ función de coagulación y plaquetas dependiente requiere recalcificación cuidadosa y controlada de sangre antes del análisis. Nuestra configuración utiliza un canal de mezcla en forma de Y, que suministra el concentrado de tampón de Ca2 + / Mg2 + a fluir la sangre justo antes de la perfusión, lo que permite una rápida y sin recalcificación estasis muestra. A diferencia de diez veces en la velocidad de flujo entre ambos depósitos minimiza la dilución. La sangre recalcified se perfunde entonces en una cámara de análisis recubierta con colágeno, y el etiquetado diferencial permite imágenes en tiempo real tanto de plaquetas y deposición de fibrina mediante microscopía de fluorescencia de vídeo. El sistema utiliza sólo herramientas disponibles en el mercado, lo que aumenta las posibilidades de normalización. La reconstitución de excelentes referenciasmbocytopenic sangre con plaquetas de peraltada concentra, además, modelos de transfusión de plaquetas, lo que demuestra su uso en este campo de investigación. Ejemplos de datos demostraron que el inicio de la coagulación y deposición de fibrina eran linealmente dependiente de la concentración de plaquetas, lo que confirma la relación entre la hemostasia primaria y secundaria en nuestro modelo. En un plazo de 16 minutos de perfusión, la activación por contacto no tuvo lugar, a pesar de recalcificación de Ca 2+ normales y los niveles de Mg 2+. Cuando el factor de coagulación XIIa fue inhibida por el inhibidor de tripsina de maíz, este marco de tiempo era incluso más tiempo, lo que indica un rango dinámico considerable en la que los cambios en la naturaleza procoagulante de las plaquetas se puede evaluar. Co-inmovilización de factor tisular con el colágeno redujo significativamente el tiempo hasta la aparición de la coagulación, pero no su tasa. La opción para estudiar el factor tisular y / o la vía de contacto aumenta la versatilidad y la utilidad del ensayo.

Introduction

hemostasia primaria y secundaria se conceptualiza originalmente como dos procesos bioquímicos relativamente separables. hemostasis primaria fue visto como un contribuyente importante en condiciones de flujo arterial, con un papel clave para las plaquetas, mientras que la hemostasia secundaria fue visto a dominar la coagulación bajo flujo de sangre venosa, lo que permite la cascada de proteasas para formar fibrina insoluble. Las últimas décadas han modificado sustancialmente esta visión tradicional, reconociendo que la activación plaquetaria y la coagulación son interdependientes y son igualmente importantes procesos durante la hemostasia fisiológica y patológica en todos (no extremas) ambientes hidrodinámicas. Esta opinión ha sido traducida a la clínica, donde cada vez se utilizan ensayos ideados para medir integralmente la coagulación de sangre completa, aunque con muchas cuestiones pendientes sobre la pertinencia, aplicabilidad y utilidad 1.

Recientemente hemos publicado un análisis funcional de las plaquetasconcentrados utilizando cámaras de flujo de microfluidos recubiertas con colágeno fibrilar en un modelo in vitro de la transfusión de 2, con muestras que contienen cantidades normales de glóbulos rojos, plasma y plaquetas. Este método utiliza heparina o hirudina sangre anticoagulada, lo que implica o ninguna participación limitada de hemostasis secundaria, que es dependiente de la generación de trombina y calcio ionizado (Ca 2+). Para apoyar la formación de trombina y por lo tanto para incluir todos los aspectos de la hemostasia bajo flujo de microfluidos, hemos desarrollado un método complementario en la misma plataforma técnica, incluyendo ahora libre de Ca2 +. De esta manera, la deposición de plaquetas y la formación de fibrina se pueden estudiar, de nuevo en un modelo de la transfusión de plaquetas, para evaluar la calidad de concentrado de plaquetas.

En este método, las plaquetas y el fibrinógeno están etiquetados con fluoróforos que se han separado completamente espectros de emisión. color dual, microscopía de vídeo en tiempo real a continuación, permite el análisis deadhesión primaria de plaquetas, así como la iniciación de la coagulación y deposición de fibrina. Una variable importante en este tipo de ensayo es de recalcificación, porque la adición de Ca2 + a la sangre estática, antes de la perfusión, inevitablemente causar la coagulación de contactos iniciada en el recipiente. Esta iniciación se sesgo la lectura debido a la obstrucción de los tubos y de biochips entradas antes de la perfusión. Por lo tanto, en nuestro método, citrato de sangre anticoagulada y un tampón -Con Ca 2 + son bombeados por separado a través de las patas superiores de una cámara de entrada en forma de Y. Los componentes se mezclan durante la perfusión antes de entrar en una cámara de análisis recubiertas con colágeno solo o en combinación con el factor tisular humano recombinante (rhTF). Mediante la adaptación de las velocidades de flujo de las bombas separadas y la concentración de Ca2 + en la memoria intermedia, una dilución de 10% de la muestra de sangre final se lleva a cabo.

El uso de este protocolo extendido, se demuestra la contribución de coágulosfactor de la XII (FXII) y la concentración de plaquetas para contactar iniciación vía de coagulación bajo flujo. Nuestros datos también muestran que mediante el recubrimiento de rhTF junto a colágeno, la vía del factor tisular se puede medir de forma concomitante.

Protocol

Este protocolo sigue las directrices éticas institucionales para la investigación en muestras humanas, y se obtuvo el consentimiento de todos los donantes involucrados. La aprobación de los experimentos descritos aquí se obtuvo de la junta de revisión institucional del Hospital de la Universidad de Amberes (número de autorización 16/10/120).

NOTA: indicaciones de temperatura son siempre la temperatura ambiente, a menos que se especifique.

Configuración 1. microfluídica

  1. Preparar los canales de microfluidos cámara de flujo, los tubos y clavijas de conexión
    1. Resuspender el vial colágeno de stock de mezcla de vórtice, y luego se diluye en la solución de glucosa isotónica proporcionado por el fabricante a una concentración final de 50 mg / ml.
      NOTA: El uso de colágeno del tendón equino, hecha principalmente de tipo I fibrillas. El equino colágeno tipo I se refiere a menudo como "Horm" colágeno y es el estándar de oro para este tipo de ensayo, por tanto históricos comorazones biológicas. El colágeno humano de tipo III también se puede utilizar, pero estas fibrillas capa menos bien, y la respuesta de plaquetas no es tan fuerte. Otras superficies de revestimiento también se pueden utilizar, tal como el factor von Willebrand, fibrinógeno, fibronectina, laminina, vitronectina, trombospondina-1, o combinaciones de estos 3.
    2. Tome un nuevo biochip microfluidos desechables con ocho, canales y dimensiones paralelas rectas, en mm, de 0,4 W x 0,1 x 20 L. Pipetear 0,8 l de colágeno en el canal (s) del biochip en un extremo y etiquetar esto como el outlet. Llenar solo 5/6 de la longitud del canal de modo que las fibrillas de colágeno no se recubran en la entrada del canal, ya que esto puede causar la obstrucción, lo que obstruye una perfusión eficiente.
    3. Incubar el biochip a 4 ° C durante al menos 4 h en un recipiente humidificado y sellado.
    4. Para estudiar el factor tisular (extrínseca) de coagulación mediada en combinación con la vía de contacto (intrínsecos), capa de los canales con collaGen y el factor tisular humano recombinante (rhTF).
      1. Diluir rhTF en 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) -buffered solución salina (HBS; 0.9% (w / v) de NaCl, pH 7,4, 1: 3,000, concentración de stock: 4,5 nM).
      2. Se elimina la solución de recubrimiento de colágeno a través de la toma de corriente. Pipetear 0,8 l de rhTF en HBS (dilución 1/500 de la concentración de valores, concentración final: 21:00) en la salida del canal, llenando 5/6 de la longitud del canal, similar a la estrategia de recubrimiento de colágeno.
      3. Incubar el biochip para un 30 minutos adicionales en un recipiente humidificado y sellado.
    5. Llenar los canales revestidos con tampón de bloqueo (1,0% (w / v) de albúmina de suero bovino y 0,1% (p / v) de glucosa en HBS w), a partir del otro extremo (etiquetado como la entrada). Llenar un número igual de canales en forma de Y con el mismo tampón de bloqueo en un biochip de mezcla.
      1. Asegúrese de que todos los canales y los brazos de los canales están completamente llenos de tampón de bloqueo. Incubar tanto biochips durante por lo menos 1 h en un recipiente humidificado y sellado.
    6. Para cada canal en uso, se preparan dos tubos de 8 cm de largo, uno de 2 cm de largo, y uno de 46 cm de largo. Coloque un pasador en un extremo de los tres tubos más pequeños y en ambos extremos de la tubería más larga.
  2. Preparar la bomba de aclarado
    1. Enjuague todos los fluidos de la bomba y la tubería conectada con agua destilada.
    2. Desengrase de calidad del biochip con una precisión sin polvo y limpie el alcohol desnaturalizado para eliminar huellas y polvo.
    3. Llenar todos los tubos con tampón de bloqueo antes de conectarlos a los biochips.
    4. Fijar el biochip recubierto en la platina del microscopio automatizado. Fijar el biochip de mezcla a la misma altura que la platina del microscopio utilizando un gato de tijera laboratorio.
    5. Conectar el biochip recubiertos con el biochip mezcla utilizando el tubo más largo, 46 ​​cm de largo. Asegúrese de que ambos biochips están a una distancia de manera que el tubo forma una línea recta, pero flexibles. Adjuntar una clavija de conexión de la jeringa en el tubo con capacidad para un Luer de la bomba de lavado. Conectar al extremo libre del tubo de 2-cm y fijar el otro extremo a la salida del biochip recubierto.
    6. Fijar los dos de 8 cm de tubo a la entrada biochip mezcla utilizando sus patas. Coloque el extremo libre de cada tubo en un vial de HBS. Enjuague todos los tubos y todos los canales con 1 ml de HBS.
      NOTA: HBS fluye desde el vial a través de la 8-cm tubo para el chip de mezcla y a través de la 46-cm tubo para el chip recubierto (que fluye desde el no recubierto a la parte recubierta) debido a la fuerza de tracción de la bomba de lavado. Este paso elimina el tampón de bloqueo y colágeno mal adherido (o rhTF en biochips revestimiento doble).
  3. Preparar las bombas de perfusión
    1. Abra el software del controlador de las bombas de perfusión. Inicializar las bombas haciendo doble clic en el icono de jeringas en el software.
    2. Seleccione el tipo de jeringa que se utilizará: 1 ml jeringas para la coagulación bUffer y 2 ml jeringas para la sangre reconstituida.
  4. Conectar las jeringas para la construcción de biochips
    1. Desconectar la bomba de lavado y de todos los tubos, excepto la conexión de los dos biochips. El tubo desconectado se vuelve a utilizar en los siguientes pasos.
    2. Conecte el tubo de 2 cm con su pasador conector jeringa al cierre Luer de un tubo de drenaje de paredes gruesas. Llenar el tubo de pared gruesa con solución de pepsina estándar utilizando una jeringa.
      NOTA: La adición de pepsina para los inhibe tubo de residuos y lisa coagulación post-perfusión y por lo tanto evita la obstrucción del sistema en el extremo posterior.
    3. Asegurar el extremo abierto del tubo de pared gruesa con una pinza de Kocher. Coloque un contenedor de residuos adecuado con lejía debajo para recoger el flujo continuo.
    4. Fijar el tubo con su pasador a la salida del biochip recubierto.

2. Preparación de muestras de sangre

  1. Recoger la sangre de un voluntario sano y separar sus componentes 4
    1. Recoger la sangre en un recipiente de ácido etilendiamina-tetraacético evacuado (EDTA). Utilice este ejemplo sólo para realizar un conteo sanguíneo completo (CSC) usando un analizador de hematología automatizado.
    2. Recoger la sangre en recipientes de citrato de sodio evacuadas. 5 ml de sangre se requiere por canal.
    3. Colocar la muestra (s) en una reconstitución de la sangre de los rotadores horizontal pendiente.
      NOTA: El ensayo debe ser completado dentro de 3 h de la flebotomía. El concentrado de plaquetas y sangre entera son muestras de grupos sanguíneos ABO / RhD igualada.
    4. Centrifugar durante 13 min a 250 xg para preparar plasma rico en plaquetas (PRP). No utilice el freno de la centrífuga para evitar la perturbación de la pastilla sin apretar.
    5. Transferir el PRP a un tubo de centrifugación cónica fresco. Se centrifuga durante 10 minutos a 4.500 xg (con freno) para sedimentar las plaquetas y preparar el plasma pobre en plaquetas (PPP). Desechar el platpellets elet. Incubar el PPP en un baño de agua a 37 ° C.
    6. La transferencia de los concentrados de glóbulos rojos a un tubo cónico fresco perforando la parte inferior de la original con una aguja 21 G.
      NOTA: El recuento de plaquetas residual en la fracción de glóbulos rojos es de 11 ± 4 x 3 por 10 l (media ± SD, n = 10).
  2. reconstituir la sangre
    1. Determinar el hematocrito de los glóbulos rojos concentrados preparados en la etapa 2.1.6 utilizando un analizador de hematología automatizado.
    2. Determinar la concentración de plaquetas del concentrado de plaquetas que se utilizará para el análisis con un analizador de hematología automatizado.
    3. Calcular el volumen de células empaquetadas rojas de la sangre, concentrado de plaquetas, y PPP que producirá un hematocrito 40% y 250 x 10 3 plaquetas / l en un volumen final 2,5 ml. Mezclar estos para preparar la sangre reconstituida y realizar un hemograma completo.
      NOTA: Otros títulos de destino de las células se puede usar, dependiendo de THpregunta de investigación e.
    4. Preparar una muestra "en blanco" control en el que el volumen de concentrado de plaquetas se sustituye por el mismo volumen de solución salina para determinar la concentración de las plaquetas "endógenos" (es decir, plaquetas de banco no sanguíneos).
  3. Etiquetar la sangre reconstituida para las plaquetas y fibrinógeno
    1. Pipetear 13 l de una solución 10,7 mg / ml de fibrinógeno Alexa Fluor 405 marcado con (70 mg / ml de concentración final) en un tubo de ensayo y añadir 1 ml de sangre reconstituida.
      NOTA: El fibrinógeno se marcó usando un kit disponible comercialmente de acuerdo con el manual del fabricante.
    2. Mezclar otro 1 ml de sangre reconstituida en un tubo de ensayo que contiene 2 l de 1 mM DiOC6 (1 mM de concentración final) o que contiene 2 l de 5 mM de calceína AM (5 M de concentración final). Añadir este al tubo que contiene la sangre con el fibrinógeno, dando un volumen final de 2 ml de plaquetas y fibrinógeno-sla sangre contenida.
      NOTA: La elección del medio de contraste puede depender de la pregunta de investigación o de la preferencia del investigador 5. Tenga en cuenta que la excitación de cualquier medio de contraste puede causar artefactos fotoquímicos.
    3. Mezclar suavemente por inversión. Incubar la muestra durante 10 min a 37 ° C.
  4. Preparar el tampón de coagulación
    1. Preparar tampón de coagulación que contiene CaCl2 10 mM y 3,75 mM de MgCl 2 en HBS. Preparar 1 ml de tampón de coagulación para un canal.
    2. Filtros de esterilizar el tampón de coagulación a través de un filtro de 0,2 micras. Pre-calentar este a 37 ° C.

3. Ensayo de perfusión

  1. Enfocar la óptica del microscopio a las fibras de colágeno adheridas a la parte inferior del canal. Utilice contraste de fase o el contraste de interferencia diferencial (DIC). Seleccione "Z actual Conjunto para las regiones seleccionadas baldosas" en el software experimento para corregir digitalmente el enfoque seleccionado.
  2. Definir una región de interés (ROI) en el canal seleccionado mediante el software de adquisición del microscopio.
    NOTA: El ROI puede ser cualquier superficie escogida arbitrariamente dentro de un canal de perfusión. Se aconseja no para analizar la formación de trombos y la generación de fibrina cerca de la entrada y la salida con el fin de evitar la adquisición de imágenes de trombos desigualmente distribuida. El área de superficie ROI debe contener un número significativo de trombos para permitir la nivelación de variabilidad de la señal por las plaquetas individuales. La ubicación de la ROI en el plano xy del canal es siempre fija y se determina antes de la perfusión. Si es necesario, la parte no recubierta de la canal puede ser incluido en el análisis para determinar si las plaquetas se unen de forma no específica al plástico biochip.
  3. Preparar muestras para perfusión
    1. Montar una jeringa de 1 ml que contiene 1 ml de tampón de coagulación pre-calentado en la bomba de perfusión.
    2. Mezclar la sangre pre-calentado reconstituido invirtiendo suavemente y carga de 2 mL en una jeringa de 2 ml.
    3. Asegúrese de que todo el aire se elimina de ambas jeringas y conectar cada uno a un tubo de 8 cm utilizando un pin conector de la jeringa.
    4. Prime los conectores y tubos de ambas jeringas a alta velocidad (400 l / min) y dejar que todo se llena con tampón de coagulación o de la sangre.
      NOTA: Por Cebado de la línea, el tampón de coagulación y la sangre reconstituida se mezclan inmediatamente en el canal en forma de Y del biochip de mezcla al iniciar el experimento, evitando la introducción de aire a las cámaras de perfusión.
  4. El uso de pernos, fijar el otro extremo de los dos tubos a las piernas de división de canal en forma de Y en el biochip de mezcla. La parte inferior de la pierna se utiliza para perfusión de tampón de coagulación y la pierna superior de sangre reconstituida.
  5. Iniciar el experimento mediante el inicio de la perfusión de 4,4 l / min para el tampón de coagulación y 44 l / min para la sangre reconstituida. Retire la pinza de Kocher en la salida del tubo de drenaje para permitir perfusión.
    NOTA: El caudal se puede cambiar dependiendo de la pregunta de investigación. Iniciar un cronómetro para determinar el tiempo entre el inicio del experimento y el inicio de la adquisición de imágenes en tiempo real.
  6. grabar imágenes cada 10 s durante 30 minutos en tiempo real usando el software de adquisición y el experimento del microscopio. Iniciar la grabación cuando la mezcla de sangre reconstituida y tampón de coagulación entra en el biochip revestida montada sobre la platina del microscopio.
    NOTA: Otra serie de tiempo se puede utilizar dependiendo de la configuración experimental. Use un aumento de 100X (10X y 10X objetivo lentes).

Experimento 4. Terminación

  1. Terminar las bombas y adquisición de la imagen después de 30 minutos o antes, si se satura la señal. Separar todos los tubos y las jeringas y desecharlos como residuos biopeligrosos.

Análisis 5. Datos

  1. Determinar el crecimiento del trombo (fluorescencia verde) y la formación de fibrina (violeta fluorescence) la cinética con el software de análisis de imágenes. Los siguientes comandos son específicos para el software utilizado aquí:
    1. Abra el procesamiento plugin: costura para coser las imágenes de lado a lado por punto de tiempo.
    2. Análisis abrir el complemento de imagen para determinar la cobertura de la superficie de las plaquetas.
    3. Medida abrir el plugin. Definir el retorno de la inversión mediante la elaboración de una región rectangular que incluye todas las fibras de fibrina y trombos; en este protocolo, el retorno de la inversión es un rectángulo de 637 mm 2.
      Seleccione la pestaña Todas las vistas para incluir todos los puntos temporales registrados.
    4. Utilice Crear tablas para generar automáticamente una hoja de cálculo que contendrá el valor medio de intensidad de fluorescencia de la región rectángulo seleccionado de cada punto de tiempo.
    5. Guardar las hojas de cálculo en formato XML.
  2. Abra una hoja de cálculo en un programa de hoja de cálculo para los cálculos posteriores.
    1. Restar la inicial (background) el valor de todos los datos.
    2. Trazar la señal fluorescente como una función del tiempo de perfusión, tanto para el verde (plaquetas) y los tintes violeta (fibrina).
      NOTA: Tener en cuenta el tiempo que transcurre entre la inicialización de la bomba y el punto de partida real de adquisición de imágenes. La formación de trombos es generalmente un proceso de dos etapas en este modelo: (1) "lento" adhesión de las plaquetas (es decir, la adhesión) a colágeno inmovilizado seguido por (2) crecimiento del trombo coagulación impulsada con un aumento "rápido" en tanto la unión de plaquetas ( es decir, la acumulación) y la deposición de fibrina (es decir, la coagulación) (Figura 1).
    3. Calcular la pendiente de la adhesión y acumulación de plaquetas por regresión lineal; esta pendiente da la cinética de crecimiento de trombos de plaquetas en cada fase de su formación.
    4. Calcular la pendiente de la coagulación de la fibrina y extrapolar esta línea para interceptar el eje X, la determinación del momento de inicio.

Representative Results

El análisis de tiempo real de datos en bruto se describe en la Figura 1. En primer lugar, las plaquetas se adhieren a la superficie reactiva, lo que resulta en un constante aumento en la fluorescencia verde grabado (Figura 1A, i), llamado adhesión. Durante esta fase, hay poca fluorescencia violeta, indicando que la fibrina no es, o sólo se forma ligeramente (Figura 1B). Al inicio de la coagulación, violeta fluorescente depósitos de fibrina rápidamente (iii), y durante ese tiempo, la fluorescencia verde de plaquetas aumenta a aproximadamente la misma velocidad, designados aquí como la acumulación de plaquetas (ii). Así, un solo experimento devuelve tres tasas de aumento de fluorescencia (i, ii, y iii) como un marcador sustituto para la velocidad a la que las plaquetas y deposición de fibrina tiene lugar en este modelo. Además, un momento de inicio de la coagulación (momento de inicio (iv)) se extrapola, que es un factor determinante de plaquetaspotencial procoagulante.

En ausencia de TF, la iniciación de la coagulación es lento y principalmente se ejecuta a través de la vía de contacto donde el complejo tenasa intrínseco activa FX a través de la activación directa de FIX 6 por FXI y / o FXII. Para demostrar la dependencia de factor XII, se añadió 4 M de inhibidor de tripsina de maíz (CTI) para inhibir el factor XII activado (FXIIa) 7. Esta inhibición no afectó a la adhesión plaquetaria (Figura 2), pero no se inició la coagulación de la duración total definida arbitrariamente del experimento de perfusión (Figura 2B y complementaria de vídeo 1).

In vitro, la vía de contacto puede ser iniciado por materiales extraños como el cristal, o en ensayos clínicos utilizando un material mineral como caolín. In vivo, las plaquetas activadas proporcionan la carga negativa 8 </ sup> a través de la exposición de la membrana de fosfolípidos ácidos 9, al igual que la fosfatidilserina, y / oa través de la liberación de polifosfatos (pólipo) 10, 11. Nuestros imita microfluidos de ensayo en tiempo real el segundo porque, en un intervalo de concentraciones de plaquetas, la reacción hemostática dependían del recuento de plaquetas (Figura 3). Al aumentar el número de plaquetas en la muestra reconstituida, la tasa de adhesión (Figura 3A), la acumulación (Figura 3B, verde), y la coagulación (Figura 3B, violeta) aumentaron linealmente. El momento de aparición acorta significativamente (Figura 3C) mediante el aumento de la concentración de plaquetas, lo que sugiere que se requiere un número de umbral de (activado) depositado plaquetas para desencadenar la coagulación.

Al daños en los tejidos in vivo, sin embargo, las células que portan TF-i senitiate la coagulación de la sangre a través del complejo tenasa extrínseco FVIIa-TF en presencia de Ca2 +. Esta es imitado en nuestra configuración experimental por puesto el revestimiento de las cámaras de perfusión que contienen colágeno con rhTF lipidada. En un análisis pareado de canales revestidos con solamente o en combinación con rhTF colágeno, el inicio de la coagulación fue significativamente más rápida (Figura 4A). La tasa de adhesión de plaquetas no fue lineal, por lo que no regresión lineal se pudo realizar (datos no mostrados). Tanto la tasa de la coagulación y la acumulación de plaquetas no fue diferente entre las condiciones (Figura 4B-4C, complementaria de vídeo 2).

Figura 1
Figura 1: Análisis de regresión de la adhesión de plaquetas y la coagulación en cámaras de perfusión de microfluidos. Esta figura aclara los parámetros derivados de la fluorescencia de datos sin procesar en tiempo real adquiridos durante el flujo de sangre recalcified sobre una superficie reactiva. (A) la intensidad media de la fluorescencia verde muestra la deposición de plaquetas en función del tiempo de perfusión. La curva describe un proceso bimodal a partir de (i) el aumento de la adhesión de plaquetas lentamente lineal seguido por (ii) rápidamente creciente acumulación lineal. Las dos partes lineales de la curva se regresan y la pendiente de estos se describen las dos tasas de formación de trombos de plaquetas por fluorescencia; (I) la adhesión y (ii) acumulación. (B) la intensidad media de fluorescencia violeta muestra la deposición de fibrina en función del tiempo. Durante la adhesión de plaquetas, la fluorescencia violeta es esencialmente ausente, mientras que se desarrolla rápidamente después de la iniciación de la coagulación. El (iv) aparición momento-de-se define como la intersección con el eje x de la regresión lineal extrapolada de (iii) la segunda fase de la formación de trombos de fibrina por fluorescencia designado aquí como la coagulación.ef = objetivo "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg" = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: En ausencia de TF, la coagulación en cámaras de flujo de perfusión recubiertos con colágeno depende de FXIIa. Perfusión de microfluidos de la sangre reconstituida que contiene CTI o tampón de control (CONTROL) se realizó a una velocidad de cizallamiento de 1.000 s -1 para un total de 30 min. (A) La tasa de adhesión de las plaquetas (s -1) no dependía de CTI. (B) En el momento de inicio para muestras tratadas con CTI fue más allá del límite de 30 min del experimento (que se muestra como una línea de puntos), lo que demuestra la dependencia de FXIIa de este parámetro. Barras y los puntos son valores medios, los bigotes son desviación estándar. El análisis estadístico fue mediante la prueba t pareada. (NS = no significativo, n ≥3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: La coagulación bajo flujo depende de la cantidad de plaquetas. Experimentos de perfusión de microfluidos se realizaron en cámaras revestidas con colágeno con sangre reconstituida en presencia de Ca2 + y concentraciones variables de plaquetas (n ≥3). (A) Índice de tasa de adhesión de plaquetas (B) de la acumulación de plaquetas (verde) y la coagulación (violeta), y (C) del momento de inicio se muestran como funciones de concentraciones de plaquetas en la sangre reconstituida. Los puntos son valores medios, los bigotes son desviaciones estándar. Haga clic aquí para conocer el Versi más grandesel de esta figura.

Figura 4
Figura 4: la activación tanto de TF y la vía de contactos de coagulación acorta significativamente el momento de inicio de la coagulación. Reconstituida sangre, en presencia de Ca2 +, se perfundió a través de cámaras recubiertos con colágeno solo o con colágeno y rhTF para estudiar la vía de contacto solo o una combinación de las vías de contacto y TF. (A) En el momento de inicio de la coagulación se acorta significativamente en cámaras de flujo que contiene por TF. (B) La tasa de acumulación de las plaquetas durante la coagulación y (C) la velocidad de coagulación no son significativamente diferentes entre el colágeno solo o cámaras de flujo de colágeno-revestidas y rhTF. Barras y los puntos son valores medios; bigotes son desviaciones estándar. El análisis estadístico fue mediante la prueba t pareada. (NS = no significativo, * p < 0,05, n ≥3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

video 1
Vídeo complementario 1: En ausencia de TF, la coagulación en cámaras de flujo de perfusión recubiertos con colágeno depende de FXIIa. El papel de la vía de contacto se determina en cámaras de flujo de perfusión recubiertos con colágeno. (A) la secuencia de imágenes de fluorescencia superpuestas de plaquetas (verde) y fibrina (fibrinógeno) (violeta) deposición en ausencia de CTI. (B) misma secuencia que el panel A, pero con el canal verde apagado. (C) Overlaid secuencia de imágenes de fluorescencia de las plaquetas (verde) y fibrina (fibrinógeno) (violeta) deposición en presencia de CTI. (D) misma secuencia que el panel C, pero con el canal verde apagado.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi "target =" _ blank "> Haga clic aquí para descargar el vídeo.

video 2
Complementario Video 2: Activación de ambos TF y la vía de contacto acorta significativamente la coagulación del momento de inicio. Para estudiar el papel de TF, se utilizaron cámaras de flujo recubiertas con colágeno solo o con colágeno y rhTF. (A) la secuencia de imágenes de fluorescencia superpuestas de plaquetas (verde) y fibrina (fibrinógeno) (violeta) deposición en cámaras de flujo recubiertas solamente con el colágeno. (B) misma secuencia que el panel A, pero con el canal verde apagado. (C) Overlaid secuencia de imágenes de fluorescencia de las plaquetas (verde) y fibrina (fibrinógeno) (violeta) deposición en cámaras de flujo recubiertas con colágeno y rhTF. (D) La misma secuencia que el panel C, pero con la switc canal verdehed fuera. Haga clic aquí para descargar el vídeo.

Discussion

La transfusión de concentrados de plaquetas se le recetó al paciente trombocitopénica para prevenir o detener el sangrado. Su impacto clínico fue destacado recientemente en una revisión histórica de la leucemia aguda 12, recordando que el aumento de las tasas de supervivencia de los pacientes pediátricos en los años sesenta y setenta fueron en gran parte atribuible a las mejoras en (plaquetas) la medicina transfusional. Los concentrados de plaquetas también se utilizan para detener la hemorragia en trauma agudo o durante la cirugía. En estas condiciones, se prefieren las plaquetas con excelentes propiedades procoagulantes que inician rápidamente hemostasis, pero concentrados de plaquetas se preparan a partir de donaciones de donantes voluntarios y, a diferencia de la medicación farmacológica, están estandarizados por preparación solamente, no por la composición (química). Por lo tanto, varias cuestiones en el ámbito de los bancos de sangre están sin respuesta, incluidas las relativas a las modalidades óptimas de donación, condiciones de almacenamiento y las prácticas de transfusión. En el campo de la platelet (transfusión) biología, muchas preguntas sobre el aclaramiento de las células de la circulación, la contribución de las plaquetas transfundidas a la hemostasia, o la inmunología también siguen sin respuesta.

Numerosas técnicas de laboratorio para el análisis de la función plaquetaria están disponibles, pero éstos generalmente se refieren a un aspecto singular de la función plaquetaria, como agregación o desgranulación 13. Para evaluar ampliamente las plaquetas y concentrados de plaquetas, modelos integrales de la hemostasia son indispensables, y éstos deben incluir la hidrodinámica. Reología de la sangre es crucial para interpretar correctamente el comportamiento de las plaquetas durante la hemostasia 14, 15 o trombosis 16, incluso si la anticoagulación impide Ca2 + y / o trombina para participar en la presencia de citrato o heparina, respectivamente 2. Para estudiar la interacción entre la coagulación y la función de las plaquetas bajo un flujo de 17, Se requiere que 18, la generación de trombina normal y, por lo tanto, libre de Ca2 + también. La configuración experimental para el estudio de la hemostasia en estas condiciones es complejo, debido a las medidas para prevenir "artefacto" o la activación incontrolada de la coagulación se debe tomar tanto como sea posible. Por otra parte, muchos grupos de investigación especializados utilizan a medida de hardware 19, 20, lo que provoca una variabilidad sustancial entre laboratorios 5. Limitaciones típicas de este enfoque son el uso de recipientes rectangulares, perfiles de flujo no pulsátil, y recubrimientos de superficies no humanos 5. El ensayo se describe aquí utiliza las herramientas disponibles en el mercado y por lo tanto puede ser adecuado para la normalización.

Debido a que la reacción de coagulación en cascada se activa fácilmente una vez que la sangre no está contenida dentro del cuerpo humano, recalcificación controlada es un paso fundamental. To lograr esto, la adición de Ca 2+ necesita ser aplazado hasta justo antes de la perfusión sobre la superficie reactiva de colágeno, ya que cuando el Ca 2+ tampón se suministra a granel a la sangre estática, la coagulación se produce, inevitablemente, con el tiempo la obstrucción de la tubería y de desviación de datos interpretación (datos no mostrados). La solución a este problema es bombear el tampón de Ca2 + y la sangre por separado, lo que permite para la mezcla por las fuerzas convectivas y de difusión durante la perfusión en su camino hacia la cámara de análisis. La mezcla completa se logra en un segmento de 46 cm de tubo entre las cámaras de mezcla y de análisis. Esta longitud se ha calculado para el tiempo de permanencia óptimo de reactivos para mezclar acuerdo con las leyes fundamentales de la masa y el transporte convectivo 21 durante la perfusión con el caudal utilizado (1.000 s -1). Este enfoque resultó controlable y reproducible.

Contacto activación de la coagulación a veces se considera como un artefacto de sencilloel muestreo de sangre y que se debe evitar en la interpretación de los tiempos de coagulación. Por lo tanto, hemos demostrado que, en ausencia de inhibidores, la coagulación de contacto inducida comienza a 16,7 min (± 3,7 min) de la perfusión. En presencia de CTI para inhibir la activación de contacto mediada por FXIIa, coagulación no se inicia durante el curso definido arbitrariamente del experimento (30 min). Esta ventana de experimentación es suficientemente largo para discernir las muestras que son pro- o antitrombótico. A pesar de que la coagulación por activación de contacto puede ser una consecuencia no deseada de contacto con la sangre superficies artificiales, nuestros datos demuestran un efecto de la dosis biológica clara de plaquetas. Esto puede ser importante para la medicina de transfusión, debido a los recientes descubrimientos en factor XII, polifosfatos de plaquetas 10, 22 de distribución fosfatidilserina, y micropartículas de plaquetas 23 en realidad han revalorizado el contacto vía de coagulación como un importante contribuyente a la hemostasia, eespecialmente en el contexto de la trombosis 24. Por ejemplo, el rendimiento variable del transfusiones de plaquetas en pacientes o la expresión variable de fosfatidilserina de plaquetas en bancos pueden por lo tanto inducir la variabilidad en la eficacia terapéutica si se demuestra que la coagulación éxito dependiendo de estos factores.

Por co-inmovilización lipidada rhTF con el colágeno, la vía extrínseca de la coagulación, o vía del FT, se activa durante la deposición de plaquetas sobre colágeno. Esto extiende el ensayo a su modo más completo, como un modelo para las lesiones que llevan sangre en contacto con las células y tejidos que lleva por TF. Nuestros datos muestran que la co-inmovilización de colágeno y TF disminuye el momento de inicio de la coagulación, pero no altera la tasa de coagulación. Es de destacar que la cantidad de rhTF inmovilizado a la superficie es una variable importante en este modelo 25, 26 y debe ser estandarizado dentro de un estudio dado. En el presence de CTI, la vía de TF puede ser estudiado exclusivamente (no se muestra), ya que se impide la activación de contacto.

En conclusión, nuestra configuración experimental combina un modelo de la transfusión de sangre por la reconstitución de trombocitopénica con las plaquetas en bancos y un modelo de la hemostasia por deposición plaquetaria dependiente de calcio y la formación de fibrina en un flujo hidrodinámico. Este ensayo se utilizará para responder a las preguntas sobre la naturaleza procoagulante de las plaquetas en bancos y las técnicas de preparación de concentrado de plaquetas tienen efectos sobre esto.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por la Fundación para la Investigación y Desarrollo del Servicio de Sangre de la Cruz Roja Flandes belga. Reconocemos el apoyo financiero proporcionado por "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF - fondo especial de investigación) de la Universidad de Gante concedida al proyecto con número de contrato BOF30290744.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD A00434
10 mL Syringe BD 309604
2 mL Syringe BD 307727
Alexa Fluor 405 Life Technologies A30100 The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen
BD vacutainer Eclipse Becton, Dickinson and Company 368650 Blood collection needle with preattached holder
BD vacutainer tube with EDTA  Becton, Dickinson and Company 368856
BD vacutainer tube with Sodium Citrate Becton, Dickinson and Company 366575
Blocking buffer in house preparation in house preparation 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM Molecular probes C1430
Coagulation buffer in house preparation in house preparation 10 mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS
Conical tube 15 mL Greiner bio-one 1888271
Conical tube 50 mL Greiner bio-one 227261
Corn trypsin inhibitor (CTI) Enzyme Research Laboratories CTI
Denaturated alcohol Fiers T0011.5
DiOC6 Sigma-Aldrich 318426 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide - 1 mM solution in DMSO
Exigo microfluidic pump Cellix EXIGO-PC-FS7.0-MF
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Labelled in house with AF 405 - stock concentration 10.7 mg/mL
Hematology analyzer Sysmex pocH-100i
HEPES buffered saline (HBS) in house preparation in house preparation 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl), pH 7.4
Horm Collagen Takeda/Nycomed 1130630 Native equine tendon collagen (type I)
Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
Humidified box Cellix HUMID-BOX
Incubation water bath GFL 1013
Microscope Zeiss Axio Observer Z1 equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Mirus Evo Nanopump Cellix 188-MIRUS-PUMP-EVO with Multiflow8
Pipette Brand A03429
Pipette tips 100-1000 Greiner bio-one 740290
Pipette tips 1-10 Eppendorf A08928
Pipette tips 2-200 Greiner bio-one 739280
Platelet concentrate orbital shaker Helmer PF-48i
Precision wipes Kimtech 5511
Pepsin solution  Hanna instrument HI7073L  2 g pepsin per 75 mL solution, Protein cleaning solution with pepsin
Recombinant Human Tissue Factor Innovin Dade Berhing B4212-40 rhTF with synthetic phospholipids
Software microscope  Zeiss N/A ZEN 2012
Sterile docking device Terumo BCT TSCD
Table Top Centrifuge Eppendorf 521-0095
Tube Roller Ratek BTR5-12V
Tubing Sealer Terumo BCT AC-155
Vena8 syringe connector pin Cellix CONNECTORS-B1IC-PACK100
Vena8 Fluoro+ Biochips Cellix 188V8CF-400-100-02P10 Coated biochip
Vena8 Needles Cellix SS-P-B1IC-B1OC-PACK200
Vena8 Tubing Cellix TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F
VenaDelta Y1 Biochips Cellix VDY1-400-100-01-02 Mixing biochip
Vortex mixer VWR 58816-121
ZEN2012 software Zeiss

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References

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