Zebrafish भ्रूण में स्थिर, गतिशील और नवजात Microtubules का विश्लेषण करने के लिए Immunolabeling का उपयोग

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Developmental Biology

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Summary

Immunolabeling तरीके विकासशील zebrafish मस्तिष्क में microtubules की अलग आबादी का विश्लेषण करने के लिए यहां वर्णित हैं, जो मोटे तौर पर अंय ऊतकों के लिए लागू कर रहे हैं । पहला प्रोटोकॉल immunolabeling स्थिर और गतिशील microtubules के लिए एक अनुकूलित विधि रूपरेखा । दूसरा प्रोटोकॉल छवि के लिए एक विधि प्रदान करता है और विशेष रूप से नवजात microtubules यों ।

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McFarland, R. J., Brown, S. P., Vital, E., Werner, J. M., Brewster, R. M. Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (127), e55792, doi:10.3791/55792 (2017).

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Abstract

Microtubules (MTs) गतिशील और नाजुक संरचनाओं कि vivo मेंछवि को चुनौती दे रहे हैं, विशेष रूप से हड्डीवाला भ्रूण में कर रहे हैं । Immunolabeling तरीके यहां वर्णित है zebrafish भ्रूण के विकासशील तंत्रिका ट्यूब में MTs के विभिंन आबादी का विश्लेषण । जबकि ध्यान तंत्रिका ऊतक पर है, यह पद्धति मोटे तौर पर अंय ऊतकों के लिए लागू है । प्रक्रियाओं के मध्य somitogenesis-चरण भ्रूण (1 somite 12 somites) के लिए जल्दी के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, लेकिन वे अपेक्षाकृत मामूली समायोजन के साथ अंय चरणों की एक श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । पहले प्रोटोकॉल स्थिर और गतिशील MTs के स्थानिक वितरण का आकलन करने और छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के साथ इन आबादियों का एक मात्रात्मक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है । यह दृष्टिकोण छवि microtubule गतिशीलता और वास्तविक समय में वितरण के लिए मौजूदा उपकरणों का पूरक है, ट्रांसजेनिक लाइनों या टैग constructs के परिवर्तनीय अभिव्यक्ति का उपयोग कर । वास्तव में, इस तरह के उपकरण बहुत उपयोगी हैं, लेकिन वे आसानी से गतिशील और स्थिर टन के बीच भेद नहीं है । छवि और इन अलग microtubule आबादी का विश्लेषण करने की क्षमता को समझने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ है कोशिका ध्रुवीकरण और morphogenesis अंतर्निहित तंत्र । दूसरा प्रोटोकॉल नवजात MTs विशेष रूप से विश्लेषण करने के लिए एक तकनीक की रूपरेखा । यह समय के साथ MTs के de नोवो वृद्धि गुण कैप्चरिंग द्वारा पूरा किया जाता है, दवा nocodazole और दवा वॉशआउट के बाद एक वसूली अवधि के साथ microtubule depolymerization निंनलिखित । इस तकनीक zebrafish भ्रूण में MTs के अध्ययन के लिए अभी तक लागू नहीं किया गया है, लेकिन microtubule विधानसभा में फंसा प्रोटीन के vivo में समारोह की जांच के लिए एक मूल्यवान परख है ।

Introduction

Microtubules (MTs) α के पॉलिमर हैं-और β-tubulin कि रैखिक protofilaments में इकट्ठा, जिनमें से कई एक खोखले ट्यूब1,2फार्म करने के लिए गठबंधन. MTs संरचनाओं का ध्रुवीकरण कर रहे हैं, तेजी से बढ़ रही प्लस समाप्त होता है और धीमी गति से बढ़ रही ऋण समाप्त होता है कि centrosome या अंय microtubule-आयोजन केंद्र (MTOC)3पर लंगर डाले हैं । De नोवो एमटी गठन γ-tubulin रिंग कॉम्प्लेक्स (γ-TURC) पर nucleation द्वारा शुरू किया जाता है, जो मीट्रिक टन विधानसभा के लिए एक टेम्पलेट प्रदान करता है4. किसी भी सेल में, MTs की दो आबादी अलग दरों पर पर बारी है कि प्रतिष्ठित किया जा सकता है । गतिशील MTs गतिशील अस्थिरता5के रूप में जाना जाता है एक प्रक्रिया में विकास और संकोचन के चरणों के बीच स्विचन द्वारा अपने सेलुलर पर्यावरण का पता लगाने । गतिशील mts के विपरीत, स्थिर mts गैर-बढ़ रहे हैं और डायनेमिक mts6की तुलना में अब आधा जीवन है ।

सेल जीवविज्ञान में अनुसंधान के दशकों के लिए मीट्रिक टन संरचना और समारोह का अध्ययन करने के लिए उपकरणों की एक परिष्कृत सरणी प्रदान की गई है और इन cytoskeletal तत्वों पर ज्ञान का एक बड़ा शरीर के परिणामस्वरूप । उदाहरण के लिए, MTs स्थापना और सेल ध्रुवीकरण के रखरखाव, जो न केवल उनके आंतरिक ध्रुवीकरण करने के लिए कारण है, लेकिन यह भी स्थिर बनाम गतिशील MTs7के अंतर उपसेलुलर वितरण करने में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं, 8. इसके विपरीत, अब तक कम से अधिक जटिल तीन में मीट्रिक टन वास्तुकला और समारोह के बारे में समझा जाता है-आयामी (3-डी) वातावरण, जैसे हड्डीवाला भ्रूण इमेजिंग की चुनौती के कारण भाग में उच्च संकल्प पर मीट्रिक टन cytoskeleton । इस सीमा के बावजूद, GFP की हाल ही की पीढ़ी-व्यक्त ट्रांसजेनिक लाइनों कि लेबल mts या फ्लोरोसेंट-टैग मीट्रिक टन मार्कर के क्षणिक अभिव्यक्ति गतिशील परिवर्तन है कि MTs से गुजरना और उनके सेलुलर के बारे में हमारी समझ बढ़ गई है और zebrafish भ्रूण में विकास की भूमिका । पूरे मीट्रिक टन नेटवर्क ट्रांसजेनिक लाइनों में imaged किया जा सकता है जिसमें tubulin या तो सीधे लेबल है9 या tubulin पॉलिमर अप्रत्यक्ष रूप से मीट्रिक टन-जुड़े प्रोटीन का उपयोग कर लेबल है Doublecortin-जैसे-कळेनासे (Dclk) या Ensconsin (EMTB)10, 11. अंय लाइनें (और constructs) उत्पंन किया गया है कि विशेष रूप से लेबल मीट्रिक टन से अधिक समाप्त होता है या centrosome-लंगर ऋण के द्वारा मीट्रिक टन आंतरिक ध्रुवीयता का आकलन सक्षम समाप्त होता है11,12,13, 14. इन उपकरणों की शक्ति रहते हैं, जीवों के विकास में मीट्रिक टन गतिशीलता अध्ययन करने की क्षमता में निहित है । इस तरह के अध्ययनों से पता चला है, उदाहरण के लिए, विशिष्ट कोशिका आबादी में MTs के स्थानिक और गतिशील वितरण, morphogenesis के दौर से गुजर ऊतकों में mitotic धुरी के उंमुखीकरण (सेल डिवीजन के विमान का एक संकेतक), मीट्रिक टन बहुलक का ध्रुवीकरण के रूप में यह सेल बढ़ाव और प्रवास के रूप में प्रक्रियाओं से संबंधित है, और मीट्रिक टन विकास दर धूमकेतु गति9,13,15द्वारा निर्धारित । इन उपकरणों की सीमा है कि वे स्थिर और गतिशील मीट्रिक टन आबादी के बीच आसानी से भेदभाव नहीं है ।

रिच सेल जीवविज्ञान साहित्य से ड्राइंग, immunolabeling तरीके छवि स्थिर और गतिशील zebrafish भ्रूण में MTs यहां वर्णित हैं, जो ट्रांसजेनिक लाइनों के उपयोग के पूरक हैं । zebrafish में इस तरह के immunolabeling तरीकों का व्यापक उपयोग कुछ हद तक निर्धारण प्रक्रिया के दौरान मीट्रिक टन अखंडता के संरक्षण में कठिनाई से प्रभावित किया गया है. प्रोटोकॉल 1 , विकासशील zebrafish hindbrain के क्रॉस अनुभागों में immunolabeling कुल, डायनेमिक, और स्थिर MTs के लिए ऑप्टिमाइज़ की गई विधि को रेखांकित करता है । इसके अलावा, एक सरल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विधि इन मीट्रिक टन आबादी यों तो वर्णन किया गया है । स्थिर mts गतिशील से प्रतिष्ठित है कई पोस्ट-शोधों के संशोधनों पर आधारित α-tubulin, जैसे acetylation और detyrosination, जो समय के साथ स्थिर MTs पर संचित16,17. zebrafish भ्रूण में, acetylation सिलिअरी पर होता है और axonal mts लेकिन स्थिर चरण mts18पर नहीं, स्थिर mts का एक सबसेट के लिए इस मार्कर की उपयोगिता सीमित. इसके विपरीत, detyrosination zebrafish भ्रूण18में सभी स्थिर MTs पर घटित करने के लिए प्रकट होता है । यह पोस्ट-शोधों संशोधन α-tubulin (detyrosinated tubulin) के carboxy-टर्मिनल glutamic एसिड को उजागर करता है18 और विरोधी Glu-tubulin19का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है । हालांकि detyrosination है तरजीही पर स्थिर MTs, प्रयोगात्मक साक्ष्य इंगित करता है कि इस पोस्ट-शोधों संशोधन का एक कारण के बजाय, मीट्रिक टन स्थिरता16का परिणाम है । पारस्परिक मीट्रिक टन, गतिशील MTs से बना है, एक एंटीबॉडी, विरोधी Tyr-tubulin, कि विशेष रूप से α-tubulin19के tyrosinated रूप पहचानता का उपयोग कर प्रतिष्ठित है. इन मार्करों और फोकल इमेजिंग के साथ immunolabeling के बाद, MTs की मात्रात्मक विश्लेषण (लंबाई, संख्या, और सापेक्ष बहुतायत) विकासशील तंत्रिका ट्यूब के परिभाषित क्षेत्रों में किया जा सकता है । 3-डी छवि-संसाधन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इस विश्लेषण को निष्पादित करने के लिए एक सुव्यवस्थित विधि यहां प्रदान की गई है । इस विधि morphogenesis और स्थापना या सेल ध्रुवीयता की परिपक्वता20के बारे में सवाल पता करने के लिए लागू किया जा सकता है । दरअसल, स्थिर MTs के ध्रुवीकरण arrays के विस्तार कई विकासात्मक घटनाओं के साथ साथ, photoreceptor morphogenesis21, विकासशील तंत्रिका ट्यूब18 और axon गठन8में कोशिकाओं के उपर्त्वचीकरण सहित, ।

2 प्रोटोकॉल एक सेल जीवविज्ञान परख के vivo में अनुकूलन का वर्णन करने के लिए अपने विधानसभा चरण (nucleation/anchorage और विकास)22,23के दौरान MTs विश्लेषण । नवजात टन centrosome पर nucleated रहे है और बाद में मां centriole के subdistal उपांग के लिए लंगर23। एक विधि नवजात मीट्रिक टन regrowth निंनलिखित depolymerization का विश्लेषण करने के लिए वर्णित है । इस प्रोटोकॉल nocodazole उपचार पर depolymerize MTs, दवा वॉशआउट प्रक्रिया और बाद उपचार वसूली अवधि के लिए विवरण प्रदान करता है । एमटी री-ग्रोथ नियमित अंतराल पर नजर आती हैएस पोस्ट वॉशआउट कुल MTs के लिए मार्कर के साथ immunolabeling द्वारा (एंटी β-tubulin) centrosome (anti γ-tubulin) और नाभिक (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) के लिए मार्कर के साथ, प्रोटोकॉल 1में वर्णित सामान्य कार्यविधियों के अनुसार. इस प्रोटोकॉल के मीट्रिक टन depolymerization कदम आवश्यक है क्योंकि यह de नोवो मीट्रिक टन के विकास के बजाय मौजूदा MTs के विस्तार के आकलन में सक्षम बनाता है । इस तकनीक को अंय प्रकाशित प्रक्रियाओं से इसलिए अलग है depolymerization के अभाव में मीट्रिक टन विकास दर को मापने के लिए एक प्लस टिप मार्कर का उपयोग करके ऐसे अंत बाध्यकारी प्रोटीन के रूप में 3 ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े (EB3-GFP), के रूप में ट्रॅन में दिखाया गया एट अल., २०१२११। इसके अलावा, इस परख विशेष रूप से डी नोवो मीट्रिक टन विधानसभा में दोषपूर्ण भ्रूण का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है, जैसे कि पहले रिपोर्ट NEDD1 म्यूटेंट में भर्ती γ-tubulin centrosome के लिए बिगड़ा है, जिसके परिणामस्वरूप है अपूर्ण तंत्रिका ट्यूब गठन और ंयूरॉंस दोष24

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Protocol

< p class = "jove_content" > आचार कथन: नीचे वर्णित प्रक्रियाओं मैरीलैंड बाल्टीमोर काउंटी पशु देखभाल दिशानिर्देश के विश्वविद्यालय का पालन करें ।

< p class = "jove_title" > 1. स्थिर और गतिशील Immunolabeling का उपयोग कर MTs का विश्लेषण (प्रोटोकॉल 1)

  1. से पहले निर्धारण के लिए भ्रूण के मैनुअल dechorionation
    1. प्राप्त करने से अधिक प्रणाली पानी घनघोर द्वारा हौसले से पैदा भ्रूण और फिर एक प्लास्टिक पेट्री डिश में शेष भ्रूण का संग्रह (सामग्री के तालिका को देखें) ।
    2. प्रणाली पानी से किसी भी मलबे को हटाने और भ्रूण एक नया भ्रूण माध्यम से भरा पकवान को हस्तांतरण (सामग्री के तालिका को देखें) को सुनिश्चित करना है कि भ्रूण एक स्वच्छ वातावरण में विकसित करना ।
    3. २८.५ & #176 में एक तापमान नियंत्रित मशीन में वांछित चरण के लिए भ्रूण को विकसित करने के लिए अनुमति दें; C.
    4. जगह भ्रूण से छोटे 24 के बाद एक गिलास पकवान में निषेचन (hpf) से पहले dechorionation.
      नोट: निर्धारण से पहले Dechorionate भ्रूण को निर्धारण के तेजी से प्रवेश को अधिकतम करने के लिए और मीट्रिक टन अखंडता की रक्षा । dechorionation.
    5. के दौरान आवश्यक अतिरिक्त Ca 2 + प्रदान करने के लिए प्रणाली पानी के बजाय भ्रूण माध्यम का प्रयोग करें
    6. मैंयुअल रूप से भ्रूण से चोरियों को दूर करते हुए पेट्री डिश में, एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत ठीक संदंश का उपयोग कर ।
      1. दौर में एक छोटे से क्षेत्र चुटकी, पारदर्शी चोरियों कि संदंश की एक जोड़ी के साथ भ्रूण घेरना और धीरे खींच संदंश अलग करने के लिए झिल्ली में एक टूटना पैदा करते हैं ।
      2. संदंश का उपयोग कर उठी चोरियों पर नाजुक रूप से आँखों से खोलने में विस्तार । के रूप में यह टूटना सकता संदंश के साथ भ्रूण को छूने के लिए नहीं सावधान रहना ।
  2. । मंचन भ्रूण के
    1. स्थानांतरण का मंचन, dechorionated १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों के लिए भ्रूण । एक गिलास पाश्चर पिपेट.
      का उपयोग संभव के रूप में ज्यादा भ्रूण माध्यम के रूप में निकालें नोट: युवा (मध्य somitogenesis) भ्रूण पर निर्धारण और दवा उपचार करते हैं, तंत्रिका दर्द की अनुभूति, जो इच्छामृत्यु के दौरान दर्द कम करने के लिए कोई additonal प्रक्रिया की आवश्यकता होती है मध्यस्थता केंद्रों के गठन से पहले । विकास चरणों के रूप में परिभाषित कर रहे है Kimmel एट अल ., 1995 < सुप वर्ग = "xref" > २५ . 4-5 और 11-12 somite चरणों < सुदृढ वर्ग के लिए छवियों को प्राप्त करने के लिए उपयोग किया गया = "xfig" > आंकड़े 2
      और 3 .
    2. तैयार 4% paraformaldehyde (पीएफए)/MT विधानसभा बफर (मॉब) निर्धारण ( तालिका का उल्लेख सामग्री ) के संयोजन के द्वारा 1 मिलीलीटर 8% पीएफए प्रति 1 मिलीलीटर 2x मॉब और जोड़ने 2 & #181; L १००% ट्राइटन X-१०० कुल मात्रा का 1 मिलीलीटर प्रति.
      चेतावनी: दस्ताने पहनते है जबकि पीएफए और ट्राइटन X-१०० है, जो त्वचा अड़चनें है युक्त समाधान हैंडलिंग ।
    3. 1 मिलीलीटर में भ्रूण ठीक करें 4% पीएफए/मॉब निर्धारण 5 मिनट के लिए २८.५ पर & #176; C. महाप्राण एक पिपेट के साथ निर्धारण, यह 1 मिलीलीटर ताजा निर्धारण के साथ बदलें, और एक घुमाव पर कमरे के तापमान (आरटी) में 3 घंटे के लिए मशीन ।
      नोट: नमूने जल्दी से उनके जैविक तापमान पर तय किया जाना चाहिए (२८.५ & #176; C for zebrafish) तापमान पर निर्भर एमटी depolymerization को रोकने के लिए.
  3. महाप्राण निर्धारण और Tris (NP40-टीबीएस) बफर के साथ 1 मिलीलीटर 1x NP40-बफर खारा जोड़ें । धीरे एक घुमाव पर आरटी पर आंदोलन 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार । स्टोर पर भ्रूण 4 & #176; सी में 1 मिलीलीटर ताजा 1x टीबीएस-NP40 से अधिक नहीं 7 दिनों के लिए ।
    चेतावनी: जब हैंडलिंग एनपी-४०, एक त्वचा अड़चन.
  4. युक्त समाधान दस्ताने पहनें
  5. immunolabeling
    1. हीट आरटी के लिए धारा 4% कम पिघलने बिंदु (LMP) agarose एक बंद कंटेनर में माध्यम embedding जब तक समाधान एक गर्म थाली सेट का उपयोग कर स्पष्ट हो जाता है ५० & #176; सी तैनात एक विदारक माइक्रोस्कोप के करीब . कंटेनर को नमूनों के बीच बंद रखें और एम्बेडिंग प्रक्रिया के दौरान गर्म करें (steps 1.4.4-1.4.6).
    2. एक पेट्री डिश के लिए १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों से भ्रूण हस्तांतरण एक गिलास पिपेट का उपयोग कर और यह 1x टीबीएस-NP40 के साथ भरें ।
    3. somitogenesis स्टेज भ्रूण से बड़ी जर्दी कोशिकाओं को हटाने (4-5 और 11-12 somites) पेट्री डिश में एक विदारक माइक्रोस्कोप के आवर्धन के तहत ठीक संदंश का उपयोग कर < सुप वर्ग = "xref" > २६ . पूंछ कली द्वारा संदंश की एक जोड़ी के साथ भ्रूण पकड़ो और दूर छील अंय जोड़ी के साथ जर्दी कोशिकाओं के क्रम में hindbrain ऊतक के संरक्षण के लिए । पेट्री पकवान की जर्दी मलबे से मुक्त के एक क्षेत्र के लिए de-जर्दी भ्रूण स्थानांतरण ।
      नोट: agarose-भर मोल्ड में एंबेड भ्रूण व्यक्तिगत रूप से LMP agarose.
    4. के समयपूर्व सख्त रोकने के लिए
    5. भरें १ १२ मिमी x 5 मिमी x 3 मिमी के साथ २०० & #181; L पिघल LMP agarose का उपयोग कर एक micropipette. चरणों का पालन 1.4.5.-1.4.6 । जल्दी (मोल्ड भरने के 20 एस के भीतर) LMP agarose से पहले एंबेड भ्रूण को आरटी और जम को ठंडा ।
    6. का प्रयोग ठीक संदंश एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत अपने पतला अंत की ओर agarose-भरा मोल्ड को पेट्री पकवान से tailbud द्वारा एक de-जर्दी भ्रूण हस्तांतरण ।
    7. का उपयोग ठीक संदंश मोल्ड में भ्रूण ओरिएंट ऐसी है कि वांछित विमान में vibratome कटौती । इस तरह की है कि hindbrain ऊतक अपने पृष्ठीय सतह के किनारे का सामना करना पड़ रहा है और उसके पूर्वकाल सतह पतला क्षेत्र के अंत का सामना कर के साथ मोल्ड की लंबाई के समानांतर चलाता भ्रूण ओरिएंट द्वारा अनुप्रस्थ वर्गों बनाएं । दोहराएं चरणों 1.4.4-1.4.6 शेष भ्रूण के लिए ।
    8. पर 5 मिनट के लिए जमना के लिए agarose embedding अनुमति दें
    9. उत्पन्न ४० & #181; agarose एंबेडेड भ्रूण की सबसे ऊंची धुरी के मीटर वर्गों (steps 1.4.1-1.4.7) 1x vibratome-टीबीएस से भरे अनुभागीय पकवान के साथ एक NP40 का उपयोग करना । ५०० & #181 में 24-वेल प्लेट के लिए ब्याज के अनुभागों को स्थानांतरित करना; L 1x टीबीएस-NP40 का प्रयोग ठीक संदंश । अच्छी तरह से प्रति केवल एक भ्रूण के वर्गों प्लेस ।
      नोट: संदर्भ को देखें < सुप वर्ग = "xref" > 18 अधिक विवरण के लिए । यह सुनिश्चित करें कि अनुभागों में हर समय हाइड्रेटेड रहें कम से २५० & #181; agarose एंबेडिंग से पृथक्करण को रोकने के लिए शेष चरणों के लिए कम गति (10-25 rpm) में और चट्टान के एल । अवरुद्ध और धोने के समाधान में मौजूद डिटर्जेंट तरल माध्यम की सतह तनाव को कम करने और वर्गों के डुबकी की अनुमति चाहिए । जांच करें कि वर्गों के दौरान कुओं में रहते है और सभी जोड़तोड़ के बाद । बहाकर के दौरान गलती से परित्याग करने वाले अनुभागों को रोकने के लिए सावधानी का प्रयोग करें.
  6. निकालें बफ़र और जोड़ें ५०० & #181; ब्लॉकिंग समाधान के एल । RT.
    में कम से 1 ज के लिए रॉक नोट: उपयोग किया जा करने के लिए प्रत्येक द्वितीयक एंटीबॉडी की होस्ट प्रजातियों से 5% सीरा शामिल है एक ब्लॉकिंग समाधान का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिका के लिए देखें) ।
  7. में ३०० & #181; एल प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए बफर अवरुद्ध में पतला 36-72 पर 4 & #176; सी एक झूली कुरसी पर । ६०० & #181 में दो बार धोएं; L 1x टीबीएस-NP40 30 मिनट प्रत्येक के लिए एक झूली कुरसी पर, RT.
    पर नोट: कुल mts (anti & #946;-tubulin, या anti & #945;-tubulin) और स्थिर mts (anti-Glu-tubulin) या डायनेमिक mts (anti-Tyr tubulin) के विरुद्ध प्राथमिक एंटीबॉडी में मशीनिंग द्वारा डबल-लेबल सेक्शन । प्राथमिक एंटीबॉडी का चयन करें कि विभिन्न होस्ट प्रजातियों में उठाया गया है जब कुल और पोस्ट के लिए डबल लेबलिंग-अनुवाद संशोधित & #945;-tubulin आबादी । एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के लिए सामग्री के तालिका का संदर्भ लें ।
  8. में ३०० & #181; fluorophore के एल-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी 16-24 एच के लिए एक झूली कुरसी पर बफर अवरुद्ध में पतला, पर 4 & #176; सी अंधेरे में । ६०० & #181 में दो बार धोएं; L 1x टीबीएस-NP40 30 मिनट प्रत्येक के लिए एक झूली कुरसी पर, RT.
    पर नोट: इस बिंदु के बाद से पंनी में माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त बहु अच्छी तरह से पकवान लपेटो और प्रत्येक हेरफेर के बाद शमन को रोकने के लिए । द्वितीयक एंटीबॉडी का चयन करें कि प्राथमिक एंटीबॉडी के मेजबान immunoglobulin के साथ प्रतिक्रिया. अलग, गैर अतिव्यापी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा है कि माध्यमिक एंटीबॉडी fluorophores चुनें । एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के लिए सामग्री
    के तालिका का संदर्भ लें ।
  9. ५०० में भ्रूण की मशीन & #181; DAPI समाधान के एल 30 मिनट के लिए एक झूली कुरसी पर, rt. धो में तीन बार टीबीएस-NP40 5 मिनट के लिए आरटी पर कमाल प्रत्येक.
    नोट: नाभिकीय लेबलिंग १.१२ चरण में किए गए मीट्रिक टन ठहराव के लिए सेलुलर प्रसंग प्रदान करता है.
  10. एक धूल से मुक्त स्लाइड के केंद्र पर विरोधी फीका एजेंट के साथ बढ़ते माध्यम की एक बूंद जगह है । बढ़ते मध्यम छोटी बूंद के लिए वर्गों हस्तांतरण करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें । नमूना के शीर्ष पर एक धूल मुक्त coverslip प्लेस । स्लाइड एक सूखी, अंधेरे, और शांत जगह में स्टोर, पंनी में लिपटे, जब तक इमेजिंग किया जाता है ।
    नोट: इमेजिंग करने से पहले एक ठीक-इत्तला दे दी स्थायी मार्कर का उपयोग कर स्लाइड के पीछे पर वर्गों चक्कर लगाना वर्गों की पहचान करने के लिए जब माइक्रोस्कोप का उपयोग करने में मदद मिलेगी.
  11. फोकल इमेजिंग
    1. उद्देश्य का सामना करना पड़ coverslip के साथ मंच के लिए स्लाइड चिपका द्वारा एक औंधा लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप पर माउंट । एक नियंत्रण स्लाइड पर उपयुक्त प्रकाशिकी (उद्देश्य, लेजर, और चैनल सेटिंग्स जैसे लाभ और ऑफसेट) निर्धारित करें और उंहें नमूनों के बीच सुसंगत रखें < सुप क्लास = "xref" > 27 . पिक्सेल को डेटा हानि रोकने के लिए संतृप्त करने से बचें ।
    2. पर कब्जा Z-स्टैक्स फोकल छवियां चयनित द्वितीयक एंटीबॉडी fluorophores के लिए चैनल सेटिंग्स का उपयोग कर और छवि फ़ाइलों को सहेजें < सुप वर्ग = "xref" > २७ . प्रत्येक अनुभाग के लिए Z-स्टैक्स प्राप्त करना.
      नोट: < सशक्त वर्ग में छवियों को प्राप्त करने के लिए उपयोग किए गए पैरामीटर्स को दोहराने = "xfig" > आंकड़े 2
      और 3 निम्न प्राप्ति सेटिंग्स का उपयोग करके: मोड = XYZ; उद्देश्य आवर्धन = 63X तेल विसर्जन लेंस; उद्देश्य संख्यात्मक एपर्चर = १.४; Z चरण = ०.१ & #181; m; Z-गहराई = १६.२३ & #181; m. निंन चैनल सेटिंग्स का उपयोग करें: DAPI उत्तेजना 20% यूवी रेंज लेजर के साथ, उत्सर्जन फ़िल्टर रेंज = 430-480 एनएम, photomultiplier (pmt) लाभ = ५२५ V, और pmt ऑफ़सेट =-१.७२%; ४४८ एनएम fluorophore ( तालिका सामग्री के लिए देखें) 20% ४८८ एनएम लेजर के साथ उत्तेजना, उत्सर्जन फिल्टर रेंज 493-573 एनएम, pmt गेन = ६८९ V, और pmt ऑफ़सेट =-०.२%; ३२% ५९४ एनएम लेजर के साथ ५९४ एनएम fluorophore उत्तेजना, उत्सर्जन फिल्टर रेंज = 608-706 एनएम, पीएमटी लाभ = ७६८ वी, और पीएमटी ऑफसेट =-६.८%.
    3. अद्वितीय, वर्णनात्मक फ़ाइल नाम के साथ रॉ डेटा फ़ाइलों को बचाने और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में संपादन के लिए एक प्रतिलिपि बनाने के लिए ।
  12. अधिकतम अनुमानों को प्रदर्शित करने के लिए Z-पोट का संकलन
    1. सार्वजनिक डोमेन 3-डी छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर ( उदा. , ImageJ) का उपयोग करके डेटा फ़ाइल की प्रतिलिपि खोलें । जांच करें कि प्रत्येक चैनल एक व्यक्तिगत छवि अनुक्रम (Z-स्टैक्स) के रूप में प्रकट होता है ।
    2. निम्न मेनू अनुक्रम का उपयोग करके छवि चैनल विभाजित करें: & #8220; images/Color/विभाजन & #8221;.
    3. निंन मेनू अनुक्रम का उपयोग करके रुचि के चैनलों को अधिव्याप्त करके कोई मर्ज की गई छवि बनाएं: & #34; छवियां/रंग/& #34; ५९४ एनएम, ४८८ एनएम, और DAPI चैनल का चयन करने के लिए झूठी रंग लाल, हरे और नीले, क्रमशः । चेक & #34; बनाएं समग्र & #34; र चय & #34; ओके & #34; < सुप class = "xref" > 28 .
      नोट: DAPI चैनल को बेहतर रूप से विस्तृत करने के लिए एक अधिकतम प्रोजेक्शन में MTs के रूप में विशिष्ट विवरण देना < सशक्त वर्ग = "xfig" > आरेख 2 और 3 , केवल अन्य दो चैनलों के लिए false रंग चुनकर.
    4. मर्ज किए गए z-स्टैक की जांच करें और सभी दृश्यमान चैनलों के लिए भीतरी सर्वश्रेष्ठ Z-विमानों की शुरुआत और समाप्त होने वाली स्थितियों का ध्यान रखें । आम तौर पर अनुभाग की असमान सतहों के कारण उपइष्टतम संकेत है कि बाहरी जेड-विमानों को खारिज. संदर्भ को देखें < सुप वर्ग = "xref" > २९ माहिती.
    5. निंन 3-डी छवि विश्लेषण मेनू अनुक्रम का उपयोग करके z-स्टैक की अधिकतम तीव्रता प्रोजेक्शन का प्रदर्शन करके मर्ज किए गए z-स्टैक को एकल 2-डी छवि के रूप में विज़ुअलाइज़ करें: & #34; images/स्टैक/Z-project. & #34; आंतरिक श्रेष्ठ के प्रारंभ और समाप्त होने वाले स्थान दर्ज करें Z-विमानों से कदम 1.11.3 के रूप में & #34; प्रारंभ स्लाइस & #34; व & #34; रोक स्लाईस, & #34; क्रमशः । Select & #34; अधिकतम तीव्रता & #34; प्रक्षेपण के प्रकार के रूप में और क्लिक करें & #34; ओके & #34;. संदर्भ को देखें < सुप वर्ग = "xref" > २८ अधिक माहिती.
  13. का विश्लेषण एमटी लेबलिंग
    1. वाणिज्यिक 3-डी छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें । Select & #34; लायब्रेरी बनाएं & #34; और छवि लायब्रेरी के लिए एक वर्णनात्मक नाम प्रदान करें । Click & #34; create. & #34; फोकल माइक्रोस्कोप से लाइब्रेरी में जेनरेट की गई raw छवि फ़ाइलों को खींचें. बड़ी फ़ाइलों को स्थानांतरित करने के लिए और अधिक समय की आवश्यकता है ।
    2. विश्लेषण करने के लिए किसी फ़ाइल का चयन करें । चुन & #34; विस्तारित फोकस & #34; से & #34; दृश्य & #34; मेनू मुख्य विंडो में चैनल मर्ज की गई छवि प्रदर्शित करने के लिए.
    3. एक चैनल के लिए स्लाइडर उपकरण खींचकर छोड़ दिया है या सही जब तक पृष्ठभूमि संकेत कम है और सही संकेत मजबूत है थ्रेसहोल्ड समायोजित करें । ध्यान रखें कि प्रत्येक चैनल लेबल अणु के लिए एक सच्चे संकेत दिखाता है ( जैसे , DAPI चैनल दिखा आयताकार या mitotic नाभिक लेकिन प्रतिदीप्ति या कोशिका से ऑटो agarose नहीं).
    4. का चयन & #34; मुक्तहस्त क्षेत्र ब्याज (ROI) & #34; उपकरण और विश्लेषण किया जा करने के लिए ब्याज की क्षेत्र की रूपरेखा. Select & #34; actions & #34; tab के बाद & #34; फसल को चयन & #34; छवि को क्रॉप करने के लिए । किसी नए नाम के अंतर्गत क्रॉप की गई छवि फ़ाइल सहेजें. 3-डी विश्लेषण से संबंधित विशिष्ट ऑब्जेक्ट्स को फ़िल्टर करने के लिए प्रोटोकॉल बनाने के लिए & #34; माप & #34; टैब पर क्लिक करें.
    5. खीच & #34; ऑब्जेक्ट् स & #34; को प्रोटोकॉल विंडो में ढूंढें । पहले प्रोटोकॉल & #34;D api का नाम बदलें । & #34; ड्रॉपडाउन मेनू में DAPI चैनल का चयन करें. निंन सेटिंग्स को DAPI प्रोटोकॉल पर खींचें और उंहें नीचे रखें & #34; ऑब्जेक्ट्स खोजें & #34; निम्न क्रम में ( Table 1 ): & #34; ऑब्जेक्ट्स में छिद्र भरें & #34;;; & #34; पृथक मार्मिक वस्तुएं & #34;; & #34; ऑब्जेक्ट्स को आकार से निकालें & #34;; & #34; छोडी न छू ROIs & #34;.
      नोट: तालिका 1 में सेटिंग्स का लक्ष्य है पहले एक थ्रेशोल्ड सेट करने के लिए जो संकेतों का वितरण और आकार का विश्लेषण किया जा रहा ऑब्जेक्ट्स के आकार के साथ असंगत हैं जो संकेत छोड़ देता है । उदाहरण के लिए, एक संकेत को समाप्त करने के लिए पर्याप्त नहीं एक नाभिक जब गिनती नाभिक.
    6. के लिए शेष फ़िल्टर को इकट्ठा करने के लिए अनुक्रम (step 1.12.9) का पालन करें & #946;-tubulin और अन्य मार्कर तालिका 1 .
    7. में सेटिंग्स का उपयोग कर
    8. Select & #34; माप & #34; प्रत्येक प्रोटोकॉल के तल पर । चुन & #34; तीव्रता र मात्रा मापन & #34; र & #34; कंकाली लम्बाई & #34; सभी tubulin लेबलिंग के लिए, लेकिन केवल DAPI संकेत के लिए पूर्व.
    9. मापा जा करने के लिए क्षेत्र के आसपास एक रॉय आकर्षित । इस क्षेत्र को सॉफ्टवेयर प्रोसेस करने के बाद & #34; सारांश & #34; टैब के तहत माप पर गौर करें । डेटा की प्रतिलिपि बनाएं और उंहें एक व्यावहारिक स्प्रेडशीट को बचाने के लिए, के रूप में तालिका में 2 । बाद में विश्लेषण के लिए स्प्रेडशीट की बैक-अप प्रतिलिपि बनाएं ।
    10. ब्याज की माप का चयन करें (उदाहरण के लिए, मीट्रिक टन बंडल की लंबाई, मीट्रिक टन बंडलों की संख्या/ विभिंन मार्करों) स्प्रेडशीट में और प्रत्येक समूह के लिए औसत निर्धारित करने के लिए विश्लेषण ।
      नोट: औसत मीट्रिक टन बंडल लंबाई = का योग & #39; मतलब कंकाल की लंबाई के लिए & #946;-tubulin & #39; प्रत्येक भ्रूण की कुल संख्या से विभाजित भ्रूण के लिए । तालिका 2 की पंक्ति 20 को देखें । स्प्रेडशीट स्वरूपित करें ताकि चर और प्रयोगात्मक समूहों को आसानी से ग्राफी रहे हैं ।
< p class = "jove_title" > 2. डी नोवो मीट्रिक टन विधानसभा परख (प्रोटोकॉल 2)

  1. का निर्माण और परीक्षण बहु-well प्रवाह के माध्यम से उपकरण (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ) 2 दिन पहले प्रयोग करने के लिए ।
    नोट: उपकरण nocodazole सामग्री के तालिका से आपूर्ति का उपयोग कर उपचार के बाद कई प्रयोगात्मक समूहों के एक साथ वॉशआउट सक्षम बनाता है । सिलिकॉन मुहर लगाने से पहले यह भ्रूण के लिए कोई विषाक्तता जोखिम बन गया है सुखाने के समय के कम से 24 ज की आवश्यकता है ।
    1. आधा लंबाई में एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब विभाजन, एक जिग या बैंड का उपयोग कर देखा ।
    2. कट 7 अर्द्ध हलकों, 3 सेमी के एक त्रिज्या के साथ, ७० से बाहर & #181; मीटर नायलॉन जाल और उन्हें ट्रिम कर दीजिए एक विभाजन केंद्रापसारक ट्यूब के आधे में कसकर फिट करने के लिए. गोंद सेमी-हलकों में 10 मिलीलीटर उंनयन मछलीघर सुरक्षित सिलिकॉन मुहर का उपयोग चिह्नों के समानांतर ट्यूब । 2 दिन के लिए सूखी और 2-3 घंटे के लिए पानी की एक चोंच में भिगोने से कुल्ला करने के लिए डिवाइस की अनुमति दें
    3. रेखा के ऊपर (लड़ी पिरोया) अंत मॉडलिंग मिट्टी के साथ काट केंद्रापसारक ट्यूब की है कि तरल की ऊंचाई प्रवाह के माध्यम से डिवाइस में बनाए रखा की एक गहराई है & #188; इंच (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा १ , विचार २ व ३).
    4. एक ५०-एमएल सिरिंज से सवार को हटाने और टिप में ठीक टयूबिंग के 12 इंच डालने के द्वारा वॉशआउट तंत्र तैयार करते हैं । में टयूबिंग धक्का के रूप में दूर के रूप में यह जाना और संयुक्त चारों ओर सील होगा मॉडलिंग क्ले का उपयोग कर ।
    5. पूर्व गीला जाल भ्रूण का उपयोग करने के लिए तरल पूरे प्रवाह के माध्यम से डिवाइस के माध्यम से चलाने के लिए अनुमति देने के लिए । कोण बर्फ पर डिवाइस इतना है कि सभी डिब्बों में तरल पूल लेकिन अभी भी बाहर सामने खाली जहां मिट्टी रिम स्थित है । एक रिंग स्टैंड का उपयोग कर, बर्फ पर फ्लो-थ्रू डिवाइस के ऊपर वॉशआउट तंत्र को निलंबित करें (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा १ ).
    6. बर्फ पर भ्रूण के माध्यम से २०० मिलीलीटर ठंड और वॉशआउट तंत्र में पर्याप्त डालना सुनिश्चित करें कि सभी हवाई बुलबुले और मंजूरी दे दी है कि प्रवाह की दर लगभग 7 मिलीलीटर/सिरिंज की ऊंचाई बदलकर प्रवाह दर को समायोजित करें ।
  2. Enzymatically dechorionate भ्रूण
    1. गैर विशिष्ट को हल करने की एक समाधान बनाओ कमजोर द्वारा 1 मिलीलीटर 10 मिलीग्राम/एमएल गैर विशिष्ट को 20 मिलीलीटर भ्रूण माध्यम में की चिढ़ाना स्टॉक ।
    2. भ्रूण पर रासायनिक dechorionation प्रदर्शन 1 ज timepoint से पहले जब वे वांछित विकासात्मक मंच तक पहुंचने की उंमीद कर रहे हैं । १०० mm पेट्री से भ्रूण के माध्यम से निकाली जाने वाली चोरियों को पचाने में होता है जिसमें भ्रूण का मंचन किया जाता है और 20 मिलीलीटर गैर-विशिष्ट कार्य समाधान को जोड़ते हैं ।
    3. में ३७ & #176; C 5 min.
      के लिए नोट: 5 मिनट से अधिक नहीं है या गैर के एक उच्च एकाग्रता का उपयोग करें विशिष्ट चिढ़ा समाधान, के रूप में इस के अलावा गिरने भ्रूण में परिणाम होगा एक बार nocodazole के साथ इलाज किया ।
    4. जल्दी से बाहर पिपेट गैर विशिष्ट चिढ़ाने और लगभग 25 मिलीलीटर भ्रूण माध्यम से फिर से भरना व्यंजन । एक बार दोहराएं ।
    5. एक 1-एमएल ग्लास पिपेट का उपयोग कर, 24 hpf से छोटे भ्रूण को नुकसान से बचाने के लिए कांच के व्यंजन को हस्तांतरण ।
    6. पूरा dechorionation मैंयुअल रूप से ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर चोरियों को हटाने के द्वारा, के रूप में कदम 1.1.5.
    7. में वर्णित
    8. जगह ग् पेट्री व्यंजन में dechorionated भ्रूण युक्त एक २८.५ & #176; सी मशीनर 30 मिनट की एक ंयूनतम के लिए जब तक वे इच्छित विकासात्मक चरण तक पहुंचने ।
  3. Depolymerize मौजूदा MTs
    1. 5 & #181 के काम समाधान तैयार करते हैं; g/मब nocodazole के संयोजन द्वारा ५० & #181; L 1 mg/एमएल स्टॉक nocodazole 10 मिलीलीटर बर्फ ठंडा भ्रूण मध्यम के साथ.
      चेतावनी: उपयोग दस्ताने जब हैंडलिंग nocodazole, एक त्वचा अड़चन.
    2. nocodazole उपचार समूह के भ्रूण माध्यम का आदान-प्रदान 10 मिलीलीटर शीत nocodazole काम समाधान के साथ । विकास के चरण के लिए एक उपयुक्त समय के लिए बर्फ पर पेट्री व्यंजन प्लेस (उदाहरण के लिए, 4-5 somite भ्रूण के लिए 1 एच) । बर्फ पर एक पेट्री डिश में एक तरफ अनुपचारित नियंत्रण भ्रूण सेट कदम 2.3.4.1.
    3. में वॉशआउट नमूनों के साथ तय हो
    4. स्थानांतरण भ्रूण एक आग पॉलिश का उपयोग 1-एमएल ग्लास पिपेट प्रवाह के माध्यम से तंत्र के लिए, प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए अलग डिब्बों का उपयोग कर । ५० मिलीलीटर सिरिंज के शीर्ष में बर्फ शीत भ्रूण माध्यम डालने के द्वारा nocodazole वॉशआउट शुरू करो.
      नोट: प्रायोगिक समूह के अनुसार कम से 30 भ्रूण का प्रयोग करें । प्रयोगात्मक समूहों नियंत्रण भ्रूण या morpholino या आरएनए के एक किस्म-भ्रूण इंजेक्शन से मिलकर सकता है । वॉशआउट के बारे में कुल की आवश्यकता होगी १५० भ्रूण माध्यम के मिलीलीटर के लिए हर 8-10 मिनट वॉशआउट जोड़ा जा nocodazole जबकि जारी रखने के लिए बर्फ के साथ मीट्रिक टन विकास को बाधित । बर्फ पर भ्रूण रखते हुए इस परख की सफलता के लिए आवश्यक है क्योंकि MTs ठंड तापमान और ठंड में देरी जल्दी भ्रूण में विकास पर अस्थिर कर रहे हैं ।
    5. की अनुमति MTs वॉशआउट के 20 मिनट के बाद आरटी पर ग्लास पेट्री गर्म युक्त व्यंजन के लिए भ्रूण स्थानांतरित द्वारा (२८.५ & #176; ग) भ्रूण के माध्यम से एक आग पॉलिश का उपयोग कर 1 एमएल ग्लास पिपेट । जैसे ही भ्रूण स्थानांतरित होता है, एक टाइमर शुरू करते हैं ।
      1. 1 मिनट, 5 मिनट और 10 मिनट में pipetting द्वारा नियंत्रण और वॉशआउट भ्रूण को ठीक एक १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में 1 मिलीलीटर 4% पीएफए के साथ भरा मॉब फिक्स (२८.५ & #176; C) और चरण 1.2.3 में निर्देशों का पालन ।
  4. के लिए नमूनों को तैयार immunolabeling के रूप में 1.3-1.5 वर्गों में वर्णित है ।
  5. Immunolabel फ्लोटिंग वर्गों और छवि भ्रूण वर्गों में वर्णित के रूप में 1.6-1.10 प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए निम्न परिवर्तन विनिर्देशों के साथ: उपयोग 1:500 खरगोश विरोधी & #947;-tubulin और 1:200 माउस विरोधी & #946;-tubulin.
  6. प्रक्रिया और 3-डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण, चरण १.१२ में वर्णित के रूप में.

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Representative Results

स्थिर और गतिशील immunolabeling का उपयोग कर MTs का विश्लेषण
प्रोटोकॉल 1में, मीट्रिक टन उप के वितरण जल्दी (तंत्रिका कील) और देर के दौरान (तंत्रिका रॉड) तंत्रिका ट्यूब विकास के चरणों का पता चला है, Glu-tubulin और Tyr-स्थिर और गतिशील MTs के लिए मार्करों के रूप में tubulin, क्रमशः का उपयोग कर । गतिशील टन प्रबल में hindbrain तंत्रिका किलिंग चरण (4-5 somites) (चित्रा 2ए-डी) में । के रूप में कील तंत्रिका रॉड में विकसित (11-12 somites), बढ़ाया उपर्त्वचीकरण के एक मंच, गुणात्मक कम MTs विरोधी के साथ immunoreactive रहे है Tyr-tubulin एंटीबॉडी (चित्रा 2ई-एच), विशेष रूप से ventral रॉड में । इसके विपरीत, Glu-tubulin बिखरा हुआ है और तंत्रिका (चित्रा 3ए-डी) भर में कबरा है, लेकिन टन के साथ ventral तंत्रिका रॉड में समृद्ध है (चित्रा 3ई एच) । ऐरोहेड इंगित करने के लिए विशिष्ट मीट्रिक टन बंडलों या संरचनाओं जहां लेबल वृद्धि हुई है ।

हालांकि दोनों विरोधी Glu-tubulin और विरोधी Tyr-tubulin एंटीबॉडी एक ही मेजबान प्रजातियों में उत्पादित किया गया (एक डबल लेबलिंग प्रयोग को रोकने), इन परिणामों से संकेत मिलता है कि स्थिर और गतिशील मीट्रिक मार्कर शायद ही कभी zebrafish hindbrain में ओवरलैप. सबसे पहले, ventral तंत्रिका रॉड अधिक स्थिर है (चित्रा 3एफ) से गतिशील (चित्रा 2एफ) MTs. प्रवृत्ति पृष्ठीय तंत्रिका रॉड में उलट है, zebrafish neurulation के एक मॉडल है जिसमें पृष्ठीय ऊतक गतिशील रहता है जब तक तंत्रिका ट्यूब20का गठन किया है के साथ संगत । दूसरे, जबकि mitotic धुरी पूरी तरह से Tyr के साथ लेबल कर रहे हैं-tubulin तंत्रिका में एंटीबॉडी (चित्रा 2डी, ऐरोहेड), केवल धुरी के आधार, centrosome के साथ संयोग, स्थिरता मार्कर के साथ लेबल है Glu-tubulin ( चित्र 3 D, ऐरोहेड) । β-tubulin इम्यूनोफ्लोरेसेंस, दोनों परख करने के लिए आम, सभी टन के वितरण के प्रयोगकर्ता बताते है और एक आधार प्रदान करता है गैर विशेष लेबल को खारिज ।

3-डी छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके ऑब्जेक्ट्स मापने से डेटा की बड़ी मात्रा में परिणाम होता है जिसे सुविधाजनक तालिका (तालिका 2) में व्यवस्थित किया जा सकता है । लंबाई, गणना, और क्षेत्र माप करने के लिए, हम केवल उस डेटा के सबसेट का उपयोग कर रहे हैं, जिसका विश्लेषण करने के लिए उपलब्ध है. डेटा है कि हम आगे का विश्लेषण नहीं कर के घटकों में से एक की पहचान की वस्तुओं की संख्या है । यह संख्या एक आंतरिक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है, के रूप में संख्या वर्गों की तरह के बीच व्यापक रूप से भिन्न नहीं होना चाहिए, और नाभिक के अनुपात के लिए MTs एक एकल उपचार स्थिति में समान रहना चाहिए. एक ग़ैर एक संकेत है कि या तो विश्लेषण समायोजित फिल्टर के साथ फिर से दौड़ की जरूरत है या कि छवि बहुत खराब है विश्लेषण के लिए लेबल है । इस प्रकार, सभी ग़ैर छवियों समायोजित सेटिंग्स के साथ reश्लेषित किया जाना चाहिए । ग़ैर खंड खराब लेबलिंग या शारीरिक क्षति है कि असामांय वस्तु गिनती में परिणाम हो सकता है के संकेत के लिए जांच की जानी चाहिए । एक बार विश्लेषण समाप्त हो गया है और गुणवत्ता नियंत्रित, उपयोगी जानकारी जैसे कुल mts और स्थिर mts या स्थिर mts के अनुपात की औसत लंबाई के रूप में कच्चे डेटा से पुनर्प्राप्त किया जा सकता कुल mts (तालिका 3) । इन माप के अलावा, कई अंय मैट्रिक्स 3-डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है कि टन के बारे में अनुमान आकर्षित या अंय सेलुलर संरचनाओं (नाभिक, centrosome, आदि) के लिए उनके संबंध का इस्तेमाल किया जा सकता है

De नोवो मीट्रिक टन विधानसभा परख
nocodazole उपचार depolymerizes MTs फैलाना लेबलिंग में जिसके परिणामस्वरूप (चित्रा 4A, 4d, और 4g). के रूप में MTs regrow, वे centrosome (चित्रा 4बी, 4E, और 4H) से विस्तार, तथापि, यह एक एकल विमान में उनके गैर planar पथ (चित्रा 4सी, 4F, और 4i) के कारण स्पष्ट नहीं किया जा सकता है । फिर भी, कुछ छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर 3-डी में लंबाई को मापने में सक्षम हैं, nocodazole वॉशआउट के बाद मीट्रिक टन विकास के एक आकलन को सक्षम करने (तालिका 4) । एक महत्वपूर्ण अवलोकन है कि तालिका 4 में डेटासेट से प्राप्त किया जा सकता है कि टन का मतलब लंबाई के बाद समय के साथ वृद्धि करने के लिए प्रकट होता है तंत्रिका ट्यूब के सभी क्षेत्रों में nocodazole वॉशआउट विश्लेषण किया । जैसा कि ऊपर बताया गया है, 3-डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर से प्राप्त मैट्रिक्स के अन्य प्रकार के मीट्रिक टन डेटा की व्याख्या करने के लिए सेलुलर संदर्भ प्रदान कर सकते हैं (उदाहरण के लिए, प्रति नाभिक MTs का अनुपात).

Figure 1
चित्र 1 : के लिए वॉशआउट तंत्र का चित्रण de नोवो मीट्रिक टन विधानसभा परख । इनसेट एक ५०-एमएल केंद्रापसारक ट्यूब कट लंबाई में चिपके जाल से बने प्रवाह के माध्यम से एक बंद-अप डिवाइस है । मेष compartmentalizes प्रवाह के माध्यम से उपकरण है कि कई प्रयोगात्मक समूहों को एक साथ संसाधित किया जा सकता है । उपयोग के दौरान, भ्रूण माध्यम सिरिंज में जोड़ा जाता है और धीरे ट्यूब के माध्यम से प्रवाह को भरने के लिए उपकरण के माध्यम से बहती है, सभी प्रयोगात्मक समूहों के लिए एक निरंतर कुल्ला प्रदान. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: immunolabeling का उपयोग करने के लिए छवि गतिशील MTs. Dechorionated भ्रूण उचित चरणों में (4-5 ए डी और 12-13 somites में ई एच) में तय किया गया, transversely hindbrain के माध्यम से खोदी, और immunolabeled के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ β-tubulin (ग्रीन में एक और ) सभी MTs और tyrosinated α-tubulin ( B और Fमें लाल) को चिह्नित करने के लिए डायनेमिक मीट्रिक टन आबादी प्रकट करने के लिए । उच्च गतिशील MTs मर्ज किए गए चित्रों (C, G) और उनके उच्च आवर्धन (d, H) में उन क्षेत्रों के रूप में देखी जा सकती है जहां पीला लेबल दृश्यमान है (ऐरोहेड में d, h) । स्केल पट्टियां = 25 µm (A-C और E-G) और 10 µm (D and H) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
igure 3: immunolabeling का उपयोग करने के लिए छवि स्थिर MTs. Dechorionated भ्रूण तय किया गया, hindbrain के माध्यम से खोदी गई, और उपयुक्त चरणों में immunolabeled (4-5 somites में ए-डी और 12-13 somites में ई-एच). स्थिर mts α के detyrosinated रूप-tubulin (Glu-tubulin) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लेबल कर रहे हैं ( बी और एफमें लाल) जबकि कुल टन एक सामांय β-tubulin एंटीबॉडी (हरे रंग में एक और ) के साथ visualized थे । मर्ज किए गए चित्रों में लाल और पीले संकेत (C, G) और उनके उच्च आवर्धन (d, h) उच्च मीट्रिक टन स्थिरता (ऐरोहेड d, h में) के क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्केल पट्टियां = 25 µm (A-C और E-G) और 10 µm (D and H) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: immunolabeling की छवि नवजात टन का उपयोग करें । hindbrain के माध्यम से 4-5 somites और transversely खोदी गई Dechorionated भ्रूणों को ठीक किया गया । वर्गों β-tubulin के साथ immunolabeled थे (डी, ई, और एफ) बढ़ती MTs और γ-tubulin (A, B, और C) को चिह्नित करने के लिए nucleation बिंदु/centrosome । तंत्रिका ट्यूब का एक पृष्ठीय क्षेत्र (ए, डी में बॉक्स्ड है; B, E और C-F) और उच्च आवर्धन पर दिखाया गया (G, H, I, क्रमशः) प्रकट करने के लिए नाभिक (DAPI, नीला), centrioles (γ-tubulin, red) और कुल MTs (β-tubulin, हरा). व्हाईट ऐरोहेड: colocalization ऑफ MTs आणि centrioles; पीली ऐरोहेड: किसी कोशिका का दूसरा centriole दिखाई देता है । स्केल पट्टियां = 25 µm (A-F) और 10 µm (G-I) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Table 1
तालिका 1:3-डी छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में ऑब्जेक्ट्स को फ़िल्टर करने के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स ।

Table 2
तालिका 2: प्रतिनिधि कच्चे डेटा सेट 3-डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त स्थिर MTs का विश्लेषण करने के लिए। प्रत्येक स्तंभ किसी एकल अनुभाग से माप का प्रतिनिधित्व करता है । Min: सबसे छोटा माप; अधिकतम: सबसे बड़ा माप; एसडी: मानक विचलन; SE: मानक त्रुटि ।

Table 3
तालिका 3:3-डी छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर से प्राप्त किए जा सकने वाले डेटासेट के उदाहरण स्थिर MTs को बढ़ाता है। कुल का मतलब लंबाई की माप का चयन करें (β-tubulin) और स्थिर (Glu-tubulin) MTs सभी नमूनों से प्रासंगिक लेबल के लिए मतलब कंकाल लंबाई का औसत लेने के द्वारा गणना ( तालिका 2को देखें) और कुल MTs करने के लिए स्थिर का अनुपात ( β-tubulin धारिता प्रति Glu-tubulin धारियाँ) औसत β-tubulin गणना औसत Glu-tubulin गणना द्वारा विभाजित लेने के द्वारा परिकलित ।

Table 4
तालिका 4: डेटासेट के उदाहरण जो 3-डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर से प्राप्त किए जा सकते हैं, का विश्लेषण करने के लिए de नोवो मीट्रिक टन विधानसभा। प्रतिनिधि परिणाम nocodazole वॉशआउट के बाद तीन पुनर्प्राप्ति समय बिंदुओं (1, 5 और 10 मिनट) के लिए प्राप्त किए गए डेटासेट की तुलना, de नोवो मीट्रिक टन असेंबली प्रयोग से । प्रत्येक समय बिंदु के लिए, परमाणु गणना के लिए प्राप्त माप, centrioles (γ-tubulin puncta), कुल MTs की संख्या (β-tubulin धारियाँ), imaged विश्लेषण के चयनित क्षेत्रों के लिए दिखाए जाते हैं (विकासशील तंत्रिका ट्यूब के पार अनुभाग).

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Discussion

वर्तमान में इमेजिंग मीट्रिक टन गतिशीलता के लिए प्रारंभिक zebrafish विकास में कई तरीके हैं, टैग अणुओं की लाइव इमेजिंग से फिक्स्ड ऊतक के immunolabeling के लिए11,12,13,14। हालांकि एक सेल में mts या तो गतिशील या स्थिर राज्यों में मौजूद कर सकते हैं, उपर्त्वचीकरण एक प्रक्रिया में mts उत्तरोत्तर समय के साथ स्थिर रहे हैं । स्थिर और गतिशील MTs के लिए मार्कर का उपयोग करना इस घटना की कल्पना करने का एक तरीका प्रदान करता है । विधि यहां प्रस्तुत 3-डी इमेजिंग सॉफ्टवेयर की शक्ति का leverages भ्रूण zebrafish ऊतक के एक पार अनुभाग में स्थिर मीट्रिक टन आबादी को गतिशील से संक्रमण है । प्रोटोकॉल 2में, विधि नवजात MTs की एक अलग जनसंख्या लेबल और उनके nucleation और विकास ओवरटाइम का पालन करने के लिए उपयोग किया जाता है ।

MTs बेहद मुश्किल से अपने पैतृक राज्य में छवि को depolymerize के लिए उनके प्रवृत्ति के कारण कर रहे हैं । इस प्रकार, इस विधि के प्रमुख घटक पूरे भ्रूण भर में MTs का तेजी से निर्धारण है । यह शारीरिक तापमान पर निर्धारण शुरू करने और एक बफर कि दोनों MTs स्थिर और भ्रूण की पारगम्यता बढ़ जाती है का उपयोग करके हासिल की है । निर्धारण समय भी महत्वपूर्ण है के रूप में कटौती निर्धारण के लिए MTs गिरफ्तारी में विफल रहता है, जबकि अधिक निर्धारण epitopes मुखौटा, एंटीबॉडी बंधन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । 3-4 एच का सुझाव दिया निर्धारण समय भ्रूण के साथ काम करता है कि मध्य में है gastrulation अप करने के लिए 24 घंटे के बाद निषेचन । समय के पैमाने के छोटे अंत की ओर भ्रूण के करीब 3 घंटे के लिए तय किया जाना चाहिए, जबकि पुराने भ्रूण पूरे 4 एच की आवश्यकता हो सकती है । यहां तक कि उचित निर्धारण के साथ, MTs समय के साथ depolymerize होगा ताकि अनुभाग और immunolabeling फिक्सिंग के एक सप्ताह के भीतर घटित होना चाहिए ।

एक बार ऊतक ठीक से तय हो गया है, समस्याओं immunolabeling के साथ पैदा कर सकते हैं । सबसे आम समस्या का सामना करना पड़ा ऊतक के केंद्र के माध्यम से गरीब पैठ गया है, विशेष रूप से, अगर बहुत सारे वर्गों में एक ही अच्छी तरह से मशीन हैं । प्राथमिक एंटीबॉडी और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए गर्मी के समय की एकाग्रता में वृद्धि, डिटर्जेंट बढ़ाने के लिए भ्रूण के permeabilization में सुधार के साथ संयुक्त immunolabeling समस्याओं के सबसे उंनति होगी । यदि एंटीबॉडी लेबलिंग के कारण निर्धारण समस्याओं या immunolabeling समस्याओं के लिए विफल रहता है, यह एंटीबॉडी लेबलिंग पैटर्न का परीक्षण करके कारण निर्धारित करने के लिए संभव है । गरीब निर्धारण झिल्ली में तीव्र लेबलिंग में परिणाम और कोशिका में लेबल फैलाना होगा, जबकि अधिक निर्धारण कमजोर लेबलिंग कि मीट्रिक टन वास्तुकला को बनाए रखने में परिणाम होगा । एंटीबॉडी के गरीब प्रवेश, तथापि, लेबल के बिना ऊतक के केंद्र में क्षेत्रों के रूप में दिखाई देगा ।

एक सार्थक तरीके से मीट्रिक टन छवियों का विश्लेषण करने की क्षमता उच्च गुणवत्ता इमेजिंग पर निर्भर है । 3-डी में MT लंबाई कैप्चर करने के लिए, न्यूनतम Z-चरण आकार उद्देश्य और संख्यात्मक एपर्चर के लिए संभव उपयोग किया जाना चाहिए । छवियां यहां दिखाया १.४ संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 63X तेल emersion उद्देश्य के साथ कब्जा कर लिया गया निंनलिखित उत्पादन: पिक्सेल = २४० एनएम, जेड कदम = ०.१ µm, z-स्टैक आकार = १६.२५२ µm । क्योंकि एक एकल मीट्रिक टन की चौड़ाई 25 एनएम है, एक हल्के माइक्रोस्कोप के लिए संकल्प की सीमा के नीचे लगभग 10 बार, इस मीट्रिक सही ढंग से इस तकनीक का उपयोग कर मापा नहीं जा सकता. इसके बजाय, केवल मीट्रिक टन लंबाई के बराबर या न्यूनतम पिक्सेल आकार में प्राप्य सभी तीन आयामों से अधिक मापा जा सकता है । लाइन और/या फ्रेम औसत मीट्रिक टन संकेत परिभाषा में वृद्धि कर सकते हैं । मीट्रिक टन विश्लेषण उच्च गुणवत्ता वर्गों के लिए आरक्षित किया जाना चाहिए । जबकि गरीब निर्धारण के साथ ऊतक और छवि का विश्लेषण नहीं किया जा सकता है, हल्के पुनर्निर्धारण ध्यान से लेजर तीव्रता बढ़ाने से counterbalanced जा सकता है और एक अच्छा गतिशील रेंज को बनाए रखते हुए कमजोर संकेत का पता लगाने के लिए लाभ । गरीब एंटीबॉडी पैठ, जबकि इष्टतम नहीं, अच्छी तरह से लेबल क्षेत्रों के लिए छवि अधिग्रहण को सीमित द्वारा सही किया जा सकता है, इमेजिंग में जिसके परिणामस्वरूप एक पतली खंड (5-10 µm) । लेबलिंग से उच्च पृष्ठभूमि फ़िल्टर सेटिंग्स का समायोजन करके के लिए क्षतिपूर्ति किया जा सकता है. हालांकि, यदि इनमें से किसी भी समायोजन किया जाता है, यह सत्यापित करने के लिए आवश्यक है कि फ़िल्टर्स थ्रेशोल्ड Z-स्टैक के प्रत्येक विमान पर स्वीकार्य है ।

3-डी इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर प्रयोगकर्ता को फिक्स्ड टिशू सेक्शन के 3-डी स्पेस में एमटी लंबाई, एरिया, एंगल, बहुतायत, और अन्य मीट्रिक्स को बढ़ाता है । यहां वर्णित विधि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके ऐसे डेटा प्राप्त करने के लिए दिशानिर्देश प्रदान करती है । हालांकि, फ़िल्टरिंग मॉड्यूल सार्वजनिक डोमेन सॉफ्टवेयर के लिए अनुकूलित किया जा सकता है प्रासंगिक plugins और/या मैक्रोज़ के साथ बढ़ाया, सभी के लिए उपलब्ध विश्लेषण कर रही है । विश्लेषण करने से पहले, ठहराव में पृष्ठभूमि और गैर-विशिष्ट संकेतों सहित बचने के लिए अपुष्ट चित्रों को थ्रेशोल्ड किया जाना चाहिए. एक बार विश्लेषण पूरा हो गया है और डेटा एक व्यावहारिक स्प्रेडशीट में स्थानांतरित कर रहे हैं, कई अनुमान डेटा सेट से बनाया जा सकता है । यहां किए गए परिकलनों में से एक β-tubulin धारिता के प्रति Glu-tubulin धारियां, या स्थिर mts के अनुपात में कुल mts जहां 1 का प्रतिनिधित्व करता है कि पूरे मीट्रिक टन cytoskeleton एक रॉय में स्थिर था । यदि प्रयोगकर्ता अपने मात्रात्मक डेटा को पूरक बनाना चाहता है, तो स्केल बारों के साथ एक पॉलिश्ड टैग की गई छवि फ़ाइल फ़ॉर्मेट (TIFF) छवि जेनरेट करना 3-डी छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के साथ सरल है.

यह परख प्रोटीन के कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है मीट्रिक टन विधानसभा में फंसा, vivo में। यदि immunolabeling धारावाहिक वर्गों बारी पर किया जाता है, इस प्रोटोकॉल के लिए एक ही भ्रूण में गतिशील और स्थिर MTs अध्ययन किया जा सकता है । भविष्य में, ऐसे बढ़ा डिटर्जेंट या बदल एंबेडिंग कोण के रूप में संशोधन पुराने भ्रूण और शारीरिक प्रश्नों की एक व्यापक श्रेणी के लिए इन तरीकों के उपयोग की अनुमति देगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

फोकल माइक्रोस्कोप अमेरिका नेशनल साइंस फाउंडेशन (NSF), अनुदान #DBI-०७२२५६९ से धन के साथ खरीदा गया था । इस शोध को अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH/NIGMS) अनुदान #GM085290 और अमेरिका के रक्षा विभाग (DOD) अनुदान #W81XWH-16-1-0466 R.M. ब्रूस्टर को संमानित किया गया द्वारा समर्थित था । ई. ओजस्वी पूर्व कॉलेज और स्नातक विज्ञान शिक्षा कार्यक्रम, अनुदान #52008090 के माध्यम से हावर्ड ह्यूजेस चिकित्सा संस्थान से UMBC के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । सपा ब्राउन शिक्षा GAANN फैलोशिप, एक Meyerhoff स्नातक NIH/NIGMS अनुदान #GM055036 द्वारा वित्त पोषित फैलोशिप के एक अमेरिकी विभाग द्वारा समर्थित किया गया था, और एक अनुसंधान अमेरिका DOD अनुदान #W81XWH-16-1-0466 द्वारा वित्त पोषित सहायक ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Used to treat petridishes.   Prepare 1% agarose
by heating a solution of  1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave
until polymerized. 
Kpipes Sigma P7643
NaCl Sigma S7653
Tris-HCl Sigma T3253-500G
KCl Sigma P9333-500G
CaCl2·2H2O Sigma C5080
NP-40 American Bioanalyticals AB01424
EGTA Sigma E3889-25G
MgCl2 Sigma M2670-500G
Bovine serum albumin (BSA) Fisher BP1605
Triton-x American Bioanalyticals AB02025
Anti-Fade mounting medium Invitrogen P10144
Mouse anti-β-tubulin Developmental studies Hybridoma Bank E7 1/200
Rabbit anti-γ-tubulin Genetex GTX113286 1/500
Rabbit anti-α-tubulin Genetex GTX108784 1/1000*
Rabbit anti-detyrosinated-tubulin Millipore AB3201 1/200-1/1000*  Titrate antibody with first use of new lot.
Rabbit anti-tyrosinated-tubulin Millipore ABT171 1/500
Mouse anti-centrin Millipore 04-1624 1/1000
Goat 488 anti-rabbit Thermofisher A11008 1/500
Goat 594 anti-rabbit Thermofisher A11012 1/500
Goat 594 anti-mouse Thermofisher A11005 1/500
Goat 488 anti-mouse Thermofisher A11001 1/500
Vibratome Vibratome 1500
Forceps World Precision Instruments 555227F
100 mm petri dish Cell treat 229693
35 mm petri dish Cell treat 229638
50 ml falcon tube Fisher 14-432-22
Woven nylon mesh 70 um Amazon.com B0043D1SZG 
Micropipette Gilson F123602
Glass pipette Fisher NC-999363-9
Aquarium sealant Amazon.com, by MarineLand Silicone Sealer 1 oz (Tube) 
Ring stand Fisher 14-675BO
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID Cole-Parmer WU-06417-21
Modeling clay Amazon.com Sargent Art 22-4000 Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice
Clamp Fisher 02-215-466
60ml syringe Fisher 14-820-11
Embryo medium (E3) 34.8 g NaCl
1.6 g KCl
5.8 g CaCl2·2H2O
9.78 g MgCl2·6H2O

To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L. 
Blocking Solution 50 ml TBS-NP-40
2.5 ml normal goat serum
1 g BSA
625 µl Triton-X
TBS-NP-40 (pH 7.6) 155 mM NaCl
10 mM Tris HCl
0.1% NP-40
2x MAB (pH6.4) 160 mM KPIPES
10 mM EGTA
2 mM MgCl2
Commercial 3-D Image processing Software PerkinElmer Volocity (V 6.2)
Dry block heater  VWR 12621-108 Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1.
Dissecting Microscope Leica MZ12
Confocal Microscope Leica SP5
Flat embedding mold emsdiasum.com BEEM 70904-01
Public domain image processing software NIH ImageJ (V 1.5)
* Success varies by lot number

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