मैरो-व्युत्पन्न प्रोजेक्टर सेल का हाइपोसिक प्रीकंडिशनिंग परिपक्व श्वन कोशिकाओं की उत्पत्ति के लिए एक स्रोत के रूप में

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Developmental Biology

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Summary

अस्थि मज्जा में मज्जा स्ट्रॉम्मल कोशिकाएं (एमएससी) तंत्रिका क्षमता के साथ मौजूद हैं हमारे प्रोटोकॉल हाइपोसिक पूर्व शर्त के माध्यम से कोशिकाओं की आबादी को समृद्ध करते हैं और उसके बाद उन्हें परिपक्व श्वन कोशिकाओं बनने का निर्देश देता है।

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Tsui, Y. P., Mung, A. K., Chan, Y. S., Shum, D. K., Shea, G. K. Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells. J. Vis. Exp. (124), e55794, doi:10.3791/55794 (2017).

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Abstract

यह पांडुलिपि मज्जा स्ट्रॉम्मल सेल (एमएससी) जनसंख्या से न्यूरल प्रजनन के लिए समृद्ध करने के एक साधन का वर्णन करता है और उसके बाद उन्हें परिपक्व श्वान सेल भाग्य के लिए निर्देशित करता है। हमने चूहा और मानव एमएससी को क्षणिक हाइपोक्सीक स्थितियों (16 घंटे के लिए 1% ऑक्सीजन) का पालन किया है, इसके बाद एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) / मूल फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (बीएफजीएफ) पूरकता के साथ कम लगाव उपचरण पर न्यूरोस्फ़ेयर के रूप में विस्तार किया गया है। न्यूरोस्फेरस को पॉली-डी-लाइसिन / लेमीनिन-लेपित टिशू कल्चर प्लास्टिक पर वरीयता दी गई थी और श्वेन सेल-जैसे कोशिकाओं (एससीएलसी) उत्पन्न करने के लिए β-Heregulin, bFGF, और प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक (पीडीजीएफ) वाले ग्लिओजेनिक कॉकटेल में सुसंस्कृत थे। एससीएलसी को ई -14-15 गर्भवती स्प्रेग दाऊली चूहों से प्राप्त शुद्ध पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया (डीआरजी) न्यूरॉन्स के साथ 2 सप्ताह के लिए कोकल्चर के माध्यम से भाग्य की प्रतिबद्धता का निर्देश दिया गया था। परिपक्व स्क्वैन कोशिकाएं S100β / p75 अभिव्यक्ति में दृढ़ता का प्रदर्शन करती हैं और माइलेज खंड बना सकती हैं। इस तरीके से उत्पन्न कोशिकाओं में एक संभावित हैरीढ़ की हड्डी की चोट के बाद ऑटोलॉगस सेल प्रत्यारोपण में, और साथ ही रोग मॉडलिंग के रूप में भी शामिल है।

Introduction

तंत्रिका प्रजनन और उनके व्युत्पत्तियों के प्रत्यारोपण, दर्दनाक तंत्रिका चोट 1 , 2 और neurodegeneration 3 , 4 के बाद एक उपचार रणनीति के रूप में वादा को दर्शाता है। नैदानिक ​​आवेदन से पहले, यह सुनिश्चित करना जरूरी है: i) स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं के एक ऑटोलॉगस स्रोत पर पहुंचने और विस्तार करने के लिए एक विधि ii) उन्हें संबंधित, परिपक्व सेल प्रकार 3 में निर्देशित करने का एक साधन रीढ़ की हड्डी की चोट के लिए सेल थेरेपी में हमारी दिलचस्पी ने हमें प्रौढ़ ऊतकों से तंत्रिका प्रजनकों के एक मजबूत, ऑटोलॉगस सेल स्रोत तलाशने में मदद की।

एमएससी का एक उप-जनन तंत्रिका शिखा से निकलता है और मज्जा गुहा से आसानी से पहुंचा जा सकता है। ये कोशिकाएं न्यूरॉन्स और ग्लिया 5 उत्पन्न कर सकती हैं। सेरेब्रल इस्केमिया के पशु मॉडल दर्शाते हैं कि हाइपोक्सिया प्रोल को बढ़ावा देता है मस्तिष्क के भीतर मस्तिष्क पूर्वज के प्रजनन और बहुतायत 6 यह मज्जा-व्युत्पन्न तंत्रिका पूर्वजों पर विस्तार के साधन के रूप में हाइपोसिक पूर्वनिर्धारण के उपयोग के लिए आधार था।

घायल रीढ़ की हड्डी में श्वान कोशिकाओं के प्रत्यारोपण में पुनर्जीवित 2 को बढ़ावा देता है SCLCs को ग्लिोजेनिक कारकों ( यानी, बीए-हेरेगुलिन, बीएफजीएफ, और पीडीजीएफ-एए) के साथ पूरक के माध्यम से एमएससी से उत्पन्न किया जा सकता है लेकिन फ़िनोटीपिक अस्थिरता प्रदर्शित करता है। वृद्धि कारकों की वापसी पर, वे एक फाइब्रोब्लास्ट-जैसी फ़िनोटाइप 7 पर लौट आए। फेरियटिपिक अस्थिरता सेलर ट्रांसप्लांटेशन में अवांछनीय है, जो कि बेपरवाह भेदभाव और कार्सिनोजेनेसिस के जोखिम के कारण होता है। जैसा कि श्वान सेल के पूर्ववर्ती भ्रूण परिधीय तंत्रिका 8 के भीतर अक्षतंतु बंडलों के साथ जुड़े हैं, हमें शुद्ध भ्रूण डीआरजी न्यूरॉन्स 7 के साथ कोकल्चर एससीएलसी को ले जाया गया 7 ,Ass = "xref"> 9 परिणामस्वरूप परिपक्व श्वान कोशिकाएं भाग्य-प्रतिबद्ध हैं और विट्रो 7 , 9 और विवो 10 में फ़ंक्शन का प्रदर्शन करती हैं

एमएससी से न्यूरल प्रजनकों के संवर्धन के लिए हमारा प्रोटोकॉल सरल और कुशल है और इसके परिणामस्वरूप बाद के एसेस के लिए सेल नंबर में वृद्धि हुई है। कोकल्चर प्लेटफॉर्म के माध्यम से भाग्य द्वारा निर्मित श्वान कोशिकाओं का व्युत्पन्न glial भेदभाव के अध्ययन और संभावित नैदानिक ​​आवेदन के लिए स्थिर और कार्यात्मक श्वन कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है।

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Protocol

जानवरों से संबंधित सभी प्रक्रियाएं प्रयोगशाला के देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड के साथ सख्त अनुसार निष्पादित की गईं और शिक्षण और अनुसंधान के लिए लाइव पशु प्रयोग पर समिति द्वारा अनुमोदित, ली का शिंग फैकल्टी ऑफ मेडिसिन, हांगकांग विश्वविद्यालय। सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद स्वस्थ दाताओं के iliac शिखर से मानव अस्थि मज्जा नमूने प्राप्त किए गए थे प्रोटोकॉल को संस्थागत समीक्षा बोर्ड, हांगकांग विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. चूहा एमएससी संस्कृतियों की तैयारी

  1. फीमर से MSCs का फसल
    1. सभी विच्छेदन उपकरण ( अर्थात, ठीक विदारक कैंची, कुंद काटने वाली कैंची और दांतेदार संदंश) को 180 डिग्री सेल्सियस तक इस्तेमाल करने से कम से कम 2 घंटे के लिए आटोक्लेव करें।
    2. कम से कम आवश्यक माध्यम-अल्फा संशोधन (αMEM) के 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस, 1% वी / वी) के पूरक के साथ एमएससी ग्रोथ माध्यम तैयार करें।)।
    3. पेंटोबारबोटोन ओवरडोज (240 मिलीग्राम / किग्रा शरीर वजन, इंट्रापेरटोनियल) द्वारा युवा पुरुष स्प्रैग दाऊली चूहों के बलिदान (200-250 ग्राम वजन)।
      नोट: विभिन्न चूहों से मज्जा नमूनों को अलग से संसाधित किया जाना चाहिए।
    4. लापरवाह स्थिति में बलिदान किए गए जानवरों को रखें। 70% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से अपने पेट और निचले अंग को साफ करें।
    5. ठीक विदारक कैंची और संदंश का उपयोग करते हुए औसत दर्जे की जांघों पर त्वचा और चमड़े के नीचे के ऊतकों को निकालें। जांघ की मांसपेशियों को ऊतक उजागर होने तक खतने से निकालें। घुटने और कूल्हे जोड़ों को देखा जाता है जब तक यह निकटता और दूरस्थ रूप से जारी रखें। कूल्हे और घुटने के जोड़ों के माध्यम से मांद का जकड़ना कुंद-छिड़का हुआ काटने कैंची का उपयोग करना।
      नोट: इस स्तर पर मज्जा गुहा का पर्दाफाश करने के लिए जांध की हड्डी को पतला न करें। अधिक प्रसंस्करण के लिए एक लामिना का प्रवाह टिशू कल्चर हुड में बरकरार महिलाओं को स्थानांतरित करें।
    6. मेटाफैक्सास के माध्यम से स्नायु के बाहर के और अन्तर्निर्मित छोर को टेंनटक्ट करने के लिए कुंद काटने का उपयोग करें।।
    7. एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर 70 माइक्रोन सेल झरनी रखें। एक 21 जी, 10 मिलीलीटर सिरिंज जिसमें फॉस्फेट-बफ़ेड खारा (पीबीएस, 10 एमएम ना 2 एचपीओ 4 , पीएच 7.4) शामिल है, इन्हें उजागर किये जाने वाले मूंगफली नहर में डालें और दोहराए जाने वाले फ्लशिंग द्वारा मज्जा की सामग्री को शंकु ट्यूब में फ्लश करें।
      नोट: पीबीएस के लगभग 20 एमएल का प्रयोग प्रत्येक स्नायु को फ्लश करने के लिए किया जाता है। यदि चमड़ी सामग्री का रंग रक्त-दाग और गड़गड़ाहट रहता है, तो एक बड़ी मात्रा का इस्तेमाल किया जा सकता है।
    8. सेंटीफ्यूगेशन द्वारा 5 मिनट के लिए 480 xg पर कोशिकाओं को ले लीजिए सतह पर तैरनेवाला त्यागें 10 मिलीलीटर एमएससी की विकास माध्यम में सेल गोली resuspend। एक 10 सेमी टिशू कल्चर डिश पर कोशिकाओं को प्लेट करें। सेल इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 ) में टिशू कल्चर व्यंजन रखें। चढ़ाना के शुरुआती दिन को दिन 0 के रूप में रिकॉर्ड करें
      नोट: सेंट्रीफ्यूगेशन से जुड़े सभी चरणों में, अधिकतम मंदी के लिए ब्रेक सेट करें।
  2. एमएससी कॉलोनियों की स्थापना और विस्तार
    नोट: इस प्रोटोकॉल आरमज्जा गुहा 11 के भीतर से एमएससी के लिए चुनने के साधन के रूप में टिशू कल्चर प्लास्टिक पालन पर एली अस्थि मज्जा की सामग्री को 2 दिनों के लिए टिशू कल्चर प्लास्टिक का पालन करने की अनुमति है।
    1. 2 दिन, गैर-पक्षपाती कोशिकाओं को हटाने के लिए पीबीएस के 10 एमएल के साथ संस्कृति प्लेटें तीन बार कुल्ला। रबीकरण के बाद 10 एमएल की एमएससी ग्रोथ माध्यम के साथ पीबीएस को बदलें। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं और हर 3 दिनों में एमएससी ग्रोथ माध्यम के साथ भरें।
      नोट: एमएससी कॉलोनियों को दिन 6-7 ( चित्रा 2 ए ) के द्वारा दिखाई देना चाहिए।
    2. विकास माध्यम को हटाने और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोकर दिन 10 से कोशिकाओं को बीतने। पुनः संयोजक एंजाइमेटिक कोशिका पृथक्करण अभिकर्मक के 1.5 एमएल जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते रहें। रिएक्शन को बेअसर करने के लिए 3 एमएल ऑफ एमएससी ग्रोथ माध्यम जोड़ें। 5 मिनट के लिए 250 xg पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा पृथक कोशिकाओं को लीजिए
    3. पीबीएस में उचित कमजोर पड़ने के बाद एक हेमोसाइटेटोमीटर का उपयोग कर गोली के भीतर कोशिकाओं को बढ़ाएं।
    4. एमएससी ग्रोथ माध्यम में 40,000 कोशिकाओं / सेमी 2 की घनत्व पर 10 सेमी की संस्कृति प्लेट में बीज उत्तीर्ण कोशिकाओं।
      नोट: चूहे के एमएससी को पासिंग के 2 दिनों के भीतर 80-90% संगम तक पहुंचाना चाहिए ( चित्रा 2 बी )। कक्षों को चरण 8 में वर्णित अनुसार पारित किया जा सकता है। एमएससी को इम्युनोकायटोकैमिस्ट्री के माध्यम से और ट्रेलिनियस भेदभाव ( चित्रा 3 ) 12 के लिए उनकी क्षमता के आधार पर दिखाया जा सकता है। अनुच्छेद 3 और 8 के बीच केवल एमएससी संस्कृतियों के बाद हाइपोसिक पूर्वनिर्धारित और तंत्रिका पूर्वज संवर्धन के अधीन हैं। अधिक से अधिक मार्ग संख्या के एमएससी एक चपटा आकारिकी ( चित्रा 2 सी ) को अपनाने और पर्याप्त संख्या में तंत्रिका पूर्वज उत्पन्न नहीं करते हैं। इन संस्कृतियों को त्याग दिया जाना चाहिए।

मानव बीएमएससी संस्कृतियों की तैयारी

  1. 9 एमएल की एमएससी ग्रोथ मध्यम और प्लेट के साथ मानव अस्थि मज्जा की 1 एमएल पतलाएक 10 सेमी सेमी ऊतक संवर्धन डिश पर कोशिकाओं। एक सेल इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 ) में संस्कृतियां बनाए रखें।
  2. 2 दिनों के बाद मध्यम निकालें और धीरे-धीरे संस्कृतियों को कुल्ला करना गैर-पक्षपाती कोशिकाओं को हटाने के लिए पीबीएस के 10 एमएल के साथ तीन बार कुल्ला। अंतिम कुल्ला के बाद, पीबीएस को हटा दें और इसे 10 एमएल ऑफ एमएससी ग्रोथ माध्यम से बदलें। पीबीएस कुल्ला के बाद संस्कृति के हर 3 दिनों के बाद विकास माध्यम को दोहराएं।
    नोट: एमएससी कॉलोनियों को दिन 6-7 तक दिखाई देना चाहिए। उपनिवेशों की संख्या विषयों के बीच भिन्न हो सकती है
  3. चरण 1.2.2 में वर्णित के अनुसार दिन 10 पर कोशिकाओं को पारित करना। पीबीएस में उचित कमजोर पड़ने के बाद एक हेमोसाइटेटोमीटर का उपयोग कर गोली के भीतर कोशिकाओं को बढ़ाएं। MSC विकास माध्यम में 10 सेमी संस्कृति प्लेट में 40,000 कोशिकाओं / सेमी 2 की घनत्व पर पारित कोशिकाओं को बीज दें।
    नोट: मानव एमएससी ( चित्रा 2 डी ) MSCs को चूने के लिए एक समान आकार का प्रदर्शन दिखाता है और इसी तरह से पासिंग के 2 दिनों के भीतर 80-90% संगम तक पहुंच जाना चाहिए। उन्हें चार्ला होना चाहिएइम्यूनोसायटोकैमिस्ट्री के माध्यम से और trilineage भेदभाव 12 के लिए उनकी क्षमता द्वारा cterized चूहे एमएससी के साथ, मानव एमएससी, जो 3 और 8 के बीच के बीच हैं, इसके बाद के हाइपोसिक पूर्वनिर्धारित और तंत्रिका पूर्वज संवर्धन के अधीन हैं।

3. हाइपोसिक प्रीकंडिशनिंग

  1. रिंग क्लैंप जारी करने और 70% इथेनॉल के साथ अलग-अलग हिस्सों को साफ करने के बाद हाइपोक्सिया चैंबर घटकों ( यानी, बेस, ढक्कन, ट्रे) को अलग करना। 15 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के तहत नसबंदी के लिए लामिनार प्रवाह टिशू कल्चर हूड के भीतर चैम्बर घटकों को रखें।
  2. हाइपोसिक प्रीदडिशनिंग से पहले, मध्यम निकालें और चूहा और मानव एमएससी संस्कृतियों (वर्ग 1 और 2) को पीबीएस के 10 एमएल के साथ कुल्ला। पीबीएस को 10 एमएल के एमएससी ग्रोथ माध्यम से बदलें जो 25 एमएम HEPES के साथ पूरक है।
    नोट: 10 सेमी व्यंजनों पर सुसंस्कृत एमएससी को हाइपोसिक प्रीदंडीशनिंग के विषय में होने से पहले 80-90% सामंजस्य तक पहुंच जाना चाहिए था।
  3. क्यूल रखेंहाइपोक्सिया चैंबर के अंदर व्यंजन डालें चैम्बर घटकों को पुन: संयोजन करें और अंगूठी क्लैंप को कस लें। 5 मिनट के लिए 10 एल / मिनट की प्रवाह दर पर चैम्बर में 99% एन 2 /1% हे 2 का गैस मिश्रण फ्लश करें।
  4. हाइपोक्सिया चैंबर के कनेक्टिंग सिल्स को सील करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई गैस रिसाव नहीं है। 16 घंटे के लिए सेल इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 ) के अंदर कक्ष रखें।
  5. हाइपोकसिक पूर्व शर्त के पूरा होने पर, बाद में तंत्रिका पूर्वज संवर्धन संस्कृति के लिए तैयारी में कक्षों की संस्कृतियों को हटा दें।

4. तंत्रिका प्रजनक संवर्धन संस्कृति

  1. न्यूरल प्राइजेंट माध्यम तैयार करें जिसमें डल्बेको की संशोधित ईगल मध्यम / हैम पोषक तत्व मिश्रण एफ 12 (डीएमईएम / एफ 12) बी 27 (2% वी / वी), मूल फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (बीएफजीएफ, 20 एनजी / एमएल), एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ, 20 एनजी / एमएल), और पी / एस (1% वी / वी)।
  2. चरण 1.2.2 में वर्णित अनुसार, हाइपोसिक पूर्व-निर्धारित चूहा / मानव एमएससी को अलग करें।5 मिनट के लिए 250 xg पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा पृथक कोशिकाओं को लीजिए पीबीएस में उचित कमजोर पड़ने के बाद एक हेमोसाइटेटोमीटर का उपयोग करके गोली के भीतर की कोशिकाओं को बढ़ाएं।
  3. 6,000 कोशिकाओं / सेमी 2 की घनत्व पर कम लगाव, 6 अच्छी तरह प्लेटों पर तंत्रिका पूर्वज के माध्यम और बीज में कोशिकाओं को फिर से खोलें। 12 दिनों के लिए सेल इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 ) में संस्कृति रखें। हर 3 दिनों में तंत्रिका जननेंद्रिय माध्यम के 75% फिर से भरें।
    नोट: आकार योग्य गैर-पक्षपाती सेल समूहों को दिन 6-7 तक देखा जाना चाहिए। 10-12 दिन तक, एक व्यास के साथ neurospheres ≥ 100 माइक्रोन देखा जा सकता है ( चित्रा 4 )। हाइपोकसिक प्रीन्डिशनेड एमएससी को अधिक न्यूरोस्फेयर पैदा करना चाहिए, क्योंकि सामान्यीकृत 9 शर्तों के तहत एमएससी की सुसंस्कृत
  4. 10 एमएल पिपेट में उन्हें ग्रहण करने और उन्हें 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करके दिन 12 पर neurospheres ले लीजिए। 5 मिनट के लिए 250 xg पर neurospheres अपकेंद्रित्र
    नोट: Neurospheres हो सकता हैनेस्टिन और जीएएफएपी 7 जैसे तंत्रिका पूर्वज मार्करों के लिए दिन 12 की विशेषता है।

5. डीआरजी न्यूरॉन्स के साथ कचरे के माध्यम से भाग्य-प्रतिबद्ध श्वन सेल का उत्पादन

  1. शुद्ध चूहा डीआरजी न्यूरॉन्स की तैयारी
    1. सभी विच्छेदन उपकरण ( यानी, विच्छेदन कैंची, संदंश, दो माइक्रोडिसेसेक्शन संदंश और माइक्रोडिसैक्टिंग कैंची) को 180 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग करने के लिए कम से कम 2 घंटे पहले आटोक्लेव करें।
    2. कोट 6-अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट्स पॉली-डी-लाइसिन (पीडीएल, पीबीएस में 10 ग्राम / एमएल) 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात। पीडीएल को निकालें और 1.5 एमएल प्रति पीबीएस प्रति अच्छी तरह कुल्ला।
    3. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर लमिनिन (पीबीएस में 10 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ प्लेट्स कोटिंग के साथ आगे बढ़ें। पीबीएस की 1.5 एमएल प्रति अच्छी तरह से प्लेटों के साथ कुल्ला।
    4. एलजी ग्लूटामाइन (1% वी / वी), तंत्रिका वृद्धि कारक (एनजीएफ, 20 एनजी / एमएल), और पी / एस (1) के साथ पूरक डीआरजी न्यूरॉन रखरखाव माध्यम तैयार करें, जिसमें बीयू 27 (2% वी / वी) % वी / वी)
    5. डीआरजी न्यूरॉन शुद्धि माध्यम तैयार करें, जिसमें बी 27 (2% वी / वी), एल-ग्लूटामाइन (1%), एनजीएफ (20 एनजी / एमएल), पी / एस (1%), फ्लोराइडॉक्सीरुडीन (एफडीयू, 10) के साथ पूरक न्यूरोबासल माध्यम शामिल है। Μg / एमएल), और यूरिडिन (10 माइक्रोग्राम / एमएल)।
    6. पेंटोबारबिटल ओवरडोज द्वारा गर्भावस्था के दिन 14-15 पर गर्भवती चूहे बलिदान करें (240 मिलीग्राम / किग्रा शरीर वजन, इंट्रापेरटोनियल)।
    7. लापरवाह स्थिति में बलिदान किए गए जानवरों को रखें। 70% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से अपने पेट को साफ करें
    8. ठीक विदारक कैंची और संदंश का प्रयोग करके लंबे समय तक पशु की निचली पेट की दीवार को काटें। विच्छेदन कैंची का उपयोग करके गर्भाशय को पहचानें और निकालें। भ्रूण को बेनकाब करने और निकालने के लिए गर्भाशय की दीवार को काटें। भ्रूण को एक बाँझ, पीबीएस से भरे 10 सेमी संस्कृति डिश में स्थानांतरण करें। बर्फ पर संस्कृति डिश रखें
    9. पीबीएस (कमरे के तापमान) से भरी 10 सेमी संस्कृति डिश के लिए विच्छेदन के लिए भ्रूण को स्थानांतरित करना और विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे स्थित होना चाहिए। प्रवण स्थिति में भ्रूण रखें
      नहींई: सफेद रंग की रीढ़ की हड्डी और संलग्न डीआरजी भ्रूण के पृष्ठीय पहलू पर अपनी पारदर्शी त्वचा के माध्यम से देख सकते हैं।
    10. रीढ़ की हड्डी के दोनों ओर सूक्ष्मदर्शी संदंश सम्मिलित करें और आसपास के नरम ऊतक से रीढ़ की हड्डी को अलग करने के लिए कुंद विच्छेदन का उपयोग करें। गर्दन के उद्घाटन और पूंछ की थैली के साथ माइक्रोडिससेटिंग संदंश का उपयोग करके रीढ़ की हड्डी को मुक्त करें। नरम ऊतक के आस-पास से मुक्त करने के लिए कॉर्ड के उदरगत पहलू पर आगे कुंद विच्छेदन करना।
    11. मुक्त रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय पहलू पर अवशिष्ट नरम ऊतक को हटाने के लिए माइक्रोडिससेटिंग संदंश का प्रयोग करें।
      नोट: इस स्तर पर, रीढ़ की हड्डी, तंत्रिका जड़ें, और संलग्न डीआरजी ही रहना चाहिए।
    12. अलग-अलग डीआरजी को माइक्रोवेसिसेटिंग संदंश का उपयोग करते हुए अपने कनेक्ट करने वाली तंत्रिका जड़ों से अलग करें। डीआरजी को 1.5 एमएल, पीबीएस युक्त बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में ट्रांसफर करने के लिए 1 एमएल टिप से जुड़ी एक विंदुक पेन का उपयोग करें।
      नोट: प्रत्येक 1.5 एमएल ट्यूब के लिए, अधिकतम100 डीआरजी को समायोजित किया जा सकता है।
    13. डीआरजी को 5 मिनट के लिए 250 ग्राम में अपकेंद्रित्र और पुनः संयोजक एंजाइमेटिक कोशिका पृथक्करण अभिकर्मक (प्रति ट्यूब 200 μL) में पुन: संयोजित करें। 10 मिनट के लिए सेते (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 ) डीआरजी को 5 मिनट के लिए 250 ग्राम में अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और डीआरजी न्यूरॉन रखरखाव माध्यम में पुन: एक 200 μL विंदुक टिप का उपयोग करके कोमल ट्रिप्रेशन द्वारा गोली को अलग करना उचित कमजोर पड़ने के बाद एक हेमोसाइटेटोमीटर का उपयोग करके गोली के भीतर कोशिकाओं को बढ़ाएं।
    14. पीडीएल / लेमीनिन-लेपित 6-अच्छी प्लेटों में 5000 कोशिकाओं / सेमी 2 की घनत्व पर 1.5 मिलीलीटर डीआरजी न्यूरॉन रखरखाव माध्यम प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं में बीज। दो दिनों की संस्कृति के बाद, डीआरजी न्यूरॉन रखरखाव माध्यम को हटा दें, पीबीएस के साथ कुल्ला, और डीआरजी न्यूरॉन शुद्धि माध्यम से प्रतिस्थापित करें।
      नोट: प्रत्येक शुद्धि चक्र के लिए, डीआरजी संस्कृतियों को 2 दिनों के लिए शुद्धिकरण माध्यम के साथ रखें, इसके बाद रखरखाव माध्यम में ऊष्मायन के 1 दिन का पालन करें। 3-4 शुद्धि चक्र के बाद, रिमसभी अंतर्जात glia के अंडाकार की उम्मीद 7 है । इसे लगभग 14 दिन लगाना चाहिए। शुद्ध संस्कृतियों ने न्यूरॉनल मार्कर टीयूजे 1 के लिए सकारात्मक परीक्षण किया है और S100β अभिव्यक्ति ( चित्रा 5 ) के लिए अनुपस्थित हैं।
  2. श्वाइन सेल की तरह कोशिकाओं का निर्माण
    1. Β-हेरेग्यूलीन (100 एनजी / एमएल), बीएफजीएफ (10 एनजी / एमएल), प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक (पीडीजीएफ-एए, 5 एनजी / एमएल), एफबीएस (10%) के साथ पूरक αMEM के साथ glial प्रेरण माध्यम तैयार करें, और पी / एस (1% वी / वी)
    2. पीडीएल / लेमीनिन-लेपित 6-अच्छी तरह प्लेटों में 5-10 क्षेत्रों में प्रति घनत्व 2 सेमी से 1.5 मिलीलीटर glial induction medium प्रति अच्छी तरह से 4 अनुभाग में तैयार न्यूरोस्फेरेट्स प्लेट। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने के बाद हर दो दिनों में glial induction medium बदलें।
      नोट: वरीकृत न्यूरोस्फेयर से कोशिकाओं को दिन 2 से बाहर निकलने में देखा जाता है। दिन 7 तक, प्रवासी कोशिकाओं में एक पतला दिखना होता है और श्वन सेल के लिए इम्यूनोपॉसिटिविटी का प्रदर्शन करना चाहिए।मार्कर पी 75 न्यूरोट्रॉफ़ीन रिसेप्टर (पी 75) और एस 100 बीओ 7 इन कोशिकाओं को एससीएलसी के रूप में संदर्भित किया जाता है
  3. डीसीजी न्यूरॉन्स के साथ एससीएलसी के कोकल्चर
    1. 1: 1 मात्रा-से-मात्रा अनुपात पर डीआरजी न्यूरॉन रखरखाव माध्यम (चरण 5.1.4) और ग्लिअल प्रेरण माध्यम (चरण 5.2.1) के शामिल कॉकोल्चर माध्यम तैयार करें।
    2. एफबीएस (5%), β-Heregulin (10 एनजी / एमएल), और पी / एस (1% वी / वी) के साथ पूरक डीएमईएम / एफ 12 के शामिल श्वन सेल रखरखाव माध्यम तैयार करें।
    3. दिन 7 एससीएलसी से संस्कृति माध्यम को निकालें, पीबीएस के साथ कुल्ला, और उन्हें 0.5 मिलीलीटर / अच्छी तरह से पुनः संयोजक एंजाइमेटिक कोशिका पृथक्करण अभिकर्मक से 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट तक सेते हैं। कोकल्चर माध्यम में एससीएलसी को रिसासपेंड करें।
    4. उचित कमजोर पड़ने के बाद एक हेमोसाइटेटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं को बढ़ाएं।
    5. 1,000 कोशिकाओं / सेमी 2 के घनत्व पर एससीएलसी को शुद्ध डीआरजी न्यूरॉन संस्कृतियों पर बीज बोना 14 दिनों के लिए कोकल्चर बनाए रखें, साथ में हर दो दिन में मध्यम प्रतिस्थापन।
      नोट: कोकल्चर के दौरान, एससीएलसी ने स्पिंडल की तरह आकारिकी हासिल कर ली जो परिपक्व श्वन कोशिकाओं ( चित्रा 6 ) के समान है। ये कोशिकाएं विकास कारकों की वापसी के बाद उनके फेनोटाईप में बनी रहती हैं और इन विट्रो और एक्सवो 7 , 10 में ऐशंस को मैनेलेट करने में सक्षम हैं। श्वान सेल मार्करों ( यानी, पी 75 और एस 100 बीओ) की सकारात्मकता की निगरानी इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा की जानी चाहिए।
    6. चरण 1.2.2 में वर्णित अनुसार, कोकल्चर के पूरा होने पर, भाग्य भाग्य-श्वन कोशिकाओं को बनाया गया। 0.5 एमएल का विलय अभिकर्मक प्रति अच्छी तरह से उपयोग करें। उचित कमजोर पड़ने के बाद एक हेमोसाइटेटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं को बढ़ाएं।
    7. 10,000 कोशिकाओं / सेमी 2 के घनत्व पर श्वान सेल के रखरखाव के माध्यम से भाग्य-निस्संदेह-शक्त कोशिकाओं को पुन: resuspend। इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए पीडीएल / लेमीनिन-लेपित 6-अच्छी तरह प्लेट्स में बीज कोशिकाएं।
      नोट: संस्कृतियों में अनिवार्य रूप से एमएससी शामिल होते हैं जो कि फाइब्रोब्लास्ट को अपनाया हैसेल भाग्य 7 इन कोशिकाओं को कोकल्चर के पूरा होने पर भाग्य-प्रतिबद्ध श्वान कोशिकाओं के साथ एक साथ गुजरता है। इस फाइब्रोब्लास्ट सबस्ट्रैटम के शीर्ष पर स्थित श्वान कोशिकाओं को आसानी से अलग किया जा सकता है और पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) के "ठंडे जेट" के साथ rinsing के आगे विस्तार किया जा सकता है, जैसा कि 13 वें स्थान पर वर्णित किया गया है। भाग्य-प्रतिबद्ध श्वान कोशिकाओं को 1 महीने के लिए रखरखाव माध्यम में विस्तारित किया जा सकता है।

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Representative Results

हमारे प्रोटोकॉल में प्रमुख चरणों का अवलोकन चित्रा 1 में दिखाया गया है । संक्षेप में, चूहे और मानव एमएससी को टिशू कल्चर प्लास्टिक के अनुपालन के लिए चुना जाता है। विस्तारित एमएससी को हाइपोक्सिया से पूर्व शर्त रखा गया है और तब न्यूरोस्फीयर-बनाने वाली स्थितियों के अधीन हैं। न्यूरोस्फेयर चढ़ाए जाते हैं और एससीएलसी में अंतर करने की अनुमति देते हैं। एससीएलसी को शुद्ध डीआरजी न्यूरॉन्स से भाग्य के लिए तैयार किए गए श्वान कोशिकाओं को तैयार करने के लिए तैयार किया गया है।

सुसंस्कृत चूहा और मानव एमएससी की आकृति विज्ञान चित्रा 2 में दिखाया गया है । उनके स्वस्थ पतला आकारिकी उच्च बीतने की संख्या के लिए बनाए गए एमएससी की चतुर्भुज उपस्थिति के विपरीत दिखाई जाती है, जिसने उनकी बहुतायत को खो दिया है। विस्तारित चूहे और मानव कालोनियों को एमएससी मार्करों की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करना चाहिए, हेमटोपोएटिक स्टेम सेल मार्करों की अनुपस्थिति, और ट्रिलनीज के लिए अलग-अलग क्षमताप्रत्यारोपण ( चित्रा 3 )। 3 और 8 के बीच से स्वस्थ एमएससी 16 घंटे के लिए हाइपोसिक पूर्व शर्त के अधीन हैं और इसके बाद ईजीएफ / बीएफजीएफ पूरक के साथ कम पालन संस्कृति प्लेटों पर पारित किया गया है। बड़ी संख्या में न्यूरोस्फेरस में हाइपोसिक पूर्ववर्ती परिणाम, साथ ही बड़े औसत न्यूरोस्फीयर आकार ( चित्रा 4 )।

न्यूरोस्फेयर पीडीएल / लैमिनिन-लेपित कल्चर प्लेटेट्स पर चढ़ाए जाते हैं और एसएलसीसी को संस्कृतियों द्वारा β-हेरेग्युलिन, बीएफजीएफ, और पीडीजीएफ-एए युक्त ग्लियायअल प्रेरण माध्यम में विकसित करने के लिए प्रेरित करते हैं। एससीएलसी स्क्वाइन कोशिकाओं और इसी मार्कर अभिव्यक्ति की विशेषता पतला आकारिकी प्रदर्शित करते हैं, फिर भी वे phenotypically अस्थिर होते हैं और विकास कारकों के विघटन पर एक फाइब्रोब्लास्ट फेनोटाइप पर वापस आ जाते हैं

संवेदी न्यूरॉन्स के साथ कोल्चरल एक सेल-आंतरिक SW के बारे में लाने के लिए एक शर्त हैभाग्य प्रतिबद्धता के लिए खुजली शुद्ध डीआरजी नेटवर्क की स्थापना, अंतर्जात ग्लिया को हटाने के लिए एफडीयू और यूरिडिन के साथ स्पंदित उपचार के माध्यम से प्राप्त की जाती है और एस 100 बीयू प्रतिरक्षता ( चित्रा 5 ) की अनुपस्थिति से इसकी पुष्टि होनी चाहिए। 7 दिन, एससीएलसी को 14 दिन ( चित्रा 6 ) के लिए शुद्ध डीआरजी न्यूरॉन्स के साथ पारित किया गया है। कोकल्चर के पूरा होने पर, परिपक्व, भाग्य-प्रतिबद्ध श्वान कोशिकाओं को उभरने चाहिए।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का अवलोकन अस्थि मज्जा किसी भी चूहे के नारी या मानव इरिक क्रेस्ट एस्पायटर से प्राप्त होता है। अस्थि मज्जा के भीतर से एमएससी टिशू कल्चर प्लास्टिक पर संलग्न और विस्तार कर सकते हैं मस्तिष्क की क्षमता के साथ एमएससी के लिए समृद्ध करने के लिए, कोशिकाओं को 16% के लिए 1% हे 2 में पूर्वनिर्धारित किया जाता है और फिर कम पालन संस्कृति पर पारित किया जाता है।बीएफजीएफ / ईजीएफ पूरक के साथ एटीएस इससे न्यूरोस्फेर के निर्माण में परिणाम होता है, जो पीडीएल / लैमिनिन-लेपित टिशू कल्चर प्लास्टिक पर लगाए जाते हैं और एससीएलसी बनाने के लिए ग्लियाल इंडक्शन मिडियम में सुसंस्कृत होते हैं। एससीएलसी को परिपक्व होने के लिए उन्हें निर्देशित करने के लिए 2 सप्ताह के लिए शुद्ध डीआरजी न्यूरॉन्स के साथ पारित किया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: एमएससी कॉलोनियों की स्थापना। आकारीन एमएससी कॉलोनिज टिशू कल्चर प्लास्टिक पर अस्थि मज्जा की कोशिकाओं को चढ़ाने के 6-7 दिनों बाद दिखाई देनी चाहिए। चूहे एमएससी कॉलोनी की एक प्रतिनिधि छवि ( ) दिखायी जाती है, जबकि मानव कालोनियां एक समान दिखती हैं। कालोनियों को 10 दिन पारित किया जा सकता है। उच्च वृद्धि पर देखा गया, दोनों चूहा (बी ) और इंसान ( डी ) एमएससीज उत्परिवर्तन के बाद एक विशेषता फाइब्रोब्लास्ट जैसी आकृति विज्ञान प्रदर्शित करते हैं। उच्च मार्ग संख्या के लिए बनाए रखा गया एमएससी एक चपटा, चौगुनी आकारिकी ( सी ) प्राप्त करते हैं और इसे त्याग दिया जाना चाहिए। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: एमएससी की विशेषता ( - डी ) मानव एमएससी की प्रतिनिधि छवियां एमएससी को उपयुक्त मार्करों जैसे कि सीडी 090 ( ), सीडी 773 ( बी ), और स्ट्रो -1 ( सी ) के अभिव्यक्ति की विशेषता और सीडी 45 ( डी ) जैसी हेमटोपोएटिक स्टेम सेल मार्करों की अनुपस्थिति के द्वारा विशेषता की जा सकती है। ( - जी ) चूहा एमप्रोटोकॉल में वर्णित अनुसूचित जातियों को पृथक और विस्तारित किया गया है क्योंकि प्रोटोटल में वर्णित एपोटीकाइट्स ( , सूडान रेड के साथ दागयुक्त वसा जमा), ऑस्टियोब्लास्ट्स ( एफ ; पेरिस्यूलर मैट्रिक्स, एलिज़िरिन रेड के साथ दाग), और क्रोन्ड्रोसाइट्स ( जी ; ओ) उपयुक्त संस्कृति की स्थिति के तहत स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: एमएससी से तंत्रिका पूर्वज के संवर्धन दोनों चूहे ( ) और मानव ( सी ) एमएससी ने न्यूरोफेहेर्स का निर्माण किया जब ईजीएफ / बीएफजीएफ के साथ पूरक माध्यम में कम पालन वाले टिशू कल्चर प्लास्टिक पर सुसंस्कृत किया गया। संख्या और चूहे के औसत व्यास ( डी ) क्षेत्रों को एमएससी की हाइपोसिक पूर्व शर्त (16 एच, 1% हे 2 ) के माध्यम से बढ़ाया जाता है, जो कि क्षेत्र प्रेरण से पहले होता है। स्केल बार = 200 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: शुद्ध चूहा डीआरजी नेटवर्क की स्थापना शुद्ध डीआरजी नेटवर्क एंटीमेटोटिक एजेंटों एफडीयू और यूरिडिन (ए) के साथ स्पंदित उपचार के बाद स्थापित हैं। न्युरेसाइट नेटवर्क जो एस 100 बीओ-व्यक्त अंतर्जात ग्लिया (बी) से रहित हैं, एससीएलसी के साथ कोकल्चर के लिए तैयार हैं। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें


चित्रा 6: डीआरजी न्यूरॉन्स के साथ कोकल्चर के माध्यम से अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न श्वन कोशिकाओं का उत्पादन। शुद्ध डीआरजी न्यूरॉन्स और मानव एससीएलसी के साथ 2 सप्ताह के कोकल्चर को पूरा करने पर, स्पिंडल के आकार वाले, भाग्य-प्रतिबद्ध श्वान कोशिकाएं सामान्य मानदण्ड- और हाइपोक्सिया-इलाज समूहों ( और डी ) दोनों से निकलती हैं। ये कोशिकाएं श्वाइन सेल मार्करों p75 (बी और ई) और एस 100 बीओ (सी और एफ) को व्यक्त करती हैं। मानव नाभिक प्रतिजन (ह्यूएनयू) की अभिव्यक्ति दर्शाती है कि एस -1 बी -1 पॉजिटिव कोशिकाएं चूहा डीआरजी से उत्पन्न ग्लियाल कोशिकाओं को दूषित नहीं करती थीं। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन

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Discussion

हाइपोसिक पूर्वनिर्धारित और न्यूरोस्फीयर संस्कृति के माध्यम से तंत्रिका प्रजनन के संवर्धन से पहले एमएससी की "स्टेमनेस" को संरक्षित करने के लिए आवश्यक है। हमारे अनुभव से, बहु-स्तरीय एमएससी को उनके लम्बी वाले फाइब्रोब्लास्ट जैसे आकारिकी से भरोसेमंद रूप से पहचाना जा सकता है। इसके विपरीत, प्रमुख साइटोस्केलेटल तनाव फाइबर के साथ, एमएससी ने अधिक चपटे, चौगुनाकार आकारिकी को अपनाया है, तंत्रिका कोशिका भाग्य को आसानी से अपनाना नहीं है और इसे त्यागना चाहिए। सामान्य तौर पर, हम एमएससी का उपयोग आठ अंकों से अधिक के पारित संख्या के साथ नहीं करते हैं। अपनी व्याकुलता को बनाए रखने के लिए, 100% संगम तक पहुंचने से पहले एमएससी के तुरंत पास होने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके विपरीत, बहुत कम संगम पर एमएससी को बनाए रखना अवांछनीय है। हमारे अनुभव से, 40,000 कोशिकाओं / सेमी 2 के घनत्व या 1: 2 के अनुपात में 80% संगम वाले पारगमन कोशिकाओं पर एमएससी की बीजों को बढ़ाना सर्वोत्तम परिणामों के लिए अनुमति देता है।

डीआरजी नेटवर्क की उचित स्थापना और रखरखाव एक आलोचक हैकोकल्चर सफलता के अल निर्धारक डीआरजी फसल के लिए आवश्यक समय न्यूनतम रखा जाना चाहिए। व्यक्तिगत गैन्ग्लिया को एक आक्रामक ढंग से संभालना चाहिए, विशेष रूप से रीढ़ की हड्डी से अलगाव के दौरान, जब तंत्रिका की जड़ों को संभालना सबसे अच्छा होता है। सामान्य तौर पर, हम पशु बलिदान के समय और कटाई डीआरजी के एंजाइमेटिक पाचन के बीच 2 घंटे से भी कम की अवधि के लिए लक्ष्य रखते हैं, टिशू मृग में लंबे समय तक फसल के परिणाम और सेल व्यवहार्यता के नुकसान के रूप में। संस्कृति के दौरान उपस्ट्रेटम से डीआरजी न्यूरॉन्स की टुकड़ी अक्सर सामना करना पड़ता है। यह होने से रोकने के लिए, कोटिंग को ताजा तैयार करने और ऊतक फसल के समय के आसपास किया जाना चाहिए। सामान्य तौर पर, बड़े, अपवर्जित डीआरजी क्लस्टर अधिक बार विलग हो जाते हैं और कोकल्चर की सफलता नहीं देते हैं। चित्रा 5 जैसा दिखने वाला नेटवर्क प्राप्त करने के उद्देश्य से एंजाइमेटिक पाचन की अवधि और ट्रिप्रेशन की मात्रा को समायोजित किया जा सकता है

जबकि हमारे कोकूलेफ्टिनेंट प्लेटफार्म लगातार भाग्य की प्रतिबद्धता को प्रेरित करता है, समानांतर उपज भाग्य में निर्मित संस्कृतियों का केवल 20-30% श्वान कोशिकाओं 7 , 13 । इसलिए हम पर्याप्त डीआरजी और एससीएलसी तैयार करने के लिए तीन से चार 6-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में कोकल्टीज का प्रयोग करते हैं। हम इस परिकल्पना करते हैं कि भ्रूण उम्र, सेल व्यवहार्यता, घनत्व और स्थलाकृति सहित अंतर्निहित डीआरजी नेटवर्क से संबंधित कारकों का संयोजन, कोकल्चर की सफलता को प्रभावित करता है। इन अंतर्निहित चर को आगे की जांच और मानकीकृत करने की आवश्यकता है। कोकल्चर उपज में सीमाओं के अलावा, चूहे-व्युत्पन्न डीआरजी न्यूरॉन्स और पशु उत्पादों की आवश्यकता को खत्म करने का एक साधन मांगा जाना चाहिए। इसके अलावा, प्रोटोकॉल की अवधि छोटा होना चाहिए। हमारे प्रोटोकॉल का एक संक्षिप्त संशोधन के रूप में, एससीएलसी की पूर्व पीढ़ी के बिना, सीधे डीआरजी न्यूरॉन्स पर सीधे वरीयता प्राप्त दिन 10 न्यूरोस्फेरियों से वयस्क श्वान कोशिकाओं को प्राप्त करने में सफलता मिली है , 10

हमारे विधि के माध्यम से समृद्ध न्यूरोस्फेयर न्यूरोनल और ग्लियाय वंश के कोशिकाओं के एक मजबूत स्रोत के रूप में काम करते हैं। पूर्ववर्ती कोशिकाओं को भाग्य की प्रतिबद्धता के निर्देशन के लिए हमारे मंच का आनुवांशिक हेरफेर से बचने का लाभ है, इसके अंतर्निहित जोखिमों के साथ, और परिणामी कोशिका कोशिका प्रत्यारोपण, बीमारी मॉडलिंग और ग्लील भेदभाव के अध्ययन के लिए प्रासंगिकता के हैं।

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Disclosures

इस पांडुलिपि के सभी लेखकों को घोषित करने का कोई खुलासा नहीं है।

Acknowledgments

तकनीकी सहायता के लिए हाइपोक्सिया चैम्बर उपकरण और सुश्री एलिस लुई को प्रदान करने के लिए लेखक डॉ। ना-सुम वोंग को स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
αMEM Sigmaaldrich M4526
DMEM/F12 Thermofisher scientific 12400-024
Neurobasal medium Thermofisher scientific 21103-049
FBS Biosera FB-1280/500
B27 Thermofisher scientific 17504-001
Epidermal growth factor (EGF) Thermofisher scientific PHG0313
Basic fibroblast growth factor (bFGF)  Peprotech 100-18B/100UG
Nerve growth factor (NGF)  Millipore NC011
Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) Peprotech 100-13A
Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) Millipore 01-201
Uridine Sigmaaldrich U3003
5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU) Sigmaaldrich F0503
Poly-D-lysine (PDL) Sigmaaldrich P7886-1G
Laminin Thermofisher scientific 23017015
GlutaMAX Thermofisher scientific 35050061
Penicillin / streptomycin (P/S) Thermofisher Scientific 15140-122
TrypLE Express Thermofisher Scientific 12604-013
10 cm plate for adherent culture TPP 93100 Used for selection of MSCs by tissue culture adherence
6-well plate for adherent culture TPP 92006 Used for expansion of MSCs following passaging
UltraLow 6-well plate for non-adherent culture Corning 3471 Used for neural progenitor enrichment
anti-human CD90(Thy-1) BD Biosciences 555593
anti-human CD73 BD Biosciences 550256
anti-human/rat STRO-1 R&D Systems MAB1038
anti-human nestin R&D Systems MAB1259
anti-human CD45 BD Biosciences 555480
anti-rat CD90(Thy-1) BD Biosciences 554895
anti-rat CD73 BD Biosciences 551123
anti-rat nestin BD Biosciences MAB1259
anti-rat CD45 BD Biosciences 554875
Anti-S100β Dako Z031101
Anti-p75 Millipore MAB5386
Anti-GFAP Sigmaaldrich G3893
Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) Covance MMS-435P
Anti-Human nuclei Millipore MAB1281
Hypoxia chamber Billups-Rothenberg MIC-101
HEPES buffer Sigmaaldrich H4034-100G

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