Author Produced

In Vitro en In Vivo beoordeling van T-, B- en myeloïde cellen onderdrukkende activiteit en humorale reacties van transplantatie ontvangers

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier presenteren we een protocol bij het opwekken van tolerantie in transplantatie, en beoordelen van in vitro en in vivo de onderdrukkende capaciteit van afzonderlijke cel subsets van de ontvanger en de immuunstatus van de ontvanger naar donor of exogene antigenen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bézie, S., Usal, C., Guillonneau, C. In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients. J. Vis. Exp. (126), e55510, doi:10.3791/55510 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De belangrijkste zorg in transplantatie is het bereiken van specifieke tolerantie door inductie van regulatoire cellen. Het begrip van tolerantie mechanismen vereist betrouwbare modellen. Hier beschrijven we modellen van tolerantie-doorbraak tot cardiale allograft in rat, veroorzaakt door blokkade van costimulatie signalen of opregulatie van immunoregulerende moleculen door genenoverdracht. Elk van deze modellen toegestaan in vivo generatie regulatoire cellen zoals regulatoire T-cellen (Tregs), regelgevende B cellen (Bregs) of regelgevende myeloïde cellen (RegMCs). In dit manuscript beschrijven we de twee aanvullende protocollen die zijn gebruikt om te identificeren en te definiëren in vitro en in vivo regelgevende cel activiteit om te bepalen hun verantwoordelijkheid in tolerantie inductie en onderhoud. Eerst een in vitro onderdrukkende assay toegestaan snelle identificatie van cellen met onderdrukkende capaciteit op effector immuunrespons op een dosis-afhankelijke wijze, en kan worden gebruikt voor verdere analyse zoals cytokine meting of cytotoxiciteit. Ten tweede, de adoptieve overdracht van cellen van een tolerante behandelde ontvanger aan een nieuw bestraalde geënte geadresseerde, benadrukt de tolerogenic eigenschappen van deze cellen in graft geregisseerd immuunresponsen beheersen en/of omzetten van nieuwe regelgevende cellen ( besmettelijke tolerantie genoemd). Deze methoden zijn niet beperkt tot cellen met bekende fenotypische markeringen en kunnen worden uitgebreid tot iedere cel bevolking. Bovendien niet donor gericht allospecificity van regelgevende cellen (een belangrijk doel in het veld) kunnen worden beoordeeld met behulp van derden donor cellen of graft in vitro of in vivo. Tot slot, om te bepalen van de capaciteit van de specifieke tolerogenic van deze regelgevende cellen, bieden wij protocollen voor de beoordeling van de humorale anti-donor antilichaam reacties en de capaciteit van de ontvanger te ontwikkelen humorale reacties tegen nieuwe of oude bekende antigenen. De modellen van tolerantie beschreven kunnen worden gebruikt om verder karakteriseren regulatoire cellen, ter identificatie van nieuwe biomarkers en immunoregulerende moleculen, en zijn aan te passen aan andere transplantatie modellen of auto-immune ziekten in knaagdieren of menselijke.

Introduction

Cardiale allograft in rat is een betrouwbare orgaan transplantatie model te beoordelen tolerantie inductie behandelingen, om te ontcijferen van de mechanismen van de inductie van de tolerantie en onderhoud, en heeft het potentieel voor het opwekken van de functioneel bevoegde en dominante regulatoire cellen. De protocollen hieronder beschrijven een volledig mismatch heterotopic cardiale transplantaat van een Lewis 1W donor rat (LEW.1W, RT1u) in een Lewis 1A ontvangende rat (LEW.1A, RT1een). In deze combinatie van de graft, acute afwijzing gebeurt snel (in ongeveer 7 dagen) en gemakkelijk kan worden geëvalueerd door graft verslaan meting door middel van palpatie van de buik. Hier stellen wij drie protocollen voor het opwekken van tolerantie voor de cardiale allograft in rat. Deze modellen, tolerantie wordt geïnduceerd en/of onderhouden door verschillende regelgevende celtypes. Eerste, de blokkade van interactie CD40-CD40L interacties met een adenovirus codering van CD40Ig (AdCD40Ig) de generatie van CD8 geïnduceerde+ Tregs staat inducerende tolerantie wanneer adoptively overgedragen aan secundaire geënte ontvangers1. Bovendien, uitputting van CD8+ cellen (met anti-CD8α antilichamen) in2Bregs en RegMCs AdCD40Ig-behandelde ontvangers gegenereerd. Diepgaande analyse van CD8+ Tregs eigenschappen de sleutelrol van verschillende immunoregulerende moleculen gedefinieerd als Interleukine-34 (IL-34) en Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 benadrukt . Overwegende dat de overexpressie van IL-34 (met een vector van AAV) geïnduceerde Tregs door middel van de generatie van RegMCs, geïnduceerde overexpressie van FGL-2 Bregs, ten grondslag liggen aan het complexe netwerk van regulatoire cellen.

Omdat chronische afwijzing langzaam ontwikkelt en op lange termijn, is een diepgaande analyse vereist om te onderscheiden van tolerantie ten opzichte van chronische afwijzing. Graft is meestal beoordeeld op cel infiltratie, fibrose, verdikking van vasculaire muur en aanvulling C4d depositie door immunohistology7. Terwijl histologie methoden dierlijke offer vereisen of biopsie graft, hier beschrijven we een eenvoudige methode om te beoordelen van verschillende kenmerken van getolereerd allograft: de opkomst en de functie van de regulatoire cellen en de reacties van de anti-donor specifiek antilichaam van bloed monster door stroom cytometry (hier, wij gebruikten fluorescentie-activated cell sorting (FACS)).

Onderhoud van tolerantie-doorbraak tot de allograft na arrestatie van de behandeling is over het algemeen geassocieerd met de inductie van regulatoire cellen8. In de laatste decennia, studies gericht op CD4+Tregs met eenparigheid van stemmen gekenmerkt hen door de belangrijke markeringen Foxp3+,hogeCD25 en CD127-9,10,11. Ook verschillende markeringen werden toegeschreven aan CD8+ Tregs, zoals CD122+, CD28-, CD45RClage, PD1+, en Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. over het jaar, de uiting van GITR, CTLA4 en cytokines (IL-10, TGFβ, IL-34, IL-35, FGL-2) werden bovendien gekoppeld aan een Treg profiel3,4,6,13, 18,19,20,21. Echter een opkomende regelgevende cel populaties, zoals Bregs, RegMCs of NKTregs, gebrek aan relevante specifieke markers. Inderdaad, Bregs zijn meestal gemeld als onvolwassen CD24+ cellen, met meervoudige CD27 expressie en soms de productie van IL-10, TGFβ of granzyme B22,23,24. De complexiteit van de myeloïde cel overdrachtslijn vereist een combinatie van verschillende markers te definiëren hun regelgevende of proinflammatoire profiel zoals CD14, CD16, CD80, CD86, interactie CD40, CD209a of CD16325,-26. Tot slot, sommige markeringen zijn gemeld bij het identificeren van NKTregs zoals CD11b+, CD27+, TGFβ+, maar meer studies nodig zijn om verdere fenotypische beschrijven ze27,28,29 ,30,31,32. Dus, bewijzen van onderdrukkende activiteit moeten legitimeren verder fenotypische beschrijving voor de identificatie van nieuwe biomarkers, nieuwe immunoregulerende bemiddelaars/mediators, en uitbreiding van het toepassingsgebied tot nieuwe celtherapieën.

Wij stellen twee complementaire methoden om te evalueren van de onderdrukkende activiteit van cellen. Ten eerste, de in vitro -methode bestaat uit het kweken van onderdrukkende cellen met gelabelde effector T cellen gestimuleerd door allogene donor antigeen presenteert cellen (APCs) op verschillende ratio's over 6 dagen en analyseren van de effector T cel proliferatie die donor-geleide immuun onderdrukking weerspiegelt. Cellen uit behandelde ratten kunnen worden vergeleken rechtstreeks met cellen van naïeve ratten en niet-behandelde geënte ratten voor onderdrukkende activiteit (of enige andere regelgevende celpopulatie), in een waaier van suppressor: effector ratio's. Bovendien, deze methode hoeft niet een transplantatie, en resultaten worden verkregen binnen 6 dagen. Ten tweede bestaat de in vivo -methode uit het overzetten van de beoogde regulatoire cellen van een behandelde rat naar een nieuw bestraalde geënte ontvanger. Terwijl B myeloïde cellen, cellen en T cellen van niet-behandelde naïef ratten zijn gewoonlijk niet voor de remming van de acute afwijzing en te verlengen graft overleving bij adoptief overdracht, cellen met medicijn onderdrukkende activiteit van behandeld-ontvangers hebben deze kenmerken 1,2,,3,,4,33. Lymphopenia geïnduceerd door bestraling van de ontvanger wordt aanbevolen om adoptively overgedragen cellen onaangetast blijven door bloed homeostase en meester gemakkelijker de immuunrespons van de anti-donor toestaan. Voor beide methoden, de besteding in vitro van allogene derden APCs of in vivo adoptief overdracht van onderdrukkende toestaan cellen ontvangers geënt met een derde-partij hart analyse van de specificiteit van de anti-donor. Overwegende dat de in-vivo -methode een groot aantal cellen, slecht vertegenwoordigd vereist kunnen cel subpopulaties gemakkelijker worden beoordeeld voor onderdrukkende activiteit in vitro33.

Humorale reacties kunnen ook worden gemeten om te beoordelen van de toestand van de tolerantie en de controle van gestuurde antilichaam reacties op antigenen van de donor. Inderdaad, tolerantie kan worden gekenmerkt door het ontbreken van humorale respons naar de donor maar behoud van de capaciteit van de geadresseerden te ontwikkelen humorale reactie op nieuwe antigenen en het behoud van geheugen reacties. Ten eerste is het beginsel van alloantibody detectie gebaseerd op de erkenning van de donor cellen door ontvangende antilichamen na incubatie van donor celtype met serum van een geënte ontvanger. Tweede, humorale antwoorden gericht aan exogene antigenen kunnen beoordeeld volgende stimulatie van langdurige tolerant ontvangers met sleutelgat Limpet hemocyanine (HC) geëmulgeerd met compleet Freund van adjuvans. De aanwezigheid van specifiek IgM en IgG antistoffen tegen antigenen kan worden gedetecteerd 4 en 13 dagen, respectievelijk na immunisatie, met enzym gekoppelde ImmunoSorbent Assay (ELISA)34. Ten derde, het behoud van immuun geheugen reacties kan worden beoordeeld door injectie van XENOGENECELLEN rode bloedcellen (RBC) dagen -7 en + 3 van transplantatie en RBC kleuring met geadresseerden serum verzameld op dagen + 8 en +17 na transplantatie. Al deze methoden toestaan voor de identificatie van immunoglobuline subtypen met behulp van specifieke secundaire antilichamen, en snelle verwerving van resultaten in minder dan 1,5 h door FACS kleuring of een paar uur door ELISA.

Ten slotte, deze protocollen zijn ontworpen voor karakterisering van transplantatie modellen, en kunnen, tot op zekere hoogte, toegepast op auto-immuunziekte modellen. De beginselen van de methode kunnen worden omgezet naar alle soorten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Alle protocollen hier door een ethisch comité zijn goedgekeurd en in een steriele wijze moeten worden uitgevoerd.

1. generatie van tolerantie in een Model van cardiale Allograft in Rat

  1. Lew.1w LEW.1A allograft procedure
    1. Een mannetje van de donor LEW.1W rat met behulp van Isofluraan-O2 inademing, aangevuld met 1% N2O na 5 min. plaats het dier in de dorsale decubitus, en ontsmetten van de buik met betadine te voeren een Thoracotomie anesthetize (d.w.z., insnijding in de pleurale ruimte van de borst).
      1. Klem de minderwaardig en superieure venae ader, ligatuur ze en snij ze. Vervolgens gesneden van de longslagader en de aorta en sla de prothese in koude 0.9% NaCl.
    2. Een 250 g mannelijke LEW.1A ontvangende rat (van 8-12 weken) met behulp van Isofluraan-O2 inademing, aangevuld met 1% N2O na 5 min. plaats het dier in de dorsale decubitus en ontsmetten van de buik met betadine te voeren een laparotomie xyphopubic anesthetize (dat wil zeggen, grote incisie van de xiphoid process op de symphysis pubica).
      1. Belichamen van de darmen, de abdominale bloedvaten klem, een wordt-laterale wapendrager (dat wil zeggen, de verbinding tussen het einde van één kanaal en de muur van de andere) tussen de aorta graft en de abdominale aorta en tussen de pulmonaire uitvoeren slagader abdominale vena cava en de klemmen verwijderen.
    3. Suture van de gespierde vliegtuig en de huid, en te ontsmetten met betadine.
    4. Injecteren Nalbufine (pijnstiller) 6 mg/kg subcutaan (SC) en oxytetracycline (antibioticum) intramuscularly (i.m.), en plaats het dier onder een warmte lamp totdat het dier ontwaakt. Injecteren van buprenorfine (opioïden) (50 µg/kg) i.m. en meloxicam (steroïdale anti-inflammatoire drugs) (0,3 mg/kg) s.c. de dag van de transplantatie en een dag na.
  2. Inductie van de tolerantie door de blokkade van costimulatory interacties
    1. Stappen 1.1.1. aan 1.1.2.
    2. In een geheime A2 gedeelte van het dier faciliteit, Verdun infectieuze deeltjes van de 2 x 1010 van AdCD40Ig (een adenovirus codering van CD40Ig, een chimeer molecule die blokkeert de interactie CD40-CD40L-interacties) in Ringer's lactaat oplossing tot een eindvolume van 150 µL en in 3 punten (3 x 50 µL) te injecteren in de ventriculaire muur van de apex van de prothese.
    3. Stappen 1.1.3 aan 1.1.4.
      Opmerking: AdCD40Ig behandeling kan worden geassocieerd met anti-CD8α, anti-ICOS of anti-CD28 antilichaam injecties2,35,,36.
  3. Inductie van de tolerantie door overexpressie van een recombinant eiwit
    1. Verdunnen 1 x 1012 virale genoom van rat IL34-recombinant AAV in Ringer's lactaat oplossing tot een eindvolume van 100 µL. Anesthetize van een rat LEW.1A 150 g met Isofluraan-O2 inademing en intraveneus te injecteren (i.v.) in de penile ader.
    2. Een maand na injectie AAV-IL34, een LEW.1W prothese op de ontvanger van de LEW.1A volgens protocol 1.1 uitvoeren.

2. in Vitro beoordelingvan de onderdrukkende activiteit van de cellen door gemengde lymfocyten Reacties (MLRs)

Opmerking: Onderdrukkende activiteit van cellen uit behandelde tolerant ratten moet worden vergeleken met de equivalente bevolking uit syngeneic geënte ontvangers of naïef ratten.

  1. Isolatie van allogene APCs: plasmacytoid dendritische cellen (PDC's)
    1. Anesthetize een mannelijke LEW.1W naïef donor rat met behulp van Isofluraan-O2 inademing, aangevuld met 1% N2O na 5 min. plaats het dier in de dorsale decubitus en ontsmetten van de buik met betadine te voeren een splenectomie. Verwijderen van de milt door de transecting van de schepen, de milt Sla in koude 1 X-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en suture van het dier.
    2. Overdracht van de milt in een schotel, 1 X PBS verwijderen en perfuse met 5 mL 0,2% collagenase overleden Ter verbetering van de spijsvertering van het enzym, de milt in kleine stukjes gesneden en incubeer 15 min bij 37 ° C.
    3. Voeg 500 µL van 0,1 M ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), breng de milt stukken in een zeef en crush de milt met de zuiger van een injectiespuit te distantiëren van de cellen. Pipetteer in een buis en wassen van de cellen met 15 mL 1 X PBS. Centrifuge 10 min op 430 x g. Verwijder het supernatant.
    4. Om te elimineren RBC en bloedplaatjes, resuspendeer de pellet splenocyte in 10 mL hypotone oplossing en 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) uit te broeden. Spoel met 1 X PBS en centrifugeer 10 min op 190 x g. negeren het supernatant.
    5. Collageenvezels verwijderen door te filteren op een 100 µm weefsel filter. De cellen om te passen cel concentratie tot 5 x 107 cellen/mL in 1 X PBS/2% foetaal kalfsserum (FCS) / 0.5 mM EDTA tellen.
      Opmerking: Het aantal splenocytes moet tussen 4 x 10,8 en 7 x 108 cellen.
    6. Verrijken voor cellen van belang door negatieve selectie voordat u sorteert cel. Incubeer 15 min bij 4 ° C met 2 µg/mL gezuiverd antilichamen specifiek voor de T-cellen (anti-TCRαβ, R7/3 kloon en anti-TCRγδ, V65 kloon), B-cellen (anti-CD45RA, OX33 kloon) en NK-cellen (anti CD161, 3.2.3 kloon), wassen met 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA en centrifugeer 10 min op 430 x g . Verwijder het supernatant.
    7. Wassen met magnetische kralen 3 keer met 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA. Gebruik van 3,5 µL kralen/106 splenocytes, wassen door 30 mL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA, plaats voor 1 min aan de magneet, toe te voegen en verwijder het supernatant. Herhaal dit twee keer. Resuspendeer de kralen in 10 volumes van 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA (bijvoorbeeld 35 µL kralen wordt verdund in 350 µL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA).
    8. Ongewenste cellen verwijderen door het mengen van de splenocytes met de magnetische kralen voor 10 min bij 4 ° C onder agitatie, plaats de buis aan de magneet voor 1 min en het supernatant overbrengen in een nieuwe buis. Herhaal dit twee keer. Cellen tellen en aanpassen van de concentratie van de cel tot 5 x 107 cellen/mL in 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Opmerking: De verrijkte splenocytes moeten variëren tussen 5 x 10,7 en 9 x 10-7.
    9. Vlekken van de cellen met gelabelde antilichamen voor verdere sortering van PDC's: uitsluiten van resterende T-cellen (anti-TCRαβ, R7/3 kloon) of B cellen (anti-CD45RA, OX33-kloon), en sorteren van CD4+ (anti-CD4, OX35 kloon) CD45R+ cellen (anti-CD45R, His24 kloon). Label kralen met elke Ab om een compensatie matrix op FACS. Incubeer 15 min bij 4 ° C en wassen met 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
    10. Resuspendeer de cellen bij een concentratie van 5 x 107 cellen/mL, filter op een 60 µm weefsel filter, en label dode cellen door toevoeging van de DAPI aan een definitieve concentratie van 0,1 µg/mL. Cellen met een 70 µm mondstuk cel sorter, sorteren met het gating op DAPI-TCR-CD45RA-CD4+CD45R+ zoals afgebeeld in Figuur 1.
  2. Isolatie van responder effector T cellen (CD4 + CD25 - -T-cellen)
    1. De milt van een niet-behandelde niet-geënt naïeve LEW.1A rat oogst en bewaar het in koude 1 X PBS.
    2. Breng de milt in een zeef in een schotel geplaatst en voeg toe 10 mL 1 X PBS. Plet de milt met de zuiger van een injectiespuit te distantiëren van de cellen. Breng de cellen in een tube van 50 mL, wassen met 1 X PBS en centrifugeer 10 min op 430 x g. negeren het supernatant.
    3. Elimineren van RBC en bloedplaatjes, resuspendeer de pellet splenocyte in 10 mL hypotone oplossing voor 5 min op RT, dan wassen in 1 X PBS en centrifuge op 10 min 190 x g. Verwijder het supernatant.
    4. Verwijder de collageenvezels door te filteren op een 100 µm weefsel filter. De cellen om te passen van de concentratie van de cel tot 5 x 107 cellen/mL in 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA tellen.
      Opmerking: Het aantal splenocytes moet tussen de 3 x 10,8 en 5 x 108 cellen.
    5. De cellen van belang verrijken voordat u sorteert. Incubeer 15 min bij 4 ° C met 2 µg/mL gezuiverd antilichamen specifiek voor CD8 cellen (anti-CD8α, OX8-kloon), B-cellen (anti-CD45RA, OX33-kloon), NK-cellen (anti CD161, 3.2.3 kloon), myeloïde cellen (anti-CD11b/c, OX42 kloon), de gamma delta T cellen (anti-TCRγδ, V65 kloon). Daarna wassen met 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA en centrifuge 10 min op 430 x g. Verwijder het supernatant.
      Opmerking: Voor het sorteren van natuurlijke CD8+ Tregs van naïeve ratten op hetzelfde moment als CD4+ effector T cellen, Voeg geen anti-CD8α Ab tijdens de uitputting.
    6. Wassen van de magnetische kralen 3 keer met 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA zoals beschreven in stap 2.1.7.
    7. Verwijderen van de ongewenste cellen door het mengen van splenocytes met de magnetische kralen voor 10 min bij 4 ° C onder agitatie, dan plaatst u de buis aan de magneet voor 1 min en het supernatant overbrengen in een nieuwe buis. Herhaal dit twee keer. Cellen tellen en aanpassen van de concentratie van de cel tot 5 x 107 cellen/mL in 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Opmerking: De splenocytes moet variëren tussen 5 x 10,7 en 8 x 107 cellen.
    8. Toevoegen van gelabelde antilichamen tegen sorteren CD4+CD25- T cellen: anti-TCRαβ (R7/3-kloon), anti-CD4 (OX35 kloon), anti-CD25 (OX39 kloon) en incubeer 15 min bij 4 ° C. Tegelijk sorteren CD8+CD45RClage Tregs, anti-CD45RC Ab (OX22 kloon) toevoegen. Label kralen met elke Ab instellen op een matrix met compensatie voor verdere verwerking op stroom cytometry. Spoel de cellen met 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA en verwijder het supernatant.
    9. Resuspendeer de cellen tot 5 x 107 cellen/mL, filter op een 60 µm weefsel filter, en label dode cellen door toevoeging van de DAPI aan een definitieve concentratie van 0,1 µg/mL. De cellen met een 70 µm mondstuk cel sorter sorteren op TCR DAPI -+CD4 gating+CD25- cellen als responder cellen (en indien nodig van TCR DAPI -+CD4-CD45RClaag als CD8+ Tregs onderdrukkende cellen) zoals afgebeeld in Figuur 2.
  3. Isolatie van onderdrukkende cellen
    Opmerking: De milt in twee porties verdelen: sorteren een B-cellen, myeloïde cellen, NK-cellen, en anderzijds over CD4+ en CD8+ CD45RClage T cellen, om te beoordelen hun onderdrukkende functie.
    Opmerking: Voor de overdracht van het adoptie cel, sla 1 x 108 splenocytes om te dienen als de positieve controle van de tolerantie door de overdracht van het adoptie, indien nodig.
    1. Sorteren van B-cellen, myeloïde cellen en NK-cellen
      1. Volg protocol 2.1.1 naar 2.1.5.
      2. Incubeer 15 min bij 4 ° C met 2 µg/mL T-cel-specifieke antilichamen (anti-TCRαβ, R7/3 kloon en anti-TCRγδ, V65 kloon), wassen met 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA ongelabelde samen en centrifugeer 10 min op 430 x g. negeren het supernatant.
      3. Wassen met magnetische kralen 3 keer met 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA zoals beschreven in stap 2.1.7.
      4. Meng de splenocytes met de magnetische kralen te verwijderen van ongewenste cellen en incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C onder agitatie, dan plaatst u de buis aan de magneet voor 1 min en het supernatant overbrengen in een nieuwe buis. Herhaal dit twee keer. Cellen tellen en aanpassen van de concentratie van de cel tot 5 x 107 cellen/mL in 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Gelabelde antilichamen toevoegen aan de splenocytes voor het sorteren van cellen met vermoedelijke onderdrukkende activiteit zoals myeloïde cellen (anti-CD11b/c, OX42 kloon), B-cellen (anti-CD45RA, OX33 kloon) of NK-cellen (anti-CD161, 3.2.3 klonen). Label de kralen met elke Ab om een compensatie matrix op FACS. Incubeer 15 min bij 4 ° C en wassen met 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Resuspendeer de cellen bij een concentratie van 5 x 107 cellen/mL, filter op een 60 µm weefsel filter, en label dode cellen door toevoeging van de DAPI aan een definitieve concentratie van 0,1 µg/mL. De cellen met een 70 µm mondstuk cel sorter sorteren gating op DAPI-CD11b/c+ voor myeloïde cellen, CD45RA+ voor B-cellen en CD161+ voor NK cellen zoals afgebeeld in Figuur 3.
    2. Sorteren van CD4 + en CD8 + CD45RC lage T cellen
      1. Volg protocol 2.2.1 naar 2.2.4.
      2. Voor negatieve selectie op een magnetische kolom, Incubeer de cellen 15 min bij 4 ° C met 2 µg/mL gezuiverd antilichamen specifiek voor de B-cellen (anti-CD45RA, OX33-kloon), NK-cellen (anti CD161, 3.2.3 kloon), myeloïde cellen (anti-CD11b/c, OX42 kloon), de gamma delta T cellen () anti-TCRγδ, V65 kloon), was ze met 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA en centrifugeer 10 min op 430 x g. negeren het supernatant.
      3. Wassen van de magnetische kralen 3 keer met 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA zoals beschreven in stap 2.1.7.
      4. Verwijderen van de ongewenste cellen door het mengen van de splenocytes met de magnetische kralen voor 10 min bij 4 ° C onder agitatie, dan plaatst u de buis aan de magneet voor 1 min en het supernatant overbrengen in een nieuwe buis. Herhaal dit twee keer. Cellen tellen en aanpassen van de concentratie van de cel tot 5 x 107 cellen/mL in 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Gelabelde antilichamen toevoegen aan de cellen om te sorteren Tregs: anti-TCRαβ (R7/3-kloon), anti-CD4 (OX35-kloon), anti-CD45RC (OX22-kloon). Label de kralen met elke Ab om een compensatie matrix op FACS. Incubeer 15 min bij 4 ° C en wassen met 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Resuspendeer de cellen bij een concentratie van 5 x 107 cellen/mL, filter op 60 µm tissues, en label dode cellen door toevoeging van de DAPI aan een definitieve concentratie van 0,1 µg/mL. De cellen met een 70 µm mondstuk cel sorter sorteren op DAPI gating-+CD4 TCR+CD45RClaag als CD4+Tregs en DAPI-TCR+CD4-CD45RC lage als CD8+Tregs ( Figuur 4).
        Opmerking: De anti-CD8α Ab (OX8 kloon) kan worden gebruikt in plaats van de anti-CD4 Ab als T-cellen worden gediscrimineerd van CD4+niet-T-cellen door anti-TCR labeling. Een overmaat van CD4+Tregs in afwachting van de dood van de cel door de cel proliferatie kleurstof (CPD) labeling moeten worden gesorteerd.
  4. Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) etikettering van responder cellen voor het meten van de proliferatie
    1. Na responder cel sorteren, wassen tweemaal de cellen met 1 X PBS.
    2. Resuspendeer de cellen bij een concentratie van 1 x 107 cellen/mL in 1 X PBS en incubeer met 0,5 µM CFSE voor 5 min op RT in het donker. Zet de reactie stop door toevoeging van FCS aan 1,5 X het volume samen en centrifugeer 10 min bij 430 x g bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
    3. Wassen van tweemaal de cellen met volledige medium, en de cellen tellen.
      Opmerking: Verwachten dat 30% van de cellen dood bij deze stap.
  5. CPD labeling van CD4 + Tregs voor onderdrukkende assay op CD4 + effector cellen
    Opmerking: Deze stap is nodig om het discrimineren van CD4 CFSE-+Tregs van CFSE- -delende responder CD4+T-cellen op dag 6 van coculture door het gating op CPD- cellen.
    1. Na CD4+ Tregs cel sorteren, wassen van tweemaal de cellen met 1 X PBS.
    2. Resuspendeer de cellen bij een concentratie van 1 x 107 cellen/mL in 1 X PBS en incubeer met 10 µM van CPD V450 voor 20 min op RT in het donker.
    3. Wassen van tweemaal de cellen met volledige medium, en de cellen tellen.
      Opmerking: Verwachten dat 30% van de cellen dood bij deze stap.
  6. Advies voor coculture
    1. Gebruik van cultuur in middelgrote bestaande uit: RPMI 1640 medium aangevuld met bèta-mercaptoethanol (5 x 10-5 M), penicilline (100 U/mL), streptomycine (0,1 mg/mL), natrium pyruvaat (1 mM), glutamine (2 mM), HEPES-buffer (1 mM), niet-essentiële aminozuren (1 X), FCS () 10%).
    2. Cultuur cellen in 96-Wells U beneden platen.
    3. Cellen toevoegen in de volgende volgorde: onderdrukkende cellen, responder cellen en allogene cellen.
    4. Het aantal responder T cellen en allogene APCs constant te houden en testen van een bereik van Tregs-nummer. Bijvoorbeeld de verhouding 4:4:1, 5 x 104 onderdrukkende cellen, 5 x 10-4 -responder cellen en 1.25 x 104 allogene cellen, en de verhouding 2:4:1, 2, 5 x 104 onderdrukkende cellen, 5 x 10-4 -responder cellen en 1.25 x 104 allogene cellen.
    5. Behouden van het aandeel van 5 x 104 -responder cellen voor 200 µL medium/putje.
    6. Voor besturingselementen bevatten een paar putjes met responder T cellen zonder allogene APCs (negatieve controle) en responder T cellen met allogene APCs zonder regulatoire cellen (positieve controle) voor CFSE gating op dag 6 (zie stap 2.7.6.).
  7. FACS kleuring en analyse na 6 dagen van coculture
    Opmerking: De verspreiding van effector cellen kan worden beoordeeld op verschillende tijdstippen. Merk op dat proliferatie exponentiële: naarmate de celdeling toeneemt, meer verschillen tussen de onderdrukkende voorwaarden en negatieve controle kunnen worden waargenomen.
    1. Overdracht van de cellen van de 96-Wells-U onder platen tot en met 96-Wells V bodem platen en centrifugeer 1 min bij 1.200 x g bij 4 ° C.
    2. Sla het supernatant in een nieuwe plaat op-20 ° C voor het meten van cytokine niveaus, indien nodig.
    3. Wassen van de cellen met 200 µL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA per goed en centrifuge 1 min bij 1.200 x g bij 4 ° C.
    4. Antilichamen toevoegen aan de cellen die moeten verder poort op responder T cellen: anti-TCRab (R7/3 kloon) en anti-CD4 (OX35 kloon). Incubeer 15 min bij 4 ° C en spoel tweemaal met 200 µL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA per putje. Verwijder het supernatant.
    5. Voeg 100 µL van de DAPI verdund op 0,1 µg/mL in 1 X PBS en lees de plaat met een FACS analyzer.
    6. Analyseren van het profiel van de CFSE door het gating op DAPI negatieve (levende cellen) CPD negatief (niet-CD4+Tregs)+CD4 TCR+ cellen. Ongestimuleerde responder cellen hebben maximale helderheid van de CFSE zoals aangegeven in Figuur 5 onder linker histogram. In aanwezigheid van allogene APCs hebben de responder cellen maximale proliferatie en minimale helderheid van de CFSE (onder, midden). In aanwezigheid van allogene APCs en regelgevende cellen hebben de effector cellen middellange proliferatie en CFSE helderheid (rechtsonder,).

3. in Vivo beoordelingvan de onderdrukkende activiteit van cellen door adoptief cel overdracht in een hart geënt ontvanger

Opmerking: Bestraling is nodig om elimineren de cellen van de gastheer en gunst donor cel engraftment en verspreiding.

  1. De geadresseerden van het transplantaat bestralen vroeg op de dag vóór de prothese aan de voorwaarde van de ontvanger. Anesthetize ratten met im. injectie van xylazine (8 mg/kg)-ketamine (80 mg/kg) en bestralen hen bij een dosis van 4.5 Gy met X-stralen.
  2. Volg protocol 2.3 te isoleren van de cellen van belang.
    Opmerking: Sla 1 x 108 splenocytes om te dienen als positieve controle van de tolerantie door de overdracht van het adoptie, indien nodig.
  3. 12u na bestraling (de dag vóór de prothese, 's avonds), anesthetize van de ratten na inademing van 4% Isofluraan-O2 en infusie van de cellen (5.0 x 107 T-cellen, 3.0 x 107 B-cellen, 3.0 x 107 myeloïde cellen of 1,50 x 108 splenocytes als positieve controle van tolerantie door adoptief overdracht) i.v. in de penile ader.
    Opmerking: Het aantal cellen die nodig is voor de tolerantie door adoptief overdracht is afhankelijk van de onderdrukkende activiteit van de cellen.
  4. De volgende dag Volg protocol 1.1 voor het uitvoeren van de allograft. Volg graft evolutie door palpatie via de buik.

4. donor specifieke antistofdetectie

Opmerking: IgG reacties gericht op de prothese donor worden gemeten door de cellen van de donor met serum van de ontvanger aan het broeden. Aftrekken van de achtergrond geïnduceerd door directe verkleuring van de LEW.1W B cellen door het broeden van de cellen met syngeneic LEW.1W serum.

  1. Oogsten van bloed van de ratten en centrifugeer 15 min bij 1.200 x g bij 4 ° C. Sla het serum. Serum kan worden opgeslagen bij-20 ° C of onmiddellijk gebruikt. Inactivering van de aanvulling in de sera door incubatie gedurende 30 minuten op 56 ° C.
  2. De milt van een donor LEW.1W rat oogst en bewaar het in koude 1 X PBS. Volg de stappen 2.2.1. naar 2.2.4. Voeg 2 x 105 cellen per putje in de bodemplaat van een 96-Wells-V. Centrifugeer 1 min bij 1.200 x g bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen.
  3. Verdun de sera serieel van 1/10 naar 1/270 in 1 X PBS (4 verdunningen/voorbeeld). Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 4 ° C met 25 µL van verdund serum/putje. Anticiperen op het aantal IgG donor-specifieke immuunresponsen subtypen (IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b) om te analyseren per monster (1 serum x 4 verdunningen x 4 IgG subtypen). Spoel de cellen met 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA en verwijder het supernatant.
  4. Incubeer de cellen met elke muis anti-rat IgG subtype Ab fluorescerende-geëtiketteerden gedurende 30 minuten bij 4 ° C, een subtype per putje.
    Opmerking: Als fluorescerende-geëtiketteerden anti-rat Ig Ab niet beschikbaar zijn, is het mogelijk gebruik van gezuiverde labelloze muis anti-rat IgG subtype Ab en een fluorescerende-geëtiketteerden secundaire-antimuis Ab. afhankelijk op de beschikbare fluorochromes en cytometer configuratie, verschillende anti-rat IgG subtypen kunnen worden getest in één goed met de juiste instellingen.
  5. Spoel de cellen met 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA tweemaal en verwijder het supernatant.
  6. Voeg 100 µL van de DAPI verdund bij 0,1 µg/mL in PBS en lees de plaat met een FACS analyzer.
  7. Lees de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI's) van het anti-rat IgG subtype die AB gelabeld met de fluorescerende op alle cellen van de DAPI- . Aftrekken van de MFI verkregen met naïeve LEW.1A serum op de LEW.1W cellen (achtergrondkleuring, linksonder) van de MFI verkregen met de sera van elke geadresseerde in de cellen van de LEW.1W bij de overeenkomstige verdunning (onderste midden voor onbehandelde verwerpen geadresseerden die maximale MFI en onderkant weergeven rechts voor behandelde tolerant geadresseerden die weergeven van tussenliggende MFI) (Figuur 6).

5. beoordeling van de humorale reacties aan exogene antigenen (Naive en geheugen)

Opmerking: Serum van ratten voor transplantatie, behandeling en immunisatie moet worden gebruikt als negatieve controles van humorale reacties. Anders, niet geïmmuniseerd naïef ratten kunnen worden gebruikt. Serum van immunocompetent geadresseerden, dat wil zeggen, getransplanteerde exoantigen-geïmmuniseerd en verwerpen geadresseerden, worden gebruikt als positieve controle van de humorale reacties.

  1. Vermogen om te ontwikkelen humorale respons op een nieuwe antigeen (Figuur 7)
    Opmerking: Deze methode is een relatieve kwantificering van humorale reacties zoals een standaard niet opgenomen. Een absolute Ig kwantificering zou mogelijk zijn door het toevoegen van een reeks verdunningen van rat IgG of IgM anti-HC Ab met bekende concentratie in stap 5.1.6.
    1. 50 µg HC in 200 µL van compleet Freund van adjuvans emulgeren en injecteren in de staart van de lange-overleven/tolerante ontvangers, onbehandelde verwerpen geadresseerden of naïef ratten beheren als positieve controle van de humorale reacties.
    2. Oogsten van bloedmonsters 4 en 13 dagen na vaccinatie en centrifugeer 15 min bij 1.200 x g bij 4 ° C. Sla de bovenste fase is dat het serum. Oogst de serum van niet-geïmmuniseerd ratten voor een negatieve controle. Serum kan worden bevroren bij-20 ° C tot de analyse van de ELISA.
    3. ELISA-plaatjes (platte bodem) jas met 50 µL per putje HC verdund bij 10 µg/mL in 1 X PBS's nachts bij 4 ° C. Zorg ervoor dat de coating oplossing omvat alle de putjes.
    4. Verwijder de overtollige ongecoate HC door het wassen. Toevoegen om te wassen, 150 µL per putje van was buffer (1 X PBS met 0,1% Tween) en flick.
    5. Blok aspecifieke binding van geadresseerde Ig door incubatie gedurende 1 uur bij 37 ° C met 100 µL per putje van wassen buffer met 10% FCS. Een keer wassen.
    6. Serieel Verdun de ontvangende sera in was buffer vanaf 1/40 aan 1/512, toevoegen van 50 µL per putje in de duplicaten van de seriële verdunning op de beklede plaat en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C. Houd sommige wells gratis serum voor een negatieve controle. Twee keer wassen.
    7. Voeg 50 µL van 1 µg/mL Biotine-geconjugeerde anti-rat IgM Ab in putjes met serum geoogst op dag 4 in ontvangers, of 50 µL van anti-rat Biotine-geconjugeerde IgG in putjes met serum geoogst op dag 13, en Incubeer 1 uur bij 37 ° C. Twee keer wassen.
    8. Voeg 50 µL per putje van HRP-geconjugeerde daar bij 1 µg/mL gedurende 45 minuten bij 37 ° C. 3 keer wassen.
    9. Voeg 50 µL van 3, 3 ', 5, 5 '-Tetramethylbenzidine (TMB) substraat voor < 30 min op RT en stop de reactie met 25 µL van 2 M zwavelzuur als positieve controles zijn verzadigd.
    10. Lees de absorptie bij 405 nm. Vergelijk de extinctie verkregen met de geadresseerde serum aan degene met het naïef rat controleserum wordt verkregen.
  2. Beoordeling van humorale respons geheugencapaciteit (Figuur 8)
    1. 7 dagen vóór de transplantatie, injecteren i.v. 109 van XENOGENECELLEN RBC verdund in 800 µL van 1 X PBS in de naïeve ratten. RBC kunnen worden van de schapen, paard of elke andere soort.
    2. De transplantatie uitvoeren en beheren van de tolerogenic behandeling.
    3. 3 dagen na de prothese, injecteren weer i.v.109 RBC verdund in 800 µL van 1 X PBS in de prothese ontvangers en niet-geënt ratten.
    4. Oogst bloed monsters 5 en 14 dagen na de tweede immunisering en centrifuge 15 min bij 1.200 x g bij 4 ° C tot het herstellen van de bovenste serum-fase. Serum kan worden opgeslagen bij-20 ° C of onmiddellijk gebruikt. Inactivering van de aanvulling in rat sera door 30 minuten op 56 ° C vóór gebruik aan het broeden.
    5. Voeg 2 x 105 RBC per putje van de bodemplaat van een 96-Wells-V. Centrifugeer 1 min bij 1.200 x g bij 4 ° C en verwijder het supernatant zorgvuldig door aspiratie.
    6. Serieel Verdun de sera 2-fold van 1/10 tot 1/1280 in 1 X PBS (8 verdunningen/voorbeeld). Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 4 ° C met 25 µL van verdund serum/putje. Spoel de cellen met 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA en verwijder het supernatant.
    7. Incubeer de cellen met de RBC soorten-geadsorbeerde anti-rat IgG of IgM subtypen gelabeld met de fluorescerende gedurende 30 minuten bij 4 ° C, een subtype per putje. Beoordelen van de rat IgM en IgG anti-RBC in serum geoogst van 5 tot 14 dagen na immunisatie, respectievelijk. Spoel de cellen met 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA tweemaal en verwijder het supernatant.
      Opmerking: Als fluorescerende-geëtiketteerden anti-rat Ig Ab niet beschikbaar zijn, is het mogelijk om gezuiverde labelloze muis anti-rat IgG subtype Ab en een fluorescerende-geëtiketteerden secundaire-antimuis Ab te gebruiken.
    8. Voeg 100 µL van de DAPI verdund op 0,1 µg/mL in 1 X PBS en analyseren van de cellen met een FACS analyzer.
    9. Vertegenwoordigen de MFI als een functie van de verdunning voor elke groep.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De beoordeling van de onderdrukkende activiteit na het sorteren van de APCs (Figuur 1), responder cellen en Tregs tegelijk (Figuur 2), of afzonderlijk (Figuur 4), en alle andere vermeende regelgevende cellen (Figuur 3), kan worden gedaan in vivo door directe inspuiting van de regulatoire cellen en in vitro door meting van de helderheid van de CFSE (Figuur 5). De status van de humorale respons van de ontvanger naar de donor (Figuur 6) of exogene antigenen (figuren 7 en 8) kan ook worden beoordeeld in vitro na in vivo immunisatie als afgebeeld.

Figure 1
Figuur 1 . Strategie als u wilt sorteren van PDC's gating.
Cellen zijn geselecteerd op de grootte van de morfologie en granulariteit (WS-A/FSC-A), paren werden uitgesloten door FSC-W/FSC-H en WS-W/SSC-H parameters, levende cellen werden geselecteerd door gating op DAPI- cellen, en PDC's werden geselecteerd op TCR-CD45RA-CD4 + CD45R+ uitdrukking. Zuiverheid werd beoordeeld door de DAPI aan gesorteerde cellen toe te voegen en draait op de sorter van de cel met de sorteer parameters. Zuiverheid van een zeldzame gesorteerde bevolking (minder dan 2%) moet groter zijn dan 95%. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Gating strategie sorteren CD4+CD25- responder T cellen en CD8+CD45RClage Tregs.
Cellen werden geselecteerd op morfologie, d.w.z., grootte en granulariteit (WS-A/FSC-A), paren werden uitgesloten door FSC-W/FSC-H en WS-W/SSC-H parameters, levende cellen werden geselecteerd door gating op DAPI- cellen, en responder cellen werden geselecteerd op TCR + CD4+CD25- -expressie. CD8+Tregs hebt is gelijktijdig gesorteerd gating op TCR+CD4--CD45RClaag cellen. Zuiverheid werd beoordeeld door de DAPI aan gesorteerde cellen toe te voegen en draait op de sorter van de cel met de sorteer parameters. Zuiverheid moet groter zijn dan 95%. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Strategie soort B-cellen, myeloïde cellen en NK-cellen gating.
Cellen zijn geselecteerd op de grootte van de morfologie en granulariteit (WS-A/FSC-A), paren werden uitgesloten door FSC-W/FSC-H en WS-W/SSC-H parameters, levende cellen werden geselecteerd door gating op DAPI- cellen, en B cellen werden geselecteerd op CD45RA+ uitdrukking myeloïde cellen op CD11b/c+ uitdrukking en NK-cellen op CD45RA-CD11b/c-CD161hoge expressie. Zuiverheid werd beoordeeld door de DAPI aan gesorteerde cellen toe te voegen en draait op de sorter van de cel met de sorteer parameters. Zuiverheid moet groter zijn dan 95%. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . Gating strategie sorteren CD8+CD45RClage en CD4+CD45RClaag Tregs.
Cellen zijn geselecteerd op de grootte van de morfologie en granulariteit (WS-A/FSC-A), paren werden uitgesloten door FSC-W/FSC-H en WS-W/SSC-H parameters, leefde cellen werden geselecteerd door gating op DAPI- cellen en CD4+Tregs werden geselecteerd op TCR + CD4+CD45RClage expressie en CD8+Tregs op TCR+CD4-CD45RClage expressie. Zuiverheid werd beoordeeld door de DAPI aan gesorteerde cellen toe te voegen en draait op de sorter van de cel met de sorteer parameters. Zuiverheid moet groter zijn dan 95%. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 . Representatieve analyse van de in vitro onderdrukkende assay.
De responder celproliferatie was geanalyseerd door selectie op de grootte van de morfologie en granulariteit (WS-A/FSC-A), uitsluiting van paren door FSC-W/FSC-H en WS-W/SSC-H parameters, uitsluiting van dode cellen en CD4+ Tregs door gating op DAPI-CPDV450 - cellen, selectie van TCR+CD4+ cellen en CFSE profiel analyse. De CFSE poort was gebaseerd op ongestimuleerde CFSE-geëtiketteerden responder cellen. CFSEhoge cellen zijn niet-prolifererende cellen en CFSElaag zijn cellen met ≥ 1 divisie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 . Representatieve analyse van de donor specifieke alloantibody reactie.
Splenocytes van de donor rat werden geïncubeerd met een bereik van verdunde warmte-geïnactiveerd serum uit behandelde of onbehandelde geadresseerden of naïef rat, en vervolgens met anti-rat IgG-FITC. Alloantibodies worden gedetecteerd door het analyseren van MFI's van het FITC op DAPI- z cellen na WS en FSC paren uitsluiting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 . Beginsel van de anti-HC detectiemethode.
Ontvangers waren geïmmuniseerde 120 dagen na transplantatie met HC aangevuld met CFA en bloedmonsters 4 en 13 dagen na immunisatie zijn geoogst. HC eiwitten waren bekleed op 96-vlakke bodem-wells-platen, en geïncubeerd met serummonsters van geïmmuniseerde ratten. Biotinyleerd geit anti-rat IgG of IgM toegestaan detectie van anti-HC Ab aanwezig in serum geoogst 4 of 13 dagen na vaccinatie. HRP-coupled daar veranderd de TMB substraat op een blauw gekleurde product dat de kleur omslaat naar geel wanneer de reactie was gestopt met zwavelzuur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8 . Schema van de anti-RBC detectiemethode.
Ontvangers waren geïmmuniseerde 7 dag(en) en 3 dagen na transplantatie met XENOGENECELLEN rode bloedcellen (RBC) en bloedmonsters werden geoogst van geïmmuniseerd ontvangers 5 en 14 dagen na de laatste vaccinatie. RBC werden geïncubeerd met serummonsters van geïmmuniseerde ratten. Aanwezigheid van anti-ige suspensie van RBC antilichamen op de RBC werd ontdekt door de kleuring met gelabelde geit anti-rat IgG of IgM antilichamen en FACS Canto analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Adoptief overdracht van totale splenocytes in een nieuw geënte ontvanger is een efficiënte manier om de aanwezigheid van regelgevende cellen veroorzaakt of versterkt door een behandeling. Host bestraling-geïnduceerde voorbijgaande lymphopenia bevordert de overleving van de cel na overdracht en vestiging van tolerantie. Bovendien laat subletale bestraling tijd voor cellen met tolerogenic eigenschappen tijdens wilt converteren naar nieuwe regelgevende cellen immuunsysteem reconstitutie, een verschijnsel genaamd besmettelijke tolerantie34. Meestal goed beschreven CD4+CD25hogeFoxp3+CD127lage Tregs voor het eerst worden bestudeerd wanneer tolerantie wordt waargenomen. Echter niet overdragen van de negatieve breuk (splenocytes uitgeput CD4+Tregs) kan soms verlenging ook na de reeds bekende regulatoire cellen en de identificatie van nieuwe cel populaties1,2, 3,4. In AdCD40Ig-induced tolerantie, de overdracht van CD4+T cellen-verarmd splenocytes geopenbaard de ontdekking van CD8+CD45RClage Tregs1. Bovendien, opeenvolgende overdracht van totale CD8+ T cellen en vervolgens beperkt tot CD45RClaag cellen, toonde de mogelijkheden van deze methode om geleidelijk een nieuwe populatie van regelgevende cellen. Bovendien maakt deze strategie analyse van alle bevolkingsgroepen. Inderdaad, we hebben aangetoond dat veel regulatoire cellen naast elkaar kunnen bestaan en zelfs waarschijnlijke, en dat compensatiemechanismen bestaat2,4. Bij ratten behandeld met CD40Ig, uitputting van CD8+ cellen toegestaan de opkomst van B-cellen en myeloïde cellen met regelgevende eigenschappen, en tolerantie voor de cardiale allograft in rat volgens het protocol beschreven hierboven2overgebracht. In een model van tolerantie geïnduceerd door overexpressie van IL34, beide CD4+ en CD8+Tregs konden overbrengen van tolerantie4.

Donor-geleide specificiteit van behandeling-geïnduceerde tolerantie kan worden beoordeeld op cellulaire en humorale niveaus. Eerste, adoptief overdracht van regulatoire cellen in ontvangers van een derde partij prothese zal niet lukken bij de overdracht van tolerantie als de cellen specifiek voor de eerste donor graft33 zijn. Tweede, onderdrukkende cellen moeten efficiënt remming van de proliferatie van responder cellen in reactie op de stimulatie door de APCs van de eerste donor van de prothese maar niet van een derde partij donor2. Ten slotte kunnen humorale reacties tegen de donor van de prothese worden onderscheiden van totale Ig productie in de ontvanger met behulp van het protocol zoals hierboven beschreven. Bovendien, in geval van specifieke tolerantie aan de eerste prothese donor ontvanger moet zitten kundig voor ontwikkelen een nieuwe humorale reactie tegen een secundaire derden graft, een nieuwe antigeen of een voormalige bekend antigeen-16.

Collagenase D behandeling van de milt is voorkeurs- en aan te raden om alle populaties van de cel uit het orgel. Tot slot, wanneer het fenotype van regulatoire cellen is zo krap dat de cellen zijn slecht vertegenwoordigd (< 1% van de splenocytes), overdracht van de negatieve breuk in vergelijking met de overdracht van de totale bevolking kan helpen bij het onderscheiden van de onderdrukkende activiteit van dit kleine bevolking. Bijvoorbeeld CD40Ig-geïnduceerde CD8+Tregs specifiek voor een allogene peptide zou FACS gekleurd met behulp van tetramers, maar hun lage aantal niet mogelijk positieve adoptief overdracht33,,38. Echter adoptief overdracht van de CD8 tetrameer-verarmd+CD45RClage T cellen niet tolerantie ten opzichte van aan totale Tregs overgemaakt heeft, het potentieel van deze subpopulatie markeren. Dit resultaat werd bevestigd door een onderdrukkende experiment in vitro . Inderdaad, het onderdrukkende experiment was ook een overtuigende manier om de capaciteit van Du51-specifieke Tregs te onderdrukken van de immuunrespons33tonen.

Het onderdrukkende protocol dat hierboven beschreven is beperkt tot de ontvangende effector CD4+T cel reacties op PDC's van de donor. Dit protocol kan worden aangepast door de PDC's te vervangen door cDCs of totale APCs, maar ervoor te zorgen dat de effector: stimulator ratio's afgestemd zijn op het bereiken van een gematigde proliferatie beheersbaar door de onderdrukkende cellen. Inderdaad, een verhouding van CD4+CD25-T cellen: PDC's moet 4:1, overwegende dat een verhouding van CD4+CD25- T cellen: cDCs moet 8:1 en CD4+CD25- T cellen: APCs, 1:1 of 1:2. De verhoudingen zijn afhankelijk van de alloreactivity tussen de donor en de ontvanger; de bovenstaande ratio's zijn geschikt voor een combinatie van LEW.1W:LEW.1A met een acute afwijzing gebeurt op dag 7, maar het bereik van-responder: stimulator verhoudingen moet worden getest voordat het offer van dieren. Tot slot heeft de CFSE voorkeur aan thymidine analyseren onderdrukkende activiteit, voor veiligheid en betrouwbaarheid zorgen. Echter, zorgen het mogelijke onderscheid tussen onderdrukkende cellen en -responder cellen voor de analyse van de CFSE op dag 6 als de effector CD4+CD25- -T-cellen worden vervangen door de totale splenocytes. Ook zorgen dat de resterende T cellen onder stimulator cellen kunnen niet vermenigvuldigen na 35 Gy bestraling.

Ontwerp van de FACS kleuring is gebaseerd op de beschikbaarheid van antilichamen die zijn vermeld in tabel 3. Soortgelijke protocollen kunnen worden aangepast voor muizen modellen, zorgen voor doel benaming (bijvoorbeeld myeloïde cellen zijn differentieel beschreven in muis en rat).

De heterotopic cardiale allograft in rat is een solide orgaantransplantatie model met grote kansen voor graft uitkomstmonitoring. Terwijl renale allograft model worden gekenmerkt door een plotselinge dood van de ontvanger, informeert de palpatie van de beat sterkte van de cardiale prothese via de buikwand van de graft evolutie39,40. Een gelijktijdige huidtransplantatie of een tweede cardiale prothese kan worden gerealiseerd op de ontvanger van de cardiale allograft te bestuderen geheugen reacties41. Bovendien zijn biomoleculaire engineering en biologische of chemische hulpmiddelen voor uitputting van bepaalde celtypen zoals B cellen (IgM KO), CD8 cellen (anti-CD8α antilichamen) of myeloïde cellen (clodronate liposomen), nuttige instrumenten voor het meten van het belang van dergelijke cel populaties bij inductie of het onderhoud van de tolerantie afhankelijk van de tijd post transplantatie waar afbreken behandeling wordt toegediend aan de ontvangende1,2,3,4.

Date, Bregs, myeloïde cellen en CD8 rat+Tregs zijn niet goed beschreven. De protocollen van de inductie van de tolerantie hierboven zijn voorgesteld als referentie voor de karakterisatie van rat regulatoire cellen1,2,3,4. Fenotypische beschrijving van deze cellen en de vergelijking met andere modellen van allotransplantation en andere soorten kunnen verder te discrimineren markeringen van groot belang. Inderdaad, vergelijking van Bregs van Muismodellen van tolerantie en operationeel tolerant patiënten Markeer overwicht van CD5 of CD24 marker expressie als biomarkers voor Bregs3,23,24, 42 , 43 , 44 , 45 . In ons model van tolerantie geïnduceerd door AdCD40Ig gecombineerd met CD8α uitputting, is de CD24 overexpressie t.o.v. B-cellen onderdrukkende activiteit2ontbreekt. Hoge-doorvoer digitale gen expressie RNA sequencing onlangs naar voren gekomen als een vernieuwend hulpmiddel om te verder karakteriseren regulatoire cellen46.

Ten slotte kunnen protocollen bij het detecteren van de aanwezigheid van regelgevende cellen geïnduceerd door de behandeling van een tolerogenic worden aangepast aan andere modellen. Hier hebben we gebruikt LEW.1W in LEW.1A combinatie van allograft, gekenmerkt door een afwijzing van de graft in ongeveer 7 dagen. De combinatie van omkeren, die is beschreven als strengere en waar acute afwijzing gebeurt sneller en sterker, kan worden gebruikt. Auto-immuunziekte modellen kunnen ook profiteren van onze ervaring in transplantatie voor het ontcijferen van de mechanismen van de inductie van de tolerantie met behandelingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd gerealiseerd in het kader van het project Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01), dat deel uitmaakt van het "Investissements d'Avenir" Franse regering programma beheerd door de ANR (ANR-11-LABX-0016-01) en de IHU-Cesti project gefinancierd wordt ook door de " Investissements d'Avenir"Franse regering programma, beheerd door de Franse nationale onderzoek Bureau (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Het IHU-Cesti project wordt ook ondersteund door de Nantes Métropole en Région Pays de la Loire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
animals
LEW.1W and LEW.1A rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
BN third party donor rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
name company catalogue number comments
reagents
AdCD40Ig Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
IL34-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
FGL2-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
anti-TCRab Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K R7/3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX39 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX8 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RA Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX33 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K 3.2.3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/c Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX42 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgd Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K V65 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RC Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX22 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX35 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45R BD Biosciences, Mountain View, CA #554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #112-096-071
anti-rat IgG1 Serotec #MCA 194
anti-rat IgG2a Serotec #MCA 278
anti-rat IgG2b Serotec #MCA 195
anti-rat IgM-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #115-095-164
streptavidin HRP BD Biosciences, Mountain View, CA #554066
KLH Sigma Aldrich, St. Louis, USA #9013-72-3
PBS 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20 Sigma, Saint-Louis, USA #9005-64-5
TMB substrate reagent kit BD Biosciences, Mountain View, CA #555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit Thermo Fisher Scientific Inc, USA #C34554
RPMI 1640 medium 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA #31870-025
penicilline streptomycine Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15140-122
Hepes Buffer Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15630-056
non essential amino acids Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11140-035
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11360-039
2 beta mercaptoethanol Sigma, Saint-Louis, USA #M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell Thermo Fisher Scientific Inc, USA #65-0842-85
Glutamine Sigma, Saint-Louis, USA #G3126
DAPI Thermo Fisher Scientific Inc, USA #D1306
Collagenase D Roche Diagnostics, Germany #11088882001
EDTA Sigma, Saint-Louis, USA #E5134
NaCl 0.9% Fresenius Kabi #B230561
Magnetic dynabeads Dynal, Invitrogen #11033 Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeads Ebiosciences, San Diego, USA #01-1111-42
Betadine Refer to the institutional guidelines
Isoflurane Refer to the institutional guidelines
Naplbuphine Refer to the institutional guidelines
Terramycine Refer to the institutional guidelines
Buprenorphine Refer to the institutional guidelines
Meloxicam Refer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
Rompun Refer to the institutional guidelines
Ringer lactate Refer to the institutional guidelines
Ketamine Refer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solution Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase D Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
name company catalog number comments
equipments
falcon 50ml BD Biosciences, Mountain View, CA #227261
falcon 15ml BD Biosciences, Mountain View, CA #188271
sieve
Corning plastic culture dishes VWR, Pessac #391-0439
100µm and 60µm tissue filters Sefar NITEX, Heiden, Switzerland #03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture  Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning #353077
96 wells V bottom plates for FACS staining ThermoScientifique, Danemark #249570
96 wells flat bottom ELISA plates Nunc Maxisorb
seringue for spleen crush BD Biosciences, Mountain View, CA #309649
ELISA reader SPARK 10M, Tecan, Switzerland SPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiator Lincolshire, England Faxitron CP160
solar agitator
FACS Canto II BD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria II BD Biosciences, Mountain View, CA
magnet Thermo Fisher Scientific Inc, USA 12302D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guillonneau, C., et al. CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest. 117, (4), 1096-1106 (2007).
  2. Bézie, S., et al. Compensatory Regulatory Networks between CD8 T, B, and Myeloid Cells in Organ Transplantation Tolerance. J Immunol. 195, (12), 5805-5815 (2015).
  3. Bézie, S., et al. Fibrinogen-Like Protein 2/Fibroleukin Induces Long-Term Allograft Survival in a Rat Model through Regulatory B Cells. PloS One. 10, (3), e0119686 (2015).
  4. Bézie, S., et al. IL-34 is a Treg-specific cytokine and mediates transplant tolerance. J Clin Invest. 125, (10), 3952-3964 (2015).
  5. Li, X. L., et al. Mechanism and localization of CD8 regulatory T cells in a heart transplant model of tolerance. J Immunol. 185, (2), 823-833 (2010).
  6. Guillonneau, C., Bézie, S., Anegon, I. Immunoregulatory properties of the cytokine IL-34. Cell Mol Life Sci. (2017).
  7. Nickeleit, V., Zeiler, M., Gudat, F., Thiel, G., Mihatsch, M. J. Detection of the complement degradation product C4d in renal allografts: diagnostic and therapeutic implications. J Am Soc Nephrol. 13, (1), 242-251 (2002).
  8. Chiffoleau, E., et al. Induction of donor-specific allograft tolerance by short-term treatment with LF15-0195 after transplantation. Evidence for a direct effect on T-cell differentiation. Am J Transplant. 2, (8), 745-757 (2002).
  9. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol. 4, (4), 337-342 (2003).
  10. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med. 203, (7), 1701-1711 (2006).
  11. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155, (3), 1151-1164 (1995).
  12. Dai, Z., et al. Natural CD8+CD122+ T cells are more potent in suppression of allograft rejection than CD4+CD25+ regulatory T cells. Am J Transplant. 14, (1), 39-48 (2014).
  13. Guillonneau, C., Picarda, E., Anegon, I. CD8+ regulatory T cells in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15, (6), 751-756 (2010).
  14. Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350, (6258), 334-339 (2015).
  15. Manavalan, J. S., et al. Alloantigen specific CD8+CD28- FOXP3+ T suppressor cells induce ILT3+ ILT4+ tolerogenic endothelial cells, inhibiting alloreactivity. Int Immunol. 16, (8), 1055-1068 (2004).
  16. Picarda, E., et al. Transient antibody targeting of CD45RC induces transplant tolerance and potent antigen-specific regulatory T cells. JCI Insight. 2, (3), e90088 (2017).
  17. Ménoret, S., et al. Phenotypic and functional characterization of CD8(+) T regulatory cells. Methods Mol Biol. 677, 63-83 (2011).
  18. Boor, P. P. C., et al. Human plasmacytoid dendritic cells induce CD8+ LAG-3+ Foxp3+ CTLA-4+ regulatory T cells that suppress allo-reactive memory T cells. Eur J Immunol. 41, (6), 1663-1674 (2011).
  19. Olson, B. M., Sullivan, J. A., Burlingham, W. J. Interleukin 35: a key mediator of suppression and the propagation of infectious tolerance. Front Immunol. 4, 315 (2013).
  20. Shimizu, J., Yamazaki, S., Takahashi, T., Ishida, Y., Sakaguchi, S. Stimulation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat Immunol. 3, (2), 135-142 (2002).
  21. Myers, L., Croft, M., Kwon, B. S., Mittler, R. S., Vella, A. T. Peptide-specific CD8 T regulatory cells use IFN-gamma to elaborate TGF-beta-based suppression. J Immunol. 174, (12), 7625-7632 (2005).
  22. Bouaziz, J. D., Le Buanec, H., Saussine, A., Bensussan, A., Bagot, M. IL-10 producing regulatory B cells in mice and humans: state of the art. Curr Mol Med. 12, (5), 519-527 (2012).
  23. Durand, J., Chiffoleau, E. B cells with regulatory properties in transplantation tolerance. World J Transplant. 5, (4), 196-208 (2015).
  24. Pallier, A., et al. Patients with drug-free long-term graft function display increased numbers of peripheral B cells with a memory and inhibitory phenotype. Kidney Int. 78, (5), 503-513 (2010).
  25. Guillonneau, C. Efficacy of Myeloid Derived Suppressor Cells on Transplant Survival. Transplantation. 99, (10), 2017-2019 (2015).
  26. Wood, K. J., Bushell, A., Hester, J. Regulatory immune cells in transplantation. Nat Rev Immunol. 12, (6), 417-430 (2012).
  27. Han, Y., et al. Pathogen-expanded CD11b+ invariant NKT cells feedback inhibit T cell proliferation via membrane-bound TGF-β1. J Autoimmun. 58, 21-35 (2015).
  28. Mesnard, L., et al. Invariant natural killer T cells and TGF-beta attenuate anti-GBM glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 20, (6), 1282-1292 (2009).
  29. Mi, Q. S., Ly, D., Zucker, P., McGarry, M., Delovitch, T. L. Interleukin-4 but not interleukin-10 protects against spontaneous and recurrent type 1 diabetes by activated CD1d-restricted invariant natural killer T-cells. Diabetes. 53, (5), 1303-1310 (2004).
  30. Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by alpha-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nat Med. 7, (9), 1057-1062 (2001).
  31. Wermeling, F., Lind, S. M., Jordö, E. D., Cardell, S. L., Karlsson, M. C. I. Invariant NKT cells limit activation of autoreactive CD1d-positive B cells. J Exp Med. 207, (5), 943-952 (2010).
  32. Yang, S. H., et al. Sulfatide-reactive natural killer T cells abrogate ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 22, (7), 1305-1314 (2011).
  33. Picarda, E., et al. MHC-derived allopeptide activates TCR-biased CD8+ Tregs and suppresses organ rejection. J Clin Invest. 124, (6), 2497-2512 (2014).
  34. Guillot, C., et al. Prolonged blockade of CD40-CD40 ligand interactions by gene transfer of CD40Ig results in long-term heart allograft survival and donor-specific hyporesponsiveness, but does not prevent chronic rejection. J Immunol. 168, (4), 1600-1609 (2002).
  35. Guillonneau, C., et al. Inhibition of chronic rejection and development of tolerogenic T cells after ICOS-ICOSL and CD40-CD40L co-stimulation blockade. Transplantation. 80, (4), 546-554 (2005).
  36. Guillonneau, C., et al. Anti-CD28 antibodies modify regulatory mechanisms and reinforce tolerance in CD40Ig-treated heart allograft recipients. J Immunol. 179, (12), 8164-8171 (2007).
  37. Qin, S., et al. "Infectious" transplantation tolerance. Science. 259, (5097), 974-977 (1993).
  38. Picarda, É, Ossart, J., Bézie, S., Guillonneau, C. Key role of allopeptide-specific CD8(+) Tregs in transplantation. Médecine Sci (Paris). 31, (1), 22-24 (2015).
  39. Chevalier, S., Lacroix, H., Moreau, J. F., Soulillou, J. P. Blood transfusion plus allograft--but not blood transfusion alone--induce IL 2-producing suppressor cells in Lew-1A recipients of LEW-1W heart allograft. Transplant Proc. 19, (1 Pt 1), 544-546 (1987).
  40. Fang, C., et al. Autoimmune responses against renal tissue proteins in long-term surviving allograft recipients. Transpl Int. 22, (11), 1091-1099 (2009).
  41. Yang, C. P., Bell, E. B. Persisting alloantigen prevents primed CD45RC- CD4 T cells from inducing allograft rejection: implications for immunological memory. Eur J Immunol. 29, (7), 2177-2186 (1999).
  42. Durand, J., et al. Regulatory B Cells with a Partial Defect in CD40 Signaling and Overexpressing Granzyme B Transfer Allograft Tolerance in Rodents. J Immunol. 195, (10), 5035-5044 (2015).
  43. Iwata, Y., et al. Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells. Blood. 117, (2), 530-541 (2011).
  44. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120, (6), 1836-1847 (2010).
  45. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120, (6), 1848-1861 (2010).
  46. Guillonneau, C., David, L., Anegon, I. Improved Analyses of CD8+ T Cell Specificities Using Multimers of Peptide MHC Complexes Coupled to DNA Barcodes. Transplantation. 101, (2), 219-221 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics