स्तनधारी कोशिकाओं की जीवाणु चैलेंज के बाद तनाव ग्रेन्युल संरचना का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण

Immunology and Infection

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Summary

हम स्तनधारी कोशिकाओं में तनाव ग्रेन्युल गठन के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, जब कोशिकाओं को बैक्टीरिया से चुनौती दी जाती है और कई अलग-अलग तनाव होते हैं। मेजबान बैक्टीरियल इंटरैक्शन की एक विस्तृत श्रृंखला में सेलुलर तनाव ग्रेन्युल प्रतिक्रिया की जांच के लिए यह प्रोटोकॉल लागू किया जा सकता है।

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Vonaesch, P., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (125), e55536, doi:10.3791/55536 (2017).

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Abstract

सेलुलर घटकों के फ्लोरोसेंट इमेजिंग मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत के लिए एक प्रभावी उपकरण है। रोगजनक संक्रमित कोशिकाओं के कई अलग-अलग विशेषताओं को प्रभावित कर सकते हैं, जिसमें इनेगल मूलभूत संरचना, साइटोस्केलेटल नेटवर्क संगठन, साथ ही साथ स्ट्रेस ग्रेन्युल (एसजी) गठन जैसी सेलुलर प्रक्रियाएं शामिल हैं। रोगज़नक़ों को कैसे व्यवस्थित करने की प्रक्रियाओं का लक्षण वर्णन रोगजनन के क्षेत्र का एक महत्वपूर्ण और अभिन्न अंग है। चर चरमांत्र आसानी से दिखाई दे सकते हैं, जबकि प्रयोगात्मक और नियंत्रण नमूनों के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर को परिभाषित करने के लिए रोगजनन चुनौती से प्रेरित सेलुलर संरचनाओं में गुणात्मक और मात्रात्मक अंतर का सटीक विश्लेषण आवश्यक है। एसजी का गठन एक विकासशील संरक्षित तनाव प्रतिक्रिया है जो एंटीवायरल प्रतिक्रियाओं की ओर जाता है और वायरल संक्रमण 1 का उपयोग करके लंबे समय तक जांच की जाती है। एसजी निर्माण सिग्नलिंग कैसकेड को प्रभावित करता है और अन्य अभी भी अज्ञात पवित्रा हो सकता हैयून्स 2 वायरस के अलावा इस तरह के बैक्टीरियल रोगजनकों के अलावा रोगजनकों के लिए इस तनाव प्रतिक्रिया की विशेषता, वर्तमान में अनुसंधान 3 का उभरते क्षेत्र है। अभी के लिए, एसजी के गठन का मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण अभी तक नियमित रूप से इस्तेमाल नहीं किया गया है, यहां तक ​​कि वायरल सिस्टम में भी। यहाँ हम असिंकित कोशिकाओं में एसजी के गठन और उत्प्रेरित करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं और एक साइटोस्लिक बैक्टीरियल रोगजन से संक्रमित कोशिकाओं में, जो विभिन्न बहिर्जात तनाव के जवाब में एसजीओं के गठन को प्रभावित करता है। एसजी के गठन और संरचना का विश्लेषण कई एसजी मार्करों और आईसीवाई के स्पॉट डिटेक्टर प्लग-इन का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है, एक ओपन सोर्स इमेज विश्लेषण टूल।

Introduction

सेलुलर स्तर पर होस्ट-पाथोजेन इंटरैक्शन विज़ुअलाइज़ करना रोगजनक रणनीतियों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने और प्रमुख सेलुलर मार्गों की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। दरअसल, महत्वपूर्ण सेलुलर लक्ष्यों या संरचनाओं को हल करने के लिए रोगजनकों को उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि रोगजनकों ने केंद्रीय सेलुलर प्रक्रियाओं को अपने अस्तित्व या प्रसार के लिए एक रणनीति के रूप में नष्ट करने के लिए विकसित किया है। सेलुलर घटकों के विज़ुअलाइज़ेशन को पुन: संयोजन से फ्लोरोसेंटली टैग किए गए होस्ट प्रोटीन को व्यक्त करते हुए प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि यह वास्तविक समय विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, विशेष रूप से टैग की मेजबानी प्रोटीन के साथ सेल लाइनों की पीढ़ी अत्यधिक श्रमसाध्य है और नतीजतन दुष्प्रभाव हो सकता है। अधिक सुविधाजनक, विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए सेलुलर कारकों का पता लगाना है, क्योंकि एक साथ कई होस्ट कारकों का विश्लेषण किया जा सकता है और एक विशेष सेल प्रकार तक सीमित नहीं है। एक दोष यह है कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के रूप में केवल एक स्थिर दृश्य को कैप्चर किया जा सकता है, मेजबान सेल फिक्सट आवश्यक हैआयन। हालांकि, इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह आसानी से गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण दोनों के लिए उधार देता है इसके बदले में मेजबान-रोगज़नक बातचीत में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

फ्लोरोसेंट इमेज विश्लेषण प्रोग्राम 3 डी और 4 डी विश्लेषण करने के लिए शक्तिशाली विश्लेषणात्मक टूल हैं। हालांकि, सॉफ्टवेयर की उच्च लागत और इसके रखरखाव मुक्त खुले स्रोत सॉफ़्टवेयर के आधार पर तरीकों को अधिक व्यापक रूप से आकर्षक बनाते हैं। जैव-विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सावधानी से इमेज विश्लेषण मूल्यवान है क्योंकि यह दृश्य विश्लेषण को सिद्ध करता है और, जब सांख्यिकीय महत्व देते हैं, तो किसी दिए गए फेनोटाइप की शुद्धता में विश्वास बढ़ता है। पहले, एसजीएस का उपयोग मुफ्त ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया गया है, जो व्यक्तिगत एसजीएस 4 की मैन्युअल पहचान की आवश्यकता है। यहां हम बीएसी के संदर्भ में सेलुलर एसजी गठन के प्रेरण और विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैंफ्री ओपन सोर्स जैव-इमेज विश्लेषण सॉफ्टवेयर आईसीवाई (http://icy.bioimageanalysis.org) का उपयोग करते हुए भयानक संक्रमण। बायो-इमेज विश्लेषण सॉफ्टवेयर का एक अंतर्निहित स्पॉट डिटेक्टर प्रोग्राम है जो एसजी विश्लेषण के लिए बेहद उपयुक्त है। यह ब्याज निर्दिष्ट क्षेत्रों (आरओआई) में स्वचालित पहचान प्रक्रिया के ठीक-ठीक होने की अनुमति देता है। यह व्यक्तिगत एसजीएस के मैनुअल विश्लेषण की आवश्यकता पर नज़र रखता है और नमूनाकरण पूर्वाग्रह को निकालता है।

कई पर्यावरणीय तनाव एसजीओं के गठन को प्रेरित करते हैं, जो चरण घने साइटोसॉलिक, व्याकरण 5 , 6 में 0.2-5 माइक्रोन के गैर-झिल्लीदार संरचनाएं हैं। यह सेलुलर प्रतिक्रिया खमीर, पौधों और स्तनधारियों में विकसित होती है और तब होती है जब वैश्विक प्रोटीन अनुवाद को हिचकते हैं। इसमें एसजीएस में स्थगित अनुवाद दीक्षा परिसरों का एकत्रीकरण शामिल है, जो कि अनुवादित रूप से निष्क्रिय एमआरएनए के लिए जगहों को माना जाता है, सेलुलर एमआरएनए के एक उपसंचर के चयनात्मक अनुवाद की अनुमति देता है।तनाव को हटाने पर, एसजीओं को भंग किया जाता है और प्रोटीन संश्लेषण की वैश्विक दरों को फिर से शुरू होता है। एसजीएस अनुवाद विस्तार प्रवर्तन कारक, आरएनए चयापचय में शामिल प्रोटीन, आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन, साथ ही मचान प्रोटीन और मेजबान सेल सिग्नलिंग में शामिल कारक हैं, हालांकि सटीक संरचना लागू होने वाले तनाव के आधार पर भिन्न हो सकती है। एसजी के गठन के लिए प्रेरित पर्यावरण कारकों में एमिनो एसिड भूख, यूवी विकिरण, गर्मी झटका, आसमाटिक सदमे, एंडोप्लास्मिक रेटिकुलम तनाव, हाइपॉक्सिया और वायरल संक्रमण 2 , 7 , 8 शामिल हैं । बहुत प्रगति को समझने में किया गया है कि वायरस कैसे प्रेरित करते हैं और एसजी के गठन को भी नष्ट करते हैं, जबकि अभी तक यह जान लिया जाता है कि बैक्टेरिया, कवक या प्रोटोजोअन रोगजनकों जैसे अन्य रोगजनकों के इस सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया 1 , 7 को कैसे प्रभावित करते हैं।

Shigeएलएलए फ्लेन्क्निरी एक ग्राम-नकारात्मक प्रायोगिक साइटोसोलिक रोगज़नक़ा है और गंभीर दस्त या शिगलोसिस के प्रेरक एजेंट हैं। शिगेलोसिस एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य बोझ है और 5 साल की उम्र के 9 , 10 के तहत बच्चों में सालाना 28,000 मौतें होती हैं। एस फ्लेक्सनेरी कोलोनीक एपिथेलियम को संक्रमित करता है और मेजबान के साइटोकेकेलेटल घटकों 11 , 12 को अपहृत करके सेल-टू-सेल फैलता है। एपिथेलियम का संक्रमण साइटोकस के भीतर एस । फ्लेन्क्लेरी की प्रतिकृति का समर्थन करता है, लेकिन संक्रमित मैक्रोफेज पाइप्रोसिस नामक एक भड़काऊ कोशिका मृत्यु प्रक्रिया के माध्यम से मर जाते हैं। संक्रमण न्युट्रोफिल की भारी भर्ती और गर्मी, ऑक्सीडेटिव तनाव और ऊतक विनाश के साथ गंभीर सूजन की ओर जाता है। इस प्रकार, जबकि संक्रमित कोशिकाओं को संक्रमण से प्रेरित आंतरिक तनाव के अधीन होते हैं, जैसे गोल्गी विघटन, जीनोटॉक्सिक तनाव और साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्थाएस, संक्रमित कोशिकाओं को भी भड़काऊ प्रक्रिया के कारण पर्यावरण तनाव के अधीन हैं

कई एसजी मार्करों का उपयोग करते हुए पर्यावरणीय तनाव पर प्रतिक्रिया करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता पर एस फ्लेन्डेरई संक्रमण के प्रभाव का लक्षण दिखाता है कि संक्रमण एसजी संरचना 3 में गुणात्मक और मात्रात्मक अंतर को दर्शाता है। हालांकि, अन्य बैक्टीरियल रोगजनकों के बारे में बहुत कम जानकारी है यहां हम साइटोसोलिक रोगज़न एस। फ्लेन्डेरी के साथ मेजबान कोशिकाओं के संक्रमण के लिए एक पद्धति का वर्णन करते हैं, विभिन्न पर्यावरणीय तनावों के साथ कोशिकाओं पर जोर देते हैं, एसजी घटकों के लेबलिंग और संक्रमित के संदर्भ में एसजी के गठन और संरचना का गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण और गैर-संक्रमित कोशिकाएं यह विधि व्यापक रूप से अन्य बैक्टीरियल रोगजनकों पर लागू होती है। इसके अलावा, एसजी के गठन का चित्र विश्लेषण वायरस या अन्य रोगजनकों द्वारा संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह एसजी का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैबहिष्कार तनाव के जवाब में एसजी के गठन पर संक्रमण या संक्रमण के प्रभाव पर प्रभाव।

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Protocol

1. बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं की तैयारी

  1. 12 या 14 मिमी का ग्लास आवरण स्थानांतरण, या तो 24- या 12-अच्छी तरह प्लेटें, क्रमशः बाँझ चिमटी के साथ, एक प्रयोगात्मक स्थिति में एक अच्छी तरह से गिना जाता है। इन्हें 15 मिनट के लिए एक टिशू कल्चर हुड में यूवी ट्रीटमेंट द्वारा निर्वहन करना
    नोट: जीवाणु चुनौतियों के लिए नियंत्रण कुओं और बहिर्जात तनाव द्वारा एसजी प्रेरण शामिल करें।
  2. 24 मिलीलीटर की एक प्लेट के लिए 12 मिलीमीटर कंडोली, बीज 1 एक्स 10 5 स्तनधारी कोशिकाएं ( जैसे, हेला कोशिकाएं) कवचों पर; एक बाँझ विंदुक टिप के साथ coverslips नीचे प्रेस कोशिकाओं को प्रत्येक सेल प्रकार के लिए उपयुक्त संस्कृति माध्यम में 5% सीओ 2 टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात पालन करना चाहिए।
    नोट: प्लेट कोशिकाओं ताकि कोशिकाओं के संगम के बीच 40 - 60% अगले दिन हो।
    1. हेला कोशिकाओं के लिए, गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए) के साथ डल्बेइको के संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम) में सेते हैं और 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) को डीम्प्लेमेंट करते हैं।एक 56 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने में 30 मिनट के लिए ताप द्वारा एफसीसी को कम करें, 15 मिनट के बाद सीरम घूमता है।
  3. बैक्टीरिया को बाहर निकालने के लिए, एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीज़र में संग्रहीत एक जीवाणु ग्लिसरॉल स्टॉक (20% ग्लिसरॉल) से एक छोटी मात्रा को हटाने के लिए एक बाँझ विंदुक टिप का उपयोग करें और इसे लेबल वाली प्लेट पर रखें। लगभग 10% थाली पर बैक्टीरिया फैलाने के लिए बाँझ लूप का प्रयोग करें। एक नया बाँझ लूप का प्रयोग करें और इसे 3 समानांतर लाइनें, आधा प्लेट लंबा बनाने के लिए धब्बा के माध्यम से खींचें। प्लेटों के बाकी हिस्सों को कवर करने वाली इन लाइनों के माध्यम से स्ट्रीक 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट ओ / एन सेते
    1. ताजा खरोंच-बाहर प्लेट से एक एकल बैक्टीरियल कॉलोनी ( जैसे, एस। फ्लेन्डेरी ) का चयन करें। 1 सप्ताह से अधिक उम्र के बैक्टीरियल कॉलोनियों के साथ काम करने से बचें।
    2. एस फ्लेक्सनेरी के तनाव के लिए एम 9 0 टी, एक लाल कॉलोनी को ट्रिटेटिक सोया एगर-0.1% कांगो लाल अगर प्लेट में 15 मिलीलीटर ट्यूब में ट्रिपेटिक सोया शोरबा के 8 एमएल में टीका लगाया जा सकता है; ढक्कन कसने और 30 में 222 आरपीएम ओ / एन पर मिलाते हुए सेते हैं6; सी।
      सावधानी: बड़ी सफेद कॉलोनियों का उपयोग न करें क्योंकि वे वायरलेंस प्लाज्मिड खो चुके हैं और गैर-संक्रमित हैं।

2. मेजबान कोशिकाओं की जीवाणु चैलेंज

  1. संक्रमण की संभावना को अधिकतम करने के लिए बैक्टीरिया तैयार करें।
    1. एस फ्लेक्सनेरी के लिए , 150 μL ओ / एन संस्कृति को 8 एमएल ट्रिपटिक सोया अग्र में जोड़कर और 222 आरपीएम को 37 डिग्री सेल्सियस तक देर से घातीय चरण (~ 2 एच) में मिलाकर जीवाणु जीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने और संक्रमण बढ़ाने के लिए।
      1. जब संस्कृति 0.6 और 0.9 (600 एनएम पर मापा जाता है) के बीच ऑप्टिकल घनत्व पर होती है, तो 1 एमएल संस्कृति को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। ऑडी 600 = 1 पर 8000 xg में 2 मिनट और 2 मिनट के लिए संक्रमण मध्यम (एनईएए के साथ डीएमईए, एफसीएस की कमी) में दो मिनट के लिए गोली बैक्टीरिया। इसलिए, अगर ओडी 600 0.85 है, तो 850 μL में पुन:
        नोट: एस। फ्लेन्क्निरी के लिए, ओडी 600 = 1 पर, प्रति एमएल 8 x 10 8 बैक्टीरिया होगा8 एमएल मध्यम में सुसंस्कृत 20 के संक्रमण की एक बहुतायत (MOI) उपयुक्त है अन्य रोगजनकों के लिए, 600 मिलीग्राम में बैक्टीरिया प्रति एमएल की संख्या और उपयुक्त एमओआई को अनुभवपूर्वक निर्धारित किया जाना चाहिए।
    2. बैक्टीरियल-होस्ट इंटरैक्शन को बढ़ाने के लिए, पॉली-एल-लाइसिन (पीएलएल) के साथ कोट बैक्टीरिया।
      नोट: एस फ्लेन्क्लेरी के पीएलएल उपचार एसजी गतिशीलता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। पीएलएल उपचार के लिए उनकी योग्यता के लिए अन्य रोगाणुओं का मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
      1. पीएलएल के साथ जीवाणुओं को कोट करने के लिए, बैक्टीरिया की संस्कृति के 1 एमएल 2,000 डिग्री सेल्सियस पर 8,000 XG के लिए और फिर ओसी 600 = 1 में फॉस्फेट-बुफर्ड सलाईन (पीबीएस) में 10 μg / mL PLL में गोली को फिर से खोलें।
      2. एक छोटी सी पकवान में बैक्टीरिया का समाधान जोड़ें, जैसे कि 12-अच्छी तरह से एक प्लेट के अंदर अच्छी तरह से, और आरटी पर (~ 20 डिग्री सेल्सियस) 10 मिनट के लिए एक प्लेट के प्रकार के बरतन पर कोमल आंदोलन के साथ सेते हैं
      3. 2 मिनट के लिए 8,000 xg के लिए गोली बैक्टीरिया, अतिरिक्त पीएलएल को हटा दें 1 एमएल पीबीएस में गोली को फिर से खोलेंडी दोहरा दो इस धोने कदम दोहरा अंतिम धोने के बाद, ओडी 600 = 1 पर संक्रमण माध्यम में पुन:
        नोट: यहां, एस फ्लेन्क्लेयर के लिए संक्रमण का माध्यम 20 मीटर एचईपीईएस w / ओ एफसीएस के साथ मेजबान सेल माध्यम है।
  2. बैक्टीरिया की चुनौती के लिए कोशिकाओं को तैयार करें
    1. चूषण पंप का उपयोग कर स्तनधारी हेला कोशिकाओं से माध्यम निकालें 500 μL आरटी हेला सेल माध्यम को कोशिकाओं, झुंड को धोने के लिए, एक चूषण पंप का उपयोग करके माध्यम को हटा दें, और 500 μL आरटी उचित संक्रमण माध्यम ( जैसे , 20 मिमी एचईपीईएस w / o एफसीएस के साथ मेजबान सेल माध्यम) के साथ बदलें।
    2. नोट: सभी धोने के कदमों के लिए, कोशिकाओं से सुखाने से बचने के लिए एक समय में जल्दी से काम करें और केवल 4 coverslips तक काम करें।
  3. चैलेंज 20 से संक्रमित करने के लिए जीवाणुओं वाले हेला कोशिकाओं को तैयार करता है - कोशिकाओं के 50%।
    नोट: उपयुक्त समय और एमओआई को प्रत्येक जीवाणु प्रजातियों के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। आम तौर पर, अच्छी शुरुआत 37 में 30 मिनट है10 डिग्री सेल्सियस के एमओआई के साथ
    1. एस फ्लेक्नेरी के लिए, दो तरीकों (चरण 2.3.1.1 या 2.3.1.2) में से एक का उपयोग करके हेला कोशिका कोशिकाओं को चुनौती दें।
      1. गैर-पीएलएल-उपचारित जीवाणु (500 μL माध्यम में 24-अच्छी तरह से प्लेट की 20 μL 600 = 1 / अच्छी तरह से 24-अच्छी तरह से प्लेट में) स्पिन करें, 10 मिनट 13000 x ग्राम के लिए
      2. कोशिकाओं पर बैक्टीरिया को व्यवस्थित करने के लिए आरटी पर 15 मिनट के लिए पीएलएल-लेपित बैक्टीरिया (500 μL माध्यम में 15 μL का ऑड 600 = 1 / अच्छी तरह से 24-अच्छी तरह से प्लेट में) जोड़ें
    2. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में सेट जैक्टीरिया के साथ कोशिकाओं को लगाकर संक्रमण होने की अनुमति दें
      नोट: कम समय बिंदुओं के लिए, टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर की बजाय 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने में प्लेटें रखकर एस फ्लेन्क्लेयरिस संक्रमण को सिंक्रनाइज़ करें।
  4. कोशिकाओं को धोने से रोकें।
    1. कोशिकाओं को धोने और अतिरिक्त बैक्टीरिया को निकालने के लिए, चूषण पंप का उपयोग करके माध्यम को हटा दें, 1 एमएल जोड़ेंताजा prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस) हेला संस्कृति माध्यम (डीएमईएम, 10% एफसीएस, एनईएए)। मध्यम घूमती है, ताजे माध्यम से हटाकर बदलें। दो बार दोहराएं और कोशिकाओं पर ताजा माध्यम छोड़ दें।
      1. एस। फ्लेन्क्नेरी या अन्य इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया के लिए, एचआईएलए कोशिकाओं और वाश के संक्रमण के बाद, कोशिकीय बैक्टीरिया को मारने और सेल आक्रमण को रोकने के लिए 50 μg / mL gentamicin युक्त मानक टिशू कल्चर माध्यम के माध्यम से मध्यम स्थान की जगह।
        नोट: बाह्य जीवाणु के लिए माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़ना न करें।
  5. टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में इच्छित समय के लिए कोशिकाओं के साथ बैक्टीरिया सेते हैं।
    नोट: एस। फ्लेन्नेरी के लिए , सेल प्रकार के आधार पर संक्रमण 6 घंटे तक हो सकता है। हेला कोशिकाओं के लिए, एसजी के गठन को प्रेरित करने के लिए बहिर्जात तनाव जोड़ने से पहले 1.5 - 2 घंटे के लिए संक्रमण आगे बढ़ें। सीको-2 संक्रमण के लिए, जिसमें शिजेला कोशिका-से-सेल फैलती है, एक्सजेन्सिव तनाव जोड़ने से पहले 30 मिनट से 6 घंटे के लिए संक्रमित होती है। Ceबैक्टीरियल संक्रमण के परिणामस्वरूप एसजीएस के गठन का आकलन करने के लिए बहिर्जात तनाव को जोड़ने के बिना इस बिंदु पर एलएलएस तय किया जा सकता है (उस मामले में, अनुभाग 4 में आगे बढ़ें)।

3. एक्सोनोनेसस स्ट्रेसर्स के जोड़ द्वारा तनाव ग्रेन्युल फॉर्मेशन को प्रेरित करना

  1. चूषण पंप का उपयोग कर संक्रमित और गैर-संक्रमित हेला कोशिकाओं के माध्यम को निकालें, मध्यम के 500 μL के माध्यम से तनाव या तनाव के बिना या बिना से मध्यम को बदलें।
    नोट: तनाव उत्पन्न करने की स्थिति में निम्नलिखित शामिल हैं (नीचे देखें)। अतिरिक्त उपचार के लिए केडरसे एट अल देखें 13
    1. गर्मी झटका उपचार के लिए, 20 मिमी एचईपीईएस युक्त नियमित माध्यम का उपयोग करें और प्लेट को 30 मिनट के लिए 44 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
    2. क्लोट्रिमाजोल (मिटोचोनड्रियल तनाव) उपचार के लिए, 20 माइक्रोन क्लोटियमैजोल के साथ एफसीएस के बिना नियमित माध्यम का उपयोग करें और 1 घंटे के लिए टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में सेते हैं।
      नोट: 20 मी के सिंगल-उपयोग अल्कोट्स को स्टोर करेंएम क्लॉरिटामॉजोल स्टॉक डाइमिथाइल सल्फोक्सिड (डीएमएसओ) में -20 डिग्री सेल्सियस तक 4 महीने तक। नियंत्रण कक्षों के लिए डीएमएसओ वाहन का उपयोग करें
    3. आर्सेनाइट के लिए (ऑक्सीडेटिव तनाव लाया जाता है), 0.5 माइक्रोन आर्सेनाइट के साथ नियमित माध्यम का उपयोग करें और 1 घंटे के लिए टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में सेते हैं।
      नोट: 6 महीने तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 एमएम आर्सेनाइट स्टॉक के सिंगल-उपयोग अल्कोट्स को स्टोर करें।
      सावधानी: क्लोत्रमोजोल और आर्सेनाइट पर्यावरण के लिए हानिकारक और खतरनाक हैं और उचित रूप से इसका निपटाया जाना चाहिए
    4. डेस-मिथाइल डेस-एमिनो (डीएमडीए) के लिए -पेटामाइन उपचार (यूकेरियोटिक अनुवाद दीक्षा को रोकता है), 50 से 200 एनएम डीएमडीए-पाटेमाइन के साथ नियमित माध्यम का उपयोग करें और 1 घंटे के लिए टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में सेते हैं।
      नोट: स्टोर-डीएमडीए-पेटामाइन -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज विगलन से बचने के लिए स्टोरों को छोटे अलंकट के रूप में स्टोर करें।

4. तनाव ग्रेन्युल संरचना का निर्धारण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण

नोट: नियंत्रण प्रक्रिया औरप्रायोगिक coverslips एक ही समय में धुंधला मतभेदों से बचने के लिए जो बाद के चरणों में छवि विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं नियंत्रण नमूने में एसजी उत्प्रेरित उपचार के बिना और एसजी उत्प्रेरित उपचार के बिना और बिना संक्रमित नमूनों का संक्रमण नहीं है।

  1. पीबीएस में 0.5 एमएल आरटी 4% पैराफॉर्मालाडीहाइड (पीएफए) जोड़कर एक सक्शन पंप का उपयोग करके पूरी तरह से मध्यम निकालें और नमूने ठीक करें। आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं
    सावधानी: पीएफए ​​हेन्डलर और पर्यावरण के लिए हानिकारक है। हेन्डलर को बचाने और रासायनिक कचरे के निपटान के लिए उचित उपाय लें
    नोट: वैकल्पिक रूप से, 15 मिनट के लिए ठीक करें और फिर एसजी मार्कर 13 के अधिक साइप्रलस्मीनिक स्थानीयकरण को बनाए रखने के लिए 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस प्रीच्रिल्ड मेथनॉल से बदलें।
  2. एक विंदुक के साथ पीएफए ​​निकालें और एक उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनर में तरल निपटान। 1 एमएल ट्राइस-बफर्ड सेलीन (टीबीएस: 25 एमएम ट्रिस, पीएएच 7.3, 15 एमएम नाओक) के साथ कंडलिप को धो लें। कोमल झटकों के साथ 2 मिनट के लिए कवरलाप को सेतेधोने के दौरान एक प्लेट प्रकार के बरतन पर
  3. एक सक्शन पंप का उपयोग करके टीबीएस को पूरी तरह से निकालें और कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए 10 मिनट के लिए टीबीएस में 500 μL 0.3% ट्राइटॉन-एक्स 100 जोड़ें।
  4. चूषण पंप के साथ परिमाणीकरण समाधान निकालें। 1 एमएल टीबीएस के साथ बदलें, प्लेट को धीरे से घुमा दें, टीसीएस को सक्शन से हटा दें, और आरटी पर 1 घंटे के लिए 1 एमएल अवरुद्ध समाधान (टीबीएस में 5% एफसीएस) जोड़ें।
  5. टीबीएस में 5% एफसीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (1: 300 कमजोर पड़ने) तैयार करें। प्रत्येक 12 मि.मी. coverslip प्रति 50 μL की गणना और एक बैच में सभी coverslips के लिए पर्याप्त है।
    नोट: सामान्य प्राथमिक एंटीबॉडी जो कि लक्षित जी 3 बीपी 1, ईआईएफ 3 बी और टीआईए 1 का उपयोग किया जाता है।
  6. एक प्लास्टिक पैराफिन फिल्म (पैराफिलम) पर प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण का 50 μL स्पॉट दृढ़ता से बेंच या चैम्बर पर टैप किया गया।
    नोट: कैन्यनील एसजी मार्करों की सूची सामग्री की तालिका में प्रदान की जाती है, लेकिन एसजीएस की संरचना लागू होने वाले तनाव पर निर्भर हो सकती है। अन्य एसजी मार्कर केडरशा एट अल में सूचीबद्ध हैं 13 एस के लिए कई एसजी मार्करों के लिए अपेक्षित परिणाम । फ्लेन्नेरी संक्रमण तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं
  7. चिमटी के साथ coverslip उठाओ, ऊतक पर coverslip के किनारे डब, संक्षेप में अतिरिक्त तरल निकालने के लिए चिमटी को रिहा, और धीरे ड्रॉप पर चेहरा नीचे। एक नम कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी पर 1.5 घंटे या रातोंरात के लिए कवर लेटेप
    नोट: प्लास्टिक पैराफिलम के साथ खड़ी एक दृढ़ता से बंद कक्ष के किनारों के साथ एक नम कक्ष तैयार करने के लिए, prewetted ऊतकों को जगह।
  8. चिमटी के साथ प्रत्येक कंसलिप को 1 एमएल टीबीएस से भरा एक नई 24-अच्छी तरह से थाली के कूच में स्थानांतरण करें; 5 मिनट के लिए एक प्लेट के प्रकार के बरतन पर कोमल झटकों के साथ सेते हैं एक सक्शन पंप का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से टीबीएस को बंद करना, 1 एमएल टीबीएस के साथ प्रतिस्थापित करना और 5 मिनट के लिए प्लेट शीशे पर वापस जगह है। दोबारा दोहराएँ एक बार धो लो।
    नोट: ऊतक के साथ अतिरिक्त तरल को हटाने और पानी के साथ सतह धोने से parafilm का पुन: उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि पैराफिन फिल्म पूरी तरह से पहले सूखा हैइसके बाद के धुंधले चरण के लिए जी।
  9. टीबीएस (कमजोर पड़ने 1: 500 - 1: 2,000) में माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। नाभिक और बैक्टीरिया को दागने के लिए, मिश्रण में 2 ग्राम / एमएल डीएपीआई जोड़ें। एक्टिन को दाग़ने के लिए, फ्लोरोसेंट फेलाइडिन जोड़ें प्लास्टिक पैराफिन फिल्म पर पिपेट 50 μL माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण।
    नोट: जीएसएबीपी 1 (बकरी एंटीबॉडी) का उपयोग करने के दौरान विभिन्न एसजी मार्करों के सह-स्थानीयकरण अध्ययन के लिए अत्यधिक शुद्ध क्रॉस समेकित गधा माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। गैर-अतिव्यापी स्पेक्ट्रा के साथ फ्लोरोसेंटली लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडीज़ चुनें EIF3b स्पष्ट रूप से कोशिकाओं के कोशिका कोशिका को दागता है और इसलिए कोशिकाओं को चित्रित करने के लिए एक अच्छा मार्कर है। एक्टिन दाग सेल-से-सेल संपर्क साइटों और जीवाणु प्रवेश के क्षेत्रों में कोशिकाओं को चित्रित करने में मदद करता है।
  10. चिमटी के साथ coverslip उठाओ, ऊतक पर coverslip के किनारे पर दबाव डालना, अतिरिक्त तरल निकालने के लिए, चिमटी को संक्षेप में रिलीज करें। धीरे-धीरे ड्रॉप पर शीतलिप का सामना करें और कवरलेट्स को सेते हैंआरटी पर 1 घंटे के लिए अंधेरे में
  11. कवरेज को ताज़ा 1 एमएल पीबीएस से भरे 24 अच्छी तरह प्लेटों में वापस रखने के लिए चिमटी का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि coverslip पूरी तरह से पीबीएस द्वारा कवर किया गया है। 5 मिनट प्रत्येक के लिए कोमल झटकों के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें
    नोट: प्रकाश से बचाने के लिए आवरण के दौरान प्लेटों को धोने के दौरान रखें क्योंकि माध्यमिक एंटीबॉडी के फ्लोरोफोर्स हल्के संवेदनशील होते हैं।
  12. संक्षेप में विलोनीकृत पानी में कसलीप पानी में डुबोएं, नमक को दूर करने के लिए, टिशू पर किनारे से सूखना और एक ग्लास स्लाइड पर 5 μL प्रतिदीप्ति बढ़ते हुए माध्यम पर कन्स्पिलमिशन माउंट करें। नेल पॉलिश का उपयोग करके इमेजिंग से पहले कवरलाप को सील करें। 4-डिग्री सेल्सियस के लिए अल्पावधि (सप्ताह) या लंबी-अवधि (महीने) भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड रखें
    नोट: हवा के बुलबुले से बचें जब इसे मुहर लगाया जाए तो छवि की गुणवत्ता को नुकसान पहुंचाएगा।

5. प्रतिदीप्ति इमेजिंग

नोट: सेट अप के अनुकूलन के लिए माइक्रोस्कोप के उपयोगकर्ता मैनुअल को देखें।

  1. एक 40 या 63X तेल विसर्जन लेंस का उपयोग कर एक confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर छवियों को प्राप्त करें। छवि अधिग्रहण के लिए वांछित फ्लोरोसेंट चैनल का चयन करें कई फ्लोरोसेंट चैनलों का उपयोग करते समय, अनुक्रमिक अधिग्रहण मोड का चयन करें।
    नोट: प्रयोगात्मक नमूनों के साथ शुरू करें जहां एसजीएस बाद के नमूनों पर ओवरेक्स्पोजर से बचने के लिए सबसे तेज़ प्रेरित हो गए हैं। सुनिश्चित करें कि सेल की पूरी गहराई में ओवरेक्स्डोज़्ड एसजीएस न हो।
    1. छवि विश्लेषण की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए सूक्ष्मदर्शी सेटिंग्स के भीतर 12 या उससे अधिक का बिट आकार सेट करें
    2. सेल की संपूर्ण गहराई को कवर करने के लिए छवि स्टैक सेट करें अलग-अलग चैनलों में और अलग एसजी मार्करों के लिए जांचें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि पूरी रेंज शामिल है। कोशिकाओं के आधार पर स्टैक की शुरुआत और कोशिकाओं के शीर्ष पर ऊंचाई पर ढेर के ऊपर सेट करें, जहां अधिक एसजी मार्कर नहीं देखा जाता है।
    3. स्टैक प्राप्त करें सभी छवियों के लिए स्टैक ऊँचाई एक ही रखें
      नोट: न करेंनियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूनों के बीच अधिग्रहण सेटिंग बदलें जो बाद के तुलना के लिए उपयोग किए जाएंगे।

6. छवि विश्लेषण

नोट: यहां फ्रीवेयर आईसीवी के इस्तेमाल के ढहते ढेर पर एसजी विश्लेषण का वर्णन किया गया है। 3 डी के पुनर्निर्माण के छवि विश्लेषण भी अन्य विशिष्ट सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जा सकता है। एसजी का पता लगाने इस प्रोटोकॉल (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging पर उपलब्ध है) के लिए स्थापित एक पूरी तरह से स्वचालित वर्कफ़्लो के माध्यम से किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए, नाभिक को प्रत्येक सेल के केंद्र को खोजने के लिए सॉफ्टवेयर के लिए डीएनए का दाग के साथ दागने की आवश्यकता होती है, और सेल किनारों को किसी भी साइटोप्लाज्मिक मार्कर (जैसे ईआईएफ 3 बी) या सॉफ्टवेयर के लिए एक्टिन दाग द्वारा चिह्नित किया जाना चाहिए सेल सीमाओं की पहचान करने के लिए स्वचालित वर्कफ़्लो का उपयोग स्व-व्युत्पन्न परिणामों को मैन्युअल रूप से सत्यापित करने के लिए या सीधे विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, जब सेल सीमाएं उच्च आत्मविश्वास के साथ पाई जाती हैं, जोचिपचिपा कोशिकाओं की घनत्व और सेल की सीमाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल मार्कर पर निर्भर करते हैं।

  1. ImageJ या फिजी का उपयोग, छवि स्टैक (छवि> ढेर> जेड प्रक्षेपण) को पतन, और .tiff फ़ाइलों के रूप में सहेजें।
    नोट: प्रत्येक छवि के लिए एक नया फ़ोल्डर बनाएं जैसा कि छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर मूल परिणामों की साइट पर इसके परिणाम को लिंक करेगा।
  2. छवि विश्लेषण प्लेटफॉर्म (फ़ाइल> ओपन) में एक नियंत्रण और प्रायोगिक। टैफ छवि लोड करें। अनुक्रम विंडो पर जाएं। चैनल पैरामीटर में "लुकअप तालिका" में नीचे स्क्रॉल करें
  3. सभी चैनल टैब के चेक बॉक्स पर क्लिक करके सभी चैनलों को निष्क्रिय करें। चैनल 0 पर क्लिक करें और फिर ऊपर रंग के रंग पर क्लिक करके पसंदीदा रंग चुनें। सभी संरचनाओं को तीव्रता वाले क्षेत्र में रेखा पर क्लिक करके और बढ़कर देखने के लिए चैनल की तीव्रता को बढ़ाएं। सभी चैनलों के लिए इसे दोहराएं
    नोट: नमूना विश्लेषण में पूर्वाग्रह को कम करने के लिए दिए गए कार्य के लिए आवश्यक चैनलों को निष्क्रिय नहीं करना।
  4. स्क्रॉलऊपर और कैनवास टैब के भीतर, ज़ूम टैब का समायोजन करके प्रति क्षेत्र लगभग 10 कोशिकाओं में ज़ूम करें।
  5. छवि में कोशिकाओं की सेल सीमाओं को चित्रित करने के लिए बहुभुज फ़ंक्शन टूल (शीर्ष पट्टी में) का उपयोग करें। एंटिन दाग या सेल सीमा के चित्रण के लिए एक साइटोसोलिक मार्कर का प्रयोग करें ( जैसे ईआईएफ 3 बी)।
    1. "फ़ाइल और आरओआई" टूल में बहुभुज फ़ंक्शन पर क्लिक करें सेल पर क्लिक करके चित्रण शुरू करें और फिर एन्कर्स को सेल सीमा के आसपास दोहराया क्लिक करके लाइन को बढ़ाएं। ROI को पूरा करने के लिए, "फ़ाइल और आरओआई" टूल के अंदर बहुभुज फ़ंक्शन पर फिर से क्लिक करें
      नोट: संक्रमित कोशिकाओं के उप-आबादी को पहचानें। नमूना में संक्रमित और गैर-संक्रमित कोशिकाओं का मिश्रण होता है। बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए, या तो डीएपीआई दाग या फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया (जैसे कि जीएफपी-व्यक्त बैक्टीरिया) का उपयोग करें। यह सुनिश्चित करने के लिए तीव्रता को बढ़ाएं कि सभी बैक्टीरिया को देखा जाए।
    2. ROI का नाम देने के लिए, दाईं तरफ ROI विंडो पर जाएं और क्लियर करेंछवि में रुचि के सेल पर सीके यह ROI टैब में संबंधित ROI को उजागर करेगा ROI नाम पर डबल क्लिक करें और नाम को संशोधित करें ( जैसे संक्रमित सेल # 1)।
      नोट: अगर एक छवि को संक्रमित और गैर-संक्रमित कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है, तो छवि को दो अलग-अलग फ़ोल्डरों में सहेजना और संक्रमित और गैर-संक्रमित कोशिकाओं को अलग से चित्रित करना आसान है, दो अलग-अलग स्प्रैडशीट्स उत्पन्न करना, जो विश्लेषण को आसान बना देगा बाद में।
  6. "डिटेक्शन और ट्रैकिंग" टैब (शीर्ष पट्टी) के अंदर स्पॉट डिटेक्टर एप्लिकेशन खोलें इनपुट टैब के भीतर, वर्तमान छवि का चयन किया जाएगा। कुछ भी मत बदलो प्री-प्रोसेसिंग टैब के भीतर, विश्लेषण करने के लिए चैनल का चयन करें।
    नोट: किसी भी समय केवल एक चैनल का विश्लेषण किया जा सकता है। एक बैच विश्लेषण यहां चुना जा सकता है यदि कोई पूरी तरह से स्वचालित विश्लेषण अनुक्रम का उपयोग करता है जिसके पैरामीटर को संतोषजनक परिणाम देने के लिए जांच की जाती है।
    1. डिटेक्टर टैब में, "डीअंधेरे पृष्ठभूमि के ऊपर उज्ज्वल धब्बों का रंग "। फिर उचित पैमाने और संवेदनशीलता का चयन करें। यह नियंत्रण और प्रायोगिक नमूनों दोनों में अलग-अलग सेटिंग और क्रॉस-चेकिंग स्पॉट डिटेक्शन का परीक्षण करके करें।
      नोट: 2,048 x 2,048 रिजॉल्यूशन वाली छवि के लिए और 0.12 माइक्रोन 2 का पिक्सेल आकार, 25 से 100 की संवेदनशीलता के साथ एक स्तर 2 थ्रेशोल्ड सामान्यतः उपयुक्त है, लेकिन प्रत्येक एसजी मार्कर को अनुभवपूर्वक परीक्षण किया जाना चाहिए। स्पॉट डिटेक्शन को सेट अप करें ताकि गैर-ट्रांस्ड कंट्रोल नमूने में स्पॉट का पता चल सके, जबकि एसजीएस के साथ प्रयोगात्मक नमूना में, सभी छोटे और बड़े एसजीओं की गणना की जाती है।
    2. ROI टैब के भीतर, अनुक्रम से सुझाए गए आरओआई का चयन करें फ़िल्टरिंग टैब के भीतर, कोई फ़िल्टर नहीं चुनें आउटपुट टैब में, उचित आउटपुट चुनें।
      नोट: विशिष्ट फ़ाइल को सक्षम करना चुनना अलग पहचान स्थितियों या विभिन्न चैनलों को सहेजने के लिए उपयोगी है। बाइनरी छवि को निर्यात करने और ROI के साथ मूल छवि निर्यात करने का चयन करना हैलोगुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण के लिए प्रफुल्लित
    3. "आरओआई के रूप में प्रदान किए गए पिछले स्पॉट निकालें" का चयन करें "कोई फ़ाइल चयनित नहीं" बटन पर क्लिक करके फ़ाइल को सहेजने के लिए फ़ोल्डर चुनें। डिस्प्ले टैब के भीतर, वांछित विकल्पों का चयन करें। "आरंभ पता लगाना" पर क्लिक करें।
      नोट: नाम और चयनित स्थान के साथ एक फ़ोल्डर बनाया जाएगा जिसमें निर्यात इमेजिंग विकल्प शामिल हैं इन छवियों को परीक्षण की गई प्रत्येक नई स्थिति के लिए ओवरराइट किया जाएगा। छवियों को रखने के लिए, या तो फ़ोल्डर का नाम बदलें ताकि एक नया फ़ोल्डर बनाया जा सके या फ़ोल्डर को एक नए फ़ोल्डर में सहेजने से चित्रों को स्थानांतरित कर सकें। छवियों के गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, प्रदर्शन पहचान चिह्न, आरओआई और आरओआई संख्या और नाम का पता लगाने की संख्या का चयन करना उपयोगी होता है।
  7. प्रत्येक छवि या शर्त के परीक्षण के लिए जेनरेट की गई स्प्रेडशीट का उपयोग करके विभिन्न मापदंडों के लिए डेटा को एकसाथ और सहेजें।
    नोट: विश्लेषण करने के लिए पैरामीटर एसओजी की प्रति आरओआई, एसजी सतह क्षेत्रों, और एसजी अधिकतम की संख्या शामिल हैइम्यूम, औसत और न्यूनतम तीव्रताएं
  8. आंकड़ों को स्थानांतरित करें और विश्लेषण विश्लेषण, ग्राफिंग और सांख्यिकीय महत्व का निर्धारण करने में सक्षम एक विश्लेषण कार्यक्रम का उपयोग करने का विश्लेषण करें।

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Representative Results

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल को समझाने और प्रदर्शित करने के लिए, हमने सीओटीओएसओलिक रोगज़न एस। फ्लेन्नेरी के साथ संक्रमित हेला कोशिकाओं में क्लॉटियमजाइल प्रेरित एसजीएस की छवि को चित्रित किया है। प्रक्रिया की एक रूपरेखा चित्रा 1 में प्रस्तुत की गई है, और कांगो रेड प्लेट, बैक्टीरिया की तैयारी, संक्रमण, पर्यावरणीय तनाव, नमूना निर्धारण और धुंधला हो जाना, नमूना इमेजिंग और मात्रात्मकता के साथ ही छवि विश्लेषण के रूप में विषाणु और अस्थिर एस। फ्लेन्डेरई शामिल हैं । एसजी के गठन को प्रेरित करने के लिए कई विभिन्न तनावों का इस्तेमाल किया जा सकता है और पूछताछ के लिए कई एसजी मार्कर उपलब्ध हैं। ईआईएफ 3 बी एक कैनोनिकल एसजी मार्कर है जो कि कोशिका के सीओप्लास्मेक कम्पार्टमेंट को स्पष्ट रूप से दागता है और सेल किनारों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जी 3 बीपी 1 एक व्यापक रूप से इस्तेमाल एसजी मार्कर है जो एसजीएस में बिना किसी पृष्ठभूमि के धुंधला हो रहा है ( चित्रा 2 ए, बी डी )। कोशिकाओं को सबसे अच्छा एक confocal सूक्ष्मदर्शी के साथ imaged, और पूरे सेल गहराई को कवर ढेर इमेजिंग विश्लेषण फ्रीवेयर आईसीआई ( चित्रा 2 ए - सी ) पर लोड कर रहे हैं। संक्रमित कोशिकाओं को बेहतर पहचानने और बाद में विश्लेषण के लिए संक्रमित या गैर-संक्रमित समूह में कोशिकाओं को डालने के लिए, यह न्यूक्लिक अम्ल का दाग ( चित्रा 2 डी ) की तीव्रता को बढ़ाने के लिए उपयोगी है। इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर के भीतर, स्पॉट डिटेक्टर का प्रयोग तब किया जाता है जब प्रत्येक नामित आरओआई ( चित्रा 2 ) के भीतर एसजीएस की पहचान की जाती है और एक बाइनरी इमेज उत्पन्न होती है जो सभी एसजीएस ( चित्रा 2 एफ ) दिखाती है।

एसजी विश्लेषण को प्रत्येक एसजी मार्कर के अनुरूप तैयार करने की आवश्यकता है और विश्लेषण के लिए उपयुक्त सेटिंग सावधानी से चुना जाना चाहिए। एसजी मा पर ध्यान केंद्रितआरकेआर जी 3 बी पी 1 , चित्रा 3 ए-सी में दिखाए गए अनुसार, पता लगाने वाले मानकों की आकार की आवश्यकता को बदलने या पहचान मापदंडों की संवेदनशीलता को बदलकर अलग-अलग परिणाम सामने आएंगे। स्केल चयन (1-3, हालांकि तराजू को जोड़ा जा सकता है) पिक्सेल आकार पर आधारित है और इस प्रकार उच्च स्तर पर, छोटे एसजीओं की गणना नहीं की जाएगी और एसजी की संख्या घट जाएगी ( चित्रा 3 सी )। संवेदनशीलता को 1 - 100 से मापा जाता है, जिसमें से 100 सबसे अधिक संवेदनशील होते हैं। संवेदनशीलता में वृद्धि करके, एसजीएस की संख्या बढ़ जाती है ( चित्रा 3 सी )। इस प्रकार, सही सेटिंग्स झूठी सकारात्मक और झूठी नकारात्मक को कम करने के लिए पाया जाना चाहिए। प्रत्येक सेटिंग के लिए प्राप्त विज़ुअल का सावधानीपूर्वक विश्लेषण करके यह सबसे अच्छा किया जाता है। जी 3 बी पी 1 के लिए, 100 की संवेदनशीलता के साथ 2 के पैमाने (2 - 100, लाल रंग में हाइलाइट) ने सबसे अच्छा परिणाम दिया कम संवेदनशीलता (50 या 25) के साथ 2 के पैमाने छोटे छोड़ दियाएसजीओं की गणना नहीं की गई (नारंगी तीर देखें) इसी तरह, 3 छोड़े छोटे एसजी बेमानी के एक पैमाने पर जबकि 1 oversampled के पैमाने महत्वपूर्ण रूप से, बड़े पैमाने पर एसजीओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए अतिरिक्त तराजू भी शामिल की जा सकती हैं, अगर यह ज़रूरी है ईआईएफ 3 बी के लिए, 55 (2 - 55) की संवेदनशीलता वाले 2 के पैमाने ने ईआईएफ 3 बी के लिए सबसे अच्छा परिणाम दिया (लाल रंग में प्रकाश डाला) हालांकि लाल तीर क्रमशः 2 - 50 और 2 - 55 में क्रमशः 2 -

एसजी विश्लेषण के पैरामीटर ठीक से सेट होने के बाद, डेटा को कई मायनों में विश्लेषण किया जा सकता है ( चित्रा 4 )। स्पॉट डिटेक्टर प्रत्येक आरओआई के भीतर एसजीएस की संख्या देता है, जैसे कि अनियंत्रित और संक्रमित कोशिकाओं की तुलना की जा सकती है ( चित्रा 4 )। इसी प्रकार, आकार, इस मामले में पिक्सल की संख्या दी जाती है, जिसमें से सतह क्षेत्र की गणना की जा सकती है ( चित्रा 4 बी )। आवृत्ति वितरण plओटी विभिन्न सेल आबादी में पाए गए एसजीओं के आकार में शिफ्ट को उजागर करने के लिए भी उपयोगी हैं। यहां, एस। फ्लेन्डेनरी संक्रमित कोशिकाओं में बड़ी एसजीएस की पूर्ण अनुपस्थिति, साथ ही वितरण में एक निश्चित बदलाव स्पष्ट हो जाता है ( चित्रा 4 सी )। इसके अलावा, तीव्रता (यहां दिखाया गया न्यूनतम और अधिकतम तीव्रता) एसजीएस की गुणवत्ता के बारे में जानकारी प्रदान करता है। एस फ्लेक्सनेरी संक्रमित कोशिकाओं के लिए, एसजीएस काफी कम तीव्र हैं। ये विश्लेषण एक्सजेन्सिव तनाव के जवाब में गठित एसजीओं के गुणात्मक और मात्रात्मक प्रकृति दोनों पर सांख्यिकीय रूप से प्रासंगिक जानकारी प्रदान करते हैं, जब सेल एसए

आकृति 1
चित्रा 1 : एस फ्लेक्सेनरी के साथ कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए प्रायोगिक प्रक्रिया की रूपरेखा औरसंक्रमण के प्रभाव का विश्लेषण एसजी संरचना एक कांगो-लाल कॉलोनी, और एक गैर-भरोसेमंद कांगो-लाल-नकारात्मक कॉलोनी, को चुने गए हैं और ओप्टिटिक सोया शोरबा में ओ / एन बढ़े हैं। पालन ​​करने के लिए बैक्टीरिया को पीएलएल के साथ लेपित होने से पहले रातोंरात संस्कृति देर से घातीय चरण में उप-घटित होती है। 12-अच्छी तरह से प्लेटों में कांच के कवरलेट पर उभरने वाले मेजबान कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए बैक्टीरिया से संक्रमित किया जाता है नियंत्रण कक्ष संक्रमित नहीं हैं। कोशिकाओं को धोया जाता है और तनाव से युक्त माध्यमों के साथ माध्यम को बदलने या कोशिकाओं को तनाव की स्थितियों जैसे गर्मी के रूप में, या तो एसजी के गठन के लिए प्रेरित करने के लिए तनाव आवेदकों के साथ धोया जाता है और इलाज किया जाता है। कोशिकाओं को तब तय किया जाता है, परिरक्षित, immunofluorescent एसजी-विशिष्ट मार्करों के साथ दाग, और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर imaged। Z- अनुमानों ImageJ का उपयोग कर बनाया गया है और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के स्पॉट डिटेक्टर का उपयोग करके विश्लेषण किया गया है। तब डेटा का विश्लेषण किया जाता है। एक बड़े पैमाने पर देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के एर संस्करण

चित्र 2
चित्रा 2 : 1 एच के लिए Clotrimazole के अतिरिक्त से पहले 1.5 घंटे के लिए एस Flexneri के साथ संक्रमित हेला कोशिकाओं के स्पॉट डिटेक्टर विश्लेषण। एसजी मार्करों EIF3b और जी 3 बीपी 1, डीएपीआई और एक्टिन के साथ दाग वाले कोशिकाओं को प्रदर्शित करने वाला z- प्रोजेक्शन की इम्यूनोफ्लोरेसेंट इमेज। बी (ए) के रूप में एक ही छवि, लेकिन बिना एटीन दाग सेल सीमाओं को चित्रित करने के लिए eIF3b के उपयोग को उजागर करने के लिए दाग नहीं। सी स्पॉट डिटेक्टर मॉड्यूल के साथ छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का स्क्रीन शॉट। डी संक्रमित और गैर-संक्रमित कोशिकाओं को अलग-अलग चैनलों का उपयोग करते हुए देखा गया। सभी जीवाणुओं को देखने के लिए, तीव्रता बढ़ जाती है। सेल में मौजूद 1 से अधिक जीवाणुओं वाले कोशिकाओं को लाल सितारा के साथ लेबल किया जाता है स्पॉट डिटेक का उत्पादनआरओआई का नाम, स्पॉट की संख्या और उनके स्थान का संकेत देते हुए व्यक्तिगत आरओआई का विश्लेषण। एफ ROIs में पाया गया स्पॉट की छवि स्केल बार = 30 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3 : विभिन्न एसजी मार्करों के माध्यम से एसजीएस की जांच के लिए स्पॉट डिटेक्टर की विभिन्न स्केल और संवेदनशीलता सेटिंग्स की तुलना। एचएएलए कोशिकाओं को संक्रमित या एस। फ्लेन्क्लेरी के साथ ज़ूम इन करें और डीएपीआई और एसजी के जी 3 बी पी 1 के साथ दाग और अलग-अलग तराजू (पिक्सेल आकार का कट ऑफ, 1-3) और संवेदनशीलता (1 - 100) में विश्लेषण किया गया। असंतोषित और संक्रमित कोशिकाओं में एसजी संख्याओं के ग्राफ़िकल प्रतिनिधित्व अलग-अलग तराजू पर विश्लेषण ( > बी) और संवेदनशीलता ( सी ) एसजी मार्कर ईआईएफ 3 बी के एसजी नंबर का पता लगाने के दृश्यों ( डी ) और ग्राफ़िकल प्रतिनिधित्व ( ) उसी छवि के लिए जब संवेदनशीलता सीमा को बदलने के बिना स्थान आकार कट-ऑफ बदलते हैं लाल लिखना और लाल प्रतीक सर्वोत्तम पैरामीटर दर्शाते हैं। लाल तीर एसजी खोज की कमी के कारण झूठी सकारात्मक और नारंगी तीरों की तरफ इशारा करते हैं। मूल्यों में मानक विचलन के साथ मतलब है श्रेष्ठ परिणामों को लाल रंग में हाइलाइट किया गया है चयनित सांख्यिकीय विश्लेषण में विलकॉक्सन रैंक की राशि परीक्षण पी-वैल्यू का उपयोग करके स्पष्टता के लिए शामिल किया गया है और दाईं तरफ विचरण एफ-परीक्षण। * = <0.05, ** = <0.01, *** = <0.001, एनएस = nonsignificant। स्केल बार = 10 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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चित्रा 4 : स्पॉट डिटेक्टर जनित एसजी डेटा का विश्लेषण एस फ्लेक्सनेरी के साथ संक्रमित क्लॉटियमोजोल युक्त एचईएलए कोशिकाओं से प्राप्त किया गया। ए जी 3 बी पी 1 एसजी की संक्रमित संक्रमित और अनियंत्रित हेला कोशिकाओं में संख्या बी जी 3 बीपी 1-एसजीएस के भूतल क्षेत्र में संक्रमित और असंक्रमित कोशिकाओं में, और उनकी प्रतिशत वितरण आवृत्ति ( सी ) डी जी 3 बी पी 1-एसजीएस के न्यूनतम और अधिकतम तीव्रता मूल्य (मनमाना) मूल्यों में मानक त्रुटि के साथ मतलब है चयनित सांख्यिकीय विश्लेषण में विलकॉक्सन रैंक की राशि परीक्षण पी-वैल्यू का उपयोग करके स्पष्टता के लिए शामिल किया गया है और दाईं तरफ विचरण एफ-परीक्षण। * = <0.05, ** = <0.01, *** = <0.001, एनएस = nonsignificant। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

यहां बताया गया प्रोटोकॉल गैर-संक्रमित कोशिकाओं और एसोसिएट्स के एसोसिएशन का विश्लेषण, साइटोसोलिक रोगज़न एस एस फ्लेन्डेरी से उत्पन्न होता है जो बाह्य तनाव की मौजूदगी या अनुपस्थिति में होता है। मुक्त इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए, प्रोटोकॉल एसजी के गठन के सटीक गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण की पहचान करने के लिए अनुमति देता है और सांख्यिकीय रूप से दिए गए फ़ोनोटाइप्स में अंतर को संबोधित करता है।

संक्रमण, एसजी-प्रेरण और इमेजिंग भागों के प्रोटोकॉल के भीतर कई महत्वपूर्ण कदम हैं। संक्रमण के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि मेजबान कोशिकाओं के साथ जीवाणु संबंधी संपर्क, जैसे कि उल्लिखित प्रोटोकॉल के रूप में आक्रमण, जितना संभव हो उतना सिंक्रनाइज़ किया जाता है। संक्रमण प्रक्रिया के दौरान बैक्टीरिया के चुनौती के प्रभाव की जांच करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण होता है। हमने पहले दिखाया है कि एस एफ फ्लेन्नेरी संक्रमण के बाद कुछ फ़िनोटीपियां, जैसे ईआईएफ 3 बी स्थानीयकरण जंगली प्रकार के दौरान शुरुआती परेशान हैंएस फ्लेक्सनेरी चुनौती जबकि अन्य फ़ोनोटाइप्स, जैसे कि जी 3 बी पी 1 युक्त एसजीएस के समूह, बाद के समय अंक 3 पर अधिक प्रभावित होते हैं। इस प्रकार, बैक्टीरिया की चुनौती के अस्थायी प्रभाव का सटीक वर्णन करने के लिए, संक्रमण के सिंक्रनाइज़ेशन का सुझाव है। विशेष रूप से, एसजी के गठन का विश्लेषण करने के लिए, कोशिकाओं को विकास के घातीय चरण में होना चाहिए, और इस प्रकार तनाव बढ़ाने के समय सेल घनत्व एक महत्वपूर्ण पैरामीटर भी है। यह गैर-संगत कोशिका संक्रमण मॉडल में एसजी विश्लेषण को भी सीमित करता है। एक और महत्वपूर्ण पहलू इमेजिंग के लिए नमूने के प्रसंस्करण और छवि अधिग्रहण के दौरान नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूनों के सह-प्रसंस्करण है। इम्यूनोफ्लोरोसेंट प्रोसेसिंग के लिए, सभी नमूनों को समान एंटीबॉडी कार्यशील द्रव्यों के साथ उसी समय के लिए और उसी स्थितियों ( यानी आरटी बनाम 4 डिग्री सेल्सियस) के तहत दाग किया जाना चाहिए, जबकि प्रत्येक कसरत को उसी तरह धोने के चरणों में रखने का ध्यान रखना चाहिए। बढ़ते ओकवरेज यह तुलनीय इम्यूनोफ्लोरोइसेंट डेनिंग सुनिश्चित करेगा जो कि क्वालिटी और मात्रात्मक दोनों का विश्लेषण किया जा सकता है। बढ़ते माध्यम के मतभेदों को छवि अधिग्रहण के दौरान नमूनों की विरंजन पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है और इसलिए इसे निरंतर रखा जाना चाहिए। इसी प्रकार, विश्लेषण में तुलना किए जाने वाले सभी नमूनों के लिए छवि अधिग्रहण लेजर शक्ति या नमूना सेट-अप से उत्पन्न होने वाले मतों को कम करने के लिए एक बैठे और उसी सेटिंग के साथ किया जाना चाहिए।

बहिर्जात तनाव का उपयोग करते समय, अभिकर्मक को ठीक से संग्रहीत करने और नए कामकाजी स्टॉक बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। विस्तारित अवधि (> क्लोट्रमियाज़ोल के लिए 4 महीने, उदाहरण के लिए) दवा की कमी की वजह से बढ़ती है और एसजी के गठन को प्रभावित करेगा। अभिकर्मकों को कोशिकाओं के अलावा तुरंत ही संस्कृति माध्यम में जोड़ा जाना चाहिए; अगर नियंत्रण कक्षों में एसजी के गठन में कमी देखी गई है या एसजीएस का एकत्रीकरण बेगुनाह दिखाई देता है, तो अभिकर्मकों को उनके एसी के लिए परीक्षण किया जाना चाहिएटीविटी और नए शेयरों को बनाना चाहिए।

एक सीमा यह है कि स्थान डिटेक्टर का उपयोग करते हुए एसजी की पहचान कम विश्वसनीय हो जाती है जब बहुत अधिक प्रतिदीप्ति मौजूद है। हालांकि यह कई एसजी मार्करों के लिए एक समस्या नहीं है, कुछ, जैसे कि ईआईएफ 3 बी, जो एसजी-उत्प्रेरण और गैर-प्रेरित दोनों शर्तों के तहत एक स्पष्ट साइटोसोलिक मार्कर है, चित्रा 3 में दिखाए गए अनुसार विश्लेषण करना अधिक मुश्किल है। इसके अलावा, प्रत्येक एसजी मार्कर के लिए तराजू और संवेदनशीलता को अनुभवपूर्वक निर्धारित किया जाना चाहिए। एक और सीमा यह है कि छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के माध्यम से विश्लेषण 2 डी छवियों के साथ सबसे अच्छा है, और इसलिए ऑप्टिकल स्लाइस या ढंके हुए ढेर पर अच्छा काम करता है, हालांकि इसका परिणाम 3 डी की जानकारी के नुकसान में होता है। इसलिए z- अनुमानों पर विश्लेषण एसजीओं के आकार की अधिकता को बढ़ाता है और एसजीओं की संख्या कम कर देता है। एसएजी का 3 डी विश्लेषण एक विशिष्ट सटीक लक्षण वर्णन देने के लिए इमरिस के साथ किया जा सकता है, अगर किसी विशिष्ट फेनोटाइप के लिए आवश्यक समझा जाता है। एसजी लक्षण वर्णन जल्दी से और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के स्वचालित स्थान डिटेक्टर का उपयोग कर एक मानकीकृत तरीके से किया जा सकता है। इसके विपरीत, एसजीएस की पहचान और चित्रण करने के लिए मैनुअल तरीके, जैसा पहले पहले 4 किया गया था, विश्लेषण को अधिक पूर्वाग्रह के लिए छोड़ दें और काफी अधिक समय लगता है। अलग-अलग संवेदनशीलता और आकार सीमा को चुनकर छोटे एसजी समुच्चय को शामिल करने या बाहर करने के लिए स्पॉट डिटेक्टर का उपयोग करने वाले एसजी विश्लेषण भी तैयार किए जा सकते हैं, जिससे एसजी के गठन के विभिन्न पहलुओं के मूल्यांकन में लचीलापन की अनुमति दी जा सकती है। एसजी विश्लेषण को एक स्वचालित रूप से स्वचालित वर्कफ़्लो 3 का उपयोग करके पूरी तरह से स्वचालित तरीके से किया जा सकता है। इस वर्कफ़्लो के भीतर, सेल का केंद्र डीएपीआई के दाग के माध्यम से पहचाना जाता है और कार्यक्रम के बाद एक कोशिका कोशिका (जैसे ईआईएफ 3 बी) या एक्टिन के आधार पर कोशिका की सीमाओं को चित्रित करने के लिए एक मुलायम क्षेत्र बढ़ता है। साथ ही, एक अर्द्ध स्वचालित विश्लेषण का उपयोग करकेविश्लेषण के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से चित्रित करना, फायदेमंद हो सकता है, जब कोशिकाएँ समूहों में बढ़ती हैं और सेल सीमाएं स्पष्ट रूप से स्पष्ट करने के लिए स्वचालित कार्यक्रम के लिए मुश्किल होती हैं इन परिस्थितियों में, सेल की सीमाओं को परिभाषित करने से मैन्युअल रूप से झूठी सकारात्मक या नकारात्मक मूल्यों को समाप्त कर सकते हैं।

प्रोटोकॉल अन्य एसजी-उत्प्रेरण परिस्थितियों और वायरस, बैक्टीरिया, खमीर और प्रोटोजोअन सहित अन्य रोगजनकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। विशेष रूप से दिलचस्पी अन्य साइटोसोलिक रोगजनकों जैसे रिकेट्सिया एसपीपी, फ्रांसेसिला तुलेरेन्सिस , बर्कहोलीस्टरिया स्यूडोमेलली और लिस्टरिया एसपीपी हो सकती हैं। 14 प्रत्येक संक्रामक एजेंट के लिए, और संभवतः विभिन्न सेल लाइनों के लिए, संक्रमण प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जाना चाहिए और एक्सोजेनस का नमूना बार empirically निर्धारित बल दिया है इसके अलावा, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए एसजी लक्षण वर्णन भी भविष्य में लाइव-सेल इमेजिंग तक बढ़ाया जा सकता है। वास्तविक समय एसजी विश्लेषण जरूरी होगामेजबान कोशिकाओं में एक या एक से अधिक फ्लोरोसेंटली टैग वाले एसजी मार्करों की अभिव्यक्ति को बढ़ाइए, परन्तु इस प्रकार एसएजी संरचना के लौकिक और विशेष गतिशीलता के बारे में सवालों को अलग-अलग प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत संबोधित करने की अनुमति होगी। संक्रमित और असंकृप्त कोशिकाओं में वास्तविक समय एसजी विश्लेषण के पूरक होने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल वाले बैक्टीरिया की आवश्यकता होगी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgements

पी एस बिल और मेलिंडा गेट्स ग्रैंड चैलेंज अनुदान OPP1141322 के एक प्राप्तकर्ता है पीवी को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन के प्रारंभिक पोस्टडॉक मोबिलिटी फेलोशिप और रौक्स-कैंटरीनी पोस्टडॉक्टरल फेलोशिप का समर्थन किया गया था। पीजेएस एचएचएमआई अनुदान और ईआरसी -2013-एडीजी 339579-डिक्रिप्ट द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat  Santa Cruz sc-16377 Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1:300
eIF3b (A20), origin goat  Santa Cruz sc-16378 Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1:300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) Cell Signaling 3411 Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1:800
eIF4AI, origin goat  Santa Cruz sc-14211 Recommended by (Ref # 13). Dilution 1:200
eIF4B, origin rabbit Abcam ab186856 Good stress granule marker in our hands. Dilution 1:300
eIF4B, origin rabbit Cell Signaling 3592 Recommended by Ref # 13. Dilution 1:100
eIF4G, origin rabbit Santa Cruz sc-11373 Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1:300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) BD Biosciences 611126 Widely used SG marker. Dilution 1:300
Tia-1, origin goat  Santa Cruz sc-1751 Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1:300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey Thermo Fisher A-11055 Cross absorbed. Dilution 1:500
A568 anti-goat, origin donkey Thermo Fisher A-11057 Cross absorbed. Dilution 1:500
A488 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A-21202 Dilution 1:500
A568 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A10037 Dilution 1:500
A647 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A31571 Dilution 1:500
A488 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A-21206 Dilution 1:500
A568 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A10042 Dilution 1:500
Other Reagents
Shigella flexneri Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth BD Biosciences 211825 Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth
TCS agar BD Biosciences 236950 Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth
Congo red SERVA Electrophoresis GmbH 27215.01 Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth
Poly-L-Lysine (PLL) Sigma-Aldrich P1274 Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397 Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection
HEPES Life Technologies 15630-056 PH buffer useful when cells are incubated at RT, application - cell culture
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 31885 Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture
Fetal Calf Serum (FCS) Biowest S1810-100 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Life Technologies 11140 1:100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650 Reagent diluent, application - cell culture
Sodium arsenite Sigma-Aldrich S7400 Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer
Clotrimazole Sigma-Aldrich C6019 Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer
Paraformaldehyde (PFA Electron Microscopy Scences 15714 4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization
A647-phalloidin Thermo Fisher A22287 Dilution is at 1:40, best added during secondary antibody staining, application - staining
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining
Parafilm Sigma-Aldrich BR701501 Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining
Prolong Gold Thermo Fisher 36930 Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting
Mowiol Sigma-Aldrich 81381 Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
24-well cell culture plate Sigma-Aldrich CLS3527 Standard tissue culture plates, application - cell culture
12 mm  glass coverslips NeuVitro 1001/12 Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support
forceps Sigma-Aldrich 81381 Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
Programs and Equipment
Prism GraphPad Software Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis
Leica SP5 Leica Microsystems Confocal microsope, application - image acquisition
Imaris Bitplane Professional image analysis program, application - data analysis
Excel Microsoft Data analysis and graphing program, application - data analysis

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References

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