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In Vitro e In Vivo de avaliação da atividade supressiva, T, B e células mieloides e respostas Humoral de pacientes transplantados

Immunology and Infection

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Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir a tolerância em transplante e avaliar in vitro e em vivo a capacidade supressora de subconjuntos distintos celular do destinatário e o status imune do destinatário para doador ou antígenos exógenos.

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Bézie, S., Usal, C., Guillonneau, C. In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients. J. Vis. Exp. (126), e55510, doi:10.3791/55510 (2017).

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Abstract

A principal preocupação no transplante é alcançar tolerância específica através da indução de células reguladoras. A compreensão dos mecanismos de tolerância requer modelos confiáveis. Aqui, descrevemos modelos de tolerância ao enxerto cardíaco em ratos, induzido pelo bloqueio dos sinais costimulation ou upregulation das moléculas imunorreguladores, através da transferência de genes. Cada um desses modelos permitidos na vivo a geração de células reguladoras, tais como pilhas de T reguladoras (Tregs), células B regulamentares (Bregs) ou células mieloides regulamentares (RegMCs). Este manuscrito, descrevemos dois protocolos complementares que foram usados para identificar e definir a atividade das células reguladoras in vitro e in vivo para determinar a sua responsabilidade na indução de tolerância e manutenção. Primeiro, um ensaio supressiva em vitro permitiu a rápida identificação de células com capacidade supressiva sobre efetoras imune respostas de forma dose-dependente e pode ser usado para uma análise mais aprofundada como medição de citocinas ou citotoxicidade. Em segundo lugar, a transferência adotiva de células de um destinatário Tratado tolerante para um destinatário transplantado recentemente irradiado, destaque as propriedades de tolerogenic dessas células em respostas imunes de enxerto dirigido de controlo e/ou convertendo novas células reguladoras ( denominado tolerância infecciosa). Esses métodos não são restritos às células com marcadores fenotípicos conhecidos e podem ser estendidos para qualquer população celular. Além disso, o doador dirigido allospecificity de células reguladoras (uma meta importante no campo) podem ser avaliados usando células de doador de terceiros ou do enxerto em vitro ou na vivo. Finalmente, para determinar a capacidade de tolerogenic específicos destas células reguladoras, nós fornecemos protocolos para avaliar as respostas humoral anticorpo antidoador e a capacidade do destinatário para desenvolver respostas humorais contra antígenos conhecidos novos ou antigos. Os modelos de tolerância descrito podem ser usados para caracterizar mais células reguladoras, para identificar novos biomarcadores e imunorreguladores moléculas e são adaptáveis a outros modelos de transplante ou doenças auto-imunes em roedores ou humanos.

Introduction

Aloenxerto cardíaco em ratos é um modelo de transplante de órgão confiável para avaliar tratamentos de indução de tolerância, para decifrar os mecanismos de indução de tolerância e de manutenção e tem o potencial para induzir as células reguladoras funcionalmente competentes e dominantes. Os protocolos abaixo descrevem um totalmente incompatibilidade heterotópica cardíaca enxerto de um rato de doador de 1W de Lewis (LEW.1W, RT1u) em um rato de destinatário Lewis 1A (LEW.1A, RT1um). Nesta combinação de enxerto, rejeição aguda ocorre rapidamente (em cerca de 7 dias) e pode ser facilmente avaliada pelo enxerto batendo medição através de palpação do abdômen. Aqui propomos três protocolos para induzir a tolerância para o aloenxerto cardíaca em ratos. Nestes modelos, tolerância é induzida e/ou mantida por tipos de diferentes células reguladoras. Primeiro, o bloqueio de CD40-CD40L interações com um adenovírus codificação CD40Ig (AdCD40Ig) induziu a geração de CD8+ Tregs capazes de induzir tolerância quando enviaram transferidos para destinatários secundários enxertados1. Além disso, a depleção de CD8 em destinatários AdCD40Ig-Tratado gerados Bregs e RegMCs2,+ células (com anticorpos anti-CD8α). Análise profunda de CD8+ Tregs Propriedades destacou o papel fundamental de várias moléculas de imunorreguladores definido como interleucina-34 (IL-34) e Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Considerando que a superexpressão de IL-34 (com um vetor de vírus adeno-associados) induzida por Tregs através de geração de RegMCs, superexpressão da FGL-2 induzida Bregs, subjacentes a complexa rede de células reguladoras.

Rejeição crônica se desenvolve lentamente e é a longo prazo, uma análise aprofundada é necessário para distinguir tolerância contra rejeição crônica. Enxerto é geralmente avaliado por infiltração celular, fibrose, espessamento da deposição de C4d vascular da parede e complemento por immunohistology7. Enquanto histologia métodos requerem o sacrifício de animais ou biópsia do enxerto, aqui nós descrevemos um método simples para avaliar diferentes características do aloenxerto tolerada: o surgimento e a função das células reguladoras e as respostas de anticorpos específicos antidoador de sangue amostra por citometria de fluxo (aqui, nós usamos a fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação).

Manutenção da tolerância para o enxerto após a detenção do tratamento é geralmente associada com a indução de células reguladoras8. Nas últimas décadas, os estudos enfocaram CD4+Tregs caracteriza-se por unanimidade-los por marcadores de chave Foxp3+, CD25altae CD1279,10,11. Da mesma forma, vários marcadores foram atribuídos a CD8+ Tregs, como CD122+, CD28-, CD45RCbaixo, PD1+e Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. sobre os anos, a expressão de GITR, CTLA4 e citocinas (IL-10, 34-TGFβ, IL, IL-35, FGL-2) foram adicionalmente associados a um Treg perfil3,4,6,13, 18,19,20,21. No entanto, populações de células reguladoras emergentes, tais como Bregs, RegMCs ou NKTregs, faltam de marcadores específicos relevantes. Com efeito, Bregs principalmente são relatados como imaturo CD24+ células, com expressão de CD27 ambígua e, por vezes, produção de IL-10, TGFβ ou granzime B22,23,24. A complexidade da linhagem mieloide célula requer uma combinação de vários marcadores para definir seu perfil de regulamentar ou proinflammatory como CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a ou CD16325,26. Finalmente, alguns marcadores têm sido relatados para identificar NKTregs como CD11b+, CD27+, TGFβ+, mas mais estudos são necessários para fenotipicamente eles descrever27,28,29 ,30,31,32. Assim, evidências de atividade supressiva são necessários para legitimar ainda mais descrição fenotípica para a identificação de novos biomarcadores, novos mediadores imunorreguladores e alargar o âmbito de aplicação de novas terapias celulares.

Propomos dois métodos complementares para avaliar a atividade supressora de células. Primeiro, o método em vitro consiste de células supressivas com células efetoras rotulada T estimuladas pelo doador alogênico células apresentadoras (APCs) em diferentes proporções ao longo de 6 dias de cultivo, e analisando o efetor proliferação de células T que reflete a imunossupressão doador-dirigido. Células de ratos tratadas podem ser comparadas diretamente às células de ingênuo ratos e ratos enxertados não tratados para atividade supressora (ou para qualquer outra população de celular regulamentar), em uma variação da proporção de supressor: effector. Além disso, este método não requer qualquer transplante, e os resultados são obtidos dentro de 6 dias. Em segundo lugar, o método na vivo consiste em transferir as células reguladoras pretendidas de um rato Tratado para um destinatário transplantado recentemente irradiado. Enquanto as células B, células mieloides ou T células de ratos não tratados ingênua são geralmente incapazes para inibir a rejeição aguda e para prolongar a sobrevivência do enxerto após transferência adotiva, células com atividade supressora potentiated de destinatários tratados têm esses atributos 1,2,3,4,33. Linfopenia induzida pela irradiação do destinatário é recomendada para permitir que as células enviaram transferidas para ser afectada pela homeostase do sangue e dominar mais facilmente as respostas imunes do anti doadores. Para ambos os métodos, a utilização em vitro de alogênico de terceiros APCs ou na vivo transferência adotiva de supressiva células em destinatários enxertados com um coração de terceiros permitem análise da especificidade antidoador. Considerando que o método na vivo requer um número substancial de células, mal representado subpopulações de células podem ser mais facilmente avaliadas para atividade supressiva em vitro33.

Respostas humorais também podem ser medidas para avaliar o estado de tolerância e o controle de respostas de anticorpos direcionados aos antígenos do doador. Com efeito, a tolerância pode ser caracterizada por ausência de resposta humoral em direção o doador mas a conservação da capacidade para os destinatários desenvolver a resposta humoral a antígenos novos e preservação da memória respostas. Em primeiro lugar, o princípio da deteção de Alo-anticorpo baseia-se no reconhecimento de células do doador por destinatários anticorpos após incubação do tipo de célula do doador com soro de um destinatário enxertado. Respostas humorais, segunda dirigidas aos antígenos exógenos podem ser avaliada seguir estimulação de destinatários tolerantes a longo prazo com Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) emulsionado com adjutor de Freund completo. A presença de anticorpos IgM e IgG específicos contra antígenos pode ser detectada dias 4 e 13, respectivamente, após a imunização, com o ensaio de imunoabsorção ligado enzima (ELISA)34. Em terceiro lugar, a preservação da memória imune respostas pode ser avaliada pela injeção de xenogénicas células vermelhas do sangue (hemácias) em dias -7 e + 3 de transplante e hemácias coloração com destinatário soro coletado em dias + 8 e + 17 após o transplante. Todos estes métodos permitem a identificação de subtipos de imunoglobulinas usando anticorpos específicos do secundários e aquisição rápida dos resultados em menos de 1,5 h por FACS coloração ou algumas horas por ELISA.

Finalmente, esses protocolos são projetados para a caracterização de modelos de transplante e podem ser, em certa medida, aplicada aos modelos de doença auto-imune. Os princípios do método podem ser transpostos para todas as espécies.

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Protocol

Nota: Todos os protocolos aqui tenham sido aprovados por um Comitê de ético e devem ser realizados de forma estéril.

1. geração de tolerância em um modelo de aloenxerto cardíaco em ratos

  1. Lew.1W para procedimento de aloenxerto LEW.1A
    1. Anestesiar um macho dador LEW.1W rato utilizando isoflurano-O2 inalação, suplementada com 1% N2O após 5 min. lugar o animal em decúbito dorsal e desinfectar o abdômen com betadine para realizar uma toracotomia (ou seja, a incisão para a espaço pleural do peito).
      1. Fixar a superior e inferior da veia cava, ligadura-los e cortá-los. Em seguida, cortar a artéria pulmonar e a aorta e salvar o enxerto no frio 0,9% NaCl.
    2. Anestesiar um 250 g masculino LEW.1A destinatário rato (de 8 a 12 semanas) utilizando isoflurano-O2 inalação, suplementada com 1% N2O, depois de 5 min. Coloque o animal em decúbito dorsal e desinfectar o abdômen com betadine para realizar uma laparotomia xyphopubic (ou seja, grande incisão do processo xifoide a sínfise púbica).
      1. Exteriorizar o intestino, fixar os vasos abdominais, realizar uma anastomose anastomose término-lateral (ou seja, a conexão entre o fim de um canal e a parede do outro) entre a aorta do enxerto e a aorta abdominal e entre o pulmonar artéria e veia cava abdominal e remover grampos.
    3. Suturar o plano muscular e pele e desinfectar com betadine.
    4. Injetar nalbufina (analgésico) 6 mg/kg por via subcutânea (s.c.) e oxitetraciclina (antibiótico) por via intramuscular (i.m.) e colocar o animal sob uma lâmpada de calor até que o animal desperta. Injetar a buprenorfina (opioides) (50 µ g/kg) i.m. e meloxicam (antiinflamatórios não-esteroides anti-inflamatórias) (0,3 mg/kg) s.c. o dia do transplante e um dia depois.
  2. Indução de tolerância pelo bloqueio da co-estimulação interações
    1. Siga os passos 1.1.1. a 1.1.2.
    2. Em uma área de A2 classificada da instalação de animais, diluir 2 x 1010 partículas infecciosas de AdCD40Ig (um adenovírus codificação CD40Ig, uma molécula quimérico que bloqueia as interações CD40-CD40L) em solução de lactato de Ringer para atingir um volume final de 150 µ l e injetar em 3 pontos (3 x 50 µ l) na parede ventricular do ápice do enxerto.
    3. Siga os passos de 1.1.3 para 1.1.4.
      Nota: Tratamento de AdCD40Ig pode ser associado com anti-CD8α, anti-ICOS ou anticorpo anti-CD28 injeções2,35,de36.
  3. Indução de tolerância pela superexpressão de uma proteína recombinante
    1. Diluir 1 x 1012 genoma viral do rato AAV IL34-recombinante em solução de lactato de Ringer para atingir um volume final de 100 µ l. anestesiar um rato LEW.1A 150g com isoflurano-O2 inalação e injetar por via intravenosa (i.v.) na veia do pênis.
    2. Um mês depois da injeção de AAV-IL34, realize um enxerto LEW.1W ao beneficiário de LEW.1A de acordo com o protocolo 1.1.

2. avaliação in Vitro da atividade supressora de células por reações mistas de linfócitos (MLRs)

Nota: Atividade supressora de células de ratos tolerantes tratados deve ser comparada com a população equivalente de syngeneic destinatários enxertados ou ratos de ingênuo.

  1. Isolamento de APCs alogênico: as células dendríticas plasmocitoide (pDCs)
    1. Anestesia um rato masculino de doador ingênuo LEW.1W uso de isoflurano-O2 inalação, suplementada com 1% N2O, depois de 5 min. Coloque o animal em decúbito dorsal e desinfectar o abdômen com betadine para executar uma esplenectomia. Remover o baço por cruza os vasos, salvar o baço em frio 1x tampão fosfato salino (PBS) e suturar o animal.
    2. Transferir o baço em um prato, retire o 1X PBS e perfundir com 5 mL de 0.2% colagenase D. Para melhorar a digestão enzimática, corte o baço em pedaços pequenos e incubar 15 min a 37 ° C.
    3. Adicionar 500 µ l de 0,1 M o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), transferir as peças de baço em uma peneira e esmagar o baço com êmbolo de uma seringa para dissociar as células. Transferir para um tubo e lavar as células com 15 mL de 1X PBS. Centrifugar 10 min a 430 g de x. descartar o sobrenadante.
    4. Para eliminar glóbulos vermelhos e plaquetas, resuspenda o pellet de splenocyte em 10 mL de solução hipotônica e incubar 5 min à temperatura ambiente (RT). Lavar com 1X PBS e centrifugar 10 min a 190 x. g. descartar o sobrenadante.
    5. Remova fibras colágenas filtrando em um filtro de tecido 100 µm. Conte as células para ajustar a concentração de células a 5 x 107 células/mL no soro de vitela fetal 1 X PBS/2% (FCS) / 0,5 mM EDTA.
      Nota: O número de splenocytes deve ser entre 4 x 108 e 7 x 108 células.
    6. Enriquece para células de interesse pela seleção negativa antes de célula de triagem. Incubar 15 minutos a 4 ° C com 2 µ g/mL purificada de anticorpos específicos de células T (anti-TCRαβ, clone do R7/3 e anti-TCRγδ, V65 clone), células B (anti-CD45RA, OX33 clone) e células NK (anti CD161, 3.2.3 clone), lavar com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA e centrifugar 10 min a 430 x g . Desprezar o sobrenadante.
    7. Lavar com grânulos magnéticos 3 vezes com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA. Usar 3,5 µ l grânulos/106 splenocytes, lave adicionando 30ml 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA, lugar para 1 min sobre o ímã e descartar o sobrenadante. Repita duas vezes. Resuspenda as contas em 10 volumes de 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA (por exemplo, 35 grânulos µ l é diluída em 350 µ l 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA).
    8. Remover células indesejáveis misturando os splenocytes com os grânulos magnéticos durante 10 minutos a 4 ° C, sob agitação, colocar o tubo sobre o ímã para 1 min e transferir o sobrenadante para um tubo novo. Repita duas vezes. Contar as células e ajustar a concentração de células 5 x 107 células/ml em 1 PBS/2% X FCS/0.5 mM EDTA.
      Nota: O número de splenocytes enriquecido deve variar entre 5 x 107 e 9 x 107.
    9. Manchar as células usando anticorpos etiquetados para classificar mais de pDCs: excluir o restante nas células T (anti-TCRαβ, clone do R7/3) ou B (anti-CD45RA, OX33 clone) e classificar CD4+ (anti-CD4, clone OX35) CD45R+ células (anti-CD45R, His24 clone). Grânulos de rótulo com cada Ab para estabelecer uma matriz de compensação na FACS. Incubar 15 minutos a 4 ° C e lavar com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA.
    10. Ressuspender as células em uma concentração de 5 x 107 células/mL, filtro em um filtro de tecido 60 µm e rotular as células mortas, adicionando DAPI em uma concentração final de 0,1 µ g/mL. Classificar as células com um classificador de pilha de bocal de 70 µm, por retenção na DAPIde TCR CD45RACD4+CD45R+ , como mostrado na Figura 1.
  2. Isolamento de células efetoras T de respondente (CD4 + CD25 pilhas de T )
    1. Colher o baço de um rato LEW.1A não tratados não enxertadas ingênuo e salve-o no frio 1 X PBS.
    2. Transferir o baço em uma peneira colocada em um prato e adicionar 10 mL de 1X PBS. Esmaga o baço com êmbolo de uma seringa para dissociar as células. Transferir as células para um tubo de 50 mL, lavar com 1X PBS e centrifugar 10 min a 430 x. g. descartar o sobrenadante.
    3. Para eliminar glóbulos vermelhos e plaquetas, resuspenda o pellet de splenocyte em 10 mL solução hipotônica durante 5 min à RT, depois lave em 1 X PBS e centrifugar 10 min x 190 g. descartar o sobrenadante.
    4. Retire as fibras de colágeno filtrando em um filtro de tecido 100 µm. Conte as células para ajustar a concentração de células 5 x 107 células/ml em 1 PBS/2% X FCS/0.5 mM EDTA.
      Nota: O número de splenocytes deve ser entre 5 x 108 células e 3 x 108 .
    5. Enriquece as células de interesse antes de classificação. Incubar 15 minutos a 4 ° C com 2 µ g/mL purificada de anticorpos específicos para células CD8 (anti-CD8α, OX8 clone), células B (anti-CD45RA, OX33 clone), células NK (anti CD161, 3.2.3 clone), células mieloides (anti-CD11b/c, OX42 clone), células de delta T gama (anti-TCRγδ, V65 clone). Em seguida, lave com PBS/2% X 1 FCS/0.5 mM EDTA e centrifugação 10 min a 430 g. x descartar o sobrenadante.
      Nota: Para classificar natural CD8 + Tregs de ingênuo ratos ao mesmo tempo como CD4+ células efetoras T, não adicione anti-CD8α Ab durante a prostração.
    6. Lave os grânulos magnéticos 3 vezes com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA conforme descrito na etapa 2.1.7.
    7. Remover as células indesejáveis misturando splenocytes com os grânulos magnéticos durante 10 minutos a 4 ° C, sob agitação, em seguida, colocar o tubo sobre o ímã para 1 min e transferir o sobrenadante para um tubo novo. Repita duas vezes. Contar as células e ajustar a concentração de células 5 x 107 células/ml em 1 PBS/2% X FCS/0.5 mM EDTA.
      Nota: O número de splenocytes deve variar entre 5 x 107 e 8 x 107 células.
    8. Acrescente os anticorpos etiquetados para tipo CD4+CD25 pilhas de T : anti-TCRαβ (clone do R7/3), anti-CD4 (OX35 clone), anti-CD25 (clone de OX39) e incubar 15 min a 4 ° C. Para classificar simultaneamente CD8 +CD45RCbaixo Tregs, adicionar anti-CD45RC Ab (OX22 clone). Etiqueta de grânulos com cada Ab para montar uma matriz de compensação para posterior processamento na citometria de fluxo. Lavar as células com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA e descartar o sobrenadante.
    9. Ressuspender as células a 5 x 107 células/mL, filtro em um filtro de tecido 60 µm e rotular as células mortas, adicionando DAPI em uma concentração final de 0,1 µ g/mL. Classificar as células com um classificador de pilha de bocal de 70 µm por retenção na TCR DAPI +CD4+CD25 células, como células de respondente (e se necessário TCR DAPI +CD4CD45RCbaixa como CD8+ Tregs células supressivas) conforme mostrado na Figura 2.
  3. Isolamento de células supressivas
    Nota: Dividir o baço em duas alíquotas: classificar um em células B, células mieloides e as células NK e o outro no CD4+ e CD8 + CD45RCbaixo T células, para avaliar sua função supressora.
    Nota: Para transferência de células adotivo, salve 1 x 108 splenocytes para servir como o controlo positivo de tolerância por transferência adoptiva, se necessário.
    1. Classificação de células B, células mieloides e células NK
      1. Segui o protocolo 2.1.1 para 2.1.5.
      2. Incubar 15 minutos a 4 ° C com 2 µ g/mL células T específicas unlabeled anticorpos (anti-TCRαβ, clone do R7/3 e anti-TCRγδ, V65 clone), lave com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA e centrifugar 10 min a 430 x. g. descartar o sobrenadante.
      3. Lavar com grânulos magnéticos 3 vezes com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA conforme descrito na etapa 2.1.7.
      4. Misture os splenocytes com os grânulos magnéticos para remover células indesejáveis e incubar durante 10 minutos a 4 ° C, sob agitação, em seguida, colocar o tubo sobre o ímã para 1 min e transferir o sobrenadante para um tubo novo. Repita duas vezes. Contar as células e ajustar a concentração de células 5 x 107 células/ml em 1 PBS/2% X FCS/0.5 mM EDTA.
      5. Acrescente os anticorpos etiquetados para os splenocytes para classificar as células com atividade supressora suspeita como células mieloides (anti-CD11b/c, OX42 clone), células B (anti-CD45RA, OX33 clone) ou células NK (anti-CD161, 3.2.3 clone). Rotule os grânulos com cada Ab para estabelecer uma matriz de compensação na FACS. Incubar 15 minutos a 4 ° C e lavar com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA.
      6. Ressuspender as células em uma concentração de 5 x 107 células/mL, filtro em um filtro de tecido 60 µm e rotular as células mortas, adicionando DAPI em uma concentração final de 0,1 µ g/mL. Classificar as células com um classificador de pilha de bocal de 70 µm por retenção na DAPICD11b/c+ para células mieloides, CD45RA+ para as células B e CD161+ para as células NK, como mostrado na Figura 3.
    2. Classificação de CD4 + e CD8 + CD45RC células de baixa T
      1. Segui o protocolo 2.2.1 a 2.2.4.
      2. Para seleção negativa em uma coluna magnética, incubar as células 15 min a 4 ° C com 2 µ g/mL purificada de anticorpos específicos para células B (anti-CD45RA, OX33 clone), células NK (anti CD161, 3.2.3 clone), células mieloides (anti-CD11b/c, OX42 clone), gama delta T células ( anti-TCRγδ, V65 clone), lave-os com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA e centrifugar 10 min a 430 x. g. descartar o sobrenadante.
      3. Lave os grânulos magnéticos 3 vezes com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA conforme descrito na etapa 2.1.7.
      4. Remover as células indesejáveis misturando os splenocytes com os grânulos magnéticos durante 10 minutos a 4 ° C, sob agitação, em seguida, colocar o tubo sobre o ímã para 1 min e transferir o sobrenadante para um tubo novo. Repita duas vezes. Contar as células e ajustar a concentração de células 5 x 107 células/ml em 1 PBS/2% X FCS/0.5 mM EDTA.
      5. Acrescente os anticorpos etiquetados para as células para classificar Tregs: anti-TCRαβ (clone do R7/3), anti-CD4 (OX35 clone), anti-CD45RC (OX22 clone). Rotule os grânulos com cada Ab para estabelecer uma matriz de compensação na FACS. Incubar 15 minutos a 4 ° C e lavar com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA.
      6. Ressuspender as células em uma concentração de 5 x 107 células/mL, filtro em um tecido de 60 µm e rotular as células mortas, adicionando DAPI em uma concentração final de 0,1 µ g/mL. Classificar as células com um classificador de pilha de bocal de 70 µm por retenção na DAPITCR+CD4 CD45RCbaixa como CD4++Tregs e DAPITCR+CD4CD45RC baixa como CD8+Tregs ( Figura 4).
        Nota: O anti-CD8α Ab (clone OX8) pode ser usado em vez do anti-CD4 Ab se as células T são discriminadas de CD4+não-T células através da marcação de anti-TCR. Um excesso de CD4+Tregs devem ser classificados em antecipação de morte celular devido a rotulagem de tintura de proliferação celular (CPD).
  4. Carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE) rotulagem das células do Respondente para medir a proliferação
    1. Após a célula de respondente classificação, lave duas vezes as células com 1X PBS.
    2. Ressuspender as células em uma concentração de 1 x 107 células/mL de 1X PBS e incubar com 0,5 µM CFSE durante 5 min à RT no escuro. Pare a reação adicionando FCS em 1.5 X o volume e centrifugar 10 min a 430 x g a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
    3. Lave duas vezes as células com meio completo e contar as células.
      Nota: Espere 30% de morte de células neste passo.
  5. CPD rotulagem de CD4 + Tregs para ensaio supressivo em CD4 + células efetoras
    Nota: Este passo é necessário para discriminar CD4 CFSE+Tregs do Respondente proliferação de CFSE CD4+células T no dia 6 de coculture por retenção de células CPD .
    1. Depois de CD4+ Tregs célula classificação, lavar duas vezes as células com 1X PBS.
    2. Ressuspender as células em uma concentração de 1 x 107 células/mL de 1X PBS e incubar com 10 µM de CPD V450 por 20 min no RT no escuro.
    3. Lave duas vezes as células com meio completo e contar as células.
      Nota: Espere 30% de morte de células neste passo.
  6. Conselhos para coculture
    1. Usar cultura no médio compreendendo: RPMI 1640 meio suplementado com beta-mercaptoetanol (5 x 10-5 M), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (0,1 mg/mL), piruvato de sódio (1 mM), glutamina (2 mM), tampão HEPES (1 mM), não aminoácidos essenciais (1x), (FCS 10%).
    2. Células de cultura em U de 96 poços de fundo placas.
    3. Adicionar células na seguinte ordem: células supressivas, Respondente células e células alogénicas.
    4. Manter constante o número de células T de respondente e APCs alogênico e testar um número de série de Tregs. Por exemplo, o rácio 4:4:1, 5 x 104 células supressiva, 5 x 104 células de respondente e 1,25 x 104 células alogénicas e proporção 4:2:1, 2,5 x 104 células supressiva, 5 x 104 células de respondente e 1,25 x 104 alogênico células.
    5. Manter a proporção de 5 x 104 Respondente células por meio de 200 µ l/poço.
    6. Para controles, incluem alguns poços com células de respondente T sem APCs alogênico (controle negativo) e Respondente T células com APCs alogênico sem células reguladoras (controle positivo) para CFSE gating no dia 6 (consulte a etapa 2.7.6.).
  7. FACS manchando e análise após 6 dias de coculture
    Nota: A proliferação de células efetoras pode ser avaliada em vários pontos do tempo. Observe que a proliferação é exponencial: com o aumento da divisão celular, mais diferenças entre as condições supressivas e controlo negativo podem ser observadas.
    1. Transferir as células desde o U-96 poços placas de fundo para 96 poços V placas de fundo e centrifugar 1 min a 1.200 x g a 4 ° C.
    2. Salve o sobrenadante em um novo prato a-20 ° C para medir os níveis de citocinas, se necessário.
    3. Lavar as células com 200 µ l 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA por bem e centrifugar 1 min a 1.200 x g a 4 ° C.
    4. Acrescente os anticorpos para as células à mais gate em células de respondente T: anti-TCRab (clone do R7/3) e anti-CD4 (OX35 clone). Incubar 15 minutos a 4 ° C e lavar duas vezes com 200 µ l 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA por bem. Desprezar o sobrenadante.
    5. Adicione 100 µ l de DAPI diluído a 0,1 µ g/mL de 1X PBS e ler a placa com um analisador de FACS.
    6. Analisar o perfil CFSE pelo gating na DAPI negativo (células vivas) CPD negativo (não-CD4+Tregs) TCR+CD4+ células. Respondente unstimulated células têm máximo brilho CFSE como mostrado na Figura 5 histograma de esquerda inferior. Na presença de células alogénicas APCs, as células de respondente tem proliferação de máxima e mínima CFSE brilho (inferior, médio). Na presença de células alogénicas APCs e células reguladoras, as células efetoras tem proliferação média e brilho CFSE (canto inferior direito).

3. avaliação in Vivo da atividade supressora células por transferência adotiva de célula em um coração transplantado destinatário

Nota: Irradiação é necessário para eliminar as células hospedeiras e favorecem a proliferação e a enxertia de célula do doador.

  1. Irradiar os destinatários de enxerto cedo no dia antes do enxerto para a condição do destinatário. ANESTHETIZE ratos com injeção im. de xilazina (8 mg/kg)-cetamina (80 mg/kg) e irradiar-lhes na dose de 4.5 Gy com raios-X.
  2. Segui o protocolo 2.3 para isolar as células de interesse.
    Nota: Guarde 1 x 108 splenocytes para servir como um controle positivo de tolerância por transferência adoptiva, se necessário.
  3. 12 h após a irradiação (um dia antes do enxerto, à noite), anestesiar os ratos por inalação de 4% de isoflurano-O2 e infundir as células (5.0 x 107 T de células, 3,0 x 10 células7 B, 3.0 x 107 células mieloides ou 1,50 x 108 splenocytes como controlo positivo de tolerância por transferência adoptiva) soro na veia do pênis.
    Nota: O número de células necessárias para tolerância por transferência adotiva depende da atividade supressora das células.
  4. No dia seguinte, segui o protocolo 1.1 para executar o aloenxerto. Siga a evolução do enxerto por palpação do abdômen.

4. o doador pesquisa de anticorpos específicos

Nota: IgG respostas direcionadas para o doador do enxerto são medidas por incubação das células do doador com o soro do receptor. Subtrai o fundo induzido pela coloração direta das células B LEW.1W incubando-se as células com syngeneic LEW.1W de soro.

  1. Colheita de sangue de ratos e centrifugar 15 min a 1.200 x g a 4 ° C. Salve o soro. Soro pode ser armazenado a-20 ° C ou usado imediatamente. Desativar o complemento no sera incubando durante 30 min a 56 ° C.
  2. Colher o baço de rato LEW.1W um doador e salve-o no frio 1 X PBS. Siga os passos 2.2.1. a 2.2.4. Adicione 2 x 105 células/poço em uma placa de fundo V 96 poços. Centrifugar 1 min a 1.200 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
  3. Diluir os soros em série de 1/10 a 1/270 em 1X PBS (4 diluições/amostra). Incube as celulas para 1 h a 4 ° C, com 25 µ l de soro diluído/poço. Antecipe o número de doadores específicos IgG subtipos (IgG IgG1, IgG2a, IgG2b) respostas imunes para analisar por amostra (subtipos de IgG de diluições x 4 1 soro x 4). Lavar as células com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA e descartar o sobrenadante.
  4. Incube as celulas com cada subtipo de IgG antirato rato Ab fluorocromo-rotulado por 30 min a 4 ° C, um subtipo/bem.
    Nota: Se marcado fluorocromo anti-rato Ig Ab está disponível, é possível usar o subtipo de IgG antirato rato sem rótulo purificada Ab e um fluorocromo-rotulado secundário anti-rato AB. dependendo no citômetro de configuração e fluorochromes disponíveis vários subtipos de IgG antiratos podem ser testados em um poço com configurações apropriadas.
  5. Lavar as células com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA duas vezes e descartar o sobrenadante.
  6. Adicione 100 µ l de DAPI diluído a 0,1 µ g/mL de PBS e ler a placa com um analisador de FACS.
  7. Leia a intensidade média de fluorescência (IFM) do subtipo de IgG de anti-rato Ab marcado com fluorocromo em todas as células DAPI . Subtrair a IMF obtida com soro LEW.1A ingênua sobre as células LEW.1W (coloração de fundo, no canto inferior esquerdo) de IFM obtido com o sera de cada destinatário nas células LEW.1W na diluição correspondente (inferior médio para destinatários rejeitar não tratados que Exibir máxima das IFM e inferior direito para tratados destinatários tolerantes que exibem IFM intermediária) (Figura 6).

5. avaliação das respostas Humoral a antígenos exógenos (Naive e memória)

Nota: Soro de ratos antes de transplante, tratamento e imunização deve ser usado como controles negativos de respostas humorais. Caso contrário, podem ser usados não-imunizadas ingênuo ratos. Soro de destinatários imunocompetentes, ou seja, transplantados destinatários exoantigen-imunizados e rejeição, são usados como controles positivos de respostas humorais.

  1. Capacidade de desenvolver resposta humoral para um novo antígeno (Figura 7)
    Nota: Este método é uma quantificação relativa de respostas humorais como não inclui um padrão. Seria possível uma quantificação absoluta do Ig, adicionando uma série de diluições de rato IgG ou IgM anti-KLH Ab com concentração conhecida na etapa 5.1.6.
    1. Emulsionar a 50 µ g de KLH em 200 µ l de adjutor de Freund completo e injetar na cauda dos destinatários long-sobrevivendo/tolerante, controle destinatários rejeitar não tratados ou ingênuo ratos como controle positivo de respostas humorais.
    2. Colheita de amostras de sangue cada 4 e 13 dias após a imunização e centrifugar 15 min a 1.200 x g a 4 ° C. Salve a fase superior que é o soro. Colha o soro de ratos não-imunizados para um controlo negativo. Soro pode ser congelado a-20 ° C até o ensaio de ELISA.
    3. Revestimento de placas de ELISA (fundo plano) com 50 µ l/poço KLH diluído a 10 µ g/mL de 1X PBS durante a noite a 4 ° C. Certifique-se que a solução de revestimento abrange todos os poços.
    4. Remova o excesso KLH não revestido por lavagem. Para lavar, adicione 150 µ l/poço de tampão de lavagem (1X PBS contendo 0,1% Tween) e flick.
    5. Vinculação de bloco inespecífica de Ig do destinatário incubando durante 1 h a 37 ° C com 100 µ l/poço de tampão de lavagem, contendo 10% FCS. Lave uma vez.
    6. Diluir o destinatário sera em tampão de lavagem a partir 1/40 a 1/512 em série, adicionar 50 µ l/poço em duplicatas de diluição serial à placa revestida e incubar durante 2 h a 37 ° C. Manter alguns poços livres de soro para um controlo negativo. Lave duas vezes.
    7. Adicionar 50 µ l de 1 µ g/mL de conjugado biotina anti-rato IgM Ab em poços contendo o soro colhido no dia 4, em recipientes ou 50 µ l de conjugado biotina de anti-rato IgG em poços contendo o soro colhido no dia 13 e incubar 1 h a 37 ° C. Lave duas vezes.
    8. Adicionar 50 µ l/poço de estreptavidina conjugado HRP a 1 µ g/mL por 45 min a 37 ° C. Lave 3 vezes.
    9. Adicionar 50 µ l de 3, 3 ', 5, 5 '-tetrametilbenzidina (TMB) substrato para < 30 min em RT e parar a reação com 25 µ l de ácido sulfúrico de 2m quando positivo controles estão saturados.
    10. Ler a absorbância em 405 nm. Compare a densidade óptica obtida com o soro do destinatário para aquele obtido com o soro de controlo do rato de ingênuo.
  2. Avaliação da capacidade de resposta humoral da memória (Figura 8)
    1. 7 dias antes do transplante, injete soro 109 de hemácias xenogénicas diluído em 800 µ l de 1X PBS em ratos o ingênuo. Glóbulos vermelhos podem ser de ovelha, cavalo ou qualquer outra espécie.
    2. Realizar o transplante e administrar o tratamento tolerogenic.
    3. 3 dias após o enxerto, injete novamente i.v.109 RBC diluído em 800 µ l de 1X PBS nos destinatários de enxerto e ratos não enxertadas.
    4. Dias de sangue amostras 5 e 14 da colheita após a segunda imunização e centrifugar 15 min a 1.200 x g a 4 ° C para recuperar a fase superior de soro. Soro pode ser armazenado a-20 ° C ou usado imediatamente. Inativar o complemento em soros de rato por Incubar 30 min a 56 ° C antes do uso.
    5. Adicione 2 x 105 RBC/bem de uma placa de fundo V 96 poços. Centrifugar 1 min a 1.200 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante cuidadosamente por aspiração.
    6. Serialmente diluir os soros 2 dobras de 1/10 a 1/1280 em 1X PBS (8 diluições/amostra). Incube as celulas para 1 h a 4 ° C, com 25 µ l de soro diluído/poço. Lavar as células com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA e descartar o sobrenadante.
    7. Incube as células com o RBC espécie-adsorvido anti-rato IgG ou IgM subtipos rotulados com fluorocromo por 30 min a 4 ° C, um subtipo/bem. Avaliar o rato IgM e IgG anti-RBC no soro colhido 5 e 14 dias após a imunização, respectivamente. Lavar as células com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA duas vezes e descartar o sobrenadante.
      Nota: Se o fluorocromo-rotulado anti-rato Ig Ab não está disponível, é possível usar o subtipo de IgG antirato rato sem rótulo purificada Ab e um fluorocromo-rotulado secundário anti-rato Ab.
    8. Adicione 100 µ l de DAPI diluído a 0,1 µ g/mL de 1X PBS e analisar as células com um analisador de FACS.
    9. Representam o IFM em função da diluição para cada grupo.

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Representative Results

A avaliação da atividade supressora seguindo a classificação da APCs (Figura 1), células do Respondente e Tregs simultaneamente (Figura 2), ou individualmente (Figura 4), e qualquer outras putativos regulamentar as células (Figura 3), pode ser feito na vivo por injecção directa das células reguladoras e em vitro por medida do brilho CFSE (Figura 5). O status da resposta humoral do destinatário para o doador (Figura 6) ou antígenos exógenos (figuras 7 e 8) também pode ser avaliada em vitro após imunização na vivo , retratados.

Figure 1
Figura 1 . Retenção de estratégia para classificar os pDCs.
As células foram selecionadas no tamanho de morfologia e granularidade (SSC/FSC um), parelhas foram excluídas pelo FSC-W/FSC-H e os parâmetros de SSC-W/SSC-H, células vivas foram Selecionadodas pelo gating na DAPI células, e pDCs foram selecionados na CD45RA TCRCD4 + CD45R+ expressão. Pureza foi avaliada adicionando DAPI para células classificadas e execução no classificador de célula com os parâmetros de classificação. Pureza de uma população classificada rara (menos de 2%) deve ser superior a 95%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Retenção de estratégia tipo CD4+CD25 Respondente T células e CD8+CD45RCbaixo Tregs.
As células foram Selecionadodas na morfologia, ou seja, o tamanho e granulosidade (SSC/FSC um), parelhas foram excluídas pelo FSC-W/FSC-H e os parâmetros de SSC-W/SSC-H, células vivas foram Selecionadodas pelo gating na DAPI células, e células de respondente foram Selecionadodas na TCR + CD4+CD25 expressão . CD8+Tregs foram simultaneamente classificadas por retenção na TCR+CD4CD45RC células debaixo . Pureza foi avaliada adicionando DAPI para células classificadas e execução no classificador de célula com os parâmetros de classificação. Pureza deve ser superior a 95%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Gating estratégia de células NK, células mieloides e células do tipo B.
As células foram selecionadas no tamanho de morfologia e granularidade (SSC/FSC um), parelhas foram excluídas pelo FSC-W/FSC-H e os parâmetros de SSC-W/SSC-H, células vivas foram Selecionadodas pelo gating na DAPI células, e células B foram Selecionadodas na CD45RA+ expressão, células mieloides, na expressão de CD11b/c+ e as células NK na CD45RA expressãoelevada de CD161 CD11b/c. Pureza foi avaliada adicionando DAPI para células classificadas e execução no classificador de célula com os parâmetros de classificação. Pureza deve ser superior a 95%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Retenção de estratégia tipo CD8+CD45RCbaixo e CD4+CD45RCbaixo Tregs.
As células foram selecionadas no tamanho de morfologia e granularidade (SSC/FSC um), parelhas foram excluídas pelo FSC-W/FSC-H e os parâmetros de SSC-W/SSC-H, viveu células foram Selecionadodas pelo gating na DAPI células e CD4+Tregs foram selecionados na TCR + CD4+CD45RCbaixa expressão e CD8+Tregs na TCR+CD4CD45RCbaixa expressão. Pureza foi avaliada adicionando DAPI para células classificadas e execução no classificador de célula com os parâmetros de classificação. Pureza deve ser superior a 95%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 . Análise representativa do em vitro ensaio supressivo.
A proliferação de células do respondente foi analisada pela seleção no tamanho de morfologia e granularidade (SSC-A/FSC-A), exclusão de parelhas pelo FSC-W/FSC-H e SSC-W/SSC-H parâmetros, exclusão de células mortas e CD4 + Tregs pelo gating na DAPICPDV450 células, seleção de TCR+CD4+ células e análise de perfil CFSE. O portal CFSE baseava-se células unstimulated CFSE-rotulado respondente. CFSEalta são células não-proliferação e CFSEbaixa são células com ≥ 1 Divisão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 . Análise representativa da resposta doador Alo-anticorpo específico.
Splenocytes de rato o doador foram incubados com uma variedade de soro diluído inactivadas pelo calor de destinatários tratados ou não ou de rato de ingênua e depois com o anti-rato IgG-FITC. Aloanticorpos são detectados através da análise de IFM do FITC em células de DAPI z após a exclusão de parelhas SSC e FSC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7 . Princípio do método de deteção de anti-KLH.
Os destinatários foram imunizados 120 dias após o transplante com KLH suplementado com CFA, e amostras de sangue foram colhidas 4 e 13 dias após a imunização. KLH proteínas foram revestidas em placas de poços de 96-plano de fundo e incubadas com amostras de soro de ratos imunizados. Biotinilado cabra antirato IgG ou IgM permitida a deteção de anti-KLH Ab presente no soro colhido 4 ou 13 dias após a imunização. Streptavidin HRP-acoplado transformou o substrato TMB para um produto de cor azul que fica amarelo quando a reação foi interrompida com ácido sulfúrico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8 . Esquema do método anti-RBC deteção.
Os destinatários foram imunizados 7 dias antes e 3 dias após o transplante com xenogénicas células vermelhas do sangue (hemácias) e amostras de sangue foram colhidas de imunizados dias destinatários 5 e 14 após a última imunização. Hemácias foram incubadas com amostras de soro de ratos imunizados. Presença de anticorpos anti-hemácias nas hemácias foi detectada pela coloração com anti-rato rotulado cabra IgG ou anticorpos IgM e análise de Canto FACS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Transferência adotiva de splenocytes total para um destinatário recentemente transplantada é uma maneira eficiente para detectar a presença de células reguladoras induzido ou potencializadas por um tratamento. Linfopenia transitória induzida por irradiação de anfitrião promove a sobrevivência da pilha após a transferência e o estabelecimento da tolerância. Além disso, a irradiação sub-letais deixa tempo para células com propriedades tolerogenic para converter para novas células reguladoras durante reconstituição imunológica, um fenômeno chamado tolerância infecciosas34. Geralmente, CD4 bem-descrito CD25altaFoxp3++CD127baixa Tregs primeiro são estudados quando a tolerância é observada. No entanto, a transferência de fração negativa (splenocytes empobrecido em CD4+Tregs) permite às vezes extensão além dos já conhecidos de células reguladoras e identificação de nova célula populações1,2, 3,4. Em tolerância induzida por AdCD40Ig, a transferência de CD4+T células empobrecido splenocytes revelou a descoberta de CD8 +CD45RCbaixo Tregs1. Além disso, transferência sucessiva de CD8 total+ T células e então restrita às células debaixa CD45RC, mostrou o potencial de um método para identificar progressivamente uma nova população de células reguladoras. Além disso, essa estratégia permite a análise de todas as populações. Na verdade, mostramos que muitas células reguladoras podem coexistir e até mesmo prováveis, e que mecanismos compensatórios existe2,4. Em ratos tratados com CD40Ig, esgotamento de CD8+ células permitiu o surgimento de células B e células mieloides com propriedades reguladoras e transferido a tolerância para o aloenxerto cardíaca em ratos de acordo com o protocolo descrito acima2. Em um modelo de tolerância induzida pela superexpressão de IL34, ambos CD4+ e CD8+Tregs foram capazes de transferir tolerância4.

Especificidade de doador-dirigido de tolerância induzida por tratamento pode ser avaliada a nível celular e humoral. Primeira, adotiva transferência de células reguladoras para os destinatários de um enxerto de terceiros não conseguirá transferir tolerância se as células são específicas para o primeiro doador enxerto33. Segunda, supressora de células eficientemente devem inibir a proliferação de células do Respondente em resposta à estimulação pelas APCs do primeiro doador do enxerto mas não de um terceiro partido doador2. Finalmente, respostas humorais contra o doador do enxerto podem ser distinguidas total produção de Ig do receptor, usando o protocolo descrito acima. Além disso, em caso de tolerância específica para o primeiro doador do enxerto, destinatário deve ser capaz de desenvolver uma nova resposta humoral contra um antígeno conhecido ex16, um novo antígeno ou um enxerto secundário de terceiros.

Tratamento de colagenase D do baço é preferencial e aconselhável extrair todas as populações de células do órgão. Finalmente, quando o fenótipo das células reguladoras é tão apertado que as células são mal representado (< 1% dos splenocytes), transferência de fração negativa em comparação com a transferência da população total pode ajudar a distinguir a atividade supressora de pequeno população. Por exemplo, CD8 induzida por CD40Ig+Tregs específicas para um peptídeo alogênico poderia ser FACS manchado usando tetrâmeros, mas seu baixo número não permitir transferência adotiva positiva33,38. No entanto, transferência adotiva do CD8 tetrâmero empobrecido+CD45RCbaixo T células não transferiu tolerância em relação ao total Tregs, destacando o potencial desta subpopulação. Este resultado foi confirmado por um experimento em vitro supressiva. Com efeito, o experimento supressivo também era uma forma convincente para mostrar a capacidade de Tregs Du51 específicos para suprimir respostas imunes33.

O protocolo supressivo descrito acima é restrito ao destinatário effector CD4+respostas de células T para pDCs do doador. Este protocolo pode ser adaptado por substituindo pDCs por conjuntos ou APCs totais, mas garantindo que os rácios de efetor: estimulador são adequados atingir uma proliferação moderada gerenciável pelas células supressivas. Na verdade, uma proporção de CD4+CD25T células: pDCs deve ser 4:1, enquanto que uma proporção de CD4+CD25 T células: conjuntos deve ser 8:1 e CD4+CD25 T células: APCs, 1:1 ou 1:2. Os rácios dependem da alloreactivity entre o dador e o receptor; as proporções acima são apropriadas para uma combinação de LEW.1W:LEW.1A com uma rejeição aguda, ocorrendo no dia 7, mas a variação da proporção do Respondente: estimulador deve ser testada antes do sacrifício de animais. Finalmente, CFSE é preferido a timidina para analisar a atividade supressiva, por preocupações de segurança e confiabilidade. No entanto, garantir a distinção possível entre células supressivas e Respondente células para a análise CFSE no dia 6 se o efetor CD4+CD25 pilhas de T são substituídas por splenocytes total. Da mesma forma, certifique-se que as células T restantes entre células estimulador não podem proliferar após 35 Gy de irradiação.

Design de manchar o FACS baseia-se na disponibilidade de anticorpos listados na tabela 3. Protocolos semelhantes podem ser adaptados para modelos de ratos, garantindo a denominação de destino (por exemplo células mieloides são diferencialmente descritas no rato e rato).

O aloenxerto cardíaco heterotópico no rato é um modelo de transplante de órgãos sólidos com grandes oportunidades para o monitoramento de resultado do enxerto. Enquanto modelo de aloenxerto renal são caracterizados por uma morte súbita do destinatário, palpação da resistência à batida do enxerto cardíaco através da parede abdominal informa do enxerto evolução39,40. Um enxerto de pele concomitante ou um segundo enxerto cardíaco pode ser realizado no destinatário para estudar memória respostas41aloenxerto cardíaca. Além disso, ferramentas de engenharia e biológica ou química biomolecular para esgotamento de tipos de células específicas, como as células B (IgM KO), células CD8 (anticorpos anti-CD8α) ou células mieloides (clodronato lipossomas), são ferramentas úteis para medir a importância de tal célula populações em indução ou manutenção da tolerância dependendo do tempo pós transplante onde esgotar o tratamento é administrado para o destinatário1,2,3,4.

A data, rato Bregs, células mieloides e CD8+Tregs não são bem descritas. Os protocolos de indução de tolerância acima são propostos como referência para a caracterização de rato células reguladoras1,2,3,4. Mais descrição fenotípica dessas células e a comparação com outros modelos de allotransplantation e outras espécies poderia ajudar a discriminar marcadores de grande interesse. Com efeito, comparação de Bregs de modelos de rato de tolerância e operacionalmente tolerantes pacientes destacar a predominância de CD5 ou CD24 expressão do marcador como biomarcadores de Bregs3,23,24, 42 , 43 , 44 , 45 . Em nosso modelo de tolerância induzida por AdCD40Ig combinado com depleção de CD8α, CD24 é overexpressed em comparação com as células B falta de atividade supressiva2. A sequenciação do ARN alto throughput digital gene expressão recentemente emergiu como uma ferramenta inovadora para caracterizar mais células reguladoras46.

Finalmente, os protocolos para detectar a presença de células reguladoras induzido por um tratamento de tolerogenic podem ser adaptados para outros modelos. Aqui usamos o LEW.1W em LEW.1A combinação de aloenxerto, caracterizada por uma rejeição do enxerto em cerca de 7 dias. A combinação de invertido, que tem sido descrita como mais rigorosas e onde a rejeição aguda acontece mais rápido e mais forte, pode ser usada. Modelos de doença auto-imune podem também beneficiar de nossa experiência em transplante para decifrar os mecanismos de indução de tolerância com tratamentos.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Este trabalho foi realizado no contexto do projeto Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) que é parte do programa de governo francês "Investissements d'Avenir" gerenciado pela ANR (ANR-11-LABX-0016-01) e pelo projeto IHU-Cesti financiado também pelo " Programa de governo francês investissements d'Avenir", gerido pelo francês nacional investigação agência (ANR) (ANR-10-IBHU-005). O projeto IHU-Cesti também é suportado pelo Nantes Métropole e Région Pays de la Loire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
animals
LEW.1W and LEW.1A rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
BN third party donor rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
name company catalogue number comments
reagents
AdCD40Ig Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
IL34-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
FGL2-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
anti-TCRab Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K R7/3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX39 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX8 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RA Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX33 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K 3.2.3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/c Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX42 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgd Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K V65 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RC Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX22 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX35 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45R BD Biosciences, Mountain View, CA #554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #112-096-071
anti-rat IgG1 Serotec #MCA 194
anti-rat IgG2a Serotec #MCA 278
anti-rat IgG2b Serotec #MCA 195
anti-rat IgM-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #115-095-164
streptavidin HRP BD Biosciences, Mountain View, CA #554066
KLH Sigma Aldrich, St. Louis, USA #9013-72-3
PBS 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20 Sigma, Saint-Louis, USA #9005-64-5
TMB substrate reagent kit BD Biosciences, Mountain View, CA #555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit Thermo Fisher Scientific Inc, USA #C34554
RPMI 1640 medium 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA #31870-025
penicilline streptomycine Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15140-122
Hepes Buffer Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15630-056
non essential amino acids Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11140-035
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11360-039
2 beta mercaptoethanol Sigma, Saint-Louis, USA #M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell Thermo Fisher Scientific Inc, USA #65-0842-85
Glutamine Sigma, Saint-Louis, USA #G3126
DAPI Thermo Fisher Scientific Inc, USA #D1306
Collagenase D Roche Diagnostics, Germany #11088882001
EDTA Sigma, Saint-Louis, USA #E5134
NaCl 0.9% Fresenius Kabi #B230561
Magnetic dynabeads Dynal, Invitrogen #11033 Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeads Ebiosciences, San Diego, USA #01-1111-42
Betadine Refer to the institutional guidelines
Isoflurane Refer to the institutional guidelines
Naplbuphine Refer to the institutional guidelines
Terramycine Refer to the institutional guidelines
Buprenorphine Refer to the institutional guidelines
Meloxicam Refer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
Rompun Refer to the institutional guidelines
Ringer lactate Refer to the institutional guidelines
Ketamine Refer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solution Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase D Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
name company catalog number comments
equipments
falcon 50ml BD Biosciences, Mountain View, CA #227261
falcon 15ml BD Biosciences, Mountain View, CA #188271
sieve
Corning plastic culture dishes VWR, Pessac #391-0439
100µm and 60µm tissue filters Sefar NITEX, Heiden, Switzerland #03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture  Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning #353077
96 wells V bottom plates for FACS staining ThermoScientifique, Danemark #249570
96 wells flat bottom ELISA plates Nunc Maxisorb
seringue for spleen crush BD Biosciences, Mountain View, CA #309649
ELISA reader SPARK 10M, Tecan, Switzerland SPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiator Lincolshire, England Faxitron CP160
solar agitator
FACS Canto II BD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria II BD Biosciences, Mountain View, CA
magnet Thermo Fisher Scientific Inc, USA 12302D

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References

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