Elektrophysiologische Analyse von humanen Pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten (hPSC-CMs) unter Verwendung von Multi-Elektroden-Arrays (MEAs)

Developmental Biology
 

Summary

Die elektrophysiologische Charakterisierung von Kardiomyozyten, die aus menschlichen Pluripotenten Stammzellen (hPSC-CMs) stammen, ist entscheidend für die Modellierung von Herzkrankheiten und für die Bestimmung von Arzneimittelwirkungen. Dieses Protokoll liefert die notwendigen Informationen, um hPSC-CMs auf Multi-Elektroden-Arrays zu dissoziieren und zu plattieren, ihr Feldpotential zu messen und ein Verfahren zur Analyse von QT- und RR-Intervallen zu verwenden.

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Sala, L., Ward-van Oostwaard, D., Tertoolen, L. G., Mummery, C. L., Bellin, M. Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (123), e55587, doi:10.3791/55587 (2017).

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Abstract

Kardiomyozyten können nun mit hohem Wirkungsgrad von menschlichen embryonalen und menschlich induzierten - pluripotenten Stammzellen (hPSC) abgeleitet werden. HPSC-abgeleitete Kardiomyozyten (hPSC-CMs) werden zunehmend als mit großem Wert für die Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen beim Menschen, insbesondere Arrhythmie-Syndromen, erkannt. Sie haben auch Relevanz als In-vitro- Systeme zur Vorhersage von Arzneimittelwirkungen gezeigt, was sie potenziell für Arzneimittel-Screening und Entdeckung, Sicherheitspharmakologie und eventuell für personalisierte Medizin nützlich macht. Dies würde durch die Ableitung von hPSC-CMs von Patienten oder anfälligen Personen als hiPSCs erleichtert werden. Für alle Anwendungen ist jedoch eine genaue Messung und Analyse der elektrischen Eigenschaften von hPSC-CM für die Identifizierung von Änderungen aufgrund von Herz-Ionen-Kanal-Mutationen und / oder Medikamenten, die auf Ionenkanäle abzielen, und können einen plötzlichen Herztod verursachen. Im Vergleich zur manuellen Patch-Clamp bieten Multi-Elektroden-Array (MEA) Geräte den Vorteil vonErmöglicht mittel- bis hochdurchsatzaufnahmen. Dieses Protokoll beschreibt, wie man 2D-Zellkulturen von hPSC-CMs zu kleinen Aggregaten und einzelnen Zellen dissoziiert und sie auf MEAs plattiert, um ihre spontane elektrische Aktivität als Feldpotential aufzuzeichnen. Es werden auch Verfahren zur Analyse der aufgezeichneten Daten zur Extraktion von spezifischen Parametern wie dem QT und den RR-Intervallen beschrieben. Änderungen in diesen Parametern würden in hPSC-CMs mit Mutationen, die für Herzrhythmusstörungen und die Zugabe von spezifischen Medikamenten verantwortlich sind, erwartet, die die Erkennung von Personen ermöglichen, die ein kardiotoxisches Risiko tragen.

Introduction

Menschliche Pluripotenten Stammzellen (hPSCs) haben die Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und praktisch jede Zellart des menschlichen Körpers durch Differenzierung 1 , 2 zu erzeugen. Detaillierte Protokolle zur direkten Differenzierung von hPSCs in mehrere Herzlinien (ventrikuläre, atriale, pacemakerartige Kardiomyozyten) wurden beschrieben 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Kardiomyozyten sind elektrisch aktive Zellen und detaillierte Kenntnisse über ihre elektrophysiologische Aktivität können äußerst informativ für das Verständnis der Herzentwicklung und der Krankheit 8 sein . Patientenspezifische hiPSC-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) wurden erfolgreich verwendet, um die zellulären, molekularen und elektrischen Eigenschaften von mehreren Herzrhythmusstörungen, einschließlich des Long QT-Syndroms, zu modellieren und zu untersuchen(LQTS) 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , Brugada-Syndrom 14 und kathekolaminergische polymorphe ventrikuläre Tachykardie 15 , 16 . Darüber hinaus wurden mehrere Medikamente zu kranken hiPSC-CMs hinzugefügt, um therapeutische Interventionen zu rekapitulieren und die zellulären pathologischen Phänotypen 10 , 15 , 20 , 21 , 22 zu retten. In jüngster Zeit wurden Screening-Plattformen auf der Basis von WT-hiPSC-CMs entwickelt, als Reaktion auf die Notwendigkeit von menschlichen Systemen in die frühen Phasen der Wirkstoffforschung 23 , 24 , 25 als Nagetier-Kardiomyozyten unterscheiden sich tief von huMans in Ionenkanalausdruck und Biophysik 26 .

Zu diesem Zweck werden Technologien entwickelt, die für eine mittel- bis hochdurchsatzfähige Anwendung geeignet sind. Hierbei handelt es sich um optische Aufzeichnungen von Membranpotentialen, Ca 2+ -Transienten und -Stämmen, Impedanzmessungen (als indirekte Messung der Zellkontraktilität) und extrahierbare Feldpotentiale (FP) -Messungen (siehe siehe Referenz 24 ). Multi-Elektroden-Arrays (MEA) -Geräte ermöglichen die Aufzeichnung der elektrischen Wellenformsignale (oder FPs), die durch Monolagen oder kleine Cluster von Kardiomyozyten erzeugt und geformt werden. Die FP-Kontur korreliert mit dem Herzwirkungspotential und in gewissem Maße mit den Elektrokardiogramm- (EKG-) Aufzeichnungen 27 ; Sie zeigen typischerweise einen anfänglichen schnellen Aufwärtsschlag, der dem Na + -Einstrom und der Membrandepolarisation entspricht (R / Q-Peak), eine langsame Welle / Plateau-Phase, die wahrscheinlich dem Ca entspricht2+ -Einstrom und eine Repolarisierungsphase, die einem vorherrschenden K + -Efflux (T-Peak) entspricht. Die Störung der FP-Wellenform kann mit Änderungen der spezifischen Aktionspotentialphasen korreliert werden.

Obwohl Patch-Clamp-Aufnahmen von Aktionspotentialen informativer sein könnten, insbesondere für Parameter als Aufwärtsgeschwindigkeit und Ruhemembranpotential, sind manuelle Messungen für Experimente im Mittel- und Hochdurchsatz nicht möglich, während die automatisierte Patch-Clamp erst vor kurzem auf hPSC angewendet wurde -CMs 29 . Da jedoch längere Aufnahmen auf MEAs sowohl akute als auch chronische Exposition gegenüber zu untersuchenden Verbindungen ermöglichen, ist es nun möglich, hPSC-CM-Plattformen für die Arzneimittel-Screening, Entdeckung 24 , 30 und für die Sicherheitspharmakologie 31 , 32 zu verwenden. Das hält das Versprechen der zukünftigen Präzision oder PersoNalisierte Medizin 33 .

Der Zweck dieses Protokolls ist es, die notwendigen Informationen für die Dissoziation und Beschichtung von hPSC-CMs auf MEA-Chips und die Messung ihrer FP zur Verfügung zu stellen. In diesem Verfahren wurde jeder Schritt optimiert, was ein optimales Zelleüberleben und -wiederherstellung nach der Dissoziation, eine optimale Zelladhäsion an der MEA-Platte und eine standardisierte Analyse und Quantifizierung von Parametern gewährleistet. Insbesondere werden die Vorgehensweise für die extrazelluläre FP-Aufzeichnung, die Analyse von QT- und RR-Intervallen sowie die Bewertung von Arzneimittelwirkungen erläutert und veranschaulicht.

Protocol

1. Vorbereitung von Lösungen und Reagenzien

  1. Bereiten Sie das hPSC-CM-Kulturmedium unter Verwendung von Insulin, Rinderserumalbumin, Polyvinylalkohol, essentiellen Lipiden (LI-BPEL) -Mittel 34 , 35 , 36 vor, indem Sie die in Tabelle 1 beschriebenen Reagenzien kombinieren. Das Medium durch einen 0,22 μm Porenfilter filtrieren und bei 4 ° C bis zu 2 Wochen aufbewahren.
  2. Vorbereiten der humanen rekombinanten Fibronectin-Stammlösung durch Rekonstituieren von 1 mg humanem rekombinantem Fibronektin in 5 ml sterilem destilliertem Wasser, um eine Konzentration von 200 & mgr; g / ml zu erreichen, Aliquot und bei -80 ° C zu lagern.
  3. 1% (Gew./Vol.) Enzym-Detergenslösung (siehe Tabelle der Materialien ) vorbereiten , um die Entfernung von restlichen Zellen aus dem Mikroarray-Chip zu erleichtern, indem 1 g Enzym-Detergenspulver in 100 ml warmem (~ 40-45 ° C) Deionisiertes Wasser. Lassen Sie die Lösung abkühlen und bei 4 ° C fOder bis zu einem Jahr.

2. Sterilisation von MEA-Chips (Abbildung 1A)

HINWEIS: Es stehen mehrere verschiedene Konfigurationen der MEAs zur Verfügung, mit Single- oder Multi-Well-Formaten. Das hier beschriebene Protokoll verwendet die Einzelkammer-MEA mit 60 Aufzeichnungselektroden in einer 8 x 8 Gitteranordnung (siehe Tabelle der Materialien ). Der Elektrodendurchmesser beträgt 30 μm und der Abstand zwischen den Elektroden beträgt 200 μm. Eine Referenzelektrode ist ebenfalls vorhanden.

  1. Spülen Sie den Chip gründlich mit deionisiertem Wasser ab.
  2. Setzen Sie die MEA-Chips in eine Glas-Petrischale, die autoklaviert werden kann. Wickeln Sie die Schale in Aluminiumfolie ein.
  3. Sterilisieren Sie die Chips in einem Labordruckkocher für 6 min. Lassen Sie das Geschirr vor dem Öffnen abkühlen.
    HINWEIS: Alternativ können die Chips durch Eintauchen in 1 ml 80% (v / v) Ethanol bei RT für 15-30 min sterilisiert werden.
  4. Legen Sie die Chips in eine Zellkultur Kapuze und setzen Sie dieOberfläche zu UV-Licht für ca. 30 min.

3. Beschichtung von MEA-Chips (Abbildung 1B und 1C)

  1. Legen Sie die sauberen Chips in eine Standard-10 cm Ø Kunststoff sterile Petrischale.
  2. Füge 8 ml steriles destilliertes Wasser zur Petrischale hinzu, um eine befeuchtete Kammer zu bilden, die verhindert, dass das kleine Volumen des Kulturmediums auf dem Chip trocknet, wenn es in den Inkubator gelegt wird.
  3. Verwenden Sie maßgeschneiderte Polytetrafluorethylen (PTFE) Ringe (Abbildung 1B ), um die Plattierung der Kardiomyozyten in der Mitte des Chips zu gewährleisten, wo sich das Elektrodenarray befindet. (Die PTFE-Ringe werden vorher in 80% Ethanol gelagert.) In der Kulturhaube die Ringe aus dem Ethanol entfernen, in eine sterile Petrischale ohne Deckel geben und die Ringe in der Kapuze trocknen lassen.
  4. Legen Sie einen trockenen Ring in einen MEA-Chip mit flammensteriliger Pinzette (Abbildung 1C ).
    HINWEIS: Alternativ können Sie mit 80% Ethanol die Pinzette waschen und trocknen lassenN die Gewebekulturhaube vor dem Gebrauch.
  5. Das Aliquot des menschlichen rekombinanten Fibronectin-Stammes (200 μg / ml in destilliertem Wasser) auftauen und in PBS mit Ca 2+ und Mg 2+ verdünnen, um eine Arbeitslösung von 40 μg / ml zu erhalten. Beschichten Sie die Elektroden durch Zugabe von 50 μl 40 μg / ml Fibronectin im Ring.
    HINWEIS: Die Beschichtung mit humanem rekombinantem Fibronectin sorgt für eine optimale hPSC-CM-Befestigung. Es können jedoch auch andere Arten von Beschichtungsproteinen wie Rinderfibronektin oder extrazelluläre Matrixproteine ​​Mischungen verwendet werden.
  6. Schließen Sie den Deckel der 10 cm Ø Plastik-Petrischale und übergeben Sie die Schale mit dem MEA-Chip vorsichtig in den Inkubator. Inkubieren bei 37 ° C für mindestens 1 h oder bei 4 ° CO / N.
  7. Übertragen Sie die Schale mit dem MEA-Chip in die Zellkultur-Kapuze. Vor dem Einsatz des MEA-Chips die 50 μl Fibronectin mit einer P200-Pipette oder einem Vakuumsystem in der Haube aspirieren, ohne den PTFE-Ring zu verschieben. Verwenden plaStic Tipps für diesen Schritt. Achten Sie darauf, dass keine festen Gegenstände ( z. B. Pipettenspitzen) das Innere der Schale berühren, da dies die Elektroden beschädigen kann.
    HINWEIS: Das verlängert die Lebensdauer von MEA-Chips.
  8. Fügen Sie vorsichtig 950 μl LI-BPEL-Medium hinzu (siehe Tabelle 1 und Tabelle der Materialien ), um sicherzustellen , dass es gleichmäßig verteilt ist und dass der Ring nicht schwebt. Bringe die Schale zum Inkubator zurück.

4. hPSC-CMs Dissoziation und Überzug (Abbildung 2)

HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll verwendet hPSC-CMs, die in einer Monolayer-Kultur unter Verwendung von Zytokinen 34 bei ~ 18 Tagen nach Beginn der Differenzierung differenziert wurden. Allerdings hat es sich als geeignet für jede 2D- und 3D-hPSC-CM-Kultur erwiesen. Bei der Verwendung von differenzierten Kulturen zu früheren oder späteren Zeitpunkten kann die Einstellung der Inkubationszeit des Dissoziationsenzyms (siehe Tabelle der Materialien ) ne seinCessary Die folgenden Volumina sind für eine einzige Vertiefung eines 12-Well-Plattenformats (3,8 cm 2 ) gedacht.

  1. Aspirieren Sie das Medium aus der hPSC-CMs Kultur gut.
  2. Während der Arbeit unter einer Gewebekulturhaube, fügen Sie 1-2 ml / Vertiefung von PBS ohne Ca 2+ / Mg 2+ hinzu, um die Kultur zu waschen. Aspirieren Sie die PBS.
  3. Füge 500 μl / Vertiefung des Dissoziationsenzyms hinzu. 5 min bei 37 ° C inkubieren.
  4. Füge 1 ml LI-BPEL / Vertiefung hinzu, um das Enzym zu verdünnen. Entfernen Sie die Monoschicht von hPSC-CMs vorsichtig, indem Sie sie vorsichtig mit einer P1000-Pipette kratzen. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml-Röhrchen.
  5. Spülen Sie den Brunnen mit 1 ml LI-BPEL, um alle verbleibenden Zellen und Zellklumpen zu sammeln.
  6. Füge weitere 2-3 ml LI-BPEL hinzu, um ein Endvolumen von 5-6 ml zu erreichen und vorsichtig 3-5x mit einer 5-ml-Pipette zu pipettieren, um Zellklumpen zu dissoziieren.
    HINWEIS: Die Dissoziation in einzelne Zellen an diesem Punkt ist nicht notwendig, da sie das Zellüberleben beeinflussen wird. Vorhandensein von kleinen Clustern wirdSorgen für eine höhere Lebensfähigkeit der Zellen.
  7. Die Zellen bei RT für 3 min bei 300 x g zentrifugieren
  8. Entfernen Sie den Überstand, versuchen, die meisten der überschüssigen Flüssigkeit zu entfernen, aber ohne das Zellpellet zu vertreiben.
  9. Das Zellpellet wird in 250 μl LI-BPEL (unter Verwendung eines P1000 und Pipettieren sehr schonend) resuspendiert.
  10. Verteilen Sie ~ 50 μl Zellsuspension pro MEA (bis zu 5 MEAs können aus einer Vertiefung einer 12-Well-Platte hergestellt werden), indem Sie die Zellsuspension direkt in die Mitte des PTFE-Rings auf die Oberseite der Elektrodenanordnung pipettieren.
    HINWEIS: In diesem Stadium sind die Zellen aufgrund des Vorhandenseins von Zellclustern schwer zu zählen und die Gesamtzahl der Zellen pro MEA kann in Abhängigkeit von der verwendeten HPSC-CM-Quelle wesentlich variieren. Während der Beschichtung, stellen Sie sicher, dass die Wolke der dissoziierten Zellen die Fläche der Elektroden bedeckt.
  11. Setzen Sie die MEAs vorsichtig auf den Inkubator bei 37 ° C und lassen Sie die Zellen O / N anbringen

5. Ringentfernung und Medium ReFrischung (Abbildung 3)

  1. Nach 1 Tag nach dem Beschichten den Ring in einer sterilen Umgebung mit steriler Pinzette vorsichtig entfernen (Abbildung 3A-3B ).
  2. Spülen Sie den Ring in 80% (v / v) Ethanol und lagern Sie ihn in einem 50 ml-Röhrchen, das frisches 80% (v / v) Ethanol enthält.
  3. Entfernen Sie vorsichtig 500 μl Medium aus dem MEA-Chip und fügen Sie 500 μl frisches LI-BPEL hinzu.
  4. Übertragen Sie die MEAs auf den Inkubator bei 37 ° C.
    HINWEIS: Die Zellen sollten beginnen, 1-7 Tage nach der Ringentfernung und mittlerer Veränderung zu schlagen ( Abbildung 3C ).
  5. Messen Sie die elektrische Aktivität von hPSC-CMs auf MEAs 1-7 Tage nach der Ringentfernung.

6. Signalqualität überprüfen (Abbildung 4)

  1. Schalten Sie den Computer ein und starten Sie die mit der MEA eingerichtete Software-Suite: TCX-Control, MC_MEA Select und MC_Rack. Stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C in TCX-Control ein, um Messungen bei physiologischer Temperatur aufzuzeichnen.
  2. Entfernen Sie die Schale mit dem MEA-Chip fRom der Inkubator. Öffnen Sie den Deckel, nehmen Sie den MEA-Chip heraus und legen Sie ihn auf ein Gewebe, um Restwasser zu absorbieren.
  3. Wischen Sie die äußeren Kontakte der Platte vorsichtig mit einem Gewebe ab und reinigen Sie sie mit einem Wattestäbchen, der mit 100% (v / v) Ethanol angefeuchtet ist, um restliches Wasser oder Schmutz zu entfernen, was zu Signalgeräuschen führen kann.
  4. Übertragen Sie die MEA-Platte auf die erwärmte (37 ° C) Aufzeichnungskopfstufe, um die spontane Aktivität zu erkennen ( zB Hardware: siehe Tabelle der Materialien , Software: MC_Rack).
    1. Öffnen Sie MC_Rack: Klicken Sie auf 'Bearbeiten' → 'MC_Card hinzufügen', um ein neues Protokoll zu erstellen. Verwenden Sie das Dropdown-Menü 'Bearbeiten', um dem Recorder verschiedene Recorder- und Display-Fenster hinzuzufügen.
      HINWEIS: Es wird eine Abtastfrequenz von mindestens 10 kHz empfohlen. Das Protokoll, das wir verwenden, enthält ein Langzeit-Display-Tool, mit einem vollständigen Layout des gesamten MEA-Chips, und ein Spike Sorter, wichtig, um Drogeneffekt zu erfassen iN in Echtzeit. Der Spike Cutout ist mit einem 'Pre Trigger' von 20 ms, einem 'Post Trigger' von 800 ms und einer 'Dead Time' von 2 ms abgestimmt. Das Protokoll kann als '.rck' Datei gespeichert und vor dem Start der Experimente neu geladen werden.
  5. Starten Sie das Protokoll im Wiedergabemodus, indem Sie auf die Schaltfläche "Abspielen" klicken.
    HINWEIS: An diesem Punkt ist es möglich, das unter Schritt 6.5 gespeicherte Protokoll neu zu laden. In MC_Rack laden Sie das Protokoll (.rck Dateierweiterung), indem Sie auf 'Datei' → 'Öffnen' klicken.
  6. Wenn die Signale deutlich sichtbare R-Peaks und T-Peaks aufweisen, warten Sie 10-15 min, um die Adaptionsphase abzuschließen. Beispiele für gute und schlechte Qualitätsspuren sind in Abbildung 4 dargestellt .
    HINWEIS: Wenn kein T-Peak in einer der Elektroden erkannt werden kann, gehen Sie nicht mit dem Experiment vor. Normalerweise ist dies das Ergebnis einer schlechten elektrischen Aktivität der hPSC-CMs oder einer schlechten Anbindung der Zellen an die Elektroden.

7. Start ExPeriment und aufnahme

  1. Klicken Sie auf "Aufnahme" und dann "spielen", und erwerben Daten für 10 min unter Grundlinie Bedingungen, um den stationären Zustand zu bestimmen. Annotieren Sie die Elektroden, die das beste Signal haben, damit sie leicht identifiziert und später für die Analyse exportiert werden können.
  2. Für die Drogen-Response-Bewertung, erhöhen Sie die Konzentrationen des Medikaments alle 10 min. Als Beispiel fügen Sie den hERG-Blocker E4031 in einer Endkonzentration von 1 μM hinzu. Dazu werden 100 μl Medium zugesetzt und das gleiche Volumen von 10 μM E4031, gelöst im Medium, zugegeben.
    ANMERKUNG: Wie bereits von Cavero und Kollegen 31 gezeigt , ist eine kluge Wahl des Volumens, in dem die Medikamente aufgelöst werden, wichtig, da sie die Arzneimittelwirkungskurve tief verändern kann.
  3. Wiederholen Sie Schritt 7.2 für alle anderen Drogenkonzentrationen von Interesse.
  4. Klicken Sie auf "Stop", um die Aufnahmen am Ende des Protokolls abzuschließen.

8MEA Reinigung für Wiederverwendung

  1. Sobald die Testaufzeichnung abgeschlossen ist, entfernen Sie das Medium vorsichtig mit einer P1000-Pipette. Berühren Sie nicht das Innere der Schale, da dies die Elektroden beschädigen kann. Entsprechend den örtlichen Sicherheitsvorschriften entsorgen.
  2. Spülen Sie die MEA-Chips mit deionisiertem Wasser mit einer Waschflasche und wiederholen Sie den Waschschritt 3-4x.
    HINWEIS: An diesem Punkt ist es nicht notwendig, dass die Zellen vollständig vom Chip gelöst sind.
  3. Füge 1 ml Enzym-Detergenslösung 1% (v / v) in jede Vertiefung hinzu und inkubiere O / N bei 4 ° C, um die Zellabtrennung und die Zellentfernung zu ermöglichen.
  4. Einen Tag später spülen Sie die MEA-Chips gründlich mit deionisiertem Wasser, um Enzym-Detergenslösung und Restzellen zu entfernen und 1 ml deionisiertes Wasser zuzugeben. Saubere MEA-Chips können bei 4 ° C in entionisiertem Wasser gelagert werden.

9. Datenexport

  1. Öffnen Sie die MC_Data Tool Software, die mit der MEA eingerichtet ist.
  2. Klicken Sie auf 'Datei' → 'MC öffnenD '
  3. Klicken Sie auf 'Tools' → 'MCD in ABF konvertieren' .
  4. Wählen Sie die Elektroden mit den besten Aufzeichnungssignalen aus, die für die Analyse exportiert werden sollen. Wählen Sie das Verzeichnis aus, in dem die exportierten Dateien gespeichert werden sollen, und klicken Sie auf "Speichern". Der Exportvorgang kann je nach Anzahl der exportierten Elektroden und der Gesamtgröße der Aufzeichnungsdateien mehrere Minuten dauern.

10. Datenanalyse

  1. Laden und installieren Sie ein elektrophysiologisches Datenerfassungs- und Analyseprogramm ( zB pClamp). Sobald sie fertig sind, starten Sie die Analysesoftware ( zB Clampfit).
  2. RR-Intervallberechnung (Abbildung 5).
    1. Platzieren Sie zwei vertikale Cursor, um die Region von Interesse auf der Spur zu definieren. Wählen Sie 'Ereigniserkennung' → 'Schwellensuche'. Der horizontale Cursor sollte alle Ereignisse, die quantifiziert werden müssen, kreuzen, wie in Abbildung 5A gezeigt .
    2. Klicken &# 39; OK 'und dann' Akzeptiere die ganze Kategorie '. Die Software sucht dann die Trace für alle passenden Events. Blaue Markierungen werden über den Ereignissen platziert.
    3. Passen Sie die Empfindlichkeit der automatischen Auswahl an, indem Sie die Parameter im Hauptereigniserkennungsfenster einstellen.
    4. Sobald alle Ereignisse automatisch identifiziert wurden, gehen Sie zum Ergebnisfenster (Fenster → Ergebnisse) und kopieren Sie die Spalte "Intervent Interval", die die Frequenzdaten enthält (Abbildung 5B ).
  3. QT Intervallberechnung (Abbildungen 6-9):
    1. Legen Sie einen Cursor direkt vor und eins nach einem einzelnen FP in den stationären Zustand. Wählen Sie 'Ereigniserkennung' → 'Vorlage erstellen' (Abbildung 6 ) .
    2. Prüfen Sie, ob das FP korrekt identifiziert ist, und klicken Sie auf "Hinzufügen". Die Vorlage wird in die Unterseite verschoben.
    3. Speichern Sie die Vorlage als '.atf'Datei. Auf diese Weise wurde eine Vorlagenspur erstellt, die während der gesamten Aufzeichnung von der Software durchsucht wird (Abbildung 7 ). Erstellen Sie eine Vorlage für jede Bedingung, da ein Arzneimittel-Effekt die Form des FP verändern könnte. Falls nötig, filtriere die Spur etwas, um maximal 10.000 Punkte innerhalb der beiden Cursor einzuschließen.
    4. Sobald die Vorlage mit der Erweiterung '.atf' gespeichert wurde, wählen Sie 'Event Detection' → 'Template Search' und laden Sie die Vorlage.
    5. Passen Sie die "Vorlagen-Match-Schwelle" an, um das gesamte FP im gewählten Intervall korrekt zu identifizieren.
    6. Sobald alle Ereignisse korrekt identifiziert wurden, speichern Sie sie in einer neuen '.abf'-Datei.
  4. Öffnen Sie die Datei mit Analysesoftware und berechnen Sie automatisch die 'Time of Peak' sowohl für die Q / R- als auch die T-Peaks ( Abb. 8, 9 ). Wenn Spuren sehr laut sind, wenden Sie einen Filter an. Berechnen Sie das QT-Intervall durch Subtraktion derQ / R-Wert aus dem T-Wert in einem Spreadsheet-Editor der Wahl.

Representative Results

Einen Tag nach der Dissoziation und dem Plattieren wird die Schicht von hPSC-CMs als dichter und weißer Film sichtbar, der die Mitte der MEA-Kammer bedeckt (Abbildung 3A ). Nach dem Entfernen des Rings ( Fig. 3B )   Die Schicht sollte an Ort und Stelle bleiben und die Inspektion auf einem Lichtmikroskop zeigt die MEA-Elektroden, die von der (kontrahierenden) hPSC-CM-Schicht bedeckt sind (Abbildung 3C ). Wegen der physikalischen und elektrischen Kopplung der Zellen wird nur eine Elektrode (goldene Elektrode) zur Analyse verwendet.

Alternativ können diese bei der Arbeit mit 3D-Strukturen, wie Embryoidkörpern oder Mikrotissen, so plattiert und physikalisch entkoppelt werden. Sichtkontrolle am Mikroskop konnte keine physikalische Verbindung zwischen den Clustern und nicht synchronisierten R-Wellen bei MEAs bestätigen keine elektrische Kopplung bestätigen. In diesem cAse können mehrere unabhängige Elektroden analysiert werden.

Typische Aufzeichnungen von FP-Spuren sind in Abbildung 4 dargestellt. Insbesondere kann eine gute Qualitätsspur durch die Anwesenheit eines klaren Peaks entsprechend dem Na + -Einstrom und der Membrandepolarisation (R / Q-Peak), einer klaren Repolarisierungsphase entsprechend dem K + -Efflux (T-Peak) und einem hohen Pegel definiert werden Signal-Rausch-Verhältnis ( Abbildung 4A , links: Noten-Y-Achsen-Skala und Abbildung 4B ). Schlechte Qualitätsspuren (Abbildung 4A , Mitte) können das Ergebnis des Ausfalls von hPSC-CMs sein, die an der MEA-Platte oder an einer schwachen hydraulischen Aktivität von hPSC-CM angebracht werden können. Warten 1-3 Tage für eine bessere Befestigung kann das Signal verbessern; Wenn jedoch keine Signalverbesserung sichtbar ist, wird diese MEA aus Experimenten empfohlen. Lärmige Spuren (Abbildung 4A , rechts) können nach der Filterung analysiert werden.

5A, 5B ). Innerhalb des Zeitintervalls, das durch die vertikalen Cursor definiert ist, sollten blaue Markierungen, die jedem Peak entsprechen, vorhanden sein. Falls das Programm keinen oder mehrere Peaks identifiziert, versuchen Sie, den horizontalen Cursor zu bewegen und die Analyse erneut auszuführen oder die Erkennungseinstellungen anzupassen. Ebenso kann eine erfolgreiche Analyse des QT-Intervalls durch visuelle Inspektion des Bildschirms mit FP-Erkennung identifiziert werden (Abbildung 7 ). Innerhalb des Zeitintervalls, das durch die vertikalen Cursor definiert ist, sollten blaue Markierungen entsprechend jeder FP-Erfassung vorhanden sein. Falls das Programm kein oder mehrere FPs identifiziert, versuchen Sie, die FP-Vorlage neu zu definieren (Abbildung 6 ) oder die Erkennungseinstellungen anzupassen und die Analyse erneut auszuführen.

Extrahierte individuelle FP-Spuren oder deren Durchschnitt ( FigurE 8) können zum Erhalten von QT-Intervallwerten mit spezifischen Einstellungen wie in Abbildung 9 verwendet werden. Die Analyse der QT-RR-Beziehung ist ratsam und in krankhaften und WT-hPSC-Linien sinnvoll (Abbildung 10A ) und die Notwendigkeit und / oder die Wirkung von QT-Intervall-Korrekturen zu bewerten (Abbildung 10B-10D ). HPSC-CMs, die LQTS-verursachende Mutationen tragen, haben im Vergleich zu WT-Kontrollen verlängerte QT-Intervalle (Abbildung 11A ). Die Behandlung von hPSC-CMs mit einem hERG-Blocker führt zu einer QT-Intervallverlängerung (Abbildung 11B ); Umgekehrt führt die Behandlung mit einem hERG-Aktivator zu einer Verkürzung des QT-Intervalls (Abbildung 11C ). Schließlich sollte die Behandlung mit Medikamenten, die die Schlagfrequenz von hPSC-CMs beeinflussen, als eine Veränderung im RR-Intervall sichtbar sein (Abbildung 11D , RR-Intervallverkürzung).

Abbildung 1 />
Abbildung 1: Sterilisation und Beschichtung von MEA-Chips. ( A ) Schema, das den Sterilisationsvorgang darstellt, einschließlich des Platzierens des MEA-Chips in eine autoklavierbare Glas-Petrischale, Umwickeln in Aluminiumfolie, Dämpfen für 6 min und UV-Belichten für 30 min. ( B ) Oberseite (linke Tafel) und seitliche (mittlere Tafel) Ansichten des kundenspezifischen PTFE Ringes; Der Ring hat einen Außendurchmesser von 1,2 cm, darunter 4 Klappen, die seine Positionierung in der Mitte des MEA-Chips ermöglichen und der Innendurchmesser 0,4 cm (rechte Tafel) ist. ( C ) Schematische Darstellung der Vorbereitung des MEA-Chips, einschließlich des Platzierens des Chips in einer Standard-Plastik-Petrischale, Zugabe von 8 ml entionisiertem Wasser außerhalb der MEA-Kammer, Platzieren des PTFE-Rings in der Mitte der Kammer und Beschichten der Elektrodenanordnung mit Fibronektin . Nach der Inkubationszeit wird Fibronektin entfernt und durch Kulturmedium ersetzt.T = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Dissoziation und Beschichtung von hPSC-CMs. Schematische Darstellung der Prozesse der hPSC-CMs enzymatische Dissoziation, Zentrifugation, Resuspension und Plattierung auf der Mitte der MEA-Kammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: MEA-Chips mit hPSC-CM-Schicht. ( A ) Top-Ansichten von MEA-Chip mit dem Ring und der Schicht von hPSC-CMs. ( B ) Seitenansicht des MEA-Chips nach Ringentfernung ( C ) Helle Feldbild der hPSC-CMs-Schicht auf dem Mikro-Elektrodenanordnung; 4fache Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: MEA Aufnahme von hPSC-CMs. ( A ) Repräsentative Spuren, die mit der MEA aufgezeichnet wurden, zeigen eine gute Qualitätsspur mit R / Q- und T-Peaks deutlich sichtbar mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis (links), eine schlechte Qualitätsspur ohne deutlich sichtbare R / Q- und T-Peaks (Mitte), Und eine laute Spur mit R / Q- und T-Peaks deutlich sichtbar aber mit niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis (rechts). ( B ) Repräsentative Beispiele für qualitativ hochwertige FP-Spuren mit unterschiedlichen Morphologien, die bei MEA-Experimenten mit hPSC-CMs aufgezeichnet werden können. Der schattierte Bereich repräsentiert das während der Analyse gemessene QT-Intervall. Da die FP bei MEA dem ersten Derivat ähneltE des Aktionspotentials 28 haben wir das Integral der FP-Trace, dargestellt als rote Punktlinie, als theoretische Demonstration einer T-Wellenwahl nahe einer vollständigen Aktionspotential-Repolarisation berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: RR-Intervallberechnung. ( A ) Beispiel für die RR-Intervallanalyse mit automatischer Peak Detection (Top) und Datenextraktion (unten) mit der Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien). Vertikale Cursor identifizieren das Intervallintervall und der horizontale Cursor überquert alle Ereignisse, die erkannt und durch blaue Markierungen identifiziert werden. ( B ) Die vergrößerte Spalte zeigt die extrahierten Daten zur Berechnung des RR-Intervalls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6
Abbildung 6: Erstellung der FP-Vorlage. Beispiel für die Vorlagenauswahl unter Verwendung von vertikalen Cursoren, die vor und nach einem einzelnen FP platziert wurden. Diese Vorlage wird für die automatische Identifikation von FP verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7
Abbildung 7: FP-Vorlage Automatische Identifikation. Beispiel für die Template-Suche während eines Intervalls, das durch zwei vertikale Cursor definiert ist. Alle erkannten Ereignisse werden durch blaue Markierungen identifiziert und sind automatischY überlagert in der Einlage. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 8
Abbildung 8: Quantifizierung der FP-Parameter. Analyse der gespeicherten Ereignisse, wobei der R-Peak manuell innerhalb der ersten beiden Cursor und der T-Peak manuell identifiziert wurde innerhalb der letzten beiden Cursor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 9
Abbildung 9: Analysefenster. Im Statistikfenster verwendete Parameter zur Erkennung von R-Peak. Für die Erkennung der T-Peak, ändern Sie Cursor und (falls nötig) poLarity Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 10
Abbildung 10: QT-RR-Beziehung. ( A ) Beispiel für eine unterschiedliche Beziehung zwischen QT- und RR-Intervallen zwischen WT (LQT1 corr ) und Long QT-Syndrom Typ 1 (LQT1 R190Q ) hPSC-CMs. Schattierte Bereiche zeigen, dass die gleiche Verschiebung im RR-Intervall eine größere Verschiebung im QT-Intervall der LQT1-erkrankten Linie erzeugt, was wahrscheinlich eine erhöhte Arrhythmie-Anfälligkeit aufweist. ( B ) Beziehung zwischen unkorrigierten QT- und RR-Intervallen, gemessen bei MEA in CMs aus 7 verschiedenen hPSC-Linien. Die Wirkung der QT-Korrektur auf die Formeln von Bazett ( C ) oder Fridericia ( D ) wird als Veränderung der Steigung des QT-RR in gezeigt und sichtbar Tervalbeziehung Figuren aus Referenz 30 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 11
Abbildung 11: Disease- oder Drug-induzierte QT- und RR-Intervallvariationen. ( A ) Beispiel für eine QT-Intervallverlängerung in hPSC-CM, abgeleitet von einem Patienten, der eine Long-QT-Syndrom (LQTS) -Mutation trägt, verglichen mit seiner isogenen WT-Kontrolle. ( B ) Beispiel für eine QT-Intervallverlängerung in hPSC-CM nach pharmakologischem hERG-Block. ( C ) QT-Intervallverkürzung bei Behandlung mit zunehmenden Dosen von hERG-Aktivator. Pfeil gibt die Richtung der Verkürzung an. ( D ) Beispiel einer drogeninduzierten RR-Intervallverkürzung Panel (C) wurde aus der Referenz angepasst> 30 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Low-Insulin, BSA, Polyvinylalkohol, essentielle Lipide (LI-BPEL) Medium
Komponente Menge für 100 mL
IMDM 43 ml
F12 43 ml
Ascorbinsäure-2-phosphat (5 mg / ml in destilliertem Wasser) 1 mL
Zellkulturergänzung (direkter Ersatz für L-Glutamin) 1 mL
Penicillin / Streptomycin 0,5ML
Phenolrot 1 mg
Proteinfreies Hybridom Medium-II (PFHMII) 5 ml
BSA (10% wt / vol im IMDM) 2,5 ml
PVA (5% Gew./Vol. In destilliertem Wasser) 2,5 ml
Chemisch definiertes Lipidkonzentrat (CDLC) 1 mL
Insulin-Transferrin-Selen-Ethanolamin (ITS-X) 100X 0,1 ml
Α-Monothioglycerin (13 & mgr; l in 1 ml IMDM) 0,3 ml
Die Reagenzien mischen, mit einem 0,22 μm Porenfilter filtrieren und das Medium bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen aufbewahren.

Tabelle 1: Li-BPEL-Mittelzusammensetzung.

Discussion

Dieses Protokoll zeigt, wie man hPSC-CMs zur Messung ihrer FP mit MEAs dissoziiert und vorbereitet. HPSC-CMs zeigen in der Regel eine spontane elektrische Aktivität, die als FP gemessen werden kann und sinnvolle Daten in Bezug auf Schlagfrequenz, QT-Intervalldauer und Arrhythmieereignisse liefern kann.

Die Dissoziation von 2D-kardialen differenzierten Kulturen wird für die Wiederherstellung einer Schlagschicht auf der MEA benötigt und stellt einen kritischen Schritt dar. Mechanische Beanspruchung durch wiederholtes Pipettieren und / oder aggressive Dissoziationsenzymbehandlungen kann zu einer hohen Zellmortalität, einem Versagen an der MEA-Platte und einem Mangel an spontaner elektrischer Aktivität führen. Dieses Protokoll wurde für Monolayer-Kulturen optimiert. Jedoch kann ein ähnlicher Ansatz für dreidimensionale (3D) Kulturen ( z. B. embryoidale Körper oder EBs) mit geringfügigen Modifikationen verwendet werden, wie das Sammeln der EBs, gefolgt von PBS-Waschung und längerer Inkubationszeit mit dem dissoziierenden Enzym. EinführenIn beiden 2D- und 3D-differenzierten Kulturen, je älter die differenzierten Zellen, könnte die längere Inkubationszeit erforderlich sein, um die Zellen aufgrund einer erhöhten extrazellulären Matrixablagerung zu lösen.

Das hier beschriebene Protokoll zur Quantifizierung von FP-Parametern kann zur Erzeugung von Dosis-Wirkungs-Kurven für kardioaktive Medikamente verwendet werden. Wie von Cavero et al. 31 , könnte die Ausgangskonzentration eines Arzneimittels das Ergebnis einer MEA-Messung stark beeinflussen. Um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu verbessern, empfehlen wir folgendes: 1) Im Falle von irreversiblen Aktivatoren / Blockern verwenden Sie relativ große Volumina von Medium, das das zu testende Arzneimittel enthält. Im Detail entfernen Sie 10-50% des mittleren Volumens aus dem MEA-Chip und fügen ein gleiches Volumen an Medium hinzu, in dem das Arzneimittel zuvor in der geeigneten Konzentration gelöst wurde. In diesem Fall ist es für die Berechnung der endgültigen Arzneimittelkonzentration von entscheidender BedeutungDie Konzentrationsänderung nach der mittleren Entfernung 2) Im Falle von reversiblen Aktivatoren / Blockern, fügen Sie 10 μl jeder Medikamentendosis aus einer 100X-Stammlösung hinzu.

Die Mehrheit der kardialen Differenzierungsprotokolle führt zu einer variablen Mischpopulation von nodalartigen, atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten, wobei der ventrikuläre Typ am meisten vertreten ist. Dies könnte eine Beschränkung bei der Modellierung von Herzkrankheiten darstellen, die einen spezifischen Kardiomyozyten-Subtyp oder Medikamente beeinflussen, die auf kardiale Subtyp-spezifische Ionenkanäle wirken. Obwohl mehrere Studien die Bedingungen optimiert haben, um eine kontrolliertere Spezifikation während der kardialen Differenzierung 3 , 5 , 37 , 38 zu lenken, wird ihre breitere Anwendbarkeit noch untersucht.

Darüber hinaus ist die variable Effizienz der Differenzierung (in verschiedenen Experimenten und in diFinalen hPSC-Linien) 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 beobachtet werden. Kardiomyozyten-Anreicherungsstrategien auf der Basis der Oberflächenprotein-Expression 35 , 45 (durch floreszenzunterstützte Zellsortierung oder durch Magnet-Wulst-Selektion 46 , 47 ) und metabolische Selektion 44 , 48 können gültige Strategien darstellen, die auf irgendeine (genetisch modifizierte oder Unmodifizierte) hPSC-line Vorplattierung der hPSC-CMs, um das elektrische Signal zu verbessern.

Obwohl hPSC-CMs im Vergleich zu menschlichen erwachsenen Kardiomyozyten 4 , 49 notorisch unreif sind, haben sie sich in r als wertvoll erwiesen(Z. B. bei Kanalopathien) 19 , 20 , 50 und medikamenteninduzierte Reaktionen ( z. B. Herz-Ionen-Kanal-Blocker) 4 , 51 . Darüber hinaus sind unreife Zellen leichter zu dissoziieren und sich besser als erwachsene Kardiomyozyten nach der Dissoziation und Plattierung 44 zu erholen, daher kann die HPSC-CM-Unreife in dieser Hinsicht als Vorteil belohnt werden. Um aber zB rekapitulieren zu können. Späten Beginn Herzkrankheiten und zuverlässig zu reproduzieren Droge Reaktionen von erwachsenen Kardiomyozyten, ein reifer mechanischer, metabolischer und elektrischer hPSC-CM Zustand sollte erhalten werden. Verfahren zur Reifung dieser Zellen umfassen verlängerte Zeit in Kultur 52 , mechanische Belastung 53 , elektrische Stimulation 54 , Zugabe von kleinenMoleküle 55 , 3D-Kultur 56 , Co-Kultur mit anderen Zelltypen 57 und sogar eine Kombination dieser Ansätze 58 ; Bisher hat keiner dieser Ansätze zu einem erwachsenen Phänotyp geführt.

Als Teil der Unreifeigenschaften zeigen hPSC-CMs elektrische Automatik. Hier werden Details zur genauen Quantifizierung von QT- und RR-Intervallen gegeben. Eine Einschränkung der Messung der spontanen elektrischen Aktivität ist, dass ein Vergleich von QT-Intervallen schwierig sein kann, wenn hPSC-CMs unterschiedliche Schlägerefrequenzen aufweisen. In diesem Fall können die Formeln von Bazett oder Fridericia verwendet werden, um das QT-Intervall für die Frequenz zu korrigieren. Jedoch, wie bereits berichtet 30 , empfehlen wir dringend, eine Major-Axis-Regressionsanalyse durchzuführen, indem wir das QT-Intervall gegenüber dem RR-Intervall sowohl für rohe als auch für korrigierte Daten zeichnen, um jegliche mögliche Vorspannung aufgrund der Korrekturmethode selbst auszuschließen.

Das hier vorgestellte Protokoll, zusammen mit den zuvor beschriebenen Methoden 59 , 60 hilft bei der Standardisierung der Prozeduren und der Analyse von hPSC-CM FPs, verbessert die Datenreproduzierbarkeit und ermöglicht einen besseren Vergleich von interlaboralen Ergebnissen.

Disclosures

CLM ist Mitbegründer und Berater von Pluriomics bv. Ein Teil der Publikationskosten wurde von Multi Channel Systems abgedeckt.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch folgende Stipendien unterstützt: CVON (HUSTCARE): die niederländische CardioVaskuläre Forschungsinitiative (die niederländische Herzstiftung, der niederländische Verband der Universitätsmedizinischen Zentren, die niederländische Organisation für Gesundheitsforschung und -entwicklung sowie die Königliche Niederländische Akademie der Wissenschaften); Der Europäische Forschungsrat (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC). Wir danken E. Giacomelli (LUMC) für Hilfe bei hPSC Herzdifferenzierung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological safety cabinet/laminar flow-hood Cleanair
MEA2100 in vitro recording system Multi Channel Systems
CO2 cell-culture incubator Sanyo MCO-15A
Centrifuge Hitachi himac-CT6EL
Leica stereomicroscope Leica Microsystems MS5
Handheld pipetman (P-10 (10 μL), P-200 (200 μL), P-1000 (1,000 μL)) Gilson International
Filter tips (10 μL, 200μL, 1,000μL) Corning 4807 (10 μL), 4810 (200μL), 4809 (1000μL)
Disposable bottle top filter (0.22 μm pore size) Millipore SCGVU02RE
Sterile plastic pipette Greiner Bio-One 606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL)
Tweezers Dumont
Autoclavable Petri dishes VWR/ Duran Group 391-0860
MEA chip Multi Channel Systems MEA200/30iR-Ti-gr
Phosphate-buffered Saline (PBS) calcium, magnesium Thermo Fisher Scientific 14040-091
Phosphate-Buffered Saline (PBS) no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190-169
Human recombinant fibronectin Tebu-Bio J64560
Custom-made polytetrafluoroethylene (PTFE) MEA rings LUMC: department of Instrument Development
Dissociation enzyme - TrypLE Select 1x Thermo Fisher Scientific 12563-029
Tergazyme enzyme detergent Sigma-Aldrich Z273287-1EA
Distilled Water Thermo Fisher Scientific 15230-089
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for LI-BPEL medium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Thermo Fisher Scientific 21056-023
F12 nutrient mixture (Ham) Thermo Fisher Scientific 31765-027
Ascorbic Acid 2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050-038
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070-063
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Protein-free Hybridoma Medium-II (PFHMII) Thermo Fisher Scientific 12040-077
Bovine Serum Albumin (BSA) Bovogen Biologicals Australia BSAS05
Poly(Vinyl Alcohol) (PVA) Sigma-Aldrich P8136
Chemically-defined Lipid Concentrate (CDLC) Thermo Fisher Scientific 11905-031
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X) 100x Thermo Fisher Scientific 51599-056
α-Monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
Name Company Software version Comments
MC_Rack Multi Channel Systems 4.6.2 Alternatively, data can be recorded using Cardio2D or MC_Experimenter (MultiChannel Systems)
TCX Control Multi Channel Systems 1.3.4
MEA Select Multi Channel Systems 1.3.0
MC_Data Tool Multi Channel Systems 2.6.15 Alternatively, Multi Channel Data Manager (MultiChannel Systems) can be used when custom data export is required (HDF5, EDF, etc.)
Clampfit Molecular Devices 7.0.0 Used in step 10.1 for analyzing, graphing, and formatting of all of data. To use Clampfit, download and install the electrophysiology data acquisition and pClam (latest version, 10.7.0), available on the Molecular Devices Website. Once complete, launch the software Clampfit. Alternatively, data can be analysed using Cardio2D (MultiChannel Systems) or MatLab custom code.

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References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, (5), 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Birket, M. J., et al. Expansion and patterning of cardiovascular progenitors derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33, (9), 970-979 (2015).
  4. Denning, C., et al. Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform. Biochim Biophys Acta. 1863, (7 Pt B), 1728-1748 (2016).
  5. Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, (4), 394-410 (2015).
  6. Lewandowski, J., Kolanowski, T. J., Kurpisz, M. Techniques for the induction of human pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. J Tissue Eng Regen Med. (2016).
  7. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111, (3), 344-358 (2012).
  8. Davies, M. P., An, R. H., Doevendans, P., Kubalak, S., Chien, K. R., Kass, R. S. Developmental changes in ionic channel activity in the embryonic murine heart. Circ Res. 78, (1), 15-25 (1996).
  9. Bellin, M., et al. Isogenic human pluripotent stem cell pairs reveal the role of a KCNH2 mutation in long-QT syndrome. EMBO J. 32, (24), 3161-3175 (2013).
  10. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363, (15), 1397-1409 (2010).
  11. Ma, D., et al. Modeling type 3 long QT syndrome with cardiomyocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells. Int J Cardiol. 168, (6), 5277-5286 (2013).
  12. Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471, (7337), 230-U120 (2011).
  13. Limpitikul, W. B., et al. A Precision Medicine Approach to the Rescue of Function on Malignant Calmodulinopathic Long QT Syndrome. Circ Res. (2016).
  14. Liang, P., et al. Patient-Specific and Genome-Edited Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Elucidate Single-Cell Phenotype of Brugada Syndrome. J Am Coll Cardiol. 68, (19), 2086-2096 (2016).
  15. Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Mol Med. 4, (3), 180-191 (2012).
  16. Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. J Cell Mol Med. 16, (3), 468-482 (2012).
  17. Bellin, M., Mummery, C. L. Inherited heart disease - what can we expect from the second decade of human iPS cell research. FEBS Lett. 590, (15), 2482-2493 (2016).
  18. Sallam, K., Li, Y., Sager, P. T., Houser, S. R., Wu, J. C. Finding the rhythm of sudden cardiac death: new opportunities using induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 116, (12), 1989-2004 (2015).
  19. Sinnecker, D., Goedel, A., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: a versatile tool for arrhythmia research. Circ Res. 112, (6), 961-968 (2013).
  20. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nat Rev Mol Cell Biol. 13, (11), 713-726 (2012).
  21. Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacol Ther. 143, (2), 246-252 (2014).
  22. Terrenoire, C., et al. Induced pluripotent stem cells used to reveal drug actions in a long QT syndrome family with complex genetics. J Gen Physiol. 141, (1), 61-72 (2013).
  23. Abi-Gerges, N., et al. Assessment of extracellular field potential and Ca2+ transient signals for early QT/pro-arrhythmia detection using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Pharmacol Toxicol Methods. 83, 1-15 (2016).
  24. Del Alamo, J. C., et al. High throughput physiological screening of iPSC-derived cardiomyocytes for drug development. Biochim Biophys Acta. 1863, (7 Pt B), 1717-1727 (2016).
  25. Blinova, K., et al. Comprehensive Translational Assessment of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes for Evaluating Drug-Induced Arrhythmias. Toxicol Sci. (2016).
  26. Nerbonne, J. M. Studying cardiac arrhythmias in the mouse--a reasonable model for probing mechanisms? Trends Cardiovasc Med. 14, (3), 83-93 (2004).
  27. Halbach, M., Egert, U., Hescheler, J., Banach, K. Estimation of action potential changes from field potential recordings in multicellular mouse cardiac myocyte cultures. Cell Physiol Biochem. 13, (5), 271-284 (2003).
  28. Tertoolen, L. G., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochem Biophys Res Commun. (2017).
  29. Rajamohan, D., et al. Automated Electrophysiological and Pharmacological Evaluation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, (6), 439-452 (2016).
  30. Sala, L., et al. A new hERG allosteric modulator rescues genetic and drug-induced long-QT syndrome phenotypes in cardiomyocytes from isogenic pairs of patient induced pluripotent stem cells. EMBO Mol Med. 8, (9), 1065-1081 (2016).
  31. Cavero, I., Guillon, J. M., Ballet, V., Clements, M., Gerbeau, J. F., Holzgrefe, H. Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay (CiPA): Pending issues for successful validation and implementation. J Pharmacol Toxicol Methods. (2016).
  32. Sala, L., Bellin, M., Mummery, C. L. Integrating cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in safety pharmacology: has the time come? Br J Pharmacol. (2016).
  33. Chen, I. Y., Matsa, E., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells: at the heart of cardiovascular precision medicine. Nat Rev Cardiol. 13, (6), 333-349 (2016).
  34. Dambrot, C., et al. Strategies for rapidly mapping proviral integration sites and assessing cardiogenic potential of nascent human induced pluripotent stem cell clones. Exp Cell Res. 327, (2), 297-306 (2014).
  35. Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8, (12), 1037-1040 (2011).
  36. Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nat Protoc. 3, (5), 768-776 (2008).
  37. Karakikes, I., et al. Small molecule-mediated directed differentiation of human embryonic stem cells toward ventricular cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, (1), 18-31 (2014).
  38. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21, (4), 579-587 (2011).
  39. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, (21), 2733-2740 (2003).
  40. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, (3), 407-414 (2001).
  41. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, (2), 228-240 (2011).
  42. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, (9), 1125-1136 (2012).
  43. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8, (1), 162-175 (2013).
  44. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, (8), 855-860 (2014).
  45. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, (11), 1011-1018 (2011).
  46. Fuerstenau-Sharp, M., et al. Generation of highly purified human cardiomyocytes from peripheral blood mononuclear cell-derived induced pluripotent stem cells. PLoS One. 10, (5), e0126596 (2015).
  47. Schwach, V., Passier, R. Generation and purification of human stem cell-derived cardiomyocytes. Differentiation. 91, (4-5), 126-138 (2016).
  48. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12, (1), 127-137 (2013).
  49. Veerman, C. C., Kosmidis, G., Mummery, C. L., Casini, S., Verkerk, A. O., Bellin, M. Immaturity of human stem-cell-derived cardiomyocytes in culture: fatal flaw or soluble problem? Stem Cells Dev. 24, (9), 1035-1052 (2015).
  50. Karakikes, I., Ameen, M., Termglinchan, V., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: insights into molecular, cellular, and functional phenotypes. Circ Res. 117, (1), 80-88 (2015).
  51. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17, (3), 170-182 (2016).
  52. Otsuji, T. G., Minami, I., Kurose, Y., Yamauchi, K., Tada, M., Nakatsuji, N. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Res. 4, (3), 201-213 (2010).
  53. Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35, (9), 2798-2808 (2014).
  54. Lieu, D. K., et al. Mechanism-based facilitated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Arrhythm Electrophysiol. 6, (1), 191-201 (2013).
  55. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
  56. Mannhardt, I., et al. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. (2016).
  57. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19, (6), 783-795 (2010).
  58. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10, (8), 781-787 (2013).
  59. Clements, M. Multielectrode Array (MEA) Assay for Profiling Electrophysiological Drug Effects in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Curr Protoc Toxicol. 68, (22), 1-22 (2016).
  60. Harris, K. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte (hiPSC-CM) Multielectrode Array Assay for Preclinical Cardiac Electrophysiology Safety Screening. Curr Protoc Pharmacol. 71, 1-15 (2015).

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