استخدام في المختبر خلية يعيش التصوير لاستكشاف تشريعات تسليمها بالقاعدة الدهنية جسيمات نانوية

Medicine
 

Summary

تصوير خلية يعيش أداة قوية لتصور العمليات الحيوية. فحص الخلايا الثابتة يوفر الصور الثابتة فقط، الذي يمكن أن يؤدي إلى سوء الفهم والالتباس حول هذه العملية. ويعرض هذا العمل وسيلة لدراسة الامتصاص والإفراج عن المخدرات والتعريب داخل الخلايا من جسيمات نانوية الاسمافرون في الخلايا الحية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Seynhaeve, A. L., ten Hagen, T. L. Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles. J. Vis. Exp. (129), e55405, doi:10.3791/55405 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تقنيات التصوير التقليدية يمكن أن توفر معلومات مفصلة عن العمليات الخلوية. بيد أن هذه المعلومات تستند إلى صور ثابتة في نظام ديناميكي وإلا، والتغاضي عن مراحل متعاقبة أو يساء تفسيرها بسهولة. ولذلك تصوير خلية يعيش والوقت الفاصل بين الفحص المجهري، فيها الخلايا الحية يمكن اتباعها لساعات أو حتى أيام على نحو مستمر أكثر أو أقل، مفيدة للغاية. يسمح البروتوكول هو موضح هنا لتحقيق مصير جسيمات نانوية العلاج الكيميائي بعد تسليم ميتوتريكسات (دوكس) في الخلايا الحية. دوكس هو عامل إينتيركالاتينج الذي يجب أن يصدر من به nanocarrier لتصبح نشاطا بيولوجيا. وعلى الرغم من تسجيل السريرية لأكثر من عقدين، امتصاص وتوزيع المخدرات الإفراج عن هي لا تزال غير مفهومة تماما. ويستكشف هذا المقال فرضية أن جسيمات نانوية القاعدة الدهنية يتم تناولها بالخلايا السرطانية وهي تتحلل ببطء. دوكس المفرج عنهم هو ثم ذوبانها إلى النواة. لمنع تثبيت القطع الأثرية، تصوير خلية يعيش والوقت الفاصل بين الفحص المجهري، هو موضح في هذا الإجراء التجريبي، يمكن تطبيقها.

Introduction

القدرة على متابعة عملية بيولوجية، مثل التفاعلات خلية خلية، في جملة-والنقل داخل الخلايا والإقبال مجمع السامة للخلايا، والبروتين-بروتين تفاعل الجزيئات واحدة في الخلايا الحية والأنسجة، وقد اكتسب أهمية كبيرة على مر آخر العقد، كما أنه يوفر بعدا إضافيا من "الوقت الحقيقي". في هذه المخطوطة، أسلوب لمتابعة مصير داخل الخلايا الحرة دوكس ودوكس إدراج في جسيمات نانوية (دوكس-NP) وصف.

جسيمات نانوية قد استخدمت على مدى عقود لعلاج أنواع معينة من السرطان. وقد وافق NP دوكس لعلاج الإيدز ساركوما كابوزي، المتقدمة المبيض والثدي السرطان، والورم النخاعي المتعدد1. أنها واحدة من جسيمات نانوية الاسمافرون الأولى واستحداث في الإعداد السريرية. يتم مسح النموذج الحر، دوكس، إلى حد كبير من الدورة الدموية، ويحد من قدرتها على الوصول إلى موقع الورم بكميات كافية. وعلاوة على ذلك، يرافقه العلاج آثار جانبية حادة والحد من الجرعات، مثل التهاب الفم وفشل القلب. عندما مغلفة في سي الاسمافرون جسيمات نانوية يزيد وقت الدورة الدموية من دقائق إلى أيام2. هذا النوع من المحتوية على الكوليسترول الحويصلية مستقر تماما، ويحدد هذا الاستقرار الدوائية للمخدرات مغلفة.

بيد أن هذا الجمود له جانب سلبي. السامة للخلايا قدرة مركب نحو الخلايا السرطانية الأولى المقيمة في المختبر، وقد ثبت أن دوكس أقوى من فحوصات دوكس-NP في السامة للخلايا3،4. كان الافتراض بأن استقرار الناقل يمنع الإفراج والخلوية الإقبال على المخدرات، وأنه من المفيد للتحقيق في هذه الظاهرة كذلك. خصائص الاسمافرون الجوهرية، بنيت لآخر العناصر العدوانية في مجرى الدم وتصل إلى موقع الورم سليمة، أسفرت عن التوافر الأحيائي البصر من المكونات السامة للخلايا (أي دوكس) في موقع الهدف (أي ورم نواة الخلية). على الرغم من تحسن NP دوكس هارديلي الاستجابة مقارنة بالنموذج الحر، كانت لا تزال ذات قيمة السريرية، كما تغليف إلى حد كبير الآثار كارديوتوكسيك5. في السنوات التالية، تم تغليف المركبات الأخرى في ناقلات نانو6. أيضا، تعديل الناقلين أسفرت عن الإفراج عن المخدرات المشغلة (أي، في موقع الورم) لكنها حافظت على استقرار في7،دوران الدم8. ورغم سنوات من التحقيق والاستخدام السريري، مصائر intratumoral نانوكاريرس مثل دوكس-NP لا تزال غير واضحة تماما. في منشور صدر مؤخرا، فقد ظهر اتخاذ نانوحبيبات ككل بينما دوكس تظل حبيسة lysosomes9.

امتصاص الخلوية لبيان نانوحبيبات والمخدرات هي العمليات الدينامية التي يمكن رصد أفضل استخدام التصوير خلية يعيش. وعلاوة على ذلك، علم الأنسجة الكلاسيكية، في الخلايا التي هي المحتضنة وإصلاحها بعد ذلك، يمكن أن يعطي نتائج خاطئة إذا كان التثبيت يدمر الناقل الاسمافرون ويدخل القطع الأثرية. هو الشرط الرئيسي لتصوير خلية يعيش التصور، ويفضل أن يكون ذلك قبل الأسفار، للعملية المطلوبة. مركبات معينة، مثل دوكس، يكون الأسفار حمراء مضمنة. أيضا، يمكن إدخال علامات مضيئة إلى الناقل، ويمكن تصور العضيات الخلية باستخدام علامات خلية يعيش. وبهذه الطريقة، يمكن تصويرها صفيف المعلمات، مثل الإقبال على الناقل، والإفراج عن المخدرات، والتعريب الخلوية للناقل، والمخدرات، وتحليلها. هنا، يتم وصف أسلوب الذي يتبع مصير بين الخلايا دوكس وأرستها دوكس في العديد من الخلايا السرطانية في الوقت الحقيقي. أيضا، هذا الأسلوب يمكن تكييفها بسهولة لخلق الظروف المثالية المستهدفة (مثلاً، اتهم جسيمات نانوية10) وآثار الإفراج عن المخدرات (مثلاً، hyperthermia7).

Protocol

1-إعداد

  1. تجميع قاعة التصوير، الذي يتألف من جزأين. وضع زجاج الغطاء 25 مم ( الشكل 1A-1) في الجزء السفلي من الدائرة ( الشكل 1A-2)
    1. والمسمار في الجزء العلوي إلى الجزء السفلي ( الشكل 1A-3). لا تشديد صعباً للغاية، كما يمكن كسر الزجاج. اﻷوتوكﻻف الدائرة بأكملها ( الشكل 1A-4)-
  2. إعداد خلية الثقافة المتوسطة بتكميل دولبيكو ' s التعديل النسر ' s المتوسطة (دميم) دون الأحمر الفينول مع 10% مصل العجل الجنين إبطال الحرارة (FCS) ومم 1 لتر-الجلوتامين تحت ظروف معقمة. مخزن في 4 درجات مئوية والحارة إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  3. الحفاظ على الخلايا مع خلية الثقافة المتوسطة في استزراع قوارير باستخدام تقنيات استزراع الخلايا القياسية.
    ملاحظة: هنا، اثنين من خطوط الخلية الماوس وسرطان الجلد B16BL6 11 ولويس الرئة سرطان (LLC)، والأورام الخبيثة البشرية اثنين، بلم و 1F6 12، استخدمت.
  4. جعل الجيلاتين 0.1% من وزنها وتذويب الجيلاتين في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تعقيم الحل عن طريق تصفية فإنه من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 ° C.

2. لوحة الخلايا

  1. إزالة قاعة التصوير من الحقيبة التعقيم في تدفق الصفحي مجلس الوزراء، بعناية تشديد الدائرة، ووضعه في طبق بتري.
    ملاحظة: لتفادي التلوث، الحفاظ على قاعة التصوير في طبق بتري حتى يمكن وضع الدائرة تحت المجهر.
  2. معطف الزجاج في دائرة التصوير مع 1 مل من 0.1% الجيلاتين المعقم لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
    ملاحظة: هذا سوف يسمح مرفق خلية أفضل.
  3. إزالة المتوسطة من قوارير الثقافة الخلية (انظر الخطوات 1.2 و 1.3) ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1 x، وفصل الخلايا باستخدام التربسين 0.25%. إلغاء تنشيط التربسين بإضافة خلية الثقافة المتوسطة وجمع الخلايا وتدور عليهم إلى أسفل في 1,100 س ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند بيليه في 5 مل مستنبت الخلية.
  4. تمييع 20 ميليلتر من تعليق خلية مع 20 ميليلتر من تريبان الأزرق (التي سيتم تناولها بالخلايا الميتة). حساب عدد الخلايا الحية والميتة باستخدام هيموسيتوميتير؛ يجب أن لا يتجاوز عدد الخلايا الميتة 10%-
  5. نضح الجيلاتين ولوحة الخلايا في تمييع يسمح بأقصى قدر تغطية 70% خلال 24 ساعة. على سبيل المثال، استخدام إضعاف 5 × 10 4 أو 10 × 10 4 خلايا في 1 مل. السماح للخلايا للانضمام في 5% CO 2 و 37 درجة مئوية ل 24 h.

3. الوقت الفاصل بين الفحص المجهري ( الشكل 2)

ملاحظة: هنا، يستخدم مجهر [كنفوكل] مع حامل مرحلة حسب الطلب، على الرغم من أن معظم المصنوعات تقدم مجموعة من الحاضنات لخلية يعيش التصوير التي مناسبة أيضا للتحقيق في إيصال الأدوية نانوبارتيكولاتيد-

  1. تقييم الخلايا تحت مجهر كونفلوينسي ومورفولوجيا الخلوية، والتلوث. ضع الدائرة مرة أخرى في الحاضنة 2 CO.
    ملاحظة: كونفلوينسي ينبغي أن لا تتجاوز 70%. إذا مورفولوجيا الخلوية هو غير متناسقة (أي، لا تتقيد الخلايا) أو الكشف عن التلوث، تجاهل قاعة التصوير.
  2. التبديل على المجهر [كنفوكل] ( 1E الشكل-1)، في ضوء الفلورسنت ( 1E الشكل-2)، وجهاز الكمبيوتر ( الشكل 1E-3)-
  3. توصيل المسخن العدسة للهدف وتعيينها إلى 35 درجة مئوية ( الشكل 1E-4 + insert).
  4. إعداد وحدة الحضانة، كما هو مبين في الشكل 1.
    ملاحظة: هذه الوحدة تتألف من مرحلة ساخنة ( الشكل 1 باء-1)، مرحلة تدفق مع موصل لأنابيب 2 CO ( الشكل 1 باء-2) وأول أكسيد الكربون 2 مسبار ( 1B الشكل -3)، وتصحيح إغلاق أحمر ( الشكل 1 باء-4). يتم استخدام هذا التصحيح لإغلاق الوحدة مؤقتاً حتى يتم وضعها في دائرة التصوير-
  5. ضع وحدة الحضانة في مرحلة مجهر
  6. والاتصال في--وخارج-flow CO 2 الأنابيب ( 1E الشكل-5). فتح صمام 2 CO الرئيسي ( 1E الشكل-6)، والتبديل على وحدة تحكم 2 CO ( 1E الشكل-7). تحقق من أن يتم تعيين وحدة التحكم إلى 5% CO 2-
    ملاحظة: للرطوبة، يمر CO 2 مرطب ( 1E الشكل-8). لإجراء التجارب على نقص، يتم تضمين منظم 2 س منفصلة ( 1E الشكل-9) في الإعداد-
  7. تعيين المرحلة درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية ( 1E الشكل-10). للتجارب هايبرثيرميا، وضبط درجة الحرارة إلى 42 درجة جيم السماح وحدة الحضانة للوصول إلى درجة الحرارة المحددة وأول أكسيد الكربون 2 النسبة المئوية-
  8. تأخذ الدائرة التصوير من شركة الرئيسي 2 حاضنة والنقل الدائرة في طبق بتري إلى غرفة الفحص المجهري.
  9. في دائرة التصوير ( الشكل 1A-4) في مصنوعة خصيصا، 35 مم-المرحلة حامل ( الشكل 1A-5) وإغلاق الدائرة مع غطاء ختم مصنوعة خصيصا ( الشكل 1A-6)-
    ملاحظة: الغطاء يسمح CO 2 بالمرور ويمنع التبخر والتلوث.
    1. فتح وحدة الحضانة واستبدال التصحيح الأحمر مع غرفة التصوير، وإغلاق الوحدة ( الشكل 1). القيام بذلك في أسرع وقت ممكن للحيلولة دون تهدئة الخلايا. تأكد من أن لا كبلات عالقون بين المرحلة والمجهر.
  10. مغادرة الوحدة إلى التأقلم للحد الأدنى 30
  11. فتح البرنامج
  12. والتبديل في الليزر-
    ملاحظة: هنا، 488 نانومتر الأرجون، 543 نانومتر الهليوم-نيون وليزر الهليوم-نيون 633 نانومتر واستخدمت-
  13. جعل قاعدة بيانات جديدة بواسطة النقر فوق " الجديدة " تحت علامة التبويب ملف اسم وحفظ قاعدة البيانات.
  14. تعيين التكوين بواسطة النقر فوق " التهيئة " تحت علامة التبويب الحصول على تحديد " وضع القناة " و " مسار واحد " لتقييم فلوروفوري واحد أو " المسار متعدد " لعدة فلوروفوريس. حدد عوامل التصفية المناسبة الفرقة-تمرير مطابقة fluorophore (مثلاً، 560 إلى 615 نانومتر الفرقة تمرير مرشح دوكس والتي أرستها دوكس؛ انظر نتائج ممثلة لمزيد من الأمثلة). قم بتحديد القناة مشرق الحقل في أحد المسارات.
  15. تعيين مسح عنصر التحكم بالنقر فوق " مسح " تحت علامة التبويب الحصول على تعيين حجم الإطار (1,024 x 1,024)، سرعة المسح الضوئي (الأمثل)، مسح الاتجاه (8-بت، واحد)، والمسح الضوئي في المتوسط (4) بواسطة النقر فوق " الوضع. " تعيين الثقب (200 ميكرومتر)، واكتساب وإزاحة ( على سبيل المثال، 580 700 و 835؛ انظر الشكل 3)، والليزر الطاقة (488 = 10 543 = 100 ٪ ٪، 633 = 100%) بواسطة النقر فوق " القنوات. "
  16. حفظ هذه الإعدادات بالنقر فوق " التكوين " في التكوين علامة التبويب وحفظها في قاعدة بيانات التكوين.
  17. تعيين مرور الوقت عن طريق النقر فوق " X الوقت متعدد " ( الشكل 1) في علامة التبويب الماكرو انقر " واحد الموقع ".
  18. حدد
  19. للحفاظ على الخلايا في التركيز، والتركيز الآلي في الماكرو بواسطة النقر فوق " السيارات التركيز. "
    ملاحظة: ضبط تلقائي للصورة يتحقق مع الليزر 633 نانومتر باستخدام انعكاس الزجاج كنقطة مرجعية.
  20. تطبيق التكوين المحفوظ بواسطة النقر فوق " مسار واحد " أو " المسار متعدد، " التمرير إلى التكوين المطلوب في قاعدة بيانات التكوين، تحديد الفترة الزمنية (مثلاً، 15 دقيقة)، عدد عمليات التفحص (مثلاً، 97) و النقر فوق " تحميل الملف Config. "
    ملاحظة: باستخدام هذه الإعدادات، سيتم سلسلة زمنية من 97 × 15 دقيقة = 24 ح.
  21. الاسم مرور الزمن في " "اسم ملف قاعدة" " وحدد قاعدة البيانات (تم في الخطوة 3.11) بواسطة النقر فوق " "قاعدة بيانات الصورة" " لإنقاذ مرور الزمن. تعيين مجلد مؤقت بالنقر فوق " صورة Tmp المجلد. "
    ملاحظة: إذا توقف النظام أو تعطل لأي سبب من الأسباب، الصور الموجودة في هذا المجلد.
  22. فتح وحدة تحضين ورفع الطوق التصوير وإضافة قطره زيت الغمر بالهدف وإغلاق الوحدة بأسرع وقت ممكن. التركيز وتحديد مكانة في قاعة التصوير.
    ملاحظة: هذا الموقف يحتوي على خلايا في أحادي الطبقة، مع حد أدنى من 70% كونفلوينسي، مما يسمح لتصوير الخلايا الفردية-
  23. تحقق من إعدادات التكوين للخلفية
  24. وتصحيحها إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: يمكن تصحيح الخلفية بتقليل قوة الربح أو الليزر. أي تغيير في التكوين تحتاج إلى حفظ (راجع الخطوة 3.17) وتحميلها (راجع الخطوة 3.18) مرة أخرى في الماكرو-
  25. في التدفق الصفحي مجلس الوزراء، تضعف الأدوية المجانية أو جسيمات نانوية في تركيز من 5 ميكروغرام/مل المخدرات أو µmol 0.05 من الدهون في الخلية الثقافة المتوسطة. التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر إذا كانت المخدرات/جسيمات نانوية غير معقمة.
  26. فتح قاعة تحضين ورفع الغطاء الختم وإزالة المتوسطة من الخلايا، وإضافة 1 مل من المخدرات/جسيمات نانوية المخفف وإغلاق الوحدة بأسرع وقت ممكن.
  27. التركيز على الخلايا وابدأ مرور الوقت عن طريق النقر فوق " "وقت البدء" " في ماكرو متعدد الوقت س.
  28. التحقق بشكل منتظم معرفة ما إذا كانت الخلايا لا يزال في التركيز أو استخدام التركيز التلقائي (راجع الخطوة 3، 16). البرنامج يحفظ تلقائياً مرور الوقت في قاعدة البيانات؛ لا تقم بإغلاق قاعدة البيانات أثناء تشغيل البرنامج.

4. تحليل بيانات

  1. اعتماداً على مسألة البحث الأصلي، استخدام برامج مثل إيماجيج لتحليل البيانات (انظر الفرع النتائج للحصول على أمثلة).

Representative Results

وقد وصفها ناقلات الاسمافرون مع علامات مختلفة سبق وصفها9. حاملات المسمى مع بيركلورات تيتراميثيليندوتريكاربوسيانيني استعملنا ديوكتاديسيل (فعلت؛ ت = 644 نانومتر؛ م = 665 nm) أو 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) الخضراء (CF-PE؛ ت = 490 نانومتر؛ م = 515 نانومتر) وترد في هذه المخطوطة. لإظهار أوجه التشابه بين الخلايا والاختلافات في امتصاص الاسمافرون والإفراج عنها، والتعريب داخل الخلايا، وجرت دراسة العديد من أنواع الأورام. وتشمل هذه سطرين الماوس و الميلانوما B16BL611 وسرطان الرئة لويس (LLC)، والأورام الخبيثة البشرية اثنين، المنتشر جداً (بلم) و12،سرطان الجلد غير المنتشر (1F6)13. جميع التجارب التي أجريت باستخدام الخلايا الحية. في جميع التجارب، تدار بتركيز 5 ميكروغرام/مل دوكس أو 5 ميكروغرام/مل NP دوكس µmol 0.05 من جسيمات نانوية لكانت 3 أو 24 h. ميسوريد وتحليل دوكس (في شكل مجاناً أو المفرج عنهم، مغلفة، معزولاً أو المقحم) المشار إليها دكسر. 40 س (الفتحة العددية: 1.3) كان يستخدم عدسة الهدف النفط، وقد أنجز تصوير مع ليزر أرجون 488 نانومتر (10%/0.2 mW الطاقة) ومرشح تمرير نطاق نانومتر 505 إلى 550 لقوات التحالف--PE وعلامة الليزوزومية (LM)-الأخضر. ليزر هيليوم نيون نانومتر 543 (100%/ 0.2 mW الطاقة) وكان يستخدم مرشح تمرير نطاق شمال البحر الأبيض المتوسط 560 إلى 615 دوكس والتي أرستها دوكس الليزوزومية العلامة الحمراء. ليزر هيليوم نيون نانومتر 633 (السلطة/0.5 100% ميغاواط) ومرشح تمرير طويل 640 nm كانت تستخدم لهل.

بسبب أن التغليف، كانوا سيتوتوكسيسيتي في المختبر ، والتوافر البيولوجي والدوائية دوكس تغيير كبير3،،من914. ويتضح الفرق بين التوافر الحيوي للدواء عندما تدار بشكل حر ومغلفة في الشكل 3. دوكس هو وكيل إينتيركالاتينج، ويجب إدخال نواة الخلية لتصبح السامة للخلايا. الشكل 3 ويتصل أفلام 1 و 2 إظهار ح 3 الوقت الفاصل بين الخلايا بلم تعامل مع دوكس أو NP دوكس تحت ظروف مماثلة. في غضون دقائق تعرض دوكس، دكسر النووية يمكن ملاحظتها (الشكل 3 ألف، 1 فيلم)، واستخدام أقل كسب (إدراج)، يمكن رؤية إينتيركالاتينج في النواة. على النقيض من ذلك، عندما تتعرض دوكس-NP، دكسر داخل الخلايا مرئياً لا يكاد ضمن هذا الإطار الزمني (الشكل 3، 2 الفيلم). إلا بزيادة المكسب ضوئي، يمكن ملاحظة دكسر في السيتوبلازم (إدراج). باستخدام إيماجيج، حللت كثافة بكسل دكسر هيولى والنووية. كما الخلايا في الحركة خلال الوقت الفاصل بين التقييم، من المهم أن الجمع بين فلوري مع صور مشرقة الميدانية. وهذا يمثل إمكانية تتبع الخلايا الفردية وتحقيق استقرار س ص-الانجراف باستخدام الإضافات المحددة في إيماجيج. في التحليل الوارد في الشكل 3، استخدمت صورة مشرقة الميدانية لرسم منطقة للفائدة (ROI) حول السيتوبلازم (خط متصل) ونواة (الخط المنقط). ويمكن الاطلاع على إدارة عائدات الاستثمار في إيماجيج في عنصر القائمة تحليل > أدوات > دوروا مدير. وتستخدم هذه رويس في الصورة الفلورية لتحليل كثافة بكسل باستخدام عنصر القائمة تحليل > التدبير. ويؤكد الفرق بين كثافة بكسل في النواة (الشكل 3) والسيتوبلازم (3D الشكل) من الخلايا دوكس أو دوكس-NP-المعالجة بما يعتبر في الصور. أيضا، كانت المحتضنة الخلايا ح 24 مع دوكس أو دوكس-NP، بعد ذلك المجمع كان محله المتوسطة وتصويرها فورا مع زيادة الحساسية لكسب ضوئي (الشكل 4). إعدادات أخرى، مثل طاقة الليزر والإزاحة والثقب وعرض الصورة، كانت متطابقة. إشارة دكسر منخفضة في الخلايا مقارنة بمعاملة دوكس دوكس-NP-تعامل لافت للنظر. استخدام مكسب 700، دكسر في الخلايا دوكس-NP-تعامل يصبح مرئياً، بينما تم تعريض صورة دوكس فعلا. هذه التجربة البسيطة في المختبر يتصور فرقا كبيرا في التوافر الأحيائي الحرة مقابل المخدرات مغلفة.

عندما الخلايا تتعرض باستمرار ل NP دوكس ح 24، دكسر يتراكم مع مرور الزمن، كما هو مبين في الشكل 5A وأفلام 3 و 4. الإشارة يزيد في السيتوبلازم، وفي وقت لاحق، كما وجدت دكسر أولمبية صيفية في النواة. تأكدت هذه الملاحظات بكثافة بكسل الرسومات البيانية (الشكل 5 (ب)). وتبلغ الكثافة يقاس بكسل هيولى أقل في بلم مقارنة بالخلايا 1F6 بسبب الاختلاف في التوزيع داخل الخلايا. بينما يتم توزيع دكسر في الخلايا 1F6 في جميع أنحاء الخلية، يتركز أكثر دكسر في الخلايا BLM في عضية القرب من النواة (الشكل 5).

ولذلك، كان التحقيق في إضفاء الطابع المحلي على المخدرات والناقل في خطوط الخلايا المختلفة (الشكل 6). كانت الخلايا المحتضنة ح 24 مع دوكس-NP/لم والمصورة. استخدام صورة مشرقة الميدانية، تراكب غشاء الخلية (خط متصل) ونواة (الخط المنقط) الانتباه في الصورة الفلورية من ثلاثة خطوط الخلايا المختلفة. يتضح هنا أن الناقل، والمسمى بفعل، يتبع نفس النمط هيولى دكسر: تتركز في عضية القرب من النواة في BLM، حول نواة كاملة في شركة ذات مسؤولية محدودة، وعشوائياً المنتشرة في جميع أنحاء السيتوبلازم في الخلايا B16BL6. في النواة، دكسر وليس فقط يمكن أن ينظر، مشيراً إلى إطلاق سراح دوكس. بالحد من كسب ضوئي، الحويصلات الخلوية الفردية التي تحتوي على دكسر والناقل، المسمى مع، فضلا عن مع قوات التحالف--PE (6B الأرقام وج 6)، يمكن رؤية.

دكسر هيولى تحفظيا في حويصلات صغيرة، وكانت تسمية الخلايا مع علامة الليزوزومية خلية يعيش في الأخضر أو الأحمر. يمكن أن يتبع حركة هذه ليسوسوميس في الخلايا (5 فيلم). دكسر هيولى وفي nanocarrier كولوكاليزي داخل هذه الهياكل، والفرق بين الخلايا في نمط دكسر، كما هو موضح في الشكل 6، ويرد هنا. ليسوسوميس هي موزعة بشكل عشوائي في جميع أنحاء السيتوبلازم في B16BL6، وتقع بجوار النواة في خلايا بلم (الشكل 7 أ). باستخدام إيماجيج، وكولوكاليزيشن بين دكسر والناقل في يحلول حسبت (الشكل 7). الصور الملونة وقدمت ثنائي (عملية > ثنائي > جعل ثنائي)، واستخدام كولوكاليزاتيون في المكونات (تحليل > كولوكاليزاتيون)، وقدم صورة كولوكاليزاتيون من دكسر مع هل. وهذا يخلق صورة ملونة-الأخضر والأحمر والأبيض، مع الأبيض بكسل يمثل بكسل كولوكاليزيد لكل الصور. عن طريق القائمة البند العملية > ثنائي > "جعل ثنائي"، سيتم فصل وتحويلها إلى بكسل سوداء، من خلالها يتم قياس كثافة بكسل بكسل أبيض (تحليل > التدبير). وبعد ذلك، قدم صورة كولوكاليزاتيون بين هذه دكسر-الصورة، وقياس الصورة الثنائية الليزوزومية ماركر (LM) وكثافة بكسل. البيانات كولوكاليزاتيون هو النسبة المئوية للايجابية دكسر بكسل-هل وعلامة دكسر-هل/الليزوزومية (الشكل 7). أن الناقل، والمسمى بقوات التحالف--PE كذلك كما فعلت، يقع في يحلول يرد أيضا في الشكل 7.

Figure 1
رقم 1: الصكوك وإعداد المعدات. A) التصوير الدائرة + الضروريات. 25-مم #1 تغطية الزجاج (1)، الجزء السفلي من الدائرة (2)، أعلى جزء من الدائرة (مكاند رأسا على عقب أسفل) والدائري (3)، ومرحلة حامل (4)، وختم غطاء (5). شريط الحجم: 2 سم. ب) وحدة الحضانة. مجهر ساخنة مرحلة (1)، تدفق مع--وخارج-flow CO2 (2) وتحقيق2 CO (3)، وتصحيح إغلاق (4). شريط الحجم: 2 سم. ج) التصوير الدائرة في وحدة حاضنة، كما يرى تحت المجهر. د) سلسلة متعدد الوقت الكلي. ﻫ) المعدات اللازمة للتصوير. مقلوب المجهر (1)، ضوء الفلورسنت (2)، الكمبيوتر (3)، وخاتم سخان (4، إدراج) وتحكم (4، الشكل الرئيسي)، CO2 تدفق الأنابيب (5)، CO2 صمام (6)، تحكم2 CO (7)، المرطب2 CO (8)، يا صمام2 و وحدة التحكم (9)، ومرحلة درجة الحرارة (10). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: التخطيطي مجهر المعلمات بالتفصيل في القسم 3 من البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: التحقيق في استيعاب قصيرة الأجل دوكس والتي أرستها دوكس.  BLM الخلايا باستمرار تعرض دوكس أو NP دوكس ح 3، وأخذت مرور الزمن. (أ) لا تزال الصور من الوقت الفاصل بين الخلايا المحتضنة مع دوكس. (ب) صور لا يزال الوقت الفاصل بين الخلايا المحتضنة مع NP دوكس. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ج) بكسل الكثافة زيادة دكسر النووية في خلايا دوكس ودوكس-NP-المعالجة. (د) زيادة كثافة بكسل دكسر هيولى في الخلايا دوكس ودوكس-NP-المعالجة. وتمثل البيانات ± يعني SD 3 خلايا في كل حقل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: التحقيق في استيعاب دوكس والتي أرستها دوكس طويلة الأجل في خطوط الخلايا المختلفة. قد تعرضت دوكس أو NP دوكس الخلايا وتصويرها 24 ساعة في وقت لاحق. وقد اتخذت الصور فورا بعد إزالة المخدرات، مع تحقيق مكاسب مختلفة 3. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: التحقيق في الإقبال على الهاتف الخلوي والإفراج عن وكلاء الاسمافرون. الخلايا تعرضوا باستمرار ل NP دوكس ح 24، وقدم مرور الزمن. (أ) لا تزال صور مرور الزمن. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) بكسل الكثافة زيادة دكسر في النواة والسيتوبلازم. وتمثل البيانات ± يعني SD 3 خلايا في كل حقل. (ج) صور تبين توطين دكسر داخل الخلية. خط متصل: غشاء الخلية، والخط المنقط: نواة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: التحقيق في إضفاء الطابع المحلي على الناقل في خطوط الخلايا المختلفة والمخدرات- خلايا (A) كانوا معرضين دوكس-NP/لم ح 24 وتصويرها. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) خلايا كانت معرضة دوكس-NP/هل/CF-PE ح 24 وتصويرها بمكسب كثافة أقل لتمييز حويصلات الفردية. (ج) برايت-الحقل ودكسر تراكب عرض دكسر في حويصلات هيولى (السهم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: التحقيق في التعريب داخل الخلايا للمخدرات والناقل. خلايا تعرضوا دوكس-NP/لم أو قوات التحالف--PE/لم ح 24، وهي تصور lysosomes باستخدام علامة الليزوزومية خلية يعيش (LM) في الأخضر أو الأحمر. (أ) الترجمة داخل الخلايا دكسر والناقل (فعلت). الأسهم تمثل 3 أمثلة دكسر ومترجمة في يحلول. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) التعريب المشارك تحليل دكسر والناقل (هل) في ليسوسوميس (LM) باستخدام إيماجيج. (ج) النسبة المئوية للتعريب المشارك من دكسر والناقل في ليسوسوميس. وتمثل البيانات ± يعني SEM 3 تجارب فردية. (د) عزل الليزوزومية الناقل تصور استخدام علامات مختلفة اثنين. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Movie 1
الفيلم 1: تتصل الشكل 3 : كانت المحتضنة BLM الخلايا مع دوكس حاء 3 الوقت الفاصل بين: الصور 19، مع فاصل زمني لمعدل الإطار دقيقة 10: 3 fps. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Movie 2
الفيلم 2: تتصل الشكل 3 : كانت المحتضنة BLM الخلايا مع NP دوكس حاء 3 الوقت الفاصل بين: الصور 19، مع فاصل زمني لمعدل الإطار دقيقة 10: 3 fps. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Movie 3
الفيلم 3: تتصل الشكل 5 : كانت المحتضنة BLM الخلايا مع NP دوكس ل 24 ه. الوقت الفاصل بين: صور 96، مع فاصل زمني قدرة 15 دقيقة معدل الإطار: 8 في الثانية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن للتحميل.)

Movie 4
فيلم 4: تتصل الشكل 5 : كانت المحتضنة الخلايا 1F6 مع NP دوكس ل 24 h. الوقت الفاصل بين: صور 96، مع فاصل زمني قدرة 15 دقيقة معدل الإطار: 8 في الثانية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Movie 5
الفيلم 5: تتصل الشكل 7 : الخلايا ليسوسوميس B16BL6 كانت ملطخة بعلامة خلية يعيش. الوقت الفاصل بين: 10 صور، مع فاصل زمني 10 س معدل الإطار: 3fps. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Discussion

كما لوحظ في الماضي، التثبيت يمكن أن تدمر نانوكاريرس الاسمافرون على الفور تقريبا ودكسر صدر النموذج هذه الدهنية المدمرة لا يزال لديه الوقت لإدخال النواة، مما يجعل تفسير البيانات صعبة للغاية وحتى مضللة. مع بعض التعديلات المجهرية، يمكن التحقيق مصير العلاج الكيميائي في الخلايا الحية والأنسجة بشكل روتيني لتأكيد أو الإطاحة بالملاحظات النسيجي. وأظهرت ورقة صدرت مؤخرا الإقبال، الإصدار، وتوطين دكسر الخلايا تعامل مع دوكس مجاناً ومغلفة باستخدام خلية يعيش الوقت الفاصل بين التصوير9. ويصف هذا العمل الإعداد التجريبية بمزيد من التفصيل. باستخدام هذا النموذج، فإنه من الممكن تصور النقل الفوري دوكس للنواة، حيث أنها تتراكم باستمرار حتى الخلية يموت في نهاية المطاف. على النقيض من ذلك، عندما يتم استخدام NP دوكس، تم العثور على كميات صغيرة فقط من دوكس المفرج عنهم في النواة. على الرغم من أن التعرض المستمر يؤدي إلى تراكم دكسر المستمر، إشارة الفلورسنت أقل بكثير في دوكس-NP-مقابل دوكس تعامل الخلايا، مما يشير إلى اختلاف في تركيز الخلايا وسيتوتوكسيسيتي لاحقاً. وعلاوة على ذلك، باستخدام علامات خلية يعيش، اتضح أنه عند تعريض الخلايا التي أرستها دوكس، دكسر وفي nanocarrier تقع في يحلول. يشير هذا إلى أن الحويصلية كاملة بالخلية ويوضح تورط طريقا اندوسيتيك أثناء امتصاص هذه الجسيمات النانوية. من الواضح أن دكسر في النواة من دوكس المفرج عنهم. باستخدام هذا الأسلوب، كما دكسر والناقل المشترك تعريب ويبدو أن يكون الشرك في lysosomes، غير لا تزال غير حاسمة عما إذا كان هذا يتم تغليف أو صدر دوكس. فمن الممكن أن يمنع استقرار جوهري نانوحبيبات دوكس الإصدار عند المترجمة في يحلول.

في هذا البروتوكول، يتجلى تصوير الخلية تعيش باستخدام إعداد مجهرية معينة، مع حامل مرحلة مصنوعة خصيصا (المواصفات يمكن أن تعطي عند الطلب). ومع ذلك، معظم المصنوعات مجهر [كنفوكل] نقدم مجموعة من الحاضنات التي تقوم بتصوير خلية يعيش. المحافظة على شروط ثقافة الخلية (أي درجة الحرارة، CO2، درجة الحموضة، والرطوبة، والعقم) هو المعيار الرئيسي لهذه الحاضنات ويتطلب إجراء بعض التجارب الأولية لتحديد الشروط المناسبة، التي يرد مزيد من الشرح. يمكن أيضا تسليم البيانات الآلي اقتناء البرامج التي تصنع نفس. خيار "موقع متعدد" يجعل من الممكن الصورة عدة مناصب في الدائرة نفسها، صقل التحليل الإحصائي. ومع ذلك، يتطلب هذا الخيار في الماكرو المذكورة في هذه المخطوطة مواقع XYZ ثابتة، الذي يضيع إمكانية لتصحيح Z-الانجراف. مسح Z-البعد يمكن إدراجها في هذا الماكرو واستخدامات الطائرة تركيز للتحليل. ومع ذلك، وهذا يتطلب فحص إضافي، وزيادة إمكانية الضيائية وتبيض.

كما هو الحال مع جميع القياسات الفلورسنت، التعرض المفرط مشكلة، خاصة عند مقارنة مجمعين مع امتصاص خلوية مختلفة. كثافة الفلورسنت لا يتوقف عند إشارة المتأصلة في المجمع، ولكن أيضا على معدل الامتصاص والتركيز ووقت التعرض للمخدرات فقط. محتوى الخلايا تعامل دوكس دكسر النووية كما هو موضح في الشكل 3، بالفعل مرئياً، بينما يعتبر أي إشارة في دوكس-NP-تعامل الخلايا. إلا بزيادة الربح يمكن دكسر في الخلايا دوكس NP-المعالجة بتصور، مما يؤدي إلى التعرض المفرط في الخلايا تعامل دوكس. وعلاوة على ذلك، حتى إينتراسيلولارلي، التي أرستها دوكس بين توزع، الذي يمكن أن ينتج أمرا لا مفر منه في ظل-أو التعرض المفرط. خاصة عند التحقيق في فخ دكسر الخلوية، الكسب خفضت إلى حد كبير إلى التمييز بين العضيات الفردية (5B الأرقام و 5 ج). وهكذا، يجب أن تقترن القياسات ممثلة بكثافة بكسل بالصور التمثيلية للتفسير الصحيح للنتائج.

الضيائية، وتبيض، ونسبة الإشارة إلى الضجيج منخفض أيضا قضايا هامة في الفحص المجهري نيون، ويجب وضع حل وسط بين جودة الصورة والحصول على الصورة. ومع ذلك، حتى عند إعداد المجهر الأمثل، جودة الصورة أيضا تحددها إلى حد كبير نوعية الخلايا والمجمع وأضاف. دكسر يعطي إشارة قوية، ومع الاحتياطات المناسبة، تبيض لم يلاحظ، حتى بعد فترات أطول (ما يصل إلى 72 ساعة). ومع ذلك، يمكن الحد إشارة الفلورسنت أيضا نتيجة افلوكس. افلوكس ظاهرة هامة في مقاومة المخدرات15 ويحدث عندما الخلايا لضخ الدواء من موقع العمل داخل الخلايا. ولذلك يمكن أيضا أن انخفاض إشارة مضيئة على مر الزمن نتيجة دوكس افلوكس9. مقارنة إشارة الفلورسنت من موقع غير الممسوحة ضوئياً في نهاية التجربة مع الصورة الأخيرة من سلسلة الوقت الفاصل بين سوف تثبت تبيض (أي الإشارة سوف يكون أعلى في الموقع غير الممسوحة ضوئياً) أو افلوكس (أي، على حد سواء إشارات ستكون متطابقة). وتتوفر العديد من الخيارات الإصلاحية (مثلاً، الخلفية، والانجراف، وتبيض، إلخ) في برامج مثل إيماجيج16. أيضا، كما يزيد من شدة الفلورسنت مع مرور الوقت، يمكن أن إعدادات التكوين قبل تقييم تجربة رائدة للتقليل من التعرض المفرط في نهاية الوقت الفاصل بين (الخطوة 3.21). بدلاً من ذلك، يمكن استخدام دائرة لتصوير مع الخلايا تتعرض فعلا للمخدرات للفترة الزمنية المطلوبة لتهيئة الإعدادات. أخيرا، لهذا النوع من التحليل، ينبغي تجنب تركيزات المخدرات السامة (الخطوة 3.22) وأنشئت قبل استخدام الاختبارات الحيوية التقليدية.

الخلايا بشكل مستمر مثقف وصيانتها في المتوسط دون الأحمر الفينول. فلوريسسيس في الجزء الأحمر من الطيف الأحمر الفينول ويمكن ملاحظتها في العضيات الخلوية، ليسوسوميس على الأرجح، تقديم معلومات إيجابية كاذبة (الخطوة 1، 2). للسماح لرصد خلايا فردية، وينبغي أن لا تتجاوز التقاء الخلية 70% (الخطوة 3.1.). أول أكسيد الكربون2 -سرعة التدفق (الخطوة 3، 5) يحتاج إلى أن ينظم في تجربة التحقق من صحة عندما يتم شراء المعدات أو بعد الصيانة. عندما تكون السرعة عالية جداً، وسوف تتبخر المتوسطة. عند السرعة منخفضة جداً، سيتم زيادة الرقم الهيدروجيني للوسط، التي يمكن أن تؤثر على نمو الخلايا. كما المتوسط دون التغييرات مؤشر الرقم الهيدروجيني الفينول الحمراء في درجة الحموضة لا يمكن ملاحظة وذلك التغاضي عنها بسهولة. حالما يتم التحقق من تدفق2 أول أكسيد الكربون، يمكن أن يتم استخدام هذه الإعدادات في كل التجارب المستقبلية.

باستخدام الطريقة الموضحة هنا، مصير جسيمات نانوية يمكن بسهولة التحقيق باستخدام التصوير خلية يعيش والوقت الفاصل بين الفحص المجهري. في هذا الإجراء، تستخدم جسيمات نانوية المتاحة تجارياً. ولكن مصير ثيرموسينسيتيفي17،10من الدهنية الأيوني؛ الدهنية المخصب مع سلسلة قصيرة شينجوليبيدس18؛ وجسيمات نانوية تغليف المخدرات الأخرى8،19 تم أيضا التحقيق بهذه الطريقة في الورم والخلايا الطبيعية.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

مرافق الفحص المجهري المستخدمة جزء من مركز التصوير الضوئي إيراسموس، ونود أن نشكر موظفي منظمة المؤتمر الإسلامي لخدماتها.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (no phenol-red) Sigma D1145 Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS
Trypsin-versene (EDTA) Lonza BE17-161E
Fetal calf serum Sigma F7524 Heat inactivate for 30 min at 55 ºC
L-Glutamin Lonza BE17-605E
Gelatin from bovine skin Sigma G9391 Make a 0,1% solution in PBS, sterile
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma D8537
Stericup 0,22 µm filter - 500 ml  Millipore SCGPU05RE
Trypan-blue Sigma T8154
Cells: Lewis lung carcimoma ATCC CRL-1642
Cells: B16BL6 Dr. P. Brouckaert, Ghent University donated Ref.10
Cells: BLM and 1F6 Dr. van Muijen, University of Nijmegen donated Ref.11
Petri dish Greiner 664160
Doxorubicin Actavis  mentioned as dox in the manuscript
Doxil/Caelyx Janssen-Cilag mentioned as Dox-NP in the manuscript
Syringe filter 0.2 µm VWR international 10462200
Lysotracker-green DND-26 Invitrogen L7526 mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript
Lysotracker-red DND-99 Invitrogen L7528 mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript
Attofluor cell ring Invitrogen A7816
Cover glass 25 mm #1 Thermo scientific CB00250RA1
Stage holder + sealing lid Custom made
ZEISS LSM 510 microscope Zeiss
Software LSM 510 version 3.2 SP2 Zeiss
Image J NIH https://imagej.nih.gov/ij/index.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Duggan, S. T., Keating, G. M. Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma. Drugs. 71, (18), 2531-2558 (2011).
  2. Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54, (4), 987-992 (1994).
  3. Ten Hagen, T. L., et al. Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats. Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).
  4. Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16, (6), 667-674 (2005).
  5. Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies. Cancer Invest. 22, (5), 663-669 (2004).
  6. Muggia, F. M. Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons. Curr Oncol Rep. 3, (2), 156-162 (2001).
  7. Li, L., et al. Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia. J Control Release. 143, (2), 274-279 (2010).
  8. Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response. J Control Release. 220, 425-437 (2015).
  9. Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging. J Control Release. 172, (1), 330-340 (2013).
  10. Dicheva, B. M., et al. Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells. Nano Lett. 13, (6), 2324-2331 (2012).
  11. Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma. Int J Cancer. 38, (5), 763-769 (1986).
  12. Van Muijen, G. N., et al. Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice. Clin Exp Metastasis. 9, (3), 259-272 (1991).
  13. Das, A. M., et al. Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration. Angiogenesis. 17, (1), 163-177 (2013).
  14. Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109, (3), 442-448 (2004).
  15. Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance. Pharm Res. 24, (11), 2156-2167 (2007).
  16. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
  17. Li, L., et al. Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy. J Control Release. 168, (2), 142-150 (2013).
  18. Pedrosa, L. R., et al. Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids. Pharm Res. 30, (7), 1883-1895 (2013).
  19. Pedrosa, L. R., et al. Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells. Pharm Res. 32, (4), 1354-1367 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics