Glucosinolate निष्कर्षण और विश्लेषण उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी साथ के लिए एक सरल विधि (एचपीएलसी)

Published 3/15/2017
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Grosser, K., van Dam, N. M. A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC). J. Vis. Exp. (121), e55425, doi:10.3791/55425 (2017).

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Abstract

Introduction

यह अनुमान है कि पौधों रासायनिक यौगिकों 1 की 200,000 से अधिक विभिन्न प्रकार का उत्पादन। केवल इन परिसर के अल्पसंख्यक 'पौधों प्राथमिक चयापचय, जो ईंधन के विकास और प्रजनन में एक भूमिका निभा रहा है; बहुमत माध्यमिक चयापचयों तथाकथित रहे हैं। उनके नाम के बावजूद, माध्यमिक चयापचयों अक्सर, संयंत्र अस्तित्व और प्रजनन के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि वे परागण को आकर्षित करने के लिए या रोगज़नक़ों और शाकाहारी 1 खिलाफ संयंत्र की रक्षा के लिए काम करते हैं।

ग्लूकोसाइनोलेट्स माध्यमिक चयापचयों है कि 150 से अधिक वर्षों के 2 के लिए अध्ययन किया गया है की एक बहुत ही विविध वर्ग के हैं। तिथि करने के लिए, 130 से अधिक संरचनात्मक रूप से अलग ग्लूकोसाइनोलेट्स 3 पहचान की गई है। मोटे तौर पर, ग्लूकोसाइनोलेट्स अमीनो एसिड, जहां से वे संश्लेषित कर रहे हैं के आधार पर अलग-अलग वर्गों में विभाजित किया जा सकता है। इण्डोल ग्लूकोसाइनोलेट्स, उदाहरण के लिए, अमीनो एसिड से संश्लेषित कर रहे हैंनियासिन, जबकि फेनिलएलनिन खुशबूदार ग्लूकोसाइनोलेट्स 4 के संश्लेषण के लिए आधार कंकाल प्रदान करता है। कक्षाओं के भीतर, वहाँ संरचनात्मक विविधता है, जो इस तरह के स्निग्ध ग्लूकोसाइनोलेट्स के वर्ग में के रूप में biosynthetic रास्ते में अनुक्रमिक श्रृंखला बढ़ाव कदम है, के बारे में लाया जाता है, या पक्ष श्रृंखला संशोधनों (जैसे, hydroxylation) 4, 5 से की एक उच्च स्तरीय है। एक glucosinolate पौधों की प्रजातियों अप करने के लिए 37 अलग अलग वर्गों संरचनात्मक 6 से संबंधित ग्लूकोसाइनोलेट्स हो सकती है। हालांकि पौधों की प्रजातियों ठेठ glucosinolate प्रोफाइल है, ग्लूकोसाइनोलेट्स के प्रकार के लिए intraspecific भिन्नता अक्सर व्यक्तियों और आबादी 6, 7 के बीच पाया जाता है। बरकरार ग्लूकोसाइनोलेट्स संयंत्र कोशिकाओं की रिक्तिकाएं में जमा हो जाती है और किसी भी aboveground या belowground अंग 7 में पाया जा सकता है, <समर्थन वर्ग = "xref"> 8, 9। सेल टूटना (जैसे, herbivory द्वारा) पर, ग्लूकोसाइनोलेट्स जारी कर रहे हैं और एंजाइम मिरोसिनेज के साथ मिश्रित कर रहे हैं, एक सरसों के तेल बम 10 की स्थापना। मिरोसिनेज की गतिविधि के कारण, और glucosinolate, प्रतिक्रिया की स्थिति, और संशोधित एंजाइमों की उपस्थिति की संरचना पर निर्भर करता है, अलग, तीखा विषाक्त, या हानिकारक यौगिकों ऐसे nitriles और (आईएसओ) Thiocyanates 11 के रूप में गठन कर रहे हैं। प्रतिक्रिया उत्पादों उच्च जैविक गतिविधियों है; उदाहरण के लिए, वे generalist कीट शाकाहारी 12 की भगाने के रूप में सेवा करते हैं। ग्लूकोसाइनोलेट्स की आनुवांशिकता और biosynthetic रास्ते में अच्छी तरह से अध्ययन कर रहे हैं, मुख्य रूप से शाकाहारी और रोगज़नक़ प्रतिरोध, सरसों और पत्तागोभी में स्वाद घटकों के रूप में उनके मूल्य, और उनके नकारात्मक (progoitrin) और सकारात्मक (glucoraphanin) मानव स्वास्थ्य के 5 पर प्रभाव के लिए उनके महत्व की वजह से, 13, 14।

उलट चरण उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) पराबैंगनी (यूवी) या photodiode सरणी के साथ सुसज्जित के आधार पर जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों, निकासी और तरीकों का पता लगाने के रूप में ग्लूकोसाइनोलेट्स में बहुत रुचि के कारण (पीडीए) डिटेक्टरों आमतौर पर 1980 के दशक के बाद से 15 इस्तेमाल किया गया है । इस पद्धति के आधार पर, यूरोपीय समुदाय के लिए एक मानक प्रोटोकॉल है कि तिलहन में ग्लूकोसाइनोलेट्स का विश्लेषण (ब्रेसिका napus, कोल्ज़, कैनोला 16) के लिए परीक्षण किया और कई प्रयोगशालाओं में मान्य किया गया था जारी किए हैं। अन्य (, जैसे ग्लूकोसाइनोलेट्स कि तिलहन बलात्कार में मौजूद नहीं हैं के लिए अतिरिक्त प्रतिक्रिया कारकों का निर्धारण) के द्वारा इस विधि के लिए जोड़े गए 17। Glucosinolate विश्लेषण 18 के लिए तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा एमएस) प्लेटफार्मों और उच्च throughput प्रोटोकॉल की बढ़ती उपलब्धता के बावजूद 19, मूल एचपीएलसी यूवी / पीडीए पद्धति अभी भी व्यापक रूप से वैज्ञानिकों द्वारा प्रयोग किया जाता है। मुख्य कारण हैं कि इस विधि सरल, लागत प्रभावी है, और अपेक्षाकृत एक व्यापक रासायनिक विश्लेषणात्मक ज्ञान के बुनियादी ढांचे के बिना प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ है। इस समुदाय की सेवा करने के लिए, हम यहाँ विस्तार संयंत्र सामग्री से ग्लूकोसाइनोलेट्स की निकासी और एचपीएलसी-पीडीए के साथ उनकी desulfo-रूपों के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल।

Protocol

1. समाधान की तैयारी glucosinolate निष्कर्षण के लिए आवश्यक

  1. एक कांच की बोतल में (ultrapure) पानी में 70% मेथनॉल (MeOH) के 500 एमएल तैयार करें। 100 नमूने और 5 मानकों, 70% की 420 मिलीलीटर के लिए MeOH की जरूरत है।
  2. NaOAc के 0.82 जी या NaOAc एक्स 3 एच की 1.36 ग्राम जोड़कर 20 मिमी सोडियम एसीटेट (NaOAc) (पीएच = 5.5) तैयार 2 ओ पानी की 500 मिलीलीटर में; हाइड्रोजन क्लोराइड (एचसीएल) के साथ पीएच को समायोजित। फ्रिज में NaOAc स्टोर। के लिए 100 नमूने और 5 मानकों, पानी में 20 मिमी NaOAc (पीएच = 5.5) की 370 एमएल की जरूरत है।
  3. स्तंभ सामग्री तैयार करते हैं, पार से जुड़े dextran जेल (प्रकार जी 25) ultrapure पानी के 125 एमएल के साथ 10 ग्राम मिश्रण। एक रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) में जिसके परिणामस्वरूप मिश्रण स्टोर।
  4. sulfatase समाधान की तैयारी
    1. Ultrapure पानी के 30 एमएल में aryl sulfatase की 10,000 इकाइयों (प्रकार एच -1 कुण्डल pomatia से) को भंग करने और पूर्ण इथेनॉल के 30 एमएल (EtOH) जोड़ें। समाधान अच्छी तरह से मिलाएं और एक 250 एमएल केंद्र को हस्तांतरणtrifuge ट्यूब या कई छोटे ट्यूब, उपलब्धता पर निर्भर करता है।
    2. (आरटी) कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 2,650 XG पर मिश्रण अपकेंद्रित्र। एक बीकर सतह पर तैरनेवाला (ओं) को हस्तांतरण; EtOH के 90 एमएल जोड़ने और यह मिश्रण। आरटी पर 15 मिनट के लिए 1,030 XG पर एक या एक से अधिक सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में मिश्रण अपकेंद्रित्र।
    3. supernatants त्यागें। भंग और ultrapure पानी के 25 एमएल के कुल में छर्रों गठबंधन। भंवर में अच्छी तरह से, -20 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रीजर में 1-एमएल ट्यूबों में बांटना, और दुकान; वे कम से कम एक साल के लिए रखना होगा।
  5. sinigrin संदर्भ समाधान की तैयारी
    1. 1-माइक्रोग्राम सटीकता (जैसे, 8.769 मिलीग्राम) के साथ sinigrin monohydrate के 9 मिलीग्राम के आसपास में तौलना। एक 10 एमएल बड़ा फ्लास्क में स्थानांतरण और ultrapure पानी की 10.0 एमएल में sinigrin monohydrate भंग।
    2. शेयर समाधान के molarity गणना और स्टॉक समाधान के गिराए द्वारा 50-750 माइक्रोन के बीच पांच sinigrin संदर्भों तैयार करते हैं। एक विस्तृत उदाहरण के लिए, देखें अनुपूरक फ़ाइल एस 1
    3. 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूबों में अलग-अलग संदर्भों sinigrin बांटना और उन्हें 20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर। प्रत्येक निकासी के बैच में पांच sinigrin संदर्भ की एक श्रृंखला शामिल है। हमेशा जब सांद्रता की गणना के लिए वर्तमान संदर्भों sinigrin इस्तेमाल किया सही molarity मूल्यों का उपयोग करें।

2. निष्कर्षण सेटअप की तैयारी

  1. पाश्चर विंदुक स्तंभों के लिए एक स्तंभ रैक तैयार (स्तंभों की तैयारी के लिए, 3.1 कदम देखें)। रैक या कॉलम लेबल नमूना संख्या का ट्रैक रखने के लिए (चित्रा 1 देखें)।
  2. लेबल 2-एमएल microcentrifuge ट्यूब की एक ही नंबर पकड़े एक ब्लॉक तैयार (3.3 कदम और चित्रा 1 देखें)

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चित्रा 1: glucosinolate निकासी के लिए रैक। सामने का दृश्य (बाएं) और (दाएं) एक स्वयं बनाया स्तंभ रैक और glucosinolate निकासी के लिए ब्लॉक के शीर्ष दृश्य। ऊंचाई: 100 मिमी, के बीच की दूरी को स्थानांतरित कर दिया छेद (पाश्चर विंदुक कॉलम धारण करने के लिए): 30 मिमी (एक्स अक्ष) x 15 मिमी (शाफ़्ट)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. कॉलम और microcentrifuge ट्यूबों की तैयारी

  1. नमूना प्रति एक स्तंभ और पांच sinigrin संदर्भ नमूने के लिए पांच अतिरिक्त कॉलम तैयार करें।
    1. प्रत्येक गिलास पिपेट में, कांच ऊन लगभग 1 सेमी एक्स 1 सेमी का एक टुकड़ा रखें। इस मुद्दे पर जहां पिपेट संकरी करने के लिए कांच ऊन नीचे पुश करने के लिए एक लकड़ी की छड़ी या कांच का प्रयोग करें। कांच ऊन बाहर चलने से स्तंभ सामग्री को रोकने चाहिए, लेकिन बहुत ज्यादा प्रयोग नहीं करते, क्योंकि यह स्तंभों की क्षालन धीमी हो जाएगी। पहनें दस्ताने ककांच ऊन के साथ काम करने एन।
  2. स्तंभ रैक पर कॉलम की जगह (चित्रा 1 देखें)। एक प्रयोगशाला ट्रे (अपशिष्ट ट्रे) में स्तंभ रैक लगातार स्तंभ washes के लिए इस्तेमाल किया eluents को पकड़ने के लिए रखें।
  3. एक प्लास्टिक 1-एमएल विंदुक टिप और पिपेट तैयार स्तंभ सामग्री के 0.5 एमएल की नोक से पहले 5 मिमी कट प्रत्येक स्तंभ में (पानी में जी -25 जेल, 1.3 चरण देखें)। pipetting से पहले अच्छी तरह स्तंभ सामग्री युक्त बोतल हिला। लीक कॉलम (जी -25 सामग्री कांच ऊन परत के माध्यम से बाहर चल रहा है) त्यागें और नए लोगों के साथ बदलें।
    1. स्तंभों में स्तंभ सामग्री pipetting के बाद, सामग्री नीचे फ्लश करने के लिए ultrapure पानी के 1 एमएल जोड़ें।
  4. नमूना प्रति एक 2-एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब और पांच sinigrin संदर्भ नमूने के लिए पांच ट्यूबों तैयार; उन्हें लेबल लगाएं। बाद में फ्रीज सुखाने के लिए टोपियां में छेद बनाने के लिए एक विदारक सुई का प्रयोग करें और के रूप में सटीक एक ही पैटर्न में ट्यूब ब्लॉक में तैयार ट्यूबों की जगहकॉलम (2.2 कदम, चित्रा 1 देखें)।

4. ग्लूकोसाइनोलेट्स की निकासी

  1. (; निकालने में अंतिम glucosinolate सांद्रता संदर्भ वक्र की सीमा में होना चाहिए सूखी वजन के आम तौर पर 50.0-100.0 मिलीग्राम) 2-एमएल में निकटतम 0.1 मिलीग्राम, लेबल, गोल फ्रीज सूखे और पतले जमीन संयंत्र सामग्री वजन -bottom प्रतिक्रिया ट्यूबों। दो छोटे धातु गेंदों (व्यास में 3 मिमी) प्रत्येक ट्यूब उबलते retardants के रूप में जोड़े।
    नोट: प्रोटोकॉल भी ताजा, फ्लैश जमी सामग्री, कि तरल नाइट्रोजन के नीचे जमीन किया गया है और निकासी तक जमी रखा करने के लिए लागू किया जा सकता है। माल 19 में पानी से कमजोर पड़ने के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए 85% तक निकासी तरल पदार्थ की मात्रा में निकासी के लिए तौला और MeOH का प्रतिशत वृद्धि हुई है।
  2. प्रत्येक ट्यूब और भंवर संक्षेप में 70% MeOH के पिपेट 1 एमएल। ट्यूब बंद करें और उन्हें एक गर्म w में के रूप में जल्दी संभव के रूप में रखने से पहले सुरक्षा टोपी के साथ उन्हें सीलकुछ ही मिनटों (~ 5 मिनट) के लिए अटर स्नान (90-92 डिग्री सेल्सियस), जब तक 70% MeOH सिर्फ फोड़े। सावधानी: इस कदम के दौरान सुरक्षा चश्मे पहन लो!
  3. 15 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान में नमूना ट्यूबों रखें। इस बीच, sulfatase लेते हैं और उन्हें आरटी पर पिघलना करने के लिए फ्रीजर में से पांच sinigrin संदर्भ नमूने हैं।
  4. अल्ट्रा sonication के बाद, आरटी पर 10 मिनट के लिए एक benchtop अपकेंद्रित्र में 2700 XG पर नमूना ट्यूबों अपकेंद्रित्र; एक गोली एक ट्यूब में फार्म चाहिए। लेबल स्तंभों के लिए supernatants जोड़ें और अलग-अलग कॉलम पर पांच संदर्भ नमूने पिपेट।
    1. supernatants pipetting, वहीं गोली अधिक अच्छी तरह से टिप रख pipetting संयंत्र सामग्री से बचने के लिए। ध्यान दें कि जब सूखे नमूनों का इस्तेमाल कर रहे हैं, तैरनेवाला मात्रा कम से कम 1.0 मिलीलीटर हो जाएगा।
  5. 70% MeOH के 1 एमएल नमूना ट्यूबों में शेष छर्रों में जोड़ें और 15 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान में उन्हें रखने से पहले नलियों भंवर। नलियों फिर अपकेंद्रित्र, कदम 4.4 में के रूप में, और superna जोड़नेसंबंधित कॉलम को tants; स्तंभ सामग्री के गुणों के कारण, ग्लूकोसाइनोलेट्स के नकारात्मक आरोप लगाया सल्फेट समूह विशेष स्तंभ पर बनाए रखा जाएगा।
  6. तीन अनुक्रमिक चरणों में निष्कर्षों के साथ स्तंभों को धो लें।
    1. पिपेट 2 एक्स 1 प्रत्येक स्तंभ पर 70% MeOH के एमएल। स्तंभ अगले 1 एमएल जोड़ने से पहले सूखी चलाने के लिए इंतजार करना; इस अर्क (जैसे, क्लोरोफिल) से अधिक ध्रुवहीन यौगिकों को हटा देगा।
    2. प्रत्येक स्तंभ के लिए ultrapure पानी के 1 एमएल जोड़कर MeOH बाहर निकलवाने।
    3. पिपेट 2 20 की एक्स 1 एमएल मिमी NaOAc sulfatase प्रतिक्रिया के लिए इष्टतम स्थिति पैदा करने के लिए प्रत्येक स्तंभ के लिए बफर।
  7. अपशिष्ट ट्रे से बाहर कॉलम के साथ रैक ले लो और एक ऊतक के साथ रैक के पैर सूखी। शीशियों और लेबल ट्यूबों के साथ ब्लॉक के ऊपर रैक रखें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक स्तंभ टिप इसी लेबल, 2-एमएल ट्यूब में है (चित्रा 1 देखें)।
  8. sulfatase soluti के 20 μL जोड़ेस्तंभों के लिए पर। सुनिश्चित करें कि sulfatase स्तंभ सामग्री की सतह तक पहुँचता है। NaOAc के पिपेट 50 μL प्रत्येक स्तंभ पर बफर sulfatase नीचे फ्लश करने के लिए। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कॉलम कवर और रात भर खड़े हो जाओ।
    नोट: sulfatase की गतिविधियों के कारण, सल्फेट समूह को हटा दिया जाएगा, स्तंभ से desulfoglucosinolates रिहा इतना है कि वे पानी के साथ elute कर सकते हैं। विस्तृत विवरण के लिए, Crocoll एट अल देखें। 19।
  9. अगले दिन, प्रत्येक स्तंभ पर ultrapure पानी के 2 x 0.75 एमएल pipetting द्वारा desulfoglucosinolates elute। जब सभी स्तंभों सूखी चलाने के लिए है, स्तंभ रैक उठा और प्रतिक्रिया ट्यूबों से हटा दें।
    1. ट्यूब (यकीन है कि वहाँ टोपी में छेद कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें) टोपी और 30 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में या एक में उन्हें रोक -80 सेल्सियस फ्रीजर। फ्रीज सूखे 12-24 H सब पानी निकालने के लिए (नमूनों की संख्या और फ्रीज सुखाने की मशीन की क्षमता पर निर्भर करता है) के लिए नमूने हैं।
  10. <li> फ्रीज सुखाने के बाद, ultrapure पानी का एक सटीक मात्रा (आमतौर पर 1.0 एमएल) में छाछ फिर से भंग। लेबल एचपीएलसी शीशियों के लिए नमूने और पांच sinigrin संदर्भों स्थानांतरण। अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए एक रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) या उन्हें एचपीएलसी के साथ विश्लेषण करने से पहले एक फ्रीजर (-20 डिग्री सेल्सियस) के लिए साइन अप करने के लिए एक साल में नमूने रखें।
  11. कांच हुड के तहत कॉलम रातोंरात सूखे और उन्हें निपटाने जब सूखी। नमूना पुन: उपयोग करने के लिए कदम 4.5 में इस्तेमाल ट्यूब से धातु गेंदों की वसूली और अपशिष्ट निपटान बिन में ट्यूब डाल दिया।

5. निकाले नमूने का माप एचपीएलसी

  1. एक उलट चरण सी 18 कॉलम (4.6 x 150 मिमी, 3 माइक्रोन, 300 ए) एक acetonitrile-पानी ढाल के साथ पर ग्लूकोसाइनोलेट्स अलग और 0.75 एमएल / मिनट की एक प्रवाह है और 40 डिग्री सेल्सियस के एक स्तंभ के तापमान (1 टेबल देखें) । 229 एनएम का पता लगाने और मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करना।
  2. उसी स्तंभ पर है लेकिन एक अनुकूलित ढाल के साथ sinigrin संदर्भों उपायविलायक के उपयोग को कम करने के लिए विधि (2 टेबल देखें)। पांच sinigrin संदर्भों इंजेक्शन लगाने, सबसे कम एकाग्रता के साथ संदर्भ के साथ शुरुआत के साथ शुरू करो। फिर एक मेथनॉल इंजेक्शन (खाली) हर दसवां नमूना के बाद स्तंभ साफ करने के लिए और चोटियों के भार को रोकने के लिए सहित, नमूने इंजेक्षन।
टाइम [मिनट] प्रवाह [एमएल / मिनट] % पानी % बी एसीएन
1 0.750 98 2
35 0.750 65 35
40 0.750 98 2
कॉलम तापमान 40 डिग्री सेल्सियस।

तालिका 1: glucosinolate जुदाई और विश्लेषण करने के लिए Acetonitrile-पानी ढालउलट चरण एचपीएलसी पर है।

टाइम [मिनट] प्रवाह [एमएल / मिनट] % पानी % बी एसीएन
1 0.750 98 2
10 0.750 89.3 10.7
1 1 0.750 98 2
कॉलम तापमान 40 डिग्री सेल्सियस।

तालिका 2: पांच sinigrin ग्लूकोसाइनोलेट्स की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल के संदर्भ की मात्रा का ठहराव के लिए छोटा acetonitrile-पानी ढाल।

6. glucosinolate पहचान और मात्रा का ठहराव

  1. पहचान
    1. व्यावसायिक रूप से लाभ के साथ नमूनों में चोटियों की यूवी स्पेक्ट्रा और प्रतिधारण समय की तुलना करेंसक्षम, शुद्ध glucosinolate संदर्भ। विभिन्न वर्गों से glucosinolate यूवी स्पेक्ट्रा के उदाहरण के लिए चित्र 2 देखें।
    2. , संदर्भ मानकों के साथ या नियंत्रण रेखा एमएस 18, 19 पर अज्ञात ग्लूकोसाइनोलेट्स पहचानें यदि संभव हो तो।
    3. परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), यदि संभव हो तो साथ अज्ञात ग्लूकोसाइनोलेट्स को पहचानें।
    4. चित्रा 2 और 3 टेबल, डेटाबेस, या साहित्य के संदर्भ में उन लोगों के साथ चोटियों की यूवी स्पेक्ट्रा और प्रतिधारण समय की तुलना करें।

चित्र 2
चित्रा 2. यूवी सबसे आम glucosinolate वर्गों के स्पेक्ट्रा। छह desulfoglucosinolates (जीएसएल) की यूवी अवशोषण स्पेक्ट्रा (200-350 एनएम), के रूप में यहाँ वर्णित है, सबसे आम संरचनात्मक वर्गों का प्रतिनिधित्व करने निकाले व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संदर्भ यौगिकों का बना समाधान पर आधारित है। आम का नाम, एसtructural नाम (कोष्ठक के बीच), और संरचनात्मक वर्ग दिए गए हैं। (ए) Sinigrin (2-propenyl जीएसएल), alkenyl; (बी) glucoerucin (4-methylthiobutyl जीएसएल), thioalkenyl; (सी) glucoraphanin (4-methylsulfinlybutyl जीएसएल), sulfinyl; (डी) glucobrassicin (indol-3-ylmethyl जीएसएल), इण्डोल; (ई) gluconasturtiin (2-phenylethyl जीएसएल), खुशबूदार; (एफ) sinalbin (4-hydroxybenzyl जीएसएल), खुशबूदार। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. मात्रा का ठहराव
    1. पांच sinigrin संदर्भ और नमूनों की चोटियों के तहत क्षेत्र को एकीकृत।
    2. एकीकृत क्षेत्र के आधार पर पांच मापी sinigrin संदर्भ की एक अंशांकन वक्र की गणना। प्रतिगमन लाइन के समीकरण का उपयोग करें (देखें समीकरण 1) ग्लूकोसाइनोलेट्स (2 समीकरण देखें) की interpolated राशि की गणना करने।
    3. अलग ग्लूकोसाइनोलेट्स की एकाग्रता की गणना करने के लिए, चुनाव आयोग से 229 एनएम पर interpolated राशि (x) का पता लगाने के लिए प्रतिक्रिया कारक (एम) से गुणा (1990) 16, Buchner (1987) 15, या ब्राउन एट अल। (1993) 17; सबसे अधिक पता लगाया desulphoglucosinolates की आम सहमति प्रतिक्रिया कारकों 3 टेबल में दिए गए हैं।
      नोट: रिस्पांस कारकों के बीच भिन्न हो सकते हैं सिस्टम, इस कारण हो सकता है अलग अलग संदर्भों द्वारा दिए गए मान रहे हैं कि (संदर्भ 15-17 देखें)। फिर भी, मूल्यों ज्यादातर काफी करीब है और संरचनात्मक वर्गों के साथ एक समान रेंज में हैं। सम्मेलन के बाद, 1 से अज्ञात ग्लूकोसाइनोलेट्स की प्रतिक्रिया कारक सेट, हालांकि glucobrassicin और अन्य इण्डोल ग्लूकोसाइनोलेट्स (चित्रा 2) के समान एक यूवी स्पेक्ट्रम के साथ अज्ञात इण्डोल ग्लूकोसाइनोलेट्स के लिए, यह एक प्रतिक्रिया कारक के रूप में 0.25 उपयोग करने के प्राप्त करने के लिए उचित होगाएकाग्रता के लिए एक वास्तविक अनुमान (3 टेबल)।
    4. अंतिम नमूने में ग्लूकोसाइनोलेट्स की राशि (एक्स टी) की गणना करने के लिए, कमजोर पड़ने कारक (डी) और नमूना के द्रव्यमान (डब्ल्यू) खाते में विश्लेषण के लिए इस्तेमाल ले (3 समीकरण देखें)।
      समीकरण (1)
      समीकरण (2)
      समीकरण (3)
      y = पीक क्षेत्र
      मीटर = संदर्भ 5 सूत्री प्रतिगमन वक्र के ढलान
      सी = y अक्ष के साथ प्रतिगमन लाइन के अवरोधन
      एक्स = निकालने में ग्लूकोसाइनोलेट्स की राशि
      एक्स टी = संयंत्र नमूने में ग्लूकोसाइनोलेट्स की एकाग्रता
      डी = कमजोर पड़ने कारक
      Buchner (1987) या ब्राउन एट अल से 229 एनएम का पता लगाने के लिए एम = प्रतिक्रिया कारक है। (1993)
      डब्ल्यू = नमूना के द्रव्यमान निकासी के लिए इस्तेमाल

Representative Results

इस विधि का पता लगाने और सभी संरचनात्मक कक्षाओं में आमतौर पर पाया desulfoglucosinolates की जुदाई (चित्रा 3) सक्षम बनाता है। हानिकारक 2-hydroxyglucosinolate progoitrin अपेक्षाकृत वर्णलेख में जल्दी आता है और स्पष्ट रूप से लाभकारी glucosinolate glucoraphanin, इस नमूने में केवल methylsulfinylglucosinolate से अलग है। Sinigrin, gluconapin, और glucobrassicanapin बढ़ती पक्ष श्रृंखला लंबाई (सी 3, सी 4, और सी 5, क्रमशः) के साथ alkenyl ग्लूकोसाइनोलेट्स की एक eluotropic श्रृंखला के रूप में। इसी तरह की एक तार्किक श्रृंखला दिखाई दे दो methylthioalkenyl ग्लूकोसाइनोलेट्स के लिए, glucoiberverin (सी 3) और glucoerucin (सी 4) है। तीन इण्डोल ग्लूकोसाइनोलेट्स, glucobrassicin की चोटियों और उसके डेरिवेटिव 4-हाइड्रोक्सी और 1-methoxyglucobrassicin (neoglucobrassicin), भी स्पष्ट रूप से अलग हो रहे हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि neoglucobrassicin और glucoerucin की चोटियों, साथ ही gluconasturtiin, केवल खुशबूदार ग्लूकोइस नमूने में sinolate, मिक्स 9 के लिए रूट के अर्क के अलावा की वजह से इस ब्रेसिका निकालने में विशेष रूप से उच्च रहे हैं।

चित्र तीन
चित्रा 3: एक glucosinolate निकालने के chromatogram। एक एचपीएलसी वर्णलेख ब्रेसिका Nigra से संयुक्त जड़ और शूटिंग के नमूने, बी रापा, और बी गोभी के विश्लेषण से उत्पन्न विस्तार (1-32 मिनट)। चोटी के लेबल अवधारण समय और पहचान desulfoglucosinolates के लिए संक्षिप्त (जीएसएल) से संकेत मिलता है। प्रो = progoitrin (2-ओह-3-butenyl जीएसएल); Raph = glucoraphanin (4-methylsulfinlybutyl जीएसएल); पाप = sinigrin (2-propenyl जीएसएल), जी एन ए = gluconapin (3-butenyl जीएसएल); 4OH = 4-hydroxyglucobrassicin; IBV = glucoiberverin (3-methylthiopropyl जीएसएल); GBN = glucobrassicanapin (4-pentenyl जीएसएल); ईआरयू = glucoerucin (4-methylthiobutyl जीएसएल); जीबीसी = glucobrassicin (indol-3-ylmethyl जीएसएल); एनएएस = gluconasturtiin (2-phenylethyl जीएसएल); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अब श्रृंखला methylsulfinyl ग्लूकोसाइनोलेट्स, जो आमतौर पर मॉडल संयंत्र Arabidopsis में पाए जाते हैं, यह भी एक eluotropic श्रृंखला, के रूप में Rorippa austriaca की जड़ निकालने में देखा दिखा। Glucohesperalin (C6), glucosiberin (सी 7), glucohirsutin (सी 8), और glucoarabin (C9) वर्णलेख (चित्रा 4) पर नियमित अंतराल पर दिखाई देते हैं। साथ में चोटियों की यूवी स्पेक्ट्रा के साथ, इस तरह के eluotropic तार्किक श्रृंखला वर्गीकृत करने के लिए, और प्रावधिक की पहचान, अज्ञात ग्लूकोसाइनोलेट्स इस्तेमाल किया जा सकता है।

चित्रा 4
चित्रा 4: chromatogram (फ्रेम 9-30 मिनट) एक Rorippa austriaca रूट निकालने में desulfoglucosinolates की। चोटी के लेबल अवधारण समय और पहचान desulfoglucosinolates के लिए संक्षिप्त (जीएसएल) से संकेत मिलता है। HES = glucohesperin (6-methylsulfinylhexyl जीएसएल); SBE = glucosiberin (7-methylsulfinylheptyl जीएसएल); जीबीसी = glucobrassicin (indol-3-ylmethyl जीएसएल); HIR = glucohirsutin (8 methylsulfinlyoctyl जीएसएल); ए आर ए = glucoarabin (9-methylsulfinylnonylglucosinolate); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

साधारण नाम पक्ष श्रृंखला संरचना आर टी (मिनट) * 229 एनएम संदर्भ #
aliphatiग ग्लूकोसाइनोलेट्स
Glucocapparin मिथाइल 3.5 1 भूरा
Sinigrin 2-propenyl 5.5 1 ब्राउन, चुनाव आयोग
Gluconapin 3-butenyl 9.5 1.11 चुनाव आयोग
Glucobrassicanapin 4-pentenyl 13.5 1.15 चुनाव आयोग
Glucoiberverin 3-methylthiopropyl 10.9 0.8 भूरा
Glucoerucin 4-methylthiobutyl 14.0 0.9 भूरा
Glucoiberin 3-methylsulfinylpropyl 3.7 1.2 भूरा
Glucoraphanin 4-methylsulfinylbutyl 4.9 0.9 भूरा
Glucoalyssin 5-methylsulfinylpentyl 7.6 0.9 भूरा
Glucohesperin 6-methylsulfinylhexyl 10.5 1 भूरा
Glucosiberin 7-methylsulfinylheptyl 13.5 1 भूरा
Glucohirsutin 8-methylsulfinyloctyl 16.8 1.1 भूरा
Glucoarabin 9-methylsulfinylnonyl 20.5 1
Glucocheirolin 3-methylsulfonylpropyl 4.2 0.9 भूरा
Progoitrin 2 (आर) ओह-3-butenyl 4.5 1.09 Buchner, चुनाव आयोग
Gluconapoleiferin 2-ओह-5-pentenyl 8.3 1 चुनाव आयोग
इण्डोल ग्लूकोसाइनोलेट्स
4-hydroxyglucobrassicin 4-hydroxyindol-3-ylmethyl 11.2 0.28 Buchner, चुनाव आयोग
Glucobrassicin indol-3-ylmethyl 15.3 0.29 Buchner, चुनाव आयोग
4-Methoxyglucobrassicin 4-methoxyindol-3-ylmethyl 18.2 0.25 Buchner, चुनाव आयोग
Neoglucobrassicin 1-methoxyindol-3-ylmethyl 22.5 0.2 Buchner, चुनाव आयोग
खुशबूदार ग्लूकोसाइनोलेट्स
Sinalbin 4-hydroxybenzyl 8.1 0.5 Buchner
Glucosibarin 2 (आर) ओह-2-phenylethyl 12.1 अगले देखना
Glucobarbarin 2 (एस) ओह-2-phenylethyl 12.7 0.95 Buchner
Glucotropaeolin लोबान 13.8 0.95 Buchner, चुनाव आयोग
Gluconasturtiin 2-phenylethyl 18.0 0.95 Buchner, चुनाव आयोग
अज्ञात - स्निग्ध / यूवी स्पेक्ट्रम जैसे खुशबूदार 1 चुनाव आयोग
अज्ञात - स्पेक्ट्रम की तरह इण्डोल 0.25 चुनाव आयोग
* लगभग अवधारण समय (आरटी) निकटतम 0.1 मिनट के लिए (± 0.3 मिनट स्तंभ, eluent गुणवत्ता पर निर्भर करता है) गोल। अवधारण बार ThermoFisher / Dionex अंतिम एचपीएलसी प्लेटफॉर्म एक सी 18 कॉलम (150 x 4.6 मिमी, 3 माइक्रोमीटर कण आकार) प्लस सी 18 के साथ सुसज्जित पर निर्धारित कर रहे हैं तालिका 1 में के रूप में precolumn (10 x 4.6 मिमी, 5 माइक्रोमीटर कण आकार) एक ढाल कार्यक्रम के साथ।
प्रतिक्रिया के लिए कारकों # सन्दर्भ: रेपसीड में Buchner, ग्लूकोसाइनोलेट्स में आर (ईडी जेपी Wathelet) 50-58 (Martinus Nijhoff प्रकाशक, 1987); ब्राउन, पीडी, Tokuhisa, जेजी, Reichelt, एम एंड Gershenzon, विभिन्न अंगों और Arabidopsis thaliana के विकास के चरणों के बीच glucosinolate संचय के जे रूपांतर। Phytochemistry। 62 (3), 471-481, doi: 10.1016 / S0031-9422 (02) 00549-6, (2003); चुनाव आयोग। तिलहन - ग्लूकोसाइनोलेट्स उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी का निर्धारण। यूरोपीय समुदायों का आधिकारिक जर्नल। एल 170/28। एनेक्स आठवीं 03.07.27-34 (1990)।

तालिका 3: की प्रतिक्रिया कारकों desulfo-ग्लूकोसाइनोलेट्स सी 18 स्तंभों पर पौधों के अर्क में और उनकी अनुमानित प्रतिधारण बार सबसे अधिक पाया। Eluents, gradienटी, स्तंभ तापमान, और प्रवाह तालिका 1 में के रूप में दर।

Discussion

इस स्थापना की है और व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि का सबसे बड़ा लाभ है कि यह मजबूत, बल्कि सीधी, और नमूना प्रति अपेक्षाकृत कम लागत है। निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए आवश्यक उपकरणों के अधिकांश एक मानक प्रयोगशाला में उपलब्ध होना चाहिए या आत्म बनाया जा सकता है, एचपीएलसी-पीडीए के अपवाद के साथ। एक और लाभ यह है कि पानी में भंग desulfoglucosinolates रासायनिक काफी स्थिर जब शांत और हवा तंग (एचपीएलसी) शीशियों में रखा जाता है, इसलिए अर्क आसानी से अन्यत्र एचपीएलसी विश्लेषण के लिए भेज दिया जा सकता है। नियंत्रण रेखा एमएस प्लेटफार्मों, जो विशेष प्रशिक्षण और व्यापक हाथों पर सॉफ्टवेयर के प्रबंध और डेटा का विश्लेषण करने के लिए अनुभव की आवश्यकता के विपरीत, एचपीएलसी यूवी / पीडीए आसानी से एक छोटी अवधि के प्रशिक्षण के बाद चलाया जा सकता है। यह न केवल प्रक्रिया की लागत कम कर देता है, लेकिन यह भी वैज्ञानिकों का एक व्यापक रेंज, छात्रों सहित के लिए इस विधि और अधिक सुलभ बना देता है।

आम तौर पर, जब प्रक्रियाओं ऊपर वर्णित carefu पालन कर रहे हैंlly, कुछ समस्याएं हो जाना चाहिए। सामान्य तौर पर, glucosinolate चोटियों बहुत अच्छी तरह से वर्णलेख में अलग हो रहे हैं। यदि यह मामला नहीं है, ढाल कार्यक्रम eluent में acetonitrile की वृद्धि की दर को कम करके अनुकूलित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक नया पूर्व स्तंभ (200-500 इंजेक्शन) या स्तंभ (1500 -2000 इंजेक्शन) के निर्माण में इस मुद्दे को हल कर सकते हैं। कभी कभी, एक बैच में एकल नमूनों की chromatograms बहुत छोटे या कोई चोटियों दिखा सकते हैं। जब sulfatase जोड़ना इस pipetting त्रुटियों के कारण आमतौर पर है (उदाहरण के लिए, एक कॉलम को छोड़ दिया गया है या ठीक से sulfatase स्तंभ में नीचे धोया नहीं था)। वैकल्पिक रूप से, प्रयोगात्मक सामग्री में glucosinolate एकाग्रता कम किया गया हो सकता से अधिक की उम्मीद है और बहुत कम सामग्री निकासी के लिए इस्तेमाल किया गया था। उत्तरार्द्ध मामला है, इंजेक्शन की मात्रा 100 μL के लिए बढ़ाया जा सकता है, या निकालने का एक सटीक विभाज्य (जैसे, 800 μL) ध्यान केंद्रित किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध फ्रीज सूखे के द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैनिकालने हैैं, पानी की एक छोटी मात्रा (जैसे, 100 μL) में छाछ भंग, और उसी संदर्भ वक्र का उपयोग reinjecting। निकालने के मूल एकाग्रता के लिए गणना में, संख्या कमजोर पड़ने कारक से गुणा किया जाना चाहिए। यदि यह समस्या का समाधान नहीं है, सामग्री को फिर से शुरू करने और अधिक सामग्री का उपयोग कर निकाला जाना चाहिए। यदि यह 100 से अधिक मिलीग्राम है, निष्कर्षण सॉल्वैंट्स की मात्रा और ट्यूबों के आकार आनुपातिक समायोजित किया जाना चाहिए निकासी दक्षता बनाए रखने के लिए।

एक अतिरिक्त लाभ यह है कि इस विधि को अच्छी तरह से मान्य किया गया है। इसका कारण यह है कि यह रेपसीड में ग्लूकोसाइनोलेट्स की मात्रा का ठहराव, जिसके लिए प्रक्रियाओं और सटीकता के कई प्रयोगशालाओं 16 में पुष्टि की गई के लिए एक मानक पद्धति के रूप में वर्णित किया गया है। इसके अलावा, आनुवंशिक पृष्ठभूमि, जैव संश्लेषण, और ग्लूकोसाइनोलेट्स की जैविक कार्यों आधुनिक में, गहन अनुसंधान के प्रयासों के अधीन हैंदूसरों 4, 6, 12 के बीच में अल पौधों की प्रजातियों Arabidopsis thaliana। इसलिए, sinigrin के संबंध में desulfoglucosinolates की सही मात्रा का ठहराव के लिए कई कारकों प्रतिक्रिया अच्छी तरह से परिभाषित किया है और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध 15,17 रहे हैं। हालांकि लोकसभा एमएस आधारित प्रोटोकॉल अधिक उच्च throughput, और अधिक संवेदनशील होते हैं, और करने में सक्षम हैं (अंतरिम) की पहचान ग्लूकोसाइनोलेट्स जिसके लिए कोई मानक उपलब्ध 18, 19, 20, नियंत्रण रेखा एमएस के लिए सार्वभौमिक प्रतिक्रिया कारकों की कमी सीमा रहे हैं glucosinolate सांद्रता 18 की सही मात्रा का ठहराव। इसके अलावा, इन तरीकों को आम तौर पर एक फ्रीज सुखाने कदम है, और ताजा सामग्री संयंत्र में पानी की मात्रा को शामिल नहीं हैं सटीक मात्रा का ठहराव मुश्किल बना गणना में बेहिसाब है। अन्त में, क्योंकि हमारे निकासी विधि शामिल एक स्तंभ आधारितशोधन और एकाग्रता कदम है, यह भी इस तरह के मिट्टी के रूप में 21 ग्लूकोसाइनोलेट्स की कम मात्रा के साथ "गंदा" नमूने के लिए लागू किया जा सकता है।

नियंत्रण रेखा एमएस आधारित विधियों है कि आमतौर पर हौसले से जमे हुए माल निकालने, निकासी के लिए 96 अच्छी तरह प्लेटें उपयोग करते हैं, और एक sulfatase कदम 18, 19 में शामिल नहीं है की तुलना में हमारे विधि अपेक्षाकृत समय लेने वाली और श्रम तीव्र है। इस पत्र में वर्णित स्तंभ रैक के साथ, एक ही व्यक्ति एक दिन में 100-150 के बारे में नमूने निकाल सकते हैं। क्षालन (अगले दिन), सुखाने फ्रीज (रात में), और फिर से भंग निम्नलिखित दो दिनों के भीतर जगह ले सकते हैं। एक स्वचालित एचपीएलसी इंजेक्टर, इंजेक्शन प्रति 40-45 मिनट की एक रन और संतुलन समय है, और कोई अप्रत्याशित घटनाओं के साथ, यह 3-4 दिन लग इस नमूने सेट के लिए डेटा प्राप्त करने के लिए होगा। एचपीएलसी सॉफ्टवेयर sinigrin वक्र, chromatograms और पीई की एक पुस्तिका की जांच के आधार पर स्वत: मात्रा का ठहराव अनुमति देता है जब100 नमूनों के लिए एके कार्य केवल एक और 1 या 2 घंटे लेने के लिए डेटा सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता से पहले हो सकती है।

glucosinolate मानकों की बढ़ती उपलब्धता के बावजूद केवल 130 से अधिक उम्मीदवारों का एक छोटा सा अंश वर्तमान में व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है। हालांकि, biosynthetic वर्गों में से प्रत्येक के लिए कुछ संदर्भों के साथ; यौगिकों को निर्दिष्ट साहित्य डेटाबेस तक पहुँच पहले से पौधों की प्रजातियों में पाया (जैसे, फाहे एट अल 22।); ऐसे eluotropic श्रृंखला के तर्क के रूप में chromatographic सिद्धांतों के बुनियादी ज्ञान (जैसे, स्निग्ध यौगिकों में पक्ष श्रृंखला पर सीएस की बढ़ती संख्या के लिए, 3 आंकड़े और 4); और नियंत्रण रेखा पर एमएस 19 या पृथक ग्लूकोसाइनोलेट्स एनएमआर 23 पर ही नमूनों की मान्यता, एक बड़ी आसानी से इस सीमा को पार कर सकता है। glucosinolate के लिए सबसे प्रोटोकॉल आंतरिक संदर्भ का उपयोग घटता का विश्लेषण करती है(यानी, निष्कर्षण विलायक 16, 17, 19 के लिए sinigrin की निकासी के लिए या sinalbin एक निश्चित एकाग्रता)। मुख्यतः, आंतरिक संदर्भ घटता अधिक व्यक्ति नमूना प्रसंस्करण त्रुटियों के लिए सही है और इस तरह सैद्धांतिक रूप से एक उच्च परिशुद्धता उपज के लिए उपयुक्त हैं। इस लाभ के बावजूद, हम, एक पांच सूत्री बाहरी संदर्भ वक्र का उपयोग करने के रूप में हम अक्सर (जैसे, ब्रेसिका Nigra 24) या sinalbin (जैसे, Sinapis अल्बा 25), विभिन्न जंगली प्रजातियों, जिनमें से कुछ sinigrin के उच्च स्तर को रोकने का विश्लेषण पसंद करते हैं दो glucosinolate संदर्भों जिसके लिए प्रतिक्रिया कारकों उपलब्ध हैं। इसके अलावा, प्रत्येक नमूने के आंतरिक मानकों उनका कहना है, विश्लेषण की लागत बढ़ जाती है के रूप में उच्च ग्रेड glucosinolate संदर्भ मानकों आम तौर पर काफी महंगे हैं।

अंत में, समय लेने वाली कदम के बावजूद, इस प्रोटोकॉलनिकालने के लिए और संयंत्र के नमूने में ग्लूकोसाइनोलेट्स यों तो एक सीधा और सुलभ तरीका प्रदान करता है। हालांकि, यह विचार करना है कि glucosinolate स्तर खुद प्रतिक्रिया उत्पादों में संभावित जैविक गतिविधि का केवल एक संकेत है, आवश्यकता मिरोसिनेज के साथ प्रतिक्रिया के रूप में देखा है, और बदलाव के लिए एक एकल glucosinolate 11 से उत्पन्न हो सकती हैं महत्वपूर्ण है। मान्यकरण assays जैविक प्रासंगिकता पुष्टि करने के लिए किया जाना चाहिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade VWR 20864.320
Sodium acetate (NaOAc) Sigma-Aldrich W302406-1KG-K
HCl VWR 1.09057.1000
Sephadex Sigma-Aldrich A25120-10G
(−)-Sinigrin hydrate
from horseradish 
Sigma-Aldrich S1647-500MG
Aryl Sulfatase Sigma-Aldrich S9626-10KU
Ethanol VWR 20816.298
Pasteur Pipette Carl Roth 4518.1
Glass Wool Carl Roth 7377.1
Glass/wooden stick VWR HERE1080766
2 mL reaction tubes VWR 211-2120
Dissecting needle Carl Roth KX93.1
Rotilabo-lab dishes Carl Roth 0772.1 Waste tray
Rotilabo-sealing clips Carl Roth N217.1
Freeze Dryer Freezone 12 L Labconco 7960030
Acetonitril super gradient grade VWR 83639.320
Water bath VWR 462-5112
Ultrasonic bath Fisher Scientific FB 15061
PH Electrode Thermo Fisher Scientific STARA2115
Centrifuge Heraeus Multifuge X1 Thermo Fisher Scientific 75004210
Pre-Column Thermo Fisher Scientific 69697 C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) 
Column Acclaim 300 Thermo Fisher Scientific 60266 C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) 
HPLC Ultimate 3000 Thermo Fisher Scientific with column oven and UV or PDA detector
Flask 1,000 mL VWR 215-1595
Glucosinolate reference compounds Phytoplan various http://www.phytoplan.de/

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References

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