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생체 외에서 그리고 Vivo에서 T, B 및 골수성 세포 진압 활동 및 이식 받는 체액 응답의 평가

Immunology and Infection

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Summary

여기, 선물이 프로토콜을 이식, 허용 오차를 유발 하 고 생체 외에서 그리고 vivo에서 평가 받는에서 고유한 셀 하위 집합의 진압 용량 및 기증자 또는 외 인 항 원 받는 사람의 면역 상태.

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Bézie, S., Usal, C., Guillonneau, C. In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients. J. Vis. Exp. (126), e55510, doi:10.3791/55510 (2017).

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Abstract

이식에서 주요 관심사는 규정 하는 세포의 유도 통해 특정 공차를 달성 하기 위해입니다. 허용 오차 메커니즘의 이해 안정적인 모델을 필요합니다. 여기, 우리 costimulation 신호 봉쇄 또는 유전자 전송을 통해 immunoregulatory 분자의 upregulation에 의해 유도 된 쥐에 심장 이식에 관용의 모델을 설명 합니다. 이 모델의 각 규제 T 세포 (Tregs), 규정 하는 B 세포 (Bregs) 등 규제 골수성 세포 (RegMCs) 규정 하는 세포의 생체 내에서 세대 수 있습니다. 이 원고에서 식별 하 고 관용 유도 및 유지 관리. 에 그들의 책임을 확인 하기 위해 생체 외에서 그리고 vivo에서 규제 세포 활동을 정의 하는 데 사용 된 두 개의 보완 프로토콜 설명 첫째, 생체 외에서 진압 분석 결과 복용량 의존 방식에서 이펙터 면역 반응에 진압 용량 세포의 급속 한 식별을 허용 하 고 cytokine 측정 또는 세포 독성 등 추가 분석에 사용할 수 있습니다. 둘째, 새로 비친된 이식할된 받는 사람에 게 관용 대우 받는 사람에서 세포의 입양 전송 감독 이식 면역 반응 제어 및/또는 변환 하는 새로운 규정 하는 세포 (이러한 셀의 tolerogenic 속성을 강조 되 나 전염 성 관용). 이러한 방법은 알려진 phenotypic 표식이 셀에 제한 되지 않으며 모든 세포 인구를 확장할 수 있습니다. 또한, 기증자 감독 규제 셀 (필드에 중요 한 목표)의 allospecificity 제 3 자 기증자 세포를 사용 하 여 평가 될 수 있다 또는 이식 체 외에서 또는 vivo에서. 마지막으로,이 규정 하는 세포의 특정 tolerogenic 용량을 확인 하려면 우리 체액 항 기증자 항 체 반응과 새로운 또는 이전 알려진된 항 원에 대 한 체액 응답을 개발 하는 받는 사람의 용량을 평가 하기 위해 프로토콜을 제공 합니다. 설명 하는 관용의 모델 추가 규제 셀, 새로운 생체 및 immunoregulatory 분자 식별 하 하 사용할 수 있습니다 그리고 다른 이식 모델 또는 쥐 또는 인간 자기 면역 질병에 적응할 수 있다.

Introduction

쥐의 심장 이식 관용 유도 및 유지 관리의 메커니즘을 해독 하는 관용 유도 치료를 평가 하기 위해 신뢰할 수 있는 장기 이식 모델 이며 기능적으로 유능 하 고 지배적인 규정 하는 세포를 유발 가능성이 있다. 프로토콜 아래 루이스 1A 받는 사람 쥐 (LEW.1A, RT1는)으로 완벽 하 게 불일치 heterotopic 심장 이식 루이스 1W 기증자 쥐 (LEW.1W, RT1u)에서 설명합니다. 이 이식 조합에서 급성 거부 빠르게 (약 7 일)에서 발생 하 고 이식 박동 복 부의 촉진을 통해 측정 하 여 쉽게 평가 될 수 있다. 여기 우리는 쥐에 심장 이식에 관용을 유도 하는 세 가지 프로토콜을 제안 합니다. 이 모델에서 공차는 유도 및/또는 다른 규제 셀에 의해 유지. 첫째, CD40 CD40L 상호작용 CD40Ig 인코딩 하는 아 데 노 바이러스의 차단 CD8의 생성을 유도 하는 (AdCD40Ig)+ Tregs 허용 때 adoptively 유도 전송 보조 이식할된 받는 사람1. 또한, CD8의 고갈+ AdCD40Ig 치료 받는 사람 생성 된 Bregs 및 RegMCs2(와 반대로 CD8α 항 체) 세포. CD8의 깊은 분석+ Tregs 속성 인터 루 킨-34 (IL-34) 및 Fibroleukin-2 (FGL-2)3,,45,6로 정의 하는 여러 immunoregulatory 분자의 중요 한 역할을 강조 . 반면 (AAV 벡터)와 IL-34의 overexpression RegMCs의 세대를 통해 Tregs 유도, FGL-2의 overexpression 유도 Bregs, 규정 하는 세포의 복잡 한 네트워크를 기본.

만성 거부 천천히 개발 하 고 장기는, 때문에 만성 거부 대 공차를 구별 하는 심층 분석 필요 합니다. 이식 세포 침투에 대 한 평가 일반적으로 섬유 증, 혈관 벽 및 보완 C4d 증 착의 immunohistology7에 의해 두껍게. 조직학 방법 동물 희생을 요구 또는 생 검 이식, 여기 우리가 용납된 이식의 다양 한 기능을 평가 하는 간단한 방법 설명: 출현 그리고 규정 하는 세포와 혈액에서 항 기증자 특정 항 체 응답의 기능 cytometry에 의해 샘플 (여기, 우리 형광 활성화 된 세포 (FACS) 정렬 사용).

공차는 이식 치료의 체포 후의 유지 보수 규제 세포8의 유도와 일반적으로 연결 됩니다. 마지막 십 년간에서 연구에 초점을 맞춘 CD4+Tregs 만장일치로 그들 키 마커로 Foxp3+, CD25높은, 그리고 특징 CD127-9,,1011. 마찬가지로, 여러 마커 CD8에 기인 했다+ CD122 같은 Tregs+, CD28-, CD45RC낮은, PD1+, 헬 리오스+ 1,12,,1314 , 15 , 16 , 17. 년, GITR, CTLA4, 및 cytokines의 표현 (IL-10, TGFβ, 일리노이-34, IL-35, FGL-2)는 Treg 프로필3,4,6,13, 또한 연결 했다 18,19,,2021. 그러나, Bregs, RegMCs, 또는 NKTregs, 같은 신흥 규제 세포 인구 관련 특정 마커 부족합니다. 실제로, Bregs는 주로 보고 미 숙 CD24+ 세포, 모호한 CD27 식 및 때때로 IL-10, TGFβ, 또는 granzyme B22,,2324의 생산. 골수성 세포 계보의 복잡성 CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a, 또는 CD16325,26등 규제 또는 proinflammatory 그들의 프로필을 정의 하는 여러 마커의 조합을 요구 한다. 마지막으로, 일부 마커 NKTregs CD11b 등을 식별 하기 위해 보고 된+, CD27+, TGFβ+, 하지만 더 많은 연구 하는 데 필요한 추가 phenotypically 설명27,28,29 ,30,,3132. 따라서, 진압 활동의 증거 추가, 새로운 바이오 마커의 식별 phenotypic 설명 합법화 하는 데 필요한 새로운 immunoregulatory 중재자, 새로운 세포 치료의 범위를 확장 하 고.

셀의 진압 활동을 평가 하는 두 가지 보완 방법 제안 한다. 첫째, 생체 외에서 메서드 표시 효과 기 T 세포 수용자 기증자 항 원 제시 세포 (Apc) 다른 비율 6 일 동안에 의해 자극된 된 진압 세포 배양으로 구성 되 고는 이펙터 분석 T 세포 확산을 기증자 감독 면역 억제를 반영 한다. 세포 치료 쥐에서 직접 셀에 순진한 쥐 및 진압 활동에 대 한 (또는 다른 규제 셀 인구), 치료 비 이식할된 쥐에서 억압: 이펙터 비율의 범위에서 비교할 수 있습니다. 또한,이 방법은 어떤 이식 필요 하지 않습니다 및 결과 6 일 이내에 얻을 수 있습니다. 둘째, vivo에서 메서드는 새로 비친된 이식할된 받는 사람에 게 의도 된 규정 하는 세포 치료 쥐에서 전송 이루어져 있다. B 세포, 골수성 세포 또는 T 세포에서 치료 비 순 쥐가 일반적으로 급성 거부 하 고 입양 전송 시 이식 생존을 머리말을 붙이는 수, 취급 받는 potentiated 진압 활동 세포는 이러한 특성 1,2,3,,433. Lymphopenia 받는 방사선에 의해 유도 된 혈액 항상성 영향을 받지 남아 adoptively 전송된 셀 안티 기증자 면역 응답을 보다 쉽게 습득 하도록 허용 하는 것이 좋습니다. 두 방법, 수용자의 생체 외에서 이용 가능 하 여 타사 Apc 또는 vivo에서 입양 양도 진압에 대 한 받는 사람 제 마음으로 투입으로 셀 안티 기증자 특이성의 분석을 수 있습니다. 하지만 비보에 방법 상당수 셀, 제대로 표현 해야 진압 활동 생체 외에서33셀 부분 모집단을 보다 쉽게 평가 수 있습니다.

체액 응답 또한 관용의 상태 및 기증자 항 원에 대 한 감독된 항 체 응답의 평가를 측정할 수 있습니다. 실제로, 공차 기증자 향해 체액 반응의 부재 하지만 새로운 항 원에 체액 응답을 개발 하는 받는 사람에 대 한 능력의 보존 및 메모리 응답의 보존에 의해 특징 수 있습니다. 첫째, alloantibody 검출의 원리의 기증자 세포 혈 청 부 화 이식할된 받는 사람에서 다음 받는 사람 항 체에 의해 기증자 세포의 인식에 기반. 둘째, 체액 응답 외 인 항 원에 감독의 장기 허용 받는와 열쇠 구멍 삿 Hemocyanin (KLH) 완전 한 Freund의 보조 제와 유화 평가 다음 자극 될 수 있습니다. 특정 항 원에 대하여 IgM와 IgG 항 체의 존재 감지할 수 있습니다 4와 13 일 각각, 면역, 효소 연결 된 ImmunoSorbent 분석 결과 (ELISA)34와 함께 다음. 셋째, 면역 메모리 응답의 보존-7 및 3 일 이식의 Rbc + 8 및 17 다음 이식 받는 사람 혈 청 일에 수집된으로 얼룩 xenogeneic 적혈구 (Rbc)의 주입에 의해 평가 될 수 있다. 이러한 모든 메서드는 특정 보조 항 체와 FACS 얼룩에 의해 미만 1.5 h에 결과의 신속한 취득 또는 ELISA에 의해 몇 시간을 사용 하 여 면역 글로불린의 식별에 대 한 수 있습니다.

마지막으로, 이러한 프로토콜 이식 모델의 특성을 위해 디자인 되 고 어느 정도까지, 자가 면역 질환 모델에 적용 될 수 있습니다. 방법의 원리는 모든 수 종 조 변경 될 수 있습니다.

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Protocol

참고: 모든 프로토콜 여기 윤리 위원회에 의해 승인 되 고 살 균 방식으로 수행 되어야 합니다.

1 쥐의 심장 이식의 모델에 관용의 세대

  1. LEW.1W LEW.1A 이식 절차
    1. Anesthetize LEW.1W isoflurane O2 흡입, 1% N2O 5 분 장소 등 decubitus에 동물 후 보충을 사용 하 여 쥐 하 고는 thoracotomy 수행 하는 betadine와 복 부를 소독 기증자 남성 (, 절 개에는 흉 막 공간 가슴의)입니다.
      1. 열 등 하 고 우량한 대 cavae 클램프, ligature 그들, 그리고 그들을 잘라. 그리고 폐 동맥과 대동맥을 잘라 차가운 0.9%에는 이식 저장 NaCl.
    2. 250 g 남성 LEW.1A 받는 사람 쥐 (8 ~ 12 주)의 1% N2O 5 분 동물 등 decubitus 놓고 xyphopubic 개복 술을 수행 하는 betadine와 복 부를 소독 한 후 보충 isoflurane O2 흡입을 사용 하 여 anesthetize (, 큰 절 개 음모 관절을 칼 과정에서).
      1. 내장을 외부화, 복 부 혈관 클램프, 수행 하는 termino-옆 문 합 (즉, 한 채널의 끝과는 다른 벽 사이의 연결) 사이 폐 및 이식 대동맥 그리고 복 부 대동맥 사이 동맥 정 맥 베 나 복 부, 그리고 제거 클램프.
    3. Suture 근육 비행기와 피부, 그리고 betadine와 소독.
    4. Nalbuphine (진통제)을 주사 6 mg/kg 피하 (사우스 캐롤라이나) 및 oxytetracycline (항생제) 피하 (인스턴트 메신저), 동물 깨어난다 때까지 열 램프 아래에서 동물을 놓습니다. Buprenorphine (opioid) (50 µ g/k g) 인스턴트 메신저 및 meloxicam (비 스테로이드 항 염증 제 약) 주입 (0.3 mg/kg) 사우스 캐롤라이나 이식 후에 1 일의 하루.
  2. Costimulatory 상호 작용의 봉쇄 대에 의해 허용의 유도
    1. 1.1.1 단계. 1.1.2을.
    2. 동물의 분류 a 2 지역에서 희석 AdCD40Ig의 2 x 1010 전염 성 입자 (는 아 데 노비 루스 CD40Ig, CD40 CD40L 상호 작용을 차단 하는 공상 분자를 인코딩) 150 µ L의 최종 볼륨을 도달 하 벨의 젖 산 솔루션 그리고는 이식의 꼭대기의 심 실 벽에 3 포인트 (3 x 50 µ L) 주입.
    3. 1.1.3 1.1.4 단계.
      참고: AdCD40Ig 치료 안티-CD8α, 안티-ICOS, 또는 안티-CD28 항 체 주사2,,3536연관 될 수 있습니다.
  3. 재조합 형 단백질의 overexpression에 의해 허용의 유도
    1. 1 x 1012 바이러스 성 게놈 쥐 100 µ L의 최종 볼륨을 도달 하 벨의 젖 산 솔루션 IL34 재조합 AAV isoflurane O2 흡입와 150 g LEW.1A 쥐를 Anesthetize 하 고 정 맥 주사의 희석 (i.v.) 음 경 정 맥에서.
    2. 한 달 AAV IL34 주입 프로토콜 1.1에 따라 LEW.1A 받는 사람에 LEW.1W 이식을 수행 합니다.

2. 체 외에서 세포 혼합된 세포 반응 (다연장)에 의해 진압 활동의 평가

참고: 세포 치료 허용 쥐에서의 진압 활동 syngeneic 이식할된 받는 사람이 나 순진한 쥐 동등한 인구와 비교 한다.

  1. 수용자 APCs의 격리: plasmacytoid 수지상 세포 (pDCs)
    1. 남성 LEW.1W 순진한 기증자 쥐 isoflurane O2 흡입, 1% N2O 5 분 동물 등 decubitus 놓고는 splenectomy 수행 하는 betadine와 복 부를 소독 한 후 보충을 사용 하 여 anesthetize 혈관을 transecting 하 여 비장을 제거, 감기 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) X에서 비장을 저장 하 고 동물을 봉합.
    2. 접시에 비장 전송, 1 X PBS를 제거 하 고 0.2% 콜라 디의 5 mL와 함께 perfuse 효소 소화 개선, 비장을 작은 조각으로 잘라 하 고 37 ° c.에서 15 분을 품 어
    3. 0.1 m M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 500 µ L을 추가 하 고 체에 비장 조각을 전송 비장 세포를 해리 하는 주사기의 피스톤과 호감. 튜브로 전송 및 1 X PBS의 15 mL로 세포 세척. 430 x g.에서 10 분 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.
    4. Rbc 및 혈소판 제거, 10ml 소형 솔루션에서 splenocyte 펠 릿 resuspend 하 고 실 온 (RT)에서 5 분을 품 어. 1 X PBS로 세척 하 고 190 x g. 삭제는 상쾌한에서 10 분 원심.
    5. 100 µ m 조직 필터에서 필터링 하 여 콜라겐 섬유를 제거 합니다. 5 x 107 셀/ml 1 X PBS/2% 송아지 태아 혈 청 (FCS) / 0.5 m EDTA m 세포 농도 조정 하려면 셀을 계산 합니다.
      참고: splenocytes의 수는 4 × 108 및 7 x 108 셀 사이 이어야 합니다.
    6. 셀 정렬 하기 전에 부정적인 선택에 의해 관심사의 세포에 대 한 풍부. 2 µ g/mL 정화 항 체 T 세포 (안티-TCRαβ, R7/3 클론, 및 안티-TCRγδ, V65 클론), (안티 CD45RA, OX33 클론), B 세포 및 NK 세포와 4 ° C에서 15 분을 품 어 (CD161, 안티 3.2.3 복제), 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA로 세척 하 고 430 x g에서 10 분 원심 . 폐기는 상쾌한.
    7. 3 번 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA와 자석 구슬을 가진 세척. 3.5 µ L 구슬/106 splenocytes를 사용 하 여, 30 mL 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA, 자석에 1 분을 위한 장소를 추가 하 여 세척 하 고는 상쾌한 삭제. 두 번 반복 합니다. 10 권 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA의 구슬 resuspend (35 µ L 구슬 350 µ L 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA에에서 희석 되는 예를 들어).
    8. 동요에서 4 ° C에서 10 분 동안 자기 구슬과 splenocytes를 혼합 하 여 원치 않는 셀을 제거, 튜브 1 분에 대 한 자석에 놓고는 상쾌한 새로운 튜브에 전송 합니다. 두 번 반복 합니다. 셀을 계산 하 고 5 x 107 셀/ml 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA에에서 셀 농도 조정 합니다.
      참고: 풍부한 splenocytes 번호 5 x 107 , 9 x 107사이 범위 합니다.
    9. 추가 Pdc의 정렬에 대 한 분류 항 체를 사용 하 여 셀을 얼룩: (안티-TCRαβ, R7/3 클론) 나머지 T 세포 B 세포 (안티 CD45RA, OX33 클론)를 제외 하 고 CD4 정렬+ (안티-CD4, OX35 클론) CD45R+ (안티-CD45R, His24 클론) 세포. FACS에 보상 매트릭스를 설정할 각 Ab와 구슬 레이블. 4 ° C에서 15 분을 품 어 그리고 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA로 씻어.
    10. Resuspend 5 x 107 셀/mL, 60 마이크론 조직 필터에는 필터의 농도에서 세포 및 0.1 µ g/mL의 최종 농도에 DAPI를 추가 하 여 죽은 세포를 레이블. DAPI--TCR CD45RA에 게이팅 70 µ m 노즐 셀 정렬 셀 정렬-CD4+CD45R+ 그림 1에서 보듯이.
  2. 응답자 효과 기 T 세포의 고립 (CD4 + CD25 - T 세포)
    1. 치료 비 투입 비 순 LEW.1A 쥐에서 비장을 수확 하 고 차가운 1에 저장 X PBS.
    2. 접시에 배치 체에서 비장 전송 고 1 X PBS의 10 mL를 추가 합니다. 비장 세포를 해리 하는 주사기의 피스톤과 호감. 50 mL 튜브에 세포를 전송, 1 X PBS로 세척 하 고 430 x g. 삭제는 상쾌한에서 10 분 원심.
    3. Rbc와 혈소판 제거, RT 5 분 10 mL 소형 솔루션에서 splenocyte 펠 릿 resuspend, 1에서 다음 세척 X PBS와 원심 분리기에서 10 분 190 x g. 폐기는 상쾌한.
    4. 100 µ m 조직 필터에서 필터링 하 여 콜라겐 섬유를 제거 합니다. 5 x 107 셀/ml 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA에에서 셀 농도 조정할 셀을 계산 합니다.
      참고: splenocytes의 수는 3 x 108 , 5 x 108 셀 사이 이어야 합니다.
    5. 정렬 하기 전에 관심사의 세포를 풍부. 2 µ g/mL 정화 항 체 (안티-CD8α, OX8 클론) CD8 세포, B 세포 (안티 CD45RA, OX33 클론), NK 세포에 4 ° C에서 15 분을 품 어 (CD161, 안티 3.2.3 복제), 골수성 세포 (안티-CD11b/c, OX42 클론), 감마 델타 T 세포 (안티-TCRγδ, V65 클론). 다음 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA로 세척 하 고 430 x g.에서 10 분 원심 분리기는 상쾌한 삭제.
      참고: 정렬 자연 CD8+ Tregs 순진한에서 CD4로 동시에 쥐+ 효과 기 T 세포 고갈 동안 안티 CD8α Ab를 추가 하지 마십시오.
    6. 3 번 단계 2.1.7에에서 설명 된 대로 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA와 자석 구슬 워시.
    7. 동요에서 4 ° C에서 10 분 동안 자석 구슬을 가진 splenocytes를 혼합 하 여 원치 않는 세포를 제거 다음 튜브 1 분에 대 한 자석에 놓고는 상쾌한 새로운 튜브에 전송 합니다. 두 번 반복 합니다. 셀을 계산 하 고 5 x 107 셀/ml 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA에에서 셀 농도 조정 합니다.
      참고: splenocytes 번호는 5 x 107 , 8 x 107 셀 사이 범위 합니다.
    8. 레이블이 지정 된 항 체를 정렬 CD4+CD25 추가- T 세포: CD4 안티 안티-TCRαβ (R7/3 클론), (OX35 클론), 안티-CD25 (OX39 복제)와 4 ° c.에서 15 분을 품 어 동시에 CD8 정렬 하려면+CD45RC낮은 Tregs, 추가 안티-CD45RC Ab (OX22 복제). 구슬 cytometry에 추가 처리를 위해 보상 매트릭스를 설정 하려면 각 Ab와 레이블을 지정 합니다. 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA와 셀을 세척 하 고는 상쾌한 삭제.
    9. 5 x 107 셀/ml, 60 마이크론 조직 필터에 필터 셀 resuspend 및 0.1 µ g/mL의 최종 농도에 DAPI를 추가 하 여 죽은 세포를 레이블. TCR DAPI -+CD4에 게이팅 70 µ m 노즐 셀 정렬 셀 정렬+CD25 응답자 셀으로- 세포 (TCR DAPI -+CD4 필요한 경우-CD45RC낮은 CD8+ Tregs 진압 셀) 그림 2와 같이.
  3. 진압 세포의 고립
    참고: 두 개의 aliquots에 비장 분할: 하나 B 세포, 골수성 세포 및 NK 세포와 CD4에 다른 정렬+ 와 CD8+ CD45RC낮은 T 세포, 그들의 진압 기능을 평가 하기 위해.
    참고: 입양 세포 이동에 대 한 1 x 108 splenocytes 필요한 경우 입양 송금, 관용의 긍정적인 통제 역할을 저장 합니다.
    1. B 셀, 골수성 세포 및 NK 세포의 정렬
      1. 2.1.1 2.1.5 프로토콜을 따릅니다.
      2. 2 µ g/mL T 세포 특정 항 체 (안티-TCRαβ, R7/3 클론, 및 안티-TCRγδ, V65 클론), 1 X PBS/2% FCS/0.5 m EDTA 세척 레이블 없음 4 ° C에서 15 분을 품 어와 430 x g. 삭제는 상쾌한에서 10 분 원심.
      3. 3 번 단계 2.1.7에에서 설명 된 대로 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA와 자석 구슬을 가진 세척.
      4. 마그네틱 구슬 원치 않는 세포를 제거 하 고 동요에서 4 ° C에서 10 분 동안 품 어 다음 튜브 1 분에 대 한 자석에 놓고는 상쾌한 새로운 튜브에 전송 하는 splenocytes 혼합. 두 번 반복 합니다. 셀을 계산 하 고 5 x 107 셀/ml 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA에에서 셀 농도 조정 합니다.
      5. 골수성 세포 (안티-CD11b/c, OX42 클론) 등 의심 진압 활동 세포, B 세포 (안티 CD45RA, OX33 클론), 또는 NK 세포를 정렬 하려면 splenocytes를 붙인된 항 체를 추가 (안티-CD161, 3.2.3 복제). FACS에 보상 매트릭스를 설정할 각 Ab와 구슬 레이블을 지정 합니다. 4 ° C에서 15 분을 품 어 그리고 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA로 씻어.
      6. Resuspend 5 x 107 셀/mL, 60 마이크론 조직 필터에는 필터의 농도에서 세포 및 0.1 µ g/mL의 최종 농도에 DAPI를 추가 하 여 죽은 세포를 레이블. DAPI-CD11b/c+ 골수성 세포, CD45RA 위한 게이팅 70 µ m 노즐 셀 정렬 셀 정렬+ B 세포, 및 CD161+ 그림 3에서 보듯이 NK 세포에 대 한.
    2. CD4의 정렬 + 와 CD8 + CD45RC 낮은 T 세포
      1. 2.2.1 2.2.4 프로토콜을 따릅니다.
      2. 마그네틱 열에 부정적인 선택에 대 한 셀 B 셀 (안티-CD45RA, OX33 클론), NK 세포에 특정 2 µ g/mL 정화 항 체와 4 ° C에서 15 분을 품 어 (CD161, 안티 3.2.3 복제), 골수성 세포 (안티-CD11b/c, OX42 클론), 감마 델타 T 세포 ( 안티-TCRγδ, V65 클론), 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA와 그들을 세척 하 고 430 x g. 삭제는 상쾌한에서 10 분 원심.
      3. 3 번 단계 2.1.7에에서 설명 된 대로 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA와 자석 구슬 워시.
      4. 동요에서 4 ° C에서 10 분 동안 자기 구슬과 splenocytes를 혼합 하 여 원치 않는 세포를 제거 다음 튜브 1 분에 대 한 자석에 놓고는 상쾌한 새로운 튜브에 전송 합니다. 두 번 반복 합니다. 셀을 계산 하 고 5 x 107 셀/ml 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA에에서 셀 농도 조정 합니다.
      5. Tregs 정렬 셀에 레이블이 지정 된 항 체를 추가: 안티-TCRαβ (R7/3 클론), 안티-CD4 (OX35 클론), 안티-CD45RC (OX22 복제). FACS에 보상 매트릭스를 설정할 각 Ab와 구슬 레이블을 지정 합니다. 4 ° C에서 15 분을 품 어 그리고 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA로 씻어.
      6. Resuspend 5 x 107 셀/mL, 60 µ m 조직에 필터의 농도에서 세포 및 0.1 µ g/mL의 최종 농도에 DAPI를 추가 하 여 죽은 세포를 레이블. DAPI에서 게이팅 70 µ m 노즐 셀 정렬 셀 정렬-+CD4 TCR+CD45RC낮은 CD4+Tregs 및 DAPI-TCR+CD4-CD45RC 낮은 CD8+Tregs ( 그림 4).
        참고: 안티-CD8α Ab (OX8 복제) 대신 사용할 수 있습니다 안티-CD4 Ab에서 CD4 T 세포는 감 별 하는 경우+안티 TCR 라벨 비 T 세포. CD4의 초과+Tregs 셀 확산 염료 (일일) 라벨 때문에 세포 죽음의 기대에 정렬 한다.
  4. Carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 확산을 측정 하기 위해 응답자 셀 라벨
    1. 응답자 셀 정렬, 후 1 X PBS 가진 셀에 두 번 세척.
    2. 1 X PBS에 1 x 107 셀/mL의 농도에서 세포를 resuspend 하 고 어둠 속에서 RT에 5 분 동안 0.5 µ M CFSE와 품 어. 볼륨 X 1.5에 FCS를 추가 하 여 반응을 중지 및 4 ° c.에 430 x g에서 10 분 원심 폐기는 상쾌한.
    3. 완전 한 매체, 셀에 두 번 세척 하 고는 셀.
      참고:이 단계에서 세포 죽음의 30%를 기대 합니다.
  5. 일일 비용 CD4의 라벨 + Tregs CD4 진압 분석 결과 대 한 + 효과 기 세포
    참고:이 단계는 차별을 CFSE-CD4 필요 합니다++- CFSE 확산 응답자 CD4에서에서 Tregs게이팅 일일- 세포에 의해 coculture의 주 6에서 T 세포.
    1. CD4 후+ Tregs 정렬 셀, 1 X PBS 가진 셀에 두 번 세척.
    2. 1 X PBS에 1 x 107 셀/mL의 농도에서 세포를 resuspend 하 고 어둠 속에서 RT 20 분에 대 한 일일 비용 V450의 10 µ M로 품 어.
    3. 완전 한 매체, 셀에 두 번 세척 하 고는 셀.
      참고:이 단계에서 세포 죽음의 30%를 기대 합니다.
  6. Coculture에 대 한 조언
    1. 사용 하는 중간 구성에 문화: RPMI 1640 매체 FCS (베타-mercaptoethanol (5 x 10-5 M), 페니실린 (100 U/mL), 스 (0.1 mg/mL), 나트륨 pyruvate (1mm), 글루타민 (2mm), HEPES 버퍼 (1 m m), 비 본질적인 아미노산 (X 1), 보충 10%).
    2. 96-잘 U에 문화 세포 하단 접시.
    3. 다음과 같은 순서로 셀 추가: 진압 셀, 응답자 셀 및 수용자 세포.
    4. 일정 하 게 유지 수 응답자 T 세포와 수용자 APCs 고 Tregs 범위 번호를 테스트 합니다. 예를 들어, 비율 4:4:1, 5 104 진압 셀, 5 x 104 응답자 셀, 및 10의4 수용자 세포와 비율 2:4 x 1.25 배: 1, 104 진압 셀, 5 x 104 응답자 셀 및 1.25 x 10 x 2.54 수용자 셀입니다.
    5. 5 x 10 200 µ L 매체/잘에 대 한4 응답 셀의 비율을 유지 합니다.
    6. 컨트롤에 대 한 수용자 Apc (부정적인 제어) 없이 응답자 T 세포와 규정 하는 세포 (긍정적인 통제) 없이 수용자 APCs와 응답자 T 세포 몇 웰 스 날 6 (단계 2.7.6 참조) 게이팅 CFSE 포함 됩니다.
  7. FACS 얼룩 및 coculture의 6 일 후 분석
    참고: 효과 기 세포의 확산 몇 시간 포인트에서 평가 될 수 있습니다. 확산 지 수는: 세포 분열 증가, 진압 조건 및 부정적인 컨트롤 사이의 더 많은 차이 관찰할 수 있다.
    1. 셀 전송 96 잘 U에서 96 잘 v 하단 접시 바닥 접시와 원심 4 ° c.에 1200 x g에서 1 분
    2. 필요한 경우는 상쾌한 cytokine 레벨을 측정 하기 위한-20 ° C에서 새로운 접시에 저장 합니다.
    3. 200 µ L 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA 잘하고 분리기 4 ° c.에 1200 x g에서 1 분 당 셀을 씻어
    4. 추가 응답자 T 세포에 게이트를 세포에 항 체를 추가: 안티-TCRab (R7/3 클론)와 안티-CD4 (OX35 복제). 4 ° C에서 15 분을 품 어 그리고 200 µ L 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA 잘 당 두 번 세척. 폐기는 상쾌한.
    5. DAPI의 100 µ L 1 X PBS에 0.1 µ g/mL에 희석 및 FACS 분석기와 플레이트를 읽고 추가 합니다.
    6. DAPI 네거티브 (라이브 셀)에 게이팅 CFSE 프로필 분석 일일 네거티브 (비 CD4+Tregs) TCR+CD4+ 세포. 그림 5 하단 왼쪽된 막대 그래프와 같이 unstimulated 응답자 셀 최대한 CFSE 명도가 있다. 수용자 APCs의 응답자 셀 있고 최대한 확산 최소 CFSE 밝기 (아래, 중간). 수용자 APCs 및 규정 하는 세포의 효과 기 세포 있고 중간 확산 CFSE 밝기 (아래, 오른쪽).

3. 마음에 입양 세포 이동에 의해 셀 진압 활동의 Vivo에서 평가 받는 투입

참고: 조사 필요 호스트 세포를 제거 하 고 기증자 세포 engraftment 및 확산을 부탁 합니다.

  1. 받는 사람 precondition을 이식 하기 전에 하루에 일찍 이식 받는 사람을 비추는. Anesthetize 임. xylazine (8 mg/kg)의 주입으로 쥐-케 타 민 (80 mg/kg)와 X와 4.5 Gy의 복용량에 그들을 비추는.
  2. 2.3 관심사의 세포 격리 프로토콜을 따릅니다.
    참고: 1 x 108 splenocytes 필요한 경우 입양 송금, 관용의 긍정적인 통제 역할을 저장 합니다.
  3. (저녁에는 이식 전에 하루), 방사선 조사 후 12 h 4 %isoflurane-O2 의 흡입에 의해 쥐를 anesthetize 하 고 셀 달 (107 T 셀 x 5.0, 107 B 셀 x 3.0, 3.0 x 107 골수성 세포, 또는 1.50 x 108 입양 송금으로 관용의 긍정적인 컨트롤로 splenocytes) i.v. 음 경 정 맥.
    참고: 입양 전송에 필요한 셀의 수는 세포의 진압 활동에 따라 달라 집니다.
  4. 다음 날, 프로토콜 1.1는 이식 수행을 따릅니다. 복 부를 통해 촉진 하 여 이식 진화를 따릅니다.

4. 기증자 특정 항 체 검출

참고: IgG 이식 기증자 향해 감독 응답 받는의 혈 청으로 기증자의 세포를 배양 하 여 측정 됩니다. Syngeneic LEW.1W 혈 청으로 세포를 배양 하 여 LEW.1W B 세포의 직접 얼룩에 의해 유도 된 배경 빼기.

  1. 쥐에서 혈액을 수확 하 고 1200 x g 4 ° c.에 15 분을 원심 혈 청을 저장 합니다. 혈 청-20 ° C에 저장 하거나 즉시 사용할 수 있습니다. 56 ° c.에 30 분 동안 배양 하 여는 세라에 보수를 비활성화
  2. 기증자 LEW.1W 쥐에서 비장을 수확 하 고 차가운 1에 저장 X PBS. 2.2.1 단계를 따릅니다. 2.2.4 하. 96-잘 V 바닥판에서 2 x 105 셀/잘을 추가 합니다. 4 ° C에서 1200 x g에서 1 분 원심 하 고 삭제는 상쾌한.
  3. 1에 1/270 X PBS 순차적으로 1/10에서 세라를 희석 (4 희석/샘플). 희석 혈 청/25 µ L와 4 ° C에서 1 시간에 대 한 셀을 품 어. 기증자 전용 IgG (IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b) 하위 면역 응답 샘플 (1 혈 청 x 4 희석 x 4 IgG 하위) 당 분석의 수를 예상 합니다. 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA와 셀을 세척 하 고는 상쾌한 삭제.
  4. 각 마우스 반대로 쥐 IgG 하위 Ab 형광 색소-4 ° C, 한 하위/잘에서 30 분에 대 한 분류와 셀을 품 어.
    참고: 형광 색소 표시 반대로 쥐 Ig Ab를 사용할 수 없는 경우, 그것은 사용 가능한 형광 및 cytometer 구성에 순화 된 레이블이 마우스 반대로 쥐 IgG 하위 Ab와 형광 색소 표시 보조 안티 마우스 Ab. 따라 사용 하 몇몇 반대로 쥐 IgG 하위 적절 한 설정으로 한 잘 테스트할 수 있습니다.
  5. 1 X PBS/2% FCS/0.5 m EDTA 셀을 두 번 세척 하 고는 상쾌한 삭제.
  6. DAPI의 100 µ L에서 0.1 µ g/mL PBS에 희석 FACS 분석기와 플레이트를 읽고 추가.
  7. 반대로 쥐 IgG 하위 모든 DAPI- 세포에 형광 색소로 표시 된 Ab의 평균 형광 강도 (MFI) 읽기. 순진한 LEW.1A 혈 청 LEW.1W 셀 (배경 얼룩, 왼쪽 하단)에 세라와 함께 각 받는 사람이 해당 희석에 LEW.1W 세포에서 얻은 MFI에서 얻은 MFI 빼기 (치료 거부 받는 사람에 대 한 중간 바닥을 오른쪽 중간 MFI를 표시 하는 치료 허용 받는 사람에 대 한 최대 MFI와 하단 표시) (그림 6).

5. 외 인 항 원 (나 이브와 메모리)에 체액 응답의 평가

참고: 이식, 치료, 그리고 예방 접종 전에 쥐에서 혈 청 체액 응답의 부정적인 컨트롤으로 사용 한다. 그렇지 않으면, 예방 접종 비 순 쥐 사용할 수 있습니다. Immunocompetent 받는 사람, , 이식된 exoantigen 예방 접종 및 거부 받는 사람에서 혈 청 체액 응답의 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다.

  1. 새로운 항 원 (그림 7)에 체액 응답을 개발 하는 능력
    참고:이 메서드는 체액 응답의 상대 부 량으로 표준 포함 되지 않습니다. 절대 Ig 정량화 단계 5.1.6에서에서 쥐 IgG 또는 IgM 안티 KLH Ab 알려진 농도 희석의 범위를 추가 하 여 가능한 것입니다.
    1. 완전 한 Freund의 보조의 200 µ L에 KLH의 50 µ g를 유상으로 만들 다 오래 살아남은/허용 받는의 꼬리에 주입, 치료 거부 받는 사람, 또는 치 졸 쥐 체액 응답의 긍정적인 통제로 제어.
    2. 4 그리고 13 일 후 예방 접종, 혈액 샘플을 수확 하 고 1200 x g 4 ° c.에 15 분을 원심 혈 청은 위 단계를 저장 합니다. 음수는 컨트롤에 대 한 예방 접종 비 쥐에서 혈 청을 수확. 혈 청 ELISA 분석 결과까지-20 ° C에서 동결 될 수 있습니다.
    3. 50 µ L/잘 KLH 4 ° c.에 하룻밤 1 X PBS에 10 µ g/mL에서 희석 ELISA 격판덮개 (플랫 바닥) 코트 코팅 솔루션 커버 모든 우물 다는 것을 확인 하십시오.
    4. 초과 uncoated KLH 세척 하 여 제거 합니다. 씻고, 추가 150 µ L/워시 버퍼의 우물 (0.1%를 포함 하는 1 X PBS 트윈) 및 영화.
    5. 블록 10 %FCS 포함 하는 워시 버퍼의 100 µ L/잘 37 ° C에서 1 시간을 위한 잠복기에 의해 받는 사람의 Ig의 불특정 바인딩. 한 번 씻는 다.
    6. 순차적으로 워시 버퍼 1/40에서 1/512로 시작에서 받는 사람 세라를 희석, 코팅된 접시에 직렬 희석의 중복에 50 µ L/잘 추가 하 고, 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어 일부 우물 부정적인 컨트롤에 대 한 혈 청의 무료 유지. 두 번 씻는 다.
    7. Biotin 활용 된 반대로 쥐 스 포함 하는 혈 청 IgM Ab 주 4에서 받는 사람, 또는 반대로 쥐 biotin 활용 된 날 13 일에 수확 하는 혈 청을 포함 하는 우물에서 IgG의 50 µ L에서 수확 하 고 37 ° c.에 1 시간을 품 어의 1 µ g/mL의 50 µ L을 추가 두 번 씻는 다.
    8. 37 ° c.에 45 분 1 µ g/mL에서 50 µ L/잘 HRP 활용 streptavidin의 추가 3 회 씻는 다.
    9. 3, 3, 5, 5 '-Tetramethylbenzidine (TMB) 기판 < RT에서 30 분의 50 µ L을 추가 하 고 2 M 황산 때 긍정적인 컨트롤 포화의 25 µ L로 반응을 중지.
    10. 405에서 흡 광도 읽고 nm. 받는 사람의 혈 청 순 쥐 제어 혈 청을 얻은 것으로 얻은 광학 밀도 비교 합니다.
  2. 메모리 체액 대응 능력 (그림 8)의 평가
    1. 이식 하기 전에 7 일 i.v. 109 xenogeneic Rbc 순진한 쥐에 1 X PBS의 800 µ L에 희석의 주입. Rbc는 양, 말 또는 다른 종에서 수 있습니다.
    2. 이식 수행 하 고 tolerogenic 치료를 관리.
    3. 이식 후 3 일 주사 다시 i.v.109 RBC 이식 받는 사람 및 투입 비 쥐 1 X PBS의 800 µ L에 희석.
    4. 두 번째 접종 및 분리기 위 세럼 단계 복구 하 4 ° C에서 1200 x g에서 15 분 후 혈액 샘플 5와 14 일 수확. 혈 청-20 ° C에 저장 하거나 즉시 사용할 수 있습니다. 사용 하기 전에 56 ℃에서 30 분을 배양 하 여 쥐 세라에 보완을 비활성화.
    5. 2 x 105 96 잘 V 바닥판의 RBC/잘 추가 합니다. 4 ° C에서 1200 x g에서 1 분 원심 하 고 열망 하 여는 상쾌한을 신중 하 게 삭제.
    6. 직렬 2-fold는 세라를 희석 1/10 1에 1/1280 X PBS (8 희석/샘플). 희석 혈 청/25 µ L와 4 ° C에서 1 시간에 대 한 셀을 품 어. 1 X PBS/2% FCS/0.5 m m EDTA와 셀을 세척 하 고는 상쾌한 삭제.
    7. RBC 종 흡착 방지 쥐 IgG와 셀 또는 IgM 하위 한 하위/잘 4 ° C에서 30 분 동안 형광 색소로 표시를 품 어. 혈 청 면역, 후에 5 그리고 14 일 각각 수확. 에 쥐 IgM과 IgG 안티-RBC 평가 1 X PBS/2% FCS/0.5 m EDTA 셀을 두 번 세척 하 고는 상쾌한 삭제.
      참고: 형광 색소 표시 반대로 쥐 Ig Ab는 사용할 수 없습니다, 경우 순화 레이블이 마우스 반대로 쥐 IgG 하위 Ab 및 형광 색소 표시 보조 안티 마우스 Ab 사용 하.
    8. DAPI에서 0.1 µ g/mL 1 X PBS에 희석의 100 µ L을 추가 하 고 FACS 분석기로 세포를 분석.
    9. 각 그룹에 대 한 희석의 기능으로 MFI를 나타냅니다.

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Representative Results

진압 활동 동시에 Apc (그림 1), 응답자 전지와 Tregs의 분류에 따라 (그림 2), 평가 또는 개별적으로 (그림 4), 그리고 어떤 다른 상 상속 규정 하는 세포 (그림 3), 수 완료 vivo에서 규정 하는 세포 및 생체 외에서 CFSE 밝기 (그림 5)의 측정에 의해 직접 주입 하 여. (그림 7 8) 외 인 항 원 기증자 (그림 6) 하는 방향으로 받는 사람의 체액 반응의 상태 평가 체 외에서 다음 vivo에서 예방 접종으로 묘사 될 수 있습니다.

Figure 1
그림 1 . Pdc를 정렬 하는 전략을 게이팅.
셀 형태 크기와 단위 (SSC-A/FSC-A)에 선정 됐다, 남자 FSC-W/FSC-H 및 SSC-W/SSC-H 매개 변수 제외, 라이브 셀 게이팅 DAPI- 셀에 의해 선정 되었다 및 Pdc TCR-CD45RA에 선정 되었다-CD4 + CD45R+ 식. 순도는 DAPI 정렬된 셀에 추가 매개 변수를 정렬 셀 정렬에서 실행 하 여 평가 되었다. 드문 정렬 된 인구 (2% 미만)의 순도 95% 이상 이어야 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 . 게이팅 전략 정렬 CD4+- CD25 응답자 T 세포와 CD8+CD45RC낮은 Tregs.
셀 형태, 즉, 크기와 단위 (SSC-A/FSC-A)에 선정 됐다, 남자 FSC-W/FSC-H 및 SSC-W/SSC-H 매개 변수 제외, 라이브 셀 게이팅 DAPI- 셀에 의해 선정 되었다 고 응답자 셀 TCR에 선정 됐다 + CD4+CD25- 식. CD8+Tregs 동시에-CD45RC낮은 셀 TCR+CD4에 게이팅 하 여 정렬 되었습니다. 순도는 DAPI 정렬된 셀에 추가 매개 변수를 정렬 셀 정렬에서 실행 하 여 평가 되었다. 순도 95% 이상 이어야 한다입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 전략 정렬 B 세포, 골수성 세포 및 NK 세포 게이팅.
셀 형태 크기와 단위 (SSC-A/FSC-A)에 선정 됐다, 남자 FSC-W/FSC-H 및 SSC-W/SSC-H 매개 변수 제외 했다, 살아있는 세포 게이팅 DAPI- 셀에 의해 선정 되었다 및 B 세포 CD45RA에 선정 됐다+ 식, CD11b/c+ 식, 골수성 세포 및 NK 세포 CD45RA에-CD11b/c-CD161높은 식. 순도는 DAPI 정렬된 셀에 추가 매개 변수를 정렬 셀 정렬에서 실행 하 여 평가 되었다. 순도 95% 이상 이어야 한다입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 . 게이팅 전략 정렬 CD8+CD45RC낮은 와 CD4+CD45RC낮은 Tregs.
셀 형태 크기와 단위 (SSC-A/FSC-A)에 선정 됐다, 남자 FSC-W/FSC-H 및 SSC-W/SSC-H 매개 변수 제외 했다, 살 았된 셀 DAPI- 세포와 CD4 게이팅에 의해 선정 되었다+Tregs TCR에 선정 됐다 + CD4+CD45RC낮은 표현과 CD8+Tregs TCR+CD4에-CD45RC낮은 식. 순도는 DAPI 정렬된 셀에 추가 매개 변수를 정렬 셀 정렬에서 실행 하 여 평가 되었다. 순도 95% 이상 이어야 한다입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 . 대표적인 분석은 생체 외에서 진압 분석 결과.
응답자 세포 증식 형태 크기 및 세분성 (SSC-A/FSC-A), FSC-W/FSC-H와 SSC-W/SSC-H 매개 변수에 의해 남자의 배제, 죽은 세포와 CD4의 제외 선택에 의해 분석 되었다+ Tregs 게이팅 DAPI-CPDV450에 의해 - 셀,+ +CD4 TCR의 선택 셀 및 CFSE 프로필 분석. CFSE 게이트 unstimulated CFSE 라는 응답자 셀에 근거 했다. CFSE높은 세포는 세포 증식 비와낮은 CFSE 세포 ≥ 1 부. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 . 기증자 특정 alloantibody 응답의 대표적인 분석입니다.
기증자 쥐에서 Splenocytes 다양 한 희석된 열 비활성화 혈 청 치료 또는 치료 받는 사람 또는 순진한 쥐에서 그리고 반대로 쥐 IgG FITC incubated 했다. Alloantibodies는 SSC 및 FSC 남자 제외 후 DAPI- z 셀에 FITC의 MFI를 분석 하 여 검색 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7 . 안티 KLH 검출 방법의 원리.
받는 사람 면역된 120 일 후 이식 KLH와 CFA, 보충 하 고 혈액 샘플은 예방접종 후 4와 13 일 수확 했다 있었다. KLH 단백질 96-평면 바닥 웰 스 판에 코팅 그리고 면역된 쥐에서 혈 청 샘플 incubated. Biotinylated 염소 반대로 쥐 IgG 또는 IgM 안티 KLH Ab 혈 청에 존재의 탐지를 허용 예방 접종 후 4 ~ 13 일 수확. HRP 결합 streptavidin 노란색으로 황산을 가진 반응 중지 하는 경우 블루 컬러 제품을 TMB 기판 변형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8 . 안티-RBC 검출 방법의 체계입니다.
받는 사람 면역된 7 일 전에 고 3 일 후 이식 xenogeneic 적혈구 (Rbc), 및 혈액 샘플에서 수확 했다 예방 접종을 받는 5와 14 일 마지막 접종 후. Rbc 면역된 쥐에서 혈 청 샘플 incubated 했다. 안티-Rbc는 Rbc에 항 체의 존재는 레이블이 염소 반대로 쥐 IgG 또는 IgM 항 체와 FACS 캔 토 분석 얼룩에 의해 발견 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

새로 이식할된 받는 사람으로 총 splenocytes의 입양 전송 규제 세포 유도 또는 치료에 의해 potentiated의 존재를 검색 하는 효율적인 방법입니다. 호스트 방사선-유도 된 과도 lymphopenia 전송 후 세포 생존 및 관용의 설립을 촉진합니다. 또한, 하위 치명적인 방사선 면역 재구성, 전염 성 관용34라는 현상 동안 새로운 규정 하는 세포로 변환 하는 tolerogenic 속성으로 셀에 대 한 시간을 떠난다. 일반적으로, 잘 설명된 CD4 CD25높은Foxp3++CD127낮은 허용 오차 관찰 Tregs 먼저 공부. 그러나, 부정적인 분수의 전송 (CD4에 소진 splenocytes+Tregs) 때로는 이미 알려진된 규정 하는 세포와 새로운 세포 인구1,2,의 식별 넘어 확장 허용 3,4. AdCD40Ig 유도 공차, CD4의 전송에서에서+T 세포 소모 splenocytes 공개 CD8의 발견+CD45RC낮은 Tregs1. 또한, 총 CD8의 연속 전송+ T 세포, 그리고 점차적으로 새로운 규정 하는 세포 인구를 식별 하는 이러한 방법의 잠재력을 보여주었다 CD45RC낮은 셀에 다음 제한. 또한,이 전략의 모든 인구 분석을 수 있습니다. 실제로, 우리는 많은 규정 하는 세포 공존할 수도 가능성이 있고 보상 메커니즘2,4있는지 나타났습니다. CD40Ig, CD8의 고갈으로 치료 하는 쥐에서+ 셀 규제 속성, 골수성 세포 및 B 세포의 출현을 허용 하 고 전송2위에서 설명한 프로토콜에 따라 쥐에 심장 이식에 내성. IL34, 두 CD4의 overexpression에 의해 유도 된 관용의 모델에서+ 와 CD8+Tregs 공차4전송할 수 있었다.

치료 유도 관용의 기증자 감독 특이성 세포 및 체액 수준 평가 수 있습니다. 제 3 자 이식의 받는 사람으로 규정 하는 세포의 첫 번째, 입양 전송 첫 번째 기증자 이식33셀 경우 허용 오차를 전송에 실패 합니다. 둘째, 진압 세포는 이식의 첫 번째 기증자는 APCs에 의해 자극에 대 한 응답에서 응답자 세포의 증식을 억제 하지만 안에서 제 3 자 기증자2효율적으로 해야 합니다. 마지막으로,는 이식의 기증자에 대 한 체액 응답 받는 총 Ig 생산에서 위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 여 구분할 수 있습니다. 또한, 첫 번째 이식 기증자에 게 특정 한 허용 오차의 경우, 받는 사람 개발 보조 제 이식, 새로운 항 원, 또는16전 알려진된 항 원 대 한 새로운 체액 반응 수 있어야 합니다.

비장의 콜라 D 치료 선호 이며 기관에서 모든 세포 인구를 추출 하는 것이 좋습니다. 마지막으로 때 규정 하는 세포의 표현 형이 너무 꽉 셀은 제대로 표현 (splenocytes의 < 1%), 전체 인구의 전송에 비해 부정적인 분수의 전송이 작은의 진압 활동을 구별할 수 인구입니다. 예를 들어 CD40Ig 유도 CD8+Tregs 수용자 펩 티 드에 FACS tetramers를 사용 하 여 스테인드 수 있습니다 그러나 그들의 낮은 수 허용 하지 않았다 긍정적인 입양 전송33,38. 그러나, tetramer 고갈 CD8의 입양 전송+CD45RC낮은 T 세포가 부분이 모집단의 잠재력을 강조 하는 총 Tregs 허용 오차 비교 전송 하지 않았다. 이 결과 생체 외에서 진압 실험에 의해 확인 되었다. 실제로, 진압 실험은 또한 억제 면역 응답33Du51 전용 Tregs의 용량을 표시 하는 설득력 있는 방법.

위에서 설명한 진압 프로토콜은 제한 받는 이펙터 CD4+기증자에서 Pdc에 대 한 T 세포 응답. 이 프로토콜은 cDCs 또는 총 APCs, Pdc를 교체 하지만 이펙터: 자극 비율 진압 세포에 의해 온건한 확산 관리를 달성 하기 위해 적절 한 지를 확인 하 여 적응 될 수 있다. 실제로, CD4의 비율+CD25-T 세포: Pdc 반면 4:1 이어야 한다 CD4의 비율+CD25 CD4 및 8:1,- T 세포: cDCs 이어야 한다+CD25- T 세포: APCs, 1:1 또는 1:2. 기증자와 받는 사람; alloreactivity 의존 비율 위의 비율 주 7 일에 발생 한 급성 거부와 LEW.1W:LEW.1A 조합에 적합 하지만 응답자: 자극 비율의 범위는 동물의 희생 하기 전에 테스트 해야 합니다. 마지막으로, CFSE 진압 활동, 안전 및 안정성 문제에 대 한 분석에 티 미 딘을 선호입니다. 그러나, 확인 진압 셀 응답자의 가능한 구별 CFSE 분석에 대 한 셀 주 6에 경우 이펙터 CD4+CD25- T 세포는 총 splenocytes로 대체 됩니다. 마찬가지로, 나머지 T 세포 자극 세포 가운데 35 Gy 방사선 다음 확산 수 없습니다 확인 하십시오.

FACS 얼룩의 디자인은 3에 나열 된 항 체의 가용성을 기반으로 합니다. 유사한 프로토콜 보장 대상 교 단 (예 골수성 세포는 쥐와 쥐에 차동 설명) 마우스 모델에 적용할 수 있습니다.

쥐에 heterotopic 심장 이식 이식 결과 모니터링을 위한 좋은 기회와 단단한 장기 이식 모델입니다. 신장 이식 모델 받는의 갑작스런 죽음에 의해 특징은, 하는 동안의 복 벽을 통해 심장 이식의 비트 강도 촉진 이식 진화39,40의 알립니다. 수 반하는 피부 이식 또는 두 번째 심장 이식 심장 이식 받는 메모리 응답41공부에 실현 될 수 있다. 또한, 특정 종류의 세포 B 세포 (IgM 코), CD8 세포 (안티-CD8α 항 체) 또는 골수성 세포 (clodronate 리), 고갈에 대 한 바이오 공학 및 생물학 또는 화학 도구는 이러한 셀의 중요성을 측정 하는 유용한 도구 유도 또는 시간에 따라 허용 오차의 유지 보수에 있는 받는 사람1,2,,34관리 치료를 없애고 이식 게시.

날짜, Bregs, 골수성 세포와 CD8 쥐+Tregs 잘 설명 하지 않습니다. 관용 유도 위의 프로토콜 쥐 규제 셀1,2,,34의 특성에 대 한 기준으로 제안 됩니다. 더 이러한 세포와 다른 모델의 allotransplantation 및 다른 종에 비교의 phenotypic 설명 큰 관심의 마커를 차별 도울 수 있었다. 마우스 모델의 허용 오차 및 운영 허용 환자에서 Bregs의 비교 Bregs3,,2324, 의 biomarkers로 CD5 또는 CD24 마커 식의 우위를 강조 하는 사실, 42 , 43 , 44 , 45 . CD8α 소모와 결합 하는 AdCD40Ig에 의해 유도 된 관용의 우리의 모델에서 CD24 진압 활동2부족 한 B 세포에 비해 overexpressed입니다. 높은 처리량 디지털 유전자 식 RNA 시퀀싱 최근 규제 셀46추가 하는 혁신적인 도구로 등장.

마지막으로, 프로토콜 규정 tolerogenic 처리에 의해 유도 하는 세포의 존재를 감지 다른 모델에 적응 될 수 있다. 여기 우리는 이식, 약 7 일에서 이식 거부에 의해 특징의 LEW.1A 조합으로 LEW.1W를 사용 합니다. 더 엄격한로 설명 하고있다, 어디 급성 거부 발생 빠르고 강한 반전 조합을 사용할 수 있습니다. 자가 면역 질환 모델 이식 해독 치료와 관용 유도의 메커니즘에 대 한 우리의 경험 으로부터 또한 활용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgments

이 작품은 ANR (ANR-11-LABX-0016-01)와 IHU Cesti 프로젝트 또한으로 자금을 관리 하는 "Investissements d'Avenir" 프랑스 정부 프로그램의 일부인 Labex IGO 프로젝트 (n ° ANR-11-LABX-0016-01)의 컨텍스트에서 실현 합니다 " Investissements d'Avenir"프랑스 정부 프로그램, 여는 프랑스 국가 연구 기관 (ANR) (ANR-10-IBHU-005) 관리. IHU-Cesti 프로젝트도 낭트 메트로 지구의 드 라 루아르에 의해 지원 됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
animals
LEW.1W and LEW.1A rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
BN third party donor rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
name company catalogue number comments
reagents
AdCD40Ig Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
IL34-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
FGL2-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
anti-TCRab Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K R7/3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX39 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX8 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RA Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX33 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K 3.2.3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/c Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX42 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgd Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K V65 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RC Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX22 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX35 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45R BD Biosciences, Mountain View, CA #554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #112-096-071
anti-rat IgG1 Serotec #MCA 194
anti-rat IgG2a Serotec #MCA 278
anti-rat IgG2b Serotec #MCA 195
anti-rat IgM-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #115-095-164
streptavidin HRP BD Biosciences, Mountain View, CA #554066
KLH Sigma Aldrich, St. Louis, USA #9013-72-3
PBS 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20 Sigma, Saint-Louis, USA #9005-64-5
TMB substrate reagent kit BD Biosciences, Mountain View, CA #555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit Thermo Fisher Scientific Inc, USA #C34554
RPMI 1640 medium 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA #31870-025
penicilline streptomycine Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15140-122
Hepes Buffer Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15630-056
non essential amino acids Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11140-035
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11360-039
2 beta mercaptoethanol Sigma, Saint-Louis, USA #M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell Thermo Fisher Scientific Inc, USA #65-0842-85
Glutamine Sigma, Saint-Louis, USA #G3126
DAPI Thermo Fisher Scientific Inc, USA #D1306
Collagenase D Roche Diagnostics, Germany #11088882001
EDTA Sigma, Saint-Louis, USA #E5134
NaCl 0.9% Fresenius Kabi #B230561
Magnetic dynabeads Dynal, Invitrogen #11033 Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeads Ebiosciences, San Diego, USA #01-1111-42
Betadine Refer to the institutional guidelines
Isoflurane Refer to the institutional guidelines
Naplbuphine Refer to the institutional guidelines
Terramycine Refer to the institutional guidelines
Buprenorphine Refer to the institutional guidelines
Meloxicam Refer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
Rompun Refer to the institutional guidelines
Ringer lactate Refer to the institutional guidelines
Ketamine Refer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solution Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase D Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
name company catalog number comments
equipments
falcon 50ml BD Biosciences, Mountain View, CA #227261
falcon 15ml BD Biosciences, Mountain View, CA #188271
sieve
Corning plastic culture dishes VWR, Pessac #391-0439
100µm and 60µm tissue filters Sefar NITEX, Heiden, Switzerland #03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture  Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning #353077
96 wells V bottom plates for FACS staining ThermoScientifique, Danemark #249570
96 wells flat bottom ELISA plates Nunc Maxisorb
seringue for spleen crush BD Biosciences, Mountain View, CA #309649
ELISA reader SPARK 10M, Tecan, Switzerland SPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiator Lincolshire, England Faxitron CP160
solar agitator
FACS Canto II BD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria II BD Biosciences, Mountain View, CA
magnet Thermo Fisher Scientific Inc, USA 12302D

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