Cuantificación de la Pigmentación Abdominal en

Genetics

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Summary

Este trabajo presenta un método para cuantificar de forma rápida y precisa la pigmentación abdominal de Drosophila melanogaster mediante el análisis de imágenes digitales . Este método agiliza los procedimientos entre la adquisición del fenotipo y el análisis de los datos e incluye el montaje de las muestras, la adquisición de imágenes, la extracción de valores de píxeles y la medición de rasgos.

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Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (124), e55732, doi:10.3791/55732 (2017).

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Abstract

La pigmentación es un rasgo morfológicamente simple pero altamente variable que a menudo tiene significación adaptativa. Ha servido extensamente como un modelo para entender el desarrollo y la evolución de fenotipos morfológicos. La pigmentación abdominal en Drosophila melanogaster ha sido particularmente útil, permitiendo a los investigadores identificar los loci que subyacen a las variaciones inter y intraespecíficas de la morfología. Hasta ahora, sin embargo, la pigmentación abdominal de D. melanogaster ha sido ampliamente ensayada cualitativamente, a través de la puntuación, más que cuantitativamente, lo que limita las formas de análisis estadístico que se pueden aplicar a los datos de pigmentación. Este trabajo describe una nueva metodología que permite la cuantificación de varios aspectos del patrón de pigmentación abdominal del adulto D. melanogaster . El protocolo incluye montaje de especímenes, captura de imágenes, extracción de datos y análisis. Todo el software utilizado para capturar imágenes y macros de características de análisisEscrito para el análisis de imágenes de código abierto. La ventaja de este enfoque es la capacidad de medir con precisión los rasgos de pigmentación usando una metodología que es altamente reproducible a través de diferentes sistemas de imagen. Aunque la técnica se ha utilizado para medir la variación en los patrones de pigmentación tergal de D. melanogaster adulto, la metodología es flexible y ampliamente aplicable a patrones de pigmentación en una miríada de organismos diferentes.

Introduction

La pigmentación muestra una enorme variación fenotípica entre especies, poblaciones e individuos, e incluso dentro de individuos durante la ontogenia 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Aunque hay una gran cantidad de estudios de pigmentación en una amplia variedad de animales, la pigmentación ha sido quizás mejor estudiada en Drosophila melanogaster , donde la potencia total de la genética molecular se ha utilizado para dilucidar los mecanismos de desarrollo y fisiológicos que regulan la pigmentación y cómo estos mecanismos evolucionan 1 , 6 . Mucho se sabe sobre los genes que regulan la síntesis bioquímica de pigmentos en D. melanogaster 7 , 8 y los genes que controlan el di temporal y espacialDistribución de esta biosíntesis 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Además, la cartografía genética ha identificado los loci genéticos subyacentes intra e interespecíficos diferencias en la pigmentación en D. melanogaster [ 14 , 15 , 16 , 17] . Las relaciones entre la pigmentación y rasgos pleiotrópicos, como el comportamiento 18 , 19 y la inmunidad 19 , 20 , también han sido explorados, al igual que la importancia adaptativa de los patrones de pigmentación [ 15 , 21 , 22] . Como tal, la pigmentación en D. melanogaster ha surgido como un poderoso pero simple mPara el desarrollo y la evolución de fenotipos complejos.

La pigmentación en adultos de D. melanogaster se caracteriza por distintos patrones de melanización en todo el cuerpo, particularmente en las alas y el tórax dorsal y el abdomen. Es la pigmentación de cada placa cuticular (tergita) en el abdomen dorsal, sin embargo, que ha recibido la mayor atención de la investigación. Hay una variación considerable en esta pigmentación ( Figura 1A- F ), debido a la genética 17 , 23 y el medio ambiente 24 , 25 factores. La cutícula de un tergito abdominal está formada por compartimentos de desarrollo anteriores y posteriores ( Figura 1G ), cada uno de los cuales puede subdividirse dependiendo de la pigmentación y la ornamentación 26 . El compartimiento anterior incluye seis cutículas(A1-a6), y el compartimento posterior incluye tres (p1-p3) ( Figura 1G ). De éstos, la cutícula p1, p2 y a1 se pliega típicamente debajo del tergite en abdómenes no estirados de modo que estén ocultados. La cutícula confiablemente visible se caracteriza por una banda de pigmentación pesada, denominada aquí "banda pigmentaria", compuesta por tipos de cutícula a4 (peludos con cerdas moderadas) y a5 (peludos con cerdas grandes), con el borde posterior de la banda Más intensamente pigmentado que el borde anterior ( Figura 1G ). Anterior a esta banda es una región de cutícula peluda ligeramente pigmentada, que tiene cerdas posteriores (a3) ​​pero no anterior (a2). La variación en la pigmentación entre las moscas se observa tanto en la intensidad de la pigmentación como en el ancho de la banda de pigmento. En general, la variación es mayor en los segmentos más posteriores (segmentos abdominales 5, 6 y 7) y es más baja en los segmentos más3 y 4) 24 . Además, hay un dimorfismo sexual en la pigmentación de D. melanogaster , con los varones que generalmente tienen tergitos abdominales quinto y sexto completamente pigmentados ( Figura 4C ).

En la mayoría de los estudios de pigmentación abdominal en D. melanogaster , la pigmentación ha sido tratada como un rasgo categórico u ordinario, con el patrón medido cualitativamente 27 , 28 , 29 o semi-cuantitativamente en una escala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Estos métodos sufren inevitablemente de una falta de precisión, y porque se basan en la evaluación subjetiva de la pigmentación, es difícil comparar los datos entre los estudios. Varios autores han cuantificado las dimensiones espaciales de la pigmentación 38 , 39 , la intensidad de la pigmentación de una determinada cutícula tipo 23 , 25 , 39 , 40 , o la intensidad media de la pigmentación a través del tergito abdominal en su conjunto 41 , 42 , 43 . Sin embargo, estos métodos de cuantificación no miden simultáneamente la intensidad y la distribución espacial de la pigmentación abdominal y por lo tanto no capturan los matices de cómo la pigmentación varía a través del abdTergite ominal Además, varios de estos métodos de cuantificación 38 , 41 , 42 , 43 requieren la disección y el montaje de la cutícula abdominal. Esto es tanto tiempo y destruye la muestra, por lo que no está disponible para los análisis morfológicos adicionales. A medida que se profundice la comprensión del desarrollo y la evolución de la pigmentación abdominal, se necesitarán herramientas más sofisticadas para medir con rapidez y precisión tanto la distribución espacial como la intensidad de la pigmentación.

El objetivo general de este método es utilizar el análisis de imágenes digitales para obtener una medida replicable y más precisa de la pigmentación abdominal en D. melanogaster . La metodología incluye tres etapas. En primer lugar, la mosca del adulto no se monta destructivamente, y se toma una imagen digital del abdomen dorsal. Segundo, usando una macro ImageJ, el usuarioDefine una franja antero-posterior de píxeles que se extiende desde la parte anterior de la cutícula a2 hasta la parte posterior de la cutícula a5 (caja verde, Figura 1G ) en el tercer y cuarto segmentos abdominales. El valor medio del píxel a través del ancho de esta tira se extrae entonces a lo largo de su eje largo, generando un perfil que captura la distribución espacial y la intensidad de la pigmentación a medida que cambia de la anterior a la posterior del tergito. En tercer lugar, un script R se utiliza para describir matemáticamente el perfil de pigmentación usando una spline cúbica. La secuencia R utiliza entonces la spline y su primera y segunda derivada para extraer el ancho de la cutícula a2-a5, el ancho de la banda de pigmento y los niveles máximo y mínimo de pigmentación. Por lo tanto, el método cuantifica tanto las características espaciales como la profundidad de la pigmentación abdominal.

Esta metodología cuantifica la pigmentación de los tercero y cuarto tergitos abdominales,Que han sido el foco de numerosos estudios anteriores 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , ya sea exclusivamente o en combinación con tergitos más posteriores. Aunque son menos variables que los tergitos quinto y sexto abdominal, los tercero y cuarto tergitos no están completamente pigmentados en varones, por lo que este protocolo puede aplicarse tanto a hombres como a mujeres. Sin embargo, como se muestra aquí, el protocolo se puede utilizar para medir la pigmentación en el quinto y sexto tergites abdominales en las mujeres. Además, modificaciones menores de los guiones utilizados para extraer las características del perfil de pigmentación deberían permitir que el método se utilice para cuantificar la variación en la pigmentación en una amplia variedad de otrosMicroorganismos.

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Protocol

1. Montaje de muestras

NOTA: Guarde las moscas muertas en etanol al 70% en agua antes de tomar imágenes.

  1. Vierta 10 ml de agar al 1,25% disuelto en agua hirviendo en una placa de Petri de 60 mm x 15 mm y déjela reposar.
  2. Bajo un microscopio de disección, utilice un par de pinzas de punta fina para hacer una ranura de ~ 20 mm de largo, 2 mm de ancho, 1 mm de profundidad en la superficie del gel. Usando fórceps finos, inserte el lado ventral de una mosca adulta en el surco, con el lado dorsal de la mosca sobresaliendo por encima del gel.
    NOTA: La holgura del gel permite un fácil reposicionamiento sin dañar el espécimen. La misma ranura se puede utilizar para múltiples especímenes, aunque se ensuciará, se desintegra e inutilizará con el tiempo. El usuario puede entonces hacer otra ranura en el mismo gel. Cada placa se puede utilizar para imagen ~ 200 moscas.
  3. Cubra completamente el espécimen en etanol al 70% en agua para reducir cualquier reflejo de luz de la cutícula cerosa y para evitar el daño del ala durManipulación de muestras.

2. Configuración del Microscopio

NOTA: Las imágenes se obtienen utilizando un alcance de disección, una base de luz transmitida, una cámara digital y una fuente de luz fría de cuello de cisne conectada a un ordenador que ejecuta un software de control de adquisición de imágenes. Las instrucciones de software son específicas de Micro-Manager v1.4.20 44 , que es un software de código abierto que incorpora ImageJ 45 .

  1. Encienda el microscopio, la cámara digital, la fuente de luz fría de doble cuello de cisne y la computadora.
  2. Ejecute el software de captura de imágenes para abrir una ventana de Micro Manager y una ventana de ImageJ. En la ventana de ImageJ haga clic en "Image"> "Type"> "8-Bit" para establecer todas las imágenes como de 8 bits. Haga clic en "live" en la ventana Micro-Manager para abrir una ventana "Snap / Live" que muestra una vista previa en tiempo real de la cámara.
    1. Maximizar el tamaño de la ventana "Snap / Live" si neNecesario Seleccione "Grayscale" en el menú desplegable "Display mode" en la pestaña "Contrast" de la ventana Micro-Manager.
  3. Encienda la fuente de luz fría a su máxima intensidad y coloque las puntas de cada cuello de cisne aproximadamente a 120 mm de la platina, una a la izquierda y otra a la derecha.
    NOTA: Los usuarios también pueden usar un iluminador anular, aunque esto puede generar un anillo de luz reflejada alrededor del abdomen de la mosca.
  4. Ajuste manualmente la ampliación del microscopio a 60X para que el campo de visión capture un área de aproximadamente 3 mm de diámetro en el escenario.
  5. Coloque un micrómetro de etapa de 2 mm en el escenario (cambiando el fondo a blanco si es necesario). Mientras mira la vista previa en vivo, enfoque el micrómetro de la etapa y ajuste la exposición en la ventana Micro-Manager introduciendo el tiempo de exposición en ms en el cuadro "Exposure".
  6. Para calibrar espacialmente la cámara, seleccione la herramienta "recta" en tLa ventana de ImageJ y dibuja una línea de la longitud del micrómetro de la etapa. En la ventana ImageJ, haga clic en "Analyze"> "Set Scale" para abrir la ventana "Set Scale", introduzca la longitud del micrómetro en μm en la casilla "Distancia conocida" e introduzca "μm" en "Unidad de longitud" caja.
    1. Observe que la ventana "Set Scale" muestra la escala en "pixels / μm". Anote la escala y haga clic en "Aceptar".
  7. En la ventana "Snap / Live", haga clic en "Stop" y luego en "Snap" para capturar una imagen del micrómetro de la etapa.
  8. Guarde la imagen como un TIFF de escala de grises de 8 bits para garantizar la capacidad de calibrar espacialmente las imágenes de nuevo si es necesario. En la ventana ImageJ, haga clic en "Archivo"> ​​"Guardar como"> "Tiff ..." Especifique dónde guardar el archivo en el explorador de archivos, nombre el archivo y haga clic en "Guardar".
  9. Cambie el escenario a negro y coloqueUna placa de Petri que sostiene una mosca montada en agar (etapas 1.1-1.2) en la etapa.
  10. Mire a través del microscopio y la posición de la mosca para asegurarse de que la línea media dorsal es recta con el fin de mejor ver el patrón de pigmentación. Mueva las alas y los apéndices para asegurarse de que la vista del abdomen no esté obstruida. Si la cutícula pigmentada (a2-a5) no es visible, apriete el abdomen lateralmente hasta que esté (aunque el abdomen de las moscas almacenadas en etanol al 70% en el agua se estire, por lo que normalmente no es necesario).
    NOTA: Al colocar la mosca, es posible que el usuario necesite usar una ampliación inferior (20X). La ampliación debe ser devuelta a 60X antes de proceder.
  11. Centrarse manualmente en el abdomen dorsal de la mosca. Ajuste manualmente las puntas de la fuente de luz para minimizar las sombras y la reflexión sobre el abdomen dorsal.
  12. Mientras mira la vista previa en vivo en la pantalla del ordenador y utiliza el histograma de valores de píxeles en la pestaña "Contraste" de la ventana Micro-Manager,Ajuste la exposición como se describe en el paso 2.4 para maximizar el rango de valores de píxeles de la imagen de vista previa.
  13. Quitar la mosca y la placa de Petri y reemplazarlos por un LED (salida espectral de 430-660 nm) conectado a un medidor de voltaje, centrado en el campo de visión en la misma posición que la mosca. Utilice el LED y el medidor de voltaje como un medidor de luz 46 y registre el voltaje generado por la luz que golpea el LED (~ 125 mV).
    NOTA: El LED y el medidor de voltaje se usan para asegurar que los niveles de luz sean constantes durante múltiples sesiones de imagen dentro de un solo experimento.
  14. Durante la duración del experimento, no cambie más la posición o intensidad de la fuente de luz, la ampliación del microscopio o la exposición de la cámara.

3. Imaging de especímenes

  1. Coloque una placa de Petri sosteniendo una mosca montada en agar (pasos 1.1-1.3) en la etapa de microscopio negro. Ajuste la posición de la mosca de modo que la tercera y la cuartaH los segmentos abdominales son visibles y la línea media dorsal está hacia arriba, como se describe en el paso 2.9. Asegúrese de que la ampliación esté a 60x antes de continuar.
  2. Manualmente enfocar el microscopio de tal manera que el tercero y el cuarto dorsal tergites abdominales están en foco. Utilice el software de captura de imágenes para adquirir una imagen como un TIFF de escala de grises de 8 bits, como se describe en el paso 2.6.
    NOTA: La imagen puede ser capturada en color y posteriormente convertida en escala de grises para su análisis.
  3. Guarde la imagen como "SESH000_sampleID.tiff", como se describe en el paso 2.7.
    NOTA: Aquí, [SESH] es constante, [000] es el número de sesión y es variable, pero debe tener tres dígitos y [sampleID] es lo que el usuario desee, aunque no debe contener caracteres de subrayado (_) adicionales y Debe ser de una longitud constante. [ID de la muestra] debe incluir detalles de los factores utilizados en el análisis de los datos de pigmentación ( por ejemplo, la temperatura o el linaje), separados por un distintivo no alfabéticoComo un guión (-). Esto permite que estos factores sean fácilmente analizados de [sampleID] usando software estadístico estándar.
  4. Retire la placa de Petri de la etapa y reemplace la mosca con la muestra siguiente. Repita los pasos 3.1-3.3 hasta que todos los especímenes hayan sido visualizados, sin ajustar los niveles de iluminación, aumento o exposición.

4. Imaging en varias sesiones

  1. Si las imágenes necesitan ser tomadas en varias sesiones, mantenga la intensidad de la luz, la exposición y la ampliación a través de las sesiones. Al comienzo de cada sesión, compruebe la calibración espacial de la cámara (paso 2.4) y la intensidad de la luz en la etapa (medida por el LED / medidor de tensión, paso 2.12).
  2. Capture y guarde una imagen del micrómetro del escenario (pasos 2.5-2.7) para asegurar la capacidad de calibrar espacialmente las imágenes de nuevo, si es necesario.
  3. Use al menos 15 muestras de control y repárelas aleatoriamente en cada sesión paraW para la detección y eliminación de efectos de sesión. Asegúrese de que los ejemplares de control duplicados entre sesiones tengan el mismo [ID de muestra] pero diferente [SESH000].
    NOTA: Las muestras de control son moscas recogidas, almacenadas y montadas de forma idéntica a los especímenes experimentales, pero son reimaginadas a través de las sesiones. El número exacto de muestras de control dependerá de la configuración experimental del usuario. Ver la discusión para más detalles.

5. Análisis de imágenes

NOTA: El análisis de imagen se realiza en ImageJ 45 y utiliza la macro "Measurement of Pigmentation.ijm", proporcionada como un archivo suplementario.

  1. Coloque todas las imágenes a analizar en la misma carpeta.
  2. Inicie ImageJ y ejecute la macro "Measurement of Pigmentation.ijm" haciendo clic en "Plugins"> "Macro"> "Ejecutar", seleccionando "Measurement of Pigmentation.ijm" en el explorador de archivos y haciendo clic en "abierto."
    NOTA: Todos los pasos siguientes se encuentran dentro de la macro. Cada paso es un comando macro individual.
  3. Tenga en cuenta que se abre un cuadro de diálogo "Acción necesaria", indicando "Elegir la carpeta donde se almacenan las imágenes". Haga clic en "Aceptar" y utilice el explorador de archivos para seleccionar la carpeta que contiene las imágenes y luego haga clic en "elegir".
  4. Tenga en cuenta que un cuadro de diálogo "Acción necesaria" se abrirá, indicando "Elegir la carpeta donde desea que los datos se almacenen." Haga clic en "Aceptar" y utilice el explorador de archivos para seleccionar la carpeta deseada para guardar los perfiles de pigmentación. Haga clic en "elegir".
  5. Tenga en cuenta que se abrirá un cuadro de diálogo preguntando "¿Cuántos caracteres tiene su ID de muestra?" En el cuadro de entrada de datos, ingrese el número de caracteres en [SampleID], como se especifica en el paso 3.3, y haga clic en "Aceptar".
  6. Tenga en cuenta que un cuadro de diálogo se abrirá, preguntando "¿Qué tan grande es su ROI?" En el cuadro de entrada de datos, ingrese el ancho de píxeles del ancho anterior-Posterior a lo largo de la cual se debe leer el perfil de pigmentación (rectángulo verde, figura 1G , figuras 2A y 2A '). Haga clic en Aceptar;" El valor predeterminado es 20 píxeles.
    NOTA: El perfil de pigmentación se lee a través de una tira de cutícula, en lugar de una línea, para reducir el ruido debido a pelos y cerdas. El ancho de esta tira dependerá de la resolución de la imagen, pero debe ser ~ 1/20 de la anchura del abdomen, en píxeles.
  7. Tenga en cuenta que la macro abrirá la imagen de la primera mosca y un cuadro de diálogo le preguntará si desea medir la mosca actual (haga clic en "Sí"), para pasar a la siguiente mosca (haga clic en "No") o para salir Macro (haga clic en "Cancelar").
  8. Tenga en cuenta que se abrirá un cuadro de diálogo que indicará "Definir la línea media del abdomen dorsal, de ANTERIOR a POSTERIOR". La herramienta "línea recta" ya estará seleccionada. Dibujar una línea desde anterior a posteriorPara definir la línea media del abdomen dorsal. Haga clic en Aceptar;" Ver Figura 2A y 2A ', línea amarilla.
    NOTA: Se utiliza para reorientar la imagen de manera que la línea media dorsal se encuentre horizontalmente a través de la pantalla, con la anterior a la izquierda, facilitando los siguientes pasos.
  9. Tenga en cuenta que se abrirá un cuadro de diálogo que indicará "Definir el borde POSTERIOR de Tergite 4 justo detrás de la banda de pigmentos". La herramienta "línea recta" ya estará seleccionada. Dibuje una línea desde el borde de la línea media posterior hasta el borde lateral derecho, de manera que el centro de la línea (marcado con un cuadrado blanco) se sitúe justo posterior al borde posterior de la banda de pigmento (cutícula a5). Haga clic en Aceptar;". Ver la Figura 2A y 2A ', línea magenta.
    NOTA: El script R detectará automáticamente el borde posterior de la banda de pigmento del perfil de pigmentación.
  10. Tenga en cuenta que un diálogoLa caja se abrirá, indicando "Defina el borde ANTERIOR de Tergite 4 en el borde anterior de la cutícula pigmentada (a2)". La herramienta "línea recta" ya estará seleccionada. Dibuje una línea desde el borde de la línea media anterior hasta el borde lateral derecho, de manera que el centro de la línea (marcado con un cuadrado blanco) se sitúe en el borde anterior de la cutícula pigmentada (cutícula a2). Haga clic en Aceptar;". Véase la figura 2A y 2A ' , línea cian.
    NOTA: El script R definirá este punto como el borde anterior de la cutícula pigmentada del tergito. En la imagen, la macro mostrará la región de interés (ROI) a lo largo de la cual se lee el perfil de pigmentación (rectángulo verde, figura 2A y 2A ', ampliada en las figuras 2B y 2B '). La macro también abrirá una segunda ventana que muestra el perfil de pigmentación para el ROI ( Figur E 2C y 2C '), donde el eje x es la posición, expresada como el número de píxeles desde el borde posterior del perfil, y el eje y es el valor medio del píxel en cada posición.
  11. Ver las gráficas del perfil de pigmentación que será abierto por la macro. Si es necesario, haga clic en "Live" en la ventana de perfil para ajustar la posición del ROI de modo que no incluya estructuras ( por ejemplo, cerdas) que influirían en el perfil de pigmentación. Una vez que el perfil es satisfactorio, haga clic en "Aceptar".
  12. Repita los pasos 5.8-5.11 para Tergite 3.
    NOTA: La macro luego exporta los perfiles de pigmentación como dos archivos CSV, cada uno denominado "SESH000_samplename_TX_profile.csv", donde [SESH000_samplename] es el nombre de la imagen y [TX] es T3 o T4 para el tercero y el cuarto tergites, respectivamente.
  13. Tenga en cuenta que la macro abre la siguiente imagen. Repita los pasos 5.7-5.13 hasta que todas las imágenes hayan sido analizadas.
Jove_title "> 6. Preprocesamiento de datos, análisis y corrección de sesión

NOTA: Todo el análisis de datos se lleva a cabo en R 47 y utiliza el script "Análisis de Pigmentación.R" proporcionado. A continuación, "L ..." indica qué línea (s) del script debe ejecutarse para cada parte del análisis. Consulte la información suplementaria para obtener detalles adicionales sobre cómo se realiza el análisis.

  1. Edite la secuencia de comandos R para establecer el directorio de trabajo (L6) y defina la ruta de acceso a la carpeta que contiene los perfiles .csv (L11).
  2. Ejecute L13-15 para generar una lista de los perfiles de pigmentación almacenados en la carpeta de perfiles.
  3. Cargue y ejecute las funciones "reader" y "addPrimaryKey" (L17-41) para leer los perfiles en un único marco de datos.
  4. Edite el script en L43 para especificar la calibración espacial de las imágenes en μm / píxeles, como se determina en el paso 2.5.
  5. Cargue y ejecute el ajuste(L46-58) para convertir la posición del perfil (eje x, figura 2C y 2C ') desde píxeles desde el borde posterior del ROI hasta μm desde el borde anterior del ROI y (0 = negro, 255 = blanco) al valor de pigmentación (0 = sin pigmento, 255 = pigmento máximo).
  6. Cargar y ejecutar la función "spline.der.er" (L60-71) para generar la spline cúbica de los perfiles de pigmentación y sus derivadas primera y segunda ( Figura 2D -2F y 2D '- 2F ').
  7. Cargar y ejecutar las funciones "coord" y "assmbly.coord" (L74-163), primero para extraer la posición de los bordes posterior (T 3 ) y anterior (T 2 ) de la banda de pigmento ( Figura 2D y 2D 'Y el borde posterior de la cutícula a2 (T1, Figura 2D y 2D '), y luego extraer los valores de pigmentación máximos (Pmáx) y mínimos (P min ), tomados en T3 y T1, respectivamente.
    NOTA: El borde anterior de la cutícula a2 ya se ha definido en el paso 5.9.
  8. Opcional: Cargue y ejecute la función "chek" (L165-175) para comprobar si la función "coord" identifica correctamente las posiciones T 1-3 para un perfil de pigmentación seleccionado al azar.
  9. Cargar y ejecutar las funciones de índice y métricas (L178-193) para generar una tabla de datos con los encabezados "Session", "Sample", "Tergite", "id" (una concatenación de Sample y Tergite), "Pmax" "P min ", "W band " (anchura de la banda de pigmento, = T3 - T 2 ), y "W tergite " (anchura de la pigmentada cA2-a5, = T3).
  10. Cargue y ejecute la función "corrección" (L196-234) para generar una tabla de datos que corrija Pmax y Pmin para cualquier factor de perturbación que surja debido a los efectos de sesión. Utilice el aumento (o disminución) promedio en Pmax o Pmin de las muestras de control reimaginadas en sesiones temporalmente adyacentes.

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Representative Results

El protocolo se utilizó para explorar el efecto de la temperatura de cría en la pigmentación abdominal. Estudios anteriores han demostrado que un aumento en la temperatura de desarrollo da lugar a una disminución de la propagación de la pigmentación abdominal en varias especies de Drosophila , incluyendo D. melanogaster 30 , 32 . Específicamente, en los tergitos abdominales 3 y 4, el grado de pigmentación (anchura de la banda de pigmento) disminuye de 17 ° C a 25 ° C y permanece igual de 25 ° C a 28 ° C 24 , 36 . Estos estudios anotaron la extensión de la pigmentación en una escala 1-10 (0: ninguna banda de pigmento, tergito completamente amarillo, 5: banda de pigmento ocupa el 50% del tergito, 10: tergito completamente oscuro). Para establecer si la metodología cuantitativa podría capturar esta plasticidad fenotípica, se midió la pigmentación enTergitos abdominales tercero y cuarto de una línea isogénica de moscas hembra ostensiblemente de tipo salvaje, criados de huevo a adulto a 17 ° C (siete moscas), 25 ° C (nueve moscas) y 28 ° C (nueve moscas). Para determinar la efectividad del procedimiento de corrección en la eliminación de los factores de molestia introducidos por los efectos de la sesión, la pigmentación de las mismas moscas fue reimaginada y re-medida uno, dos, cuatro y ocho días después. Sin embargo, las condiciones de iluminación y la exposición entre sesiones se modificaron a propósito para asegurar que había efectos de sesión para el procedimiento de corrección que se debía eliminar. Las imágenes han sido publicadas en el repositorio digital Dryad.

La primera pregunta que se planteó fue si había diferencias sistemáticas en las medidas de pigmentación a través de las sesiones. Esto se examinó utilizando el paquete lme4 en R48 para adaptarse a los modelos mixtos M ijk = S i + A j +Ε ijk y M ij = A j + ε ij tanto a Pmax como a P min , donde M es la medida de pigmento, S es la sesión (efecto aleatorio), A es el tergito abdominal que se mide (efecto aleatorio) y ε es El error residual (los subíndices son niveles dentro de las variables). Se utilizó una prueba de razón log-verosimilitud para probar si la inclusión de la sesión como un factor aleatorio mejoró significativamente el ajuste; Lo hizo ( Tabla 1 ). Como se esperaba, el examen de los componentes de la varianza (generado a través de REML 48 ) indicó que la variación debida a los efectos de la sesión representaron 67% y 70% de la varianza total en Pmax y Pmin, respectivamente ( Tabla 1 ).

Quince tergitos de control seleccionados al azar (tercero o cuarto, de moscas reaRojo a 17 ° C, 25 ° C o 28 ° C), y se usaron cambios en su P máx y P min promedio para corregir las medidas de pigmentación de los tergitos restantes a través de las sesiones. La repetición del análisis de las medidas de pigmentación corregidas eliminó los efectos de la sesión ( Tabla 1 ) y redujo el porcentaje de la varianza total debido a los efectos de la sesión a cero. El error residual es una estimación, un error de medición después de los efectos de la sesión se han eliminado, y fue de 22% y 27% para Pmax y Pmin, respectivamente ( Tabla 1 ]

A continuación, se utilizaron los datos corregidos para determinar si se podía detectar el efecto de la temperatura sobre diferentes aspectos de la pigmentación y el tamaño. El modelo mixto M ijkm = T i * D j + X k + ε ijkm se ajustó a los datos, donde T D es el tergito (tercero o cuarto), y X es la mosca individual (factor aleatorio). Debido a que la relación entre la pigmentación y la temperatura no es lineal 24 , 36 , T fue tratado como un factor categórico. Se ensayaron los niveles máximos y mínimos de pigmentación (Pmax y Pmin) y la anchura de la banda de pigmento y del tergito ( banda W y W tergita ). También se ensayó el efecto de la temperatura sobre la anchura relativa de la banda de pigmento ( banda R = banda W / tergita W ). Los datos mostraron que la anchura absoluta ( banda W ) y relativa ( banda R ) de la banda de pigmento disminuyó de 17 ° C a 25 ° C (prueba post hoc de Tukey, P <0,05 para todos) y no cambió significativamente de 25 ° C a 28 ° C (ensayo post hoc de Tukey, Tabla 2 , Figura 3A y 3B ], lo cual es consistente con estudios previos 24 , 36 . Se observó el mismo patrón para el nivel máximo y mínimo de pigmentación, Pmax y Pmin ( Tabla 2 , Figura 3C ). El efecto de la temperatura en el nivel de pigmentación no se ha descrito antes, pero parece inicialmente consistente con otros estudios que muestran que el nivel mínimo de pigmentación en el cuarto tergito abdominal está positivamente correlacionado con el ancho de la banda de pigmento en poblaciones de tipo salvaje 39 . Sin embargo, mientras que los datos de este estudio indican una relación positiva entre P máx y banda W , muestran una relación negativa entre P min y la banda W( Tabla 3 ). Esta diferencia entre los estudios actuales y los anteriores puede reflejar diferencias en cómo los factores genéticos y ambientales influyen en la correlación entre el nivel y la extensión de la pigmentación abdominal. Sin embargo, estos resultados representativos demuestran que el protocolo es capaz no sólo de identificar patrones de pigmentación previamente establecidos a través de metodologías cualitativas, sino también de revelar otros nuevos que las metodologías cualitativas no son capaces de detectar.

El efecto de la temperatura en el ancho del tergito fue más complejo. En D. melanogaster , el cuerpo y órgano disminución de tamaño no linealmente con la temperatura 49 . Estudios previos sugieren que el ancho del quinto tergito abdominal disminuye en un 10% de 16,5 ° C a 25 ° C, y un 4% adicional de 25 ° C a 29 ° C 50 . Si bien hubo una disminución no significativa en el ancho deEl cuarto tergito abdominal de 17 ° C a 25 ° C, tanto el tercero como el cuarto tergito abdominal aumentaron en anchura de 25 ° C a 28 ° C ( Tabla 2 , Figura 3D ). Puesto que la anchura de los tergitos abdominales es esencialmente definida por el usuario (pasos 5.9-5.10 en el protocolo), la disparidad entre los estudios actuales y anteriores es improbable que se deba a la forma en que el script R extrae W tergita del perfil de pigmentación. Por el contrario, puede reflejar diferencias en la forma en que se mide el segmento abdominal, en los genotipos de las moscas y en los aspectos precisos de los tergitos abdominales que se miden.

La siguiente pregunta planteada fue si la metodología podría generar datos comparables a los datos recopilados utilizando las evaluaciones existentes de la pigmentación. Estos métodos suelen pedir al observador asignar subjetivamente cada mosca a una de una aletaDe las clases fenotípicas basadas en la extensión de la pigmentación 15 , 30 , 32 , 33 , 34 y por lo tanto se basan en la capacidad del observador para evaluar el ancho de la banda de pigmento. Para probar cuán bien este método objetivo se compara con los métodos subjetivos, a cinco observadores se les pidió clasificar 45 imágenes de abdomen femenino basado en el ancho de la banda de pigmento del cuarto tergito abdominal. La clasificación promedio entre los observadores se comparó con la clasificación basada en la banda W, medida con esta metodología. Hubo una fuerte correlación entre las clasificaciones subjetiva y objetiva ( Figura 1 , en Supplementary Information.pdf), Spearmen = 0.7342, P <0.0001).

Otra pregunta planteadaFue la forma en que este método para extraer la banda W de la pigmentación spline en comparación con la medición de la anchura de la banda de pigmento a mano (método visual) utilizando la herramienta de medición lineal en ImageJ . Una vez más, se encontró una fuerte correlación entre los datos recopilados utilizando las dos metodologías ( Figura 2 , en Supplementary Information.pdf, OLS, r 2 = 0.49 , P <0.0001). Aunque el método computacional consistentemente midió la banda de pigmento como más estrecha que en el método "visual", el coeficiente de regresión no fue significativamente diferente de 1 ( P> 0,05).

La última pregunta que se planteó fue si esta metodología podría utilizarse para medir la pigmentación abdominal en otros contextos. La metodología podría extraer el Pmax , P min , W banda , y W tergite para el fIfth y sexto tergites abdominales en las mujeres y el tercero y cuarto tergites abdominales en los hombres ( Figura 4 ]. Además, la metodología podría utilizarse para cuantificar el aumento de Pmax y P min en moscas mutantes para ébano ( e 1 ), que muestran un aumento de la pigmentación cuticular en todo el cuerpo y un aumento específico en la pigmentación de la cutícula anterior al pigmento Banda 28 ( Figura 4 ).

Figura 1
Figura 1: Pigmentación abdominal en D. melanogaster . ( A - F ) Variación de la pigmentación abdominal en hembras de dos genotipos criados a tres temperaturas (17 ° C, 25 ° C y 28 ° C). A3 y A4 son el tercero y el cuarto tergiario abdominal Tes, respectivamente. ( G ) El tergito abdominal dorsal incluye un compartimiento anterior y posterior, sólo partes de las cuales son fiablemente visibles en los abdómenes no estirados. Los compartimentos se subdividen en distintos tipos de cutículas: a1: sin pigmentación, sin pelos; A2: ligeramente pigmentado y pelos; A3: ligeramente pigmentado, pelos y cerdas moderadas; A4: pigmentación oscura, pelos y cerdas moderadas; A5: pigmentos oscuros, pelos y cerdas grandes; A6: no pigmentado y pelos; P3: no pigmentado y pelos; P2: no pigmentado y sin pelos; Y p1: sin pigmentar y con mosaico. La banda de pigmento se compone de cutículas a4 y a5. En el análisis se utilizan solamente cutículas pigmentadas (a2-a5, caja verde). Barras de escala = 200 μm in (AF). El contraste de todas las imágenes se ha ajustado para resaltar el patrón de pigmentación, y las imágenes son ilustrativas. Las imágenes no ajustadas utilizadas para generar los resultados representativos se depositan en el repositorio digital Dryad..com / files / ftp_upload / 55732 / 55732fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Análisis de imagen y datos para la cuantificación de la pigmentación abdominal. ( A - F ) y ( A - F ) son para diferentes especímenes y muestran cómo el análisis trata con imágenes de diferente calidad. ( A ) El usuario define primero la línea media del abdomen (línea amarilla), el borde anterior del tergito (línea cian) y una línea ligeramente posterior al borde posterior de la banda de pigmento (línea magenta). La macro ImageJ dibuja entonces una línea desde el punto medio de las líneas anterior y posterior (línea blanca discontinua), que se ensancha para formar una ROI (caja negra), ampliada en ( B ). ( C ) La macro ImageJ entonces exTraza el valor medio del pixel a lo largo del eje anterior-posterior del ROI. Observe que en esta etapa, el perfil se lee de la parte posterior a la anterior. ( D - E ) La macro R convierte los valores medios de píxeles en un valor de pigmentación, invierte la dirección del perfil de pigmentación, la ajusta con una spline cúbica ( S (x) ) ( D ) y calcula la primera ) ) ( E ) y la segunda ( S (x) ) derivada de la estría ( F ). El guión identifica entonces: T 3 , la posición de máxima pigmentación, donde S (x) transita de <0 a> 0, moviéndose hacia delante desde la parte posterior de la spline; T 2 , la posición donde la disminución de la pigmentación es mayor y S (x) es máxima; Y T 1 , la posición donde la pigmentación del tergito está en su mínimo y S (x) transiciones desde> 0 a <0, moviéndose hacia delante fRom T 2 ,. La anterior del tergito fiablemente visible (anterior de la cutícula a2) es definida por el usuario. (AF) En los casos en que la primera derivada no puede ser utilizada para encontrar T 1 , típicamente porque S (x) no cruza 0 anteriormente a la banda de pigmento, el guión definirá T 1 como la posición donde S (x) 0 a <0 cuando se mueve hacia delante desde T 2 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: El efecto de la temperatura en diferentes aspectos de la pigmentación abdominal en D. melanogaster hembra. ( A ) Ancho de la banda de pigmentos ( banda W , FFigura 1). ( B ) Banda pigmentaria como proporción de tergito ( banda R ). ( C ) Máxima (Pmax, líneas superiores) y mínima ( P min , líneas inferiores) pigmentación. ( D ) Ancho de tergita ( W tergita ). Los puntos son medios menos cuadrados de los modelos lineales de efecto mixto (Tabla 2). Las barras de error representan el error estándar y pueden ser oscurecidas por los marcadores. La línea negra es el tercer tergito abdominal. La línea gris es el cuarto tergito abdominal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Diferencias en la pigmentación entre el tercero y cuarto tergites abdominales. Esto se muestra en ( A ébano 1 hembras, ( B ) wildtype hembras, ( C ) wildtype machos, y el quinto y sexto abdominal tergites en las mujeres de tipo salvaje. ( D ) Máxima pigmentación, P máx . ( E) Pigmentación mínima, P min . ( F ) Ancho de la banda de pigmentos, banda W. ( G ) Ancho relativo de la banda de pigmento, banda R. Las barras con diferentes letras son significativamente diferentes (Tukey HSD prueba post-hoc, P <0,05). N = 6 para todos excepto ébano 1 , donde N = 4. Barras de escala = 200 μm en ( A - C ). Las barras de errores representan el error estándar. El contraste de todas las imágenes se ha ajustado para resaltar el patrón de pigmentación, y las imágenes son ilustrativas. Por favor cliCk aquí para ver una versión más grande de esta figura.

<Td> 4,08 (78%)
Comparación de modelos Componentes de la varianza (% del total)
Rasgo de pigmentación Modelo Df Log-probabilidad Ecuación (%) Ecuación (%) Ecuación (%)
P máx. Sin corregir M ij = A i + ε ij 3 -678,28 1,94 (14%) 11,86 (86%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -457,95 440,66 *** 4,08 (26%) 10,71 (67%) 1,14 (7%)
P min Sin corregir M ij = A i + ε ij 3 -875,03 6,05 (9%) 59,39 (91%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -664,58 420,91 *** 16,67 (22%) 53,08 (70%) 6,31 (8%)
P máx. Corregido M ij = A i + ε ij 3 -445,05 1,15 (22%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -444,88 0.3378 4,08 (78%) 0,01 (<1%) 1,14 (22%)
P min Corregido M ij = A i + ε ij 3 -649,9 16,67 (73%) 6,24 (27%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -649,9 0 16,67 (73%) 0 6,31 (27%)

Tabla 1: Modelos lineales de efectos mixtos del efecto de tergita y sesión. Modelos lineales de efectos mixtos del efecto de tergite y sesión en unPigmentación bdominal (Pmax y P min ) de 50 tergitos re-medidos a lo largo de cinco sesiones, con componentes de varianza estimados a través de REML. Los modelos fueron modelos lineales de efecto mixto. M : Medida de pigmentación; R : Se mide el tergito individual; S : Sesión; Ε : Error residual. Los X² significativos se muestran en negrita. P <0,05. ** p & lt; 0,01. *** p <0,001.

Rasgo Temperatura Tergite Temperatura
X Tergite
Pmax F- ración 8.14 55,59 6,6
PAG 0,002 <0,001
P min F- ración 4.41 66,11 6,36
PAG 0,026 <0,001 0,002
Banda de música F- ración 113,93 0,01 0,64
PAG <0,001 0,931 0,531
Tergite F- ración 1,79 0,92 5.11
PAG 0,191 0,338 0,007
Banda R F- ración 27,66 0,08 1,46
PAG <0,001 0,782 0,23

Tabla 2: Efecto de la temperatura y la identidad del tergito. El efecto de la temperatura y la identidad del tergito En diferentes aspectos de la pigmentación abdominal en 50 tergitos re-medido a lo largo de cinco sesiones. Los modelos fueron modelos de efecto mixto lineal, con la mosca individual incluido como un factor aleatorio. Pmax: pigmentación máxima (corregida); P min : pigmentación mínima (corregida); W banda : Anchura de la banda de pigmento; W tergita : Ancho de tergita; R : Anchura relativa de la banda de pigmento. Los factores fijos significativos se muestran en negrita ( P < 0.05).

Interceptar Banda de música Temperatura Tergite
17 ° C 25˚C Tercero
Pmax Β 234,35 0,069 0,063 -1.178 -0.588
F 29,93 5,97 54,82
PAG <0,001 0,008 <0,001
P min Β 223,96 -0.137 3.931 -3.024 -1,54
F 19,33 Span = "2"> 9,66 62,02
PAG <0,001 0,001 <0,001

Tabla 3: Efecto de la anchura de banda de pigmento, temperatura y identidad de tergita en el nivel de pigmentación. Efecto de la anchura de banda de pigmento, la temperatura y la identidad de tergite en el nivel de pigmentación en 50 tergitos re-medido a lo largo de cinco sesiones. Los modelos fueron modelos de efecto mixto lineal, con la mosca individual incluido como un factor aleatorio. Pmax: pigmentación máxima (corregida); P min : pigmentación mínima (corregida); W banda : Anchura de la banda de pigmento; R: Anchura relativa de la banda de pigmento.

Archivo Suplementario 1. Información Complementaria.Y_Information.pdf "target =" _ blank "> Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo Complementario 2. Análisis del script Pigmentation.R. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3. Measurement of Pigmentation.ijm Haga clic aquí para descargar este archivo.

Simulación R Script. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Esta metodología permite la adquisición precisa, rápida y repetible de datos de pigmentación en una forma cuantitativa adecuada para múltiples análisis posteriores. El método se ha utilizado para obtener datos sobre el efecto de la temperatura en la pigmentación abdominal en una línea isogénica de moscas. Sin embargo, la metodología podría utilizarse en estudios de genética avanzada para identificar genes que subyacen en las diferencias de pigmentación entre individuos, poblaciones o especies, o estudios genéticos inversos para explorar los efectos de genes específicos en los patrones de pigmentación. Aunque se ha estudiado el desarrollo y la evolución de la pigmentación de D. melanogaster, la precisión con la que esta metodología captura los datos de pigmentación en forma cuantitativa permite enfoques estadísticos más poderosos. Esto a su vez permite a los investigadores utilizar menos muestras al analizar patrones de pigmentación, o les permite aclarar más sutilAspectos de la pigmentación. Además, este método no requiere la disección de la mosca, permitiendo que la muestra se utilice posteriormente para análisis adicionales, tales como mediciones morfológicas o genotipificación. De hecho, la metodología podría utilizarse potencialmente en moscas anestesiadas, las cuales podrían ser criadas selectivamente basándose en sus características de pigmentación.

Un problema potencial con la medición de la pigmentación a través del análisis de imágenes es que los valores de pigmentación pueden reflejar la exposición y las condiciones de iluminación bajo las cuales se tomó una imagen, en lugar del nivel de pigmentación en sí. Si bien el uso de niveles de iluminación fija, posiciones de luz, ampliación y exposición ayuda a aliviar estos problemas, es probable que todavía sea necesario tomar varias imágenes de control de repetición en cada sesión para controlar completamente los efectos de sesión. Este método incluye reimagen quince ejemplares de control cada sesión y usando los cambios entre sesiones en P maX y P min para detectar y eliminar los efectos de sesión. Sin embargo, el número exacto de especímenes de control que deben ser reimaginados dependerá del hardware de imagen y el software que se utiliza, el aspecto de la pigmentación de interés para el usuario y cómo variable es entre los tratamientos, y cuántas imágenes se toman en cada sesión. La realización de un experimento preliminar en el que los mismos especímenes son reimaginados en cinco sesiones permitirá al usuario calcular la varianza debido a los efectos de sesión, la varianza debida a la identidad del espécimen y la varianza residual (que es una estimación del error de medición después de corregir Para efectos de sesión) ( Tabla 1 ). Estos valores se pueden utilizar para estimar cuántas imágenes de control se deben tomar en cada sesión para detectar y controlar los efectos de la sesión. Se ha escrito una sencilla secuencia de comandos de R y se utilizan datos de un experimento preliminar para simular medidas de pigmentación a través de las sesiones. Puede ser usadoPara comprobar que el número de imágenes de control por sesión es suficiente para eliminar los efectos de sesión. Este script se proporciona como un archivo suplementario.

Si a los usuarios les preocupa que existan factores de molestia dentro de las sesiones, también pueden reimagen la misma muestra varias veces a lo largo de la sesión, como se describe en John et al., 2016 41 . En este caso, [sampleID] para el espécimen de control único debe cambiarse cada vez que se vuelva a imaginar dentro de una sesión ( por ejemplo, control1, control2, control3, etc. ); De lo contrario, el software de imagen reemplazará la imagen anterior por la nueva imagen del mismo nombre. La función de corrección basa su corrección en imágenes duplicadas con el mismo [ID de muestreo] entre sesiones temporalmente adyacentes y corregirá si el mismo espécimen se vuelve a imaginar varias veces dentro y entre sesiones o si el mismo conjunto de muestras de control se forman imágenes entre sesiones. Independientemente de cómoLas imágenes de control se toman, las sesiones deben ser tratadas como bloques y, donde sea posible, los usuarios deben emplear un diseño de bloques al azar para que cualquier efecto de sesión que permanezca después de la corrección pueda ser controlado estadísticamente. De lo contrario, los especímenes deben asignarse aleatoriamente a las sesiones de modo que los efectos de la sesión no se confundan con los factores experimentales.

El protocolo se basa en la generación de un perfil de pigmentación que representa el cambio en la pigmentación a través de cada tergito. Un problema con la generación de este perfil son los pelos oscuros que cubren la cutícula abdominal, que son invariablemente bisecados por cualquier línea anterior-posterior que cruza el tergite. El protocolo reduce el ruido generado por estos pelos teniendo el perfil de pigmentación promediado a través de una banda de cutícula. Sin embargo, los usuarios pueden establecer el ancho del ROI a 1 píxel en el paso 5.6 si desean generar perfiles que se basan en una delgada línea de cutícula. Además, los usuarios pueden analizarLa misma imagen varias veces, cambiando la posición lateral del perfil de pigmentación para capturar cambios en el ancho de la banda de pigmento dentro de un segmento. En este caso, sin embargo, los usuarios necesitarían copiar la misma imagen varias veces y dar a cada copia un nombre único antes de realizar el paso 5.1, ya que la macro ImageJ sobrescribirá los perfiles del mismo nombre.

Una segunda consideración importante a la hora de generar el perfil de pigmentación es el parámetro de suavizado de la spline cúbica, definido dentro de la función spline.der.er (L63) en el script Analysis of Pigmentation R. El parámetro de suavizado apropiado depende de la configuración y resolución de la imagen. El sobre-alisado de un perfil puede resultar en una pérdida de las características del perfil spline utilizado para calcular las coordenadas de T 1 , T 2 y T 3 ( Figura 2D y 2D '). Por el contrario, el suavizado su-Ruido del perfil y consecuentemente la exactitud de las extracciones de coordenadas. La función chek produce un resumen gráfico de la spline y sus derivados y puede usarse como una señal visual para elegir un parámetro de suavizado apropiado.

La metodología descrita aquí se centra en la captura de datos sobre la pigmentación de los terceros y cuartos tergitos abdominales en D. melanogaster femenino y masculino . Sin embargo, los resultados representativos indican que también puede usarse para medir la pigmentación de los segmentos cinto y sexto abdominal de las hembras. Además, la metodología puede detectar diferencias en el fenotipo causado por mutantes de genes que afectan a la pigmentación. La macro ImageJ y los scripts R pueden modificarse fácilmente para medir la pigmentación en el abdomen de diferentes especies de D. melanogaster , o incluso la pigmentación de otras partes del cuerpo en otros taxa, siempre que el patrón de pigmentación sea estereotípico. Por último, la metodologíaTambién podría adaptarse para medir aspectos del color de la pigmentación capturando imágenes en RGB y analizando cada canal por separado.

En general, esta metodología es parte del campo emergente de los fenómenos 51 , 52 . El objetivo de los fenómenos es generar y analizar grandes conjuntos de datos fenotípicos multidimensionales para comprender mejor las interacciones genéticas y ambientales que influyen en el fenotipo, incluyendo la enfermedad, y cómo estas interacciones evolucionan para generar diversidad biológica. Para que los fenómenos cumplan su potencial, sin embargo, las metodologías para la adquisición de datos fenotípicos deben ser sencillas y fácilmente adaptables a diferentes fenotipos, así como libremente disponibles. Mediante el uso de software de código abierto para analizar las imágenes capturadas con equipos estándar, esta metodología ayuda a lograr este objetivo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias otorga IOS-1256565 e IOS-1557638 a AWS. Agradecemos a Patricia Wittkopp ya tres revisores anónimos por sus útiles comentarios sobre una versión anterior de este documento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Biology Forceps FST 11252-30
Agar Sigma-Aldrich 5040
Dissecting Scope Leica MZ16FA
Base Leica MDG41
Camera Leica DFC280
Gooseneck Cold Light Source Schott ACE 1
Image Acquisition Control Software Micro-Manager v1.3.20 https://micro-manager.org/
Image Analysis Software ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis Software R 3.3.2 https://www.r-project.org/
LED Thor Labs LEDWE-15
Multimeter Fluke Fluke 75 Series II
60 mm x 15 mm Petri dish Celltreat Scientific Products 229663
Stage micrometer Klarman Rulings, Inc. KR-867

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