Hypoxische Vorkonditionierung von Marrow-abgeleiteten Progenitor-Zellen als Quelle für die Erzeugung von reifen Schwann-Zellen

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Developmental Biology

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Summary

Marrow Stromazellen (MSCs) mit neuronalen Potenzial gibt es im Knochenmark. Unser Protokoll bereichert diese Population von Zellen durch hypoxische Vorkonditionierung und leitet sie dann zu reifen Schwann-Zellen.

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Tsui, Y. P., Mung, A. K., Chan, Y. S., Shum, D. K., Shea, G. K. Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells. J. Vis. Exp. (124), e55794, doi:10.3791/55794 (2017).

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Abstract

Dieses Manuskript beschreibt ein Mittel, um neuronale Progenitoren aus der Pop-Pop-Pop-Population (MSC) zu bereichern und danach auf das reife Schwann-Zellschicksal zu lenken. Wir unterwarfen Ratten- und menschliche MSCs vorübergehenden hypoxischen Zuständen (1% Sauerstoff für 16 h), gefolgt von einer Expansion als Neurosphären auf Niedrig-Attachment-Substrate mit epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) / basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) -Anpassung. Neurosphären wurden auf Poly-D-Lysin / Laminin-beschichtete Gewebekultur-Plastik ausgesät und in einem gliogenen Cocktail mit β-Heregulin, bFGF und Thrombozyten-Wachstumsfaktor (PDGF) kultiviert, um Schwann-Zell-ähnliche Zellen (SCLCs) zu erzeugen. Die SCLCs wurden für 2 Wochen mit gereinigten Dorsalwurzelganglien (DRG) -Neuronen, die von E14-15-schwangeren Sprague-Dawley-Ratten erhalten wurden, über die Kokultur gerichtet. Reife Schwann-Zellen zeigen die Persistenz bei der S100β / p75-Expression und können Myelinsegmente bilden. Auf diese Weise erzeugte Zellen haben das Potential aAnwendungen in autologen Zelltransplantationen nach Rückenmarksverletzungen sowie bei der Krankheitsmodellierung.

Introduction

Die Transplantation von neuronalen Vorläufern und deren Derivaten zeigt Versprechen als Behandlungsstrategie nach traumatischer Nervenverletzung 1 , 2 und Neurodegeneration 3 , 4 . Vor der klinischen Anwendung ist es wichtig, i) eine Methode für den Zugang und die Erweiterung einer autologen Quelle von Stamm- / Vorläuferzellen und ii) ein Mittel, um sie auf relevante, reife Zelltypen zu lenken, zu gewährleisten. Unser Interesse an der Zelltherapie bei Rückenmarksverletzungen führte uns dazu, eine robuste, autologe Zellquelle neuraler Vorläufer aus adulten Geweben zu suchen.

Eine Subpopulation von MSCs stammt aus dem Neuralwappen und ist leicht aus der Markhöhle zugänglich. Diese Zellen sind neuronale Vorläufer, die Neuronen und Glia erzeugen können 5 . Tiermodelle der zerebralen Ischämie zeigen, dass Hypoxie die Prol Iferation und multipotenz der neuronalen progenitoren im gehirn 6 Dies war die Grundlage für die Verwendung der hypoxischen Vorkonditionierung als Mittel zur Ausweitung auf margen-abgeleitete neuronale Vorläufer.

Die Transplantation von Schwann-Zellen in das verletzte Rückenmark fördert die Regeneration 2 . SCLCs können aus MSCs mittels Supplementierung mit gliogenen Faktoren ( dh β-Heregulin, bFGF und PDGF-AA) erzeugt werden, zeigen aber phänotypische Instabilität. Nach dem Abzug der Wachstumsfaktoren kehren sie zu einem fibroblastenähnlichen Phänotyp 7 zurück . Phänotypische Instabilität ist bei der Zelltransplantation aufgrund des Risikos einer abweichenden Differenzierung und Karzinogenese unerwünscht. Da Schwann-Zellvorläufer mit Axonbündeln innerhalb des embryonalen peripheren Nervs 8 assoziiert sind, wurden wir zu kokulturen SCLCs mit gereinigten embryonalen DRG-Neuronen 7 ,Ass = "xref"> 9 Die resultierenden reifen Schwann-Zellen sind schicksalhaft engagiert und zeigen die Funktion in vitro 7 , 9 und in vivo 10 .

Unser Protokoll für die Anreicherung von neuronalen Progenitoren aus MSCs ist einfach und effizient und führt zu einer Erhöhung der Zellzahl für nachfolgende Assays. Die Ableitung von Schicksal-engagierten Schwann-Zellen über die Coculture-Plattform ermöglicht die Untersuchung der Glia-Differenzierung und die Erzeugung von stabilen und funktionellen Schwann-Zellen für eine mögliche klinische Anwendung.

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Protocol

Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden in strikter Übereinstimmung mit dem NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von dem Ausschuss für die Verwendung von lebenden Tieren für Lehre und Forschung, Li Ka Shing Fakultät für Medizin, der Universität von Hongkong genehmigt. Menschliche Knochenmarkproben wurden aus dem Beckenkamm gesunder Spender erhalten, nachdem sie eine einverstandene Einwilligung erhalten hatten. Die Protokolle wurden vom Institutional Review Board, der University of Hong Kong, genehmigt.

1. Vorbereitung der Ratten-MSC-Kulturen

  1. Ernte von MSCs aus dem Femur
    1. Autoklavieren Sie alle Sektionswerkzeuge ( dh feines Sezierschere , Stumpfschneidschere und Zahnpinzette) bei 180 ° C für mindestens 2 Stunden vor dem Gebrauch.
    2. Bereiten Sie das MSC - Wachstumsmedium vor, das aus einer minimalen essentiellen Medium - Alpha - Modifikation (αMEM), ergänzt mit 15% fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin / Streptomycin (P / S, 1% v / v).
    3. Opfere junge männliche Sprague Dawley Ratten (200-250 g Körpergewicht) durch Pentobarbiton Überdosierung (240 mg / kg Körpergewicht, intraperitoneal).
      HINWEIS: Marrow-Proben von verschiedenen Ratten sollten separat verarbeitet werden.
    4. Lege die geopferten Tiere in Rückenlage. Reinigen Sie den Bauch und die unteren Gliedmaßen gründlich mit 70% Ethanol.
    5. Entfernen Sie die Haut und das subkutane Gewebe über die medialen Oberschenkel mit feinen Sezierscheren und Pinzetten. Entfernen Sie die Oberschenkelmuskeln in Umfangsrichtung, bis der Femur ausgesetzt ist. Setzen Sie diese proximal und distal fort, bis die Knie- und Hüftgelenke gesehen werden. Den Femur durch das Hüft- und Kniegelenk mit stumpfen Schneidscheren abtarchen.
      HINWEIS: Trense den Femur nicht, um die Markhöhle in diesem Stadium freizulegen. Übertragen Sie intakte Oberschenkel zu einer laminaren Strömung Gewebekultur Haube für die weitere Verarbeitung.
    6. Verwenden Sie stumpf gekippte Schneidscheren, um die distalen und proximalen Enden des Femurs durch die Metaphyse zu transectieren.
    7. Legen Sie einen 70 μm Zellsieb über ein 50 mL konisches Rohr. Setzen Sie eine 21 G, 10 mL Spritze mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, 10 mM Na 2 HPO 4 , pH 7,4) in den exponierten Femurkanal ein und spülen Sie den Markinhalt durch wiederholtes Spülen in das konische Röhrchen.
      HINWEIS: Etwa 20 ml PBS werden verwendet, um jeden Femur zu spülen. Wenn die Farbe des gespülten Inhalts blutverschmiert und trüb ist, kann ein größeres Volumen verwendet werden.
    8. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 480 xg für 5 min. Den Überstand verwerfen. Das Zellpellet wird in 10 ml MSC-Wachstumsmedium resuspendiert. Die Zellen auf eine 10 cm lange Gewebekultur schichten. Die Gewebekulturschalen in einen Zellinkubator (37 ° C, 5% CO 2 ) geben. Notieren Sie den ersten Tag der Beschichtung als Tag 0.
      HINWEIS: In allen Schritten mit Zentrifugation die Bremse für maximale Verzögerung einstellen.
  2. Etablierung und Erweiterung der MSC-Kolonien
    HINWEIS: Dieses Protokoll rElies auf Gewebekultur plastische Adhärenz als Mittel, um für MSCs aus der Markhöhle 11 zu wählen. Der Knochenmarkgehalt darf 2 Tage lang an der Gewebekulturkunst haften.
    1. Am Tag 2 spülen Sie die Kulturplatten dreimal mit 10 ml PBS aus, um nicht-adhärente Zellen zu entfernen. Ersetzen Sie das PBS mit 10 ml MSC-Wachstumsmedium nach dem Spülen. Waschen Sie die Zellen mit PBS und füllen Sie mit MSC Wachstumsmedium alle 3 Tage auf.
      ANMERKUNG: MSC-Kolonien sollten am Tag 6-7 sichtbar sein ( Abbildung 2A ).
    2. Passage der Zellen bis zum Tag 10 durch Entfernen des Wachstumsmediums und Spülen der Zellen mit PBS. Zugabe von 1,5 ml rekombinantem enzymatischen Zelldissoziationsreagenz und inkubieren bei 37 ° C für 5 min. Füge 3 ml MSC-Wachstumsmedium hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren. Sammeln Sie die abgetrennten Zellen durch Zentrifugation bei 250 xg für 5 min.
    3. Quantifizierung der Zellen innerhalb des Pellets unter Verwendung eines Hämocytometers nach einer geeigneten Verdünnung in PBS.
    4. Samen passagierte Zellen mit einer Dichte von 40.000 Zellen / cm 2 in eine 10-cm-Kulturplatte in MSC-Wachstumsmedium.
      HINWEIS: Ratten-MSCs sollten innerhalb von 2 Tagen nach Passage 80-90% Konfluenz erreichen (Abbildung 2B ). Zellen können wie in Schritt 1.2.2 für bis zu 8 Passagen beschrieben passagiert werden. MSCs können durch Immunzytochemie und ihre Fähigkeit zur Trilineage-Differenzierung charakterisiert werden (Abbildung 3 ) 12 . Nur MSC-Kulturen zwischen den Passagen 3 und 8 unterliegen einer nachfolgenden hypoxischen Vorkonditionierung und einer neuronalen Progenitoranreicherung. MSCs mit größerer Durchgangszahl nehmen eine abgeflachte Morphologie an (Abbildung 2C ) und produzieren nicht genügend neuronale Vorläufer. Diese Kulturen sollten verworfen werden.

2. Vorbereitung von menschlichen BMSC-Kulturen

  1. 1 ml humanes Knochenmark aspirieren mit 9 ml MSC Wachstumsmedium verdünnen und die Platte auftragenZellen auf einer 10-cm-Gewebekulturschale. Pflegen Sie die Kulturen in einem Zellinkubator (37 ° C, 5% CO 2 ).
  2. Entfernen Sie das Medium nach 2 Tagen und spülen Sie die Kulturen dreimal mit 10 ml PBS ab, um nicht-adhärente Zellen zu entfernen. Nach dem abschließenden Spülen das PBS entfernen und es mit 10 ml MSC-Wachstumsmedium ersetzen. Füllen Sie das Wachstumsmedium nach jeder 3 Tage Kultur nach dem PBS-Spülen auf.
    ANMERKUNG: MSC-Kolonien sollten am Tag 6-7 sichtbar sein. Die Anzahl der Kolonien kann zwischen den Fächern variieren.
  3. Passage der Zellen am Tag 10, wie in Schritt 1.2.2 beschrieben. Quantifizierung der Zellen innerhalb des Pellets unter Verwendung eines Hämocytometers nach einer geeigneten Verdünnung in PBS. Die passierten Zellen mit einer Dichte von 40.000 Zellen / cm 2 auf eine 10 cm-Kulturplatte im MSC-Wachstumsmedium absaugen.
    ANMERKUNG: Menschliche MSCs (Abbildung 2D ) zeigen eine ähnliche Morphologie gegenüber Ratten-MSCs und sollten ebenfalls innerhalb von 2 Tagen nach Passage 80-90% Konfluenz erreichen. Sie sollten chara seinDurch Immunzytochemie und ihre Fähigkeit zur Trilineage-Differenzierung 12 . Wie bei Ratten-MSCs sind menschliche MSCs, die zwischen Passage 3 und 8 liegen, einer nachfolgenden hypoxischen Vorkonditionierung und neuronaler Progenitoranreicherung unterworfen.

3. Hypoxische Vorkonditionierung

  1. Demontieren Sie die Hypoxiekammerkomponenten ( dh Basis, Deckel, Schalen) nach dem Lösen der Ringklemme und wischen Sie die Einzelteile mit 70% Ethanol ab. Legen Sie die Kammerkomponenten innerhalb einer laminaren Strömungsgewebekulturhaube zur Sterilisation unter UV-Licht für 15 min.
  2. Vor der hypoxischen Vorkonditionierung, entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Ratte und die menschlichen MSC-Kulturen (Abschnitte 1 und 2) mit 10 ml PBS. Ersetzen Sie das PBS durch 10 ml MSC-Wachstumsmedium, ergänzt mit 25 mM HEPES.
    ANMERKUNG: Die MSCs, die auf 10 cm Schalen gezüchtet wurden, sollten 80-90% Konfluenz erreicht haben, bevor sie einer hypoxischen Vorkonditionierung unterzogen werden.
  3. Legen Sie die CulIn der Hypoxiekammer. Die Kammerteile wieder zusammenbauen und die Ringklemme festziehen. Spülen Sie ein Gasgemisch aus 99% N 2 /1% O 2 in die Kammer mit einer Durchflussrate von 10 l / min für 5 min.
  4. Die Anschlussenden der Hypoxiekammer abdichten, um sicherzustellen, dass kein Gasaustritt besteht. Legen Sie die Kammer 16 Stunden lang in den Zellinkubator (37 ° C, 5% CO 2 ).
  5. Nach Beendigung der hypoxischen Vorkonditionierung, entfernen Sie die Kulturen aus der Kammer in Vorbereitung für die nachfolgende neuronale Progenitor Anreicherung Kultur.

4. Neural Progenitor Anreicherung Kultur

  1. Bereiten Sie das neuronale Progenitor-Medium vor, das aus Dulbecco's modifiziertem Adlermedium / Ham-Nährstoffmischung F12 (DMEM / F12), ergänzt mit B27 (2% v / v), basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF, 20 ng / ml), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF, 20 ng / ml) und P / S (1% v / v).
  2. Trennen Sie die hypoxisch vorkonditionierten Ratten / menschlichen MSCs, wie in Schritt 1.2.2 beschrieben.Sammeln Sie die abgetrennten Zellen durch Zentrifugation bei 250 xg für 5 min. Quantifizierung der Zellen innerhalb des Pellets unter Verwendung eines Hämocytometers nach entsprechender Verdünnung in PBS.
  3. Resuspendieren der Zellen in neuronalen Progenitor-Medium und Samen auf Low-Attachment, 6-Well-Platten mit einer Dichte von 6.000 Zellen / cm 2 . Legen Sie die Kultur in einen Zellinkubator (37 ° C, 5% CO 2 ) für 12 Tage. Füllen Sie 75% des neuronalen Vorläufermediums alle 3 Tage auf.
    HINWEIS: Größere, nicht adhärente Zellcluster sollten am Tag 6-7 beobachtet werden. Am Tag 10-12 können Neurosphären mit einem Durchmesser ≥ 100 μm beobachtet werden (Abbildung 4 ). Hypoxisch vorkonditionierte MSCs sollten mehr Neurosphären im Vergleich zu MSCs ergeben, die unter normoxischen Bedingungen kultiviert wurden 9 .
  4. Sammeln Sie Neurosphären am Tag 12, indem Sie sie in eine 10-ml-Pipette absaugen und auf ein 15-ml-Kegelrohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Neurosphären bei 250 xg für 5 min.
    HINWEIS: Neurosphären können seinCharakterisiert am Tag 12 für neuronale Vorläufer Marker, wie Nestin und GFAP 7 .

5. Erzeugung von Schicksal-engagierten Schwann-Zellen über Coculture mit DRG-Neuronen

  1. Vorbereitung von gereinigten Ratten-DRG-Neuronen
    1. Autoklavieren Sie alle Sektionswerkzeuge ( dh Dissektionsscheren , Pinzetten, zwei Mikrodissektionszangen und Mikrodissektionsscheren) bei 180 ° C für mindestens 2 Stunden vor dem Gebrauch.
    2. Mantel 6-Well-Gewebekulturplatten mit Poly-D-lysin (PDL, 10 μg / ml in PBS) bei 4 ° C über Nacht. Entfernen Sie die PDL und spülen Sie mit 1,5 ml PBS pro Well.
    3. Gehen Sie mit der Beschichtung der Platten mit Laminin (10 μg / ml in PBS) bei 37 ° C für 2 h vor. Spülen Sie die Platten mit 1,5 ml PBS pro Vertiefung ab.
    4. Vorbereiten des DRG-Neuronen-Wartungsmediums, bestehend aus neurobasalem Medium, ergänzt mit B27 (2% v / v), L-Glutamin (1% v / v), Nervenwachstumsfaktor (NGF, 20 ng / ml) und P / S (1 % V / v).
    5. Vorbereiten des DRG-Neuron-Reinigungsmediums, bestehend aus neurobasalem Medium, ergänzt mit B27 (2% v / v), L-Glutamin (1%), NGF (20 ng / ml), P / S (1%), Fluorodeoxyuridin (FDU, 10 Μg / ml) und Uridin (10 & mgr; g / ml).
    6. Opfer schwangere Ratten am Gestationstag 14-15 durch pentobarbital Überdosierung (240 mg / kg Körpergewicht, intraperitoneal).
    7. Lege die geopferten Tiere in Rückenlage. Reinigen Sie den Bauch gründlich mit 70% Ethanol.
    8. Schneide die untere Bauchwand des Tieres in Längsrichtung mit feiner Sezierschere und Pinzette. Identifizieren und entfernen Sie den Uterus mit Sektionsschere. Schneide die Uteruswand, um die Embryonen auszusetzen und zu extrahieren. Übertragen Sie die Embryos in eine sterile, 10 cm Kulturschale mit PBS gefüllt. Legen Sie die Kulturschale auf Eis.
    9. Übertragen Sie den Embryo, der für die Sektion vorgesehen ist, in eine sterile, 10 cm große Kulturschale, die mit PBS (Raumtemperatur) gefüllt ist, und positionieren Sie sie unter einem Sektionsmikroskop. Haben Sie den Embryo in anfälliger Position.
      NICHTE: Das weißliche Rückenmark und die angehängten DRGs können über den dorsalen Aspekt des Embryos durch seine lichtdurchlässige Haut gesehen werden.
    10. Setzen Sie die Mikrodissektionszange auf beiden Seiten des Rückenmarks ein und verwenden Sie die stumpfe Dissektion, um das Abtasten des abweichenden Weichgewebes zu trennen. Schneiden Sie das Rückenmark frei von dem Tier mit Mikrodissektion Pinzette entlang der Halsöffnung und Heck Stummel. Führen Sie weitere stumpfe Dissektion über den ventralen Aspekt der Schnur, um es von umgebenden Weichgewebe zu befreien.
    11. Verwenden Sie Mikrodissektionszangen, um restliches Weichgewebe über den dorsalen Aspekt des befreiten Rückenmarks zu entfernen.
      HINWEIS: In diesem Stadium sollten nur das Rückenmark, Nervenwurzeln und angeschlossene DRG bleiben.
    12. Trennen Sie einzelne DRGs von ihren verbindenden Nervenwurzeln mit Mikrodissektionszangen. Verwenden Sie einen Pipettenstift, der an einer 1-ml-Spitze befestigt ist, um die DRGs in ein 1,5 ml steriles Zentrifugenröhrchen zu bringen, das PBS enthält.
      HINWEIS: Für jede 1,5 mL Röhre, maximal100 DRGs können untergebracht werden.
    13. Die DRGs bei 250 xg für 5 min zentrifugieren und in rekombinantem enzymatischen Zelldissoziationsreagenz (200 & mgr; l pro Röhrchen) resuspendieren. Inkubieren (37 ° C, 5% CO 2 ) für 10 min. Die DRGs bei 250 xg für 5 min zentrifugieren, den Überstand entfernen und in DRG-Neuron-Wartungsmedium resuspendieren. Das Pellet wird durch sanftes Triturieren mit einer 200 μl Pipettenspitze abgetrennt. Die Zellen innerhalb des Pellets mit einem Hämocytometer nach einer geeigneten Verdünnung quantifizieren.
    14. Die Zellen mit einer Dichte von 5.000 Zellen / cm 2 in PDL / Laminin-beschichtete 6-Well-Platten in 1,5 ml DRG-Neuron-Wartungsmedium pro Vertiefung absaugen. Nach zwei Tagen Kultur entfernen Sie das DRG-Neuron-Wartungsmedium, spülen mit PBS und ersetzen durch DRG-Neuron-Reinigungsmedium.
      HINWEIS: Für jeden Reinigungszyklus die DRG-Kulturen mit dem Reinigungsmedium für 2 Tage behandeln, gefolgt von einem Tag der Inkubation im Wartungsmedium. Nach 3-4 Reinigungszyklen, die remOval aller endogenen glia wird erwartet 7 Das dauert ca. 14 Tage. Gereinigte Kulturen testen positiv auf den neuronalen Marker TUJ1 und fehlen für die S100β-Expression (Abbildung 5 ).
  2. Erzeugung von Schwann-Zell-Zellen
    1. Bereiten Sie das Gliainduktionsmedium, bestehend aus αMEM, ergänzt mit β-Heregulin (100 ng / ml), bFGF (10 ng / ml), Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF-AA, 5 ng / ml), FBS (10%) und P / S (1% v / v).
    2. Die in Abschnitt 4 hergestellten Neurosphären in PDL / Laminin-beschichteten 6-Well-Platten mit einer Dichte von 5-10 Kugeln pro cm 2 in 1,5 ml Gliainduktionsmedium pro Well auftragen. Ersetzen Sie das Gliainduktionsmedium alle 2 Tage nach dem Spülen der Zellen mit PBS.
      ANMERKUNG: Zellen aus seedierten Neurosphären werden nach Tag 2 nach außen ausgewandert. Am Tag 7 haben die Migrationszellen ein verjüngtes Aussehen und sollten die Immunopositivität für die Schwann-Zelle nachweisenMarker p75 Neurotrophin Rezeptor (p75) und S100β 7 . Diese Zellen werden als SCLCs bezeichnet.
  3. Kokultur von SCLCs mit DRG-Neuronen
    1. Bereiten Sie das Kokulturmedium vor, das aus dem DRG-Neuron-Wartungsmedium (Schritt 5.1.4) und dem Gliainduktionsmedium (Schritt 5.2.1) im Verhältnis 1: 1 Volumen-zu-Volumen besteht.
    2. Vorbereitung des Schwann-Zell-Wartungsmediums aus DMEM / F12, ergänzt mit FBS (5%), β-Heregulin (10 ng / ml) und P / S (1% v / v).
    3. Entfernen Sie das Kulturmedium von Tag 7 SCLCs, spülen Sie sie mit PBS und inkubieren Sie sie mit 0,5 ml / Vertiefung des rekombinanten enzymatischen Zelldissoziationsreagens bei 37 ° C für 5 min. Die SCLCs im Kokulturmedium resuspendieren.
    4. Die Zellen mit einem Hämocytometer nach einer entsprechenden Verdünnung quantifizieren.
    5. Die SCLCs auf gereinigte DRG-Neuron-Kulturen mit einer Dichte von 1.000 Zellen / cm 2 säen. Halten Sie die Cocultures für 14 Tage, mit Medium Ersatz alle 2 Tage.
      HINWEIS: Während der Kokultur haben SCLCs die spindelartige Morphologie erworben, die typisch für reife Schwann-Zellen ist (Abbildung 6 ). Diese Zellen bestehen nach dem Entzug von Wachstumsfaktoren in ihrem Phänotyp und sind in der Lage, Axone in vitro und in vivo 7 , 10 zu myelinieren. Die Positivität der Schwann-Zellmarker ( dh p75 und S100β) sollte durch Immunfluoreszenz überwacht werden.
    6. Nach Beendigung der Kokultur, Passage-engagierte Schwann-Zellen, wie in Schritt 1.2.2 beschrieben. Verwenden Sie 0,5 ml Dissoziationsreagenz pro Vertiefung. Die Zellen mit einem Hämocytometer nach einer entsprechenden Verdünnung quantifizieren.
    7. Resuspendieren Sie Schicksal-engagierte Schwann-Zellen in Schwann-Zell-Wartungsmedium mit einer Dichte von 10.000 Zellen / cm 2 . Samenzellen in PDL / Laminin-beschichtete 6-Well-Platten für Immunfluoreszenz.
      ANMERKUNG: Cocultures enthalten zwangsläufig MSCs, die einen Fibroblasten angenommen habenZelle Schicksal 7 . Diese Zellen werden zusammen mit Schicksal-engagierten Schwann-Zellen nach der Fertigstellung der Kokultur passagiert. Schwann-Zellen, die oben auf diesem Fibroblasten-Substrat liegen, können nach dem Spülen mit "kalten Strahlen" von PBS (4 ° C), wie es an anderer Stelle beschrieben wurde, leicht abgelöst und weiter ausgebaut werden. Schicksal-engagierte Schwann-Zellen können im Wartungsmedium für 1 Monat erweitert werden.

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Representative Results

Eine Übersicht über die wichtigsten Stufen in unserem Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Zusammenfassend werden Ratten- und menschliche MSCs durch die Einhaltung von Gewebekulturplastik ausgewählt. Expandierte MSCs sind mit Hypoxie vorkonditioniert und unterliegen dann Neurosphären-bildenden Bedingungen. Neurosphären sind plattiert und können in SCLCs differenzieren. SCLCs werden mit gereinigten DRG-Neuronen cocultured, um Schicksal-engagierte Schwann-Zellen zu erzeugen.

Die Morphologie der kultivierten Ratte und menschlichen MSCs ist in Abbildung 2 dargestellt. Ihre gesunde, verjüngte Morphologie zeigt sich im Gegensatz zu der viereckigen Erscheinung von MSCs, die für hohe Durchgangszahlen beibehalten werden, die ihre Multipotenz verloren haben. Expandierte Ratten- und Humankolonien sollten die Expression von MSC-Markern, eine Abwesenheit von hämatopoetischen Stammzellmarkern und die Fähigkeit zur Trilineage-Dichte zeigenFermentation (Abbildung 3 ). Gesunde MSCs zwischen den Passagen 3 und 8 unterliegen einer hypoxischen Vorkonditionierung für 16 h und werden danach auf niedrig adhärierende Kulturplatten mit EGF / bFGF-Supplementierung übergeben. Die hypoxische Vorkonditionierung führt zu einer größeren Anzahl von Neurosphären, sowie zu größeren durchschnittlichen Neurosphären (Abbildung 4 ).

Neurosphären werden auf PDL / Laminin-beschichtete Kulturplatten plattiert und induziert, um SCLCs durch Kultur in Gliainduktionsmedium zu erhalten, das β-Heregulin, bFGF und PDGF-AA enthält. SCLCs zeigen die charakteristische verjüngte Morphologie von Schwann-Zellen und die entsprechende Marker-Expression, sind aber phänotypisch instabil und kehren nach dem Absetzen von Wachstumsfaktoren zu einem Fibroblasten-Phänotyp zurück

Die Kokultur mit sensorischen Neuronen ist eine Voraussetzung für eine Zelle-intrinsische SwJuckreiz zum Schicksal Engagement. Die Etablierung von gereinigten DRG-Netzwerken erfolgt durch gepulste Behandlung mit FDU und Uridin zur Entfernung von endogenem Glia und sollte durch die Abwesenheit von S100β-Immunopositivität bestätigt werden (Abbildung 5 ). Am Tag 7 werden SCLCs für 14 Tage mit gereinigten DRG-Neuronen passagiert und cokultiviert (Abbildung 6 ). Nach der Fertigstellung der Kokultur sollten reife, schicksalhafte Schwann-Zellen entstehen.

Abbildung 1
Abbildung 1: Überblick über das Protokoll. Knochenmark wird entweder aus Rattenfemuren oder menschlichen Beckenkamm-Aspiraten gewonnen. MSCs aus dem Knochenmark können sich auf Gewebekultur-Plastik anbringen und ausdehnen. Um MSCs mit neuronalen Potenzialen zu bereichern, werden die Zellen 16 h lang in 1% O 2 vorkonditioniert und dann auf die niedrig adhärierende Kultur pl passiertMit bFGF / EGF ergänzung. Dies führt zur Bildung von Neurosphären, die auf PDL / Laminin-beschichtete Gewebekulturplastik plattiert und in Gliainduktionsmedium kultiviert werden, um SCLCs zu erzeugen. SCLCs werden mit gereinigten DRG-Neuronen für 2 Wochen passagiert und cocultured, um sie bis zur Reife zu leiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Etablierung von MSC-Kolonien. Größere MSC-Kolonien sollten 6-7 Tage nach dem Plattieren von Knochenmarkzellen auf Gewebekulturplastik sichtbar sein. Ein repräsentatives Bild einer Ratten-MSC-Kolonie ist gezeigt ( A ), während menschliche Kolonien ein ähnliches Aussehen zeigen. Kolonien können am Tag 10 passagiert werden. Bei höherer Vergrößerung sind beide Ratten (B ) und humanen ( D ) MSCs zeigen nach der Passage eine charakteristische fibroblastenartige Morphologie. MSCs, die für hohe Durchgangszahlen beibehalten werden, erwerben eine abgeflachte, viereckige Morphologie ( C ) und sollten verworfen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Charakterisierung von MSCs. ( A - D ) Repräsentative Bilder von menschlichen MSCs. MSCs können durch die Expression geeigneter Marker wie CD90 ( A ), CD73 ( B ) und Stro-1 ( C ) und durch Abwesenheit von hämatopoetischen Stammzellmarkern wie CD45 ( D ) charakterisiert werden. ( E - G ) Ratte MDie in dem Protokoll isolierten und expandierten SCs zeigen die Multipotenz in ihrer Fähigkeit, Adipocyten zu bilden ( E ; Fettablagerungen, die mit Sudanrot gefärbt sind), Osteoblasten ( F , pericelluläre Matrix, die mit Alizarinrot gefärbt ist) und Chondrozyten ( G ; Proteoglycane, die mit Safranin- O) unter geeigneten Kulturbedingungen. Maßstäbe = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Anreicherung von neuronalen Progenitoren aus MSCs. Sowohl Ratten- ( A ) als auch menschliche ( C ) MSCs bilden Neurosphären, wenn sie bei niedrigadhärenten Gewebekultur-Plastik in Medium, ergänzt mit EGF / bFGF, kultiviert werden. Die Zahlen und der durchschnittliche Durchmesser der Ratte ( D ) -Kugeln wird durch die hypoxische Vorkonditionierung von MSCs (16 h, 1% O 2 ) vor der Induktion der Kugel verstärkt. Maßstäbe = 200 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Etablierung von gereinigten Ratten-DRG-Netzwerken Gereinigte DRG-Netze werden nach einer gepulsten Behandlung mit den Antimitotika FDU und Uridin (A) hergestellt. Neuritennetzwerke, die ohne S100β-exprimierende endogene Glia (B) sind, sind für die Kokultur mit SCLCs bereit. Maßstäbe = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


Abbildung 6: Erzeugung von Knochenmark-abgeleiteten Schwann-Zellen über Kokultur mit DRG-Neuronen. Nach Beendigung von 2 Wochen Kokultur mit gereinigten DRG-Neuronen und humanen SCLCs treten spindelförmige, schicksalhaft gebundene Schwann-Zellen aus beiden normoxia- und hypoxiebehandelten Gruppen ( A und D ) auf. Diese Zellen exprimieren die Schwann-Zellmarker p75 (B und E) und S100β (C und F). Die Expression von humanem Nuklei-Antigen (HuNeu) zeigt, dass die S100β-positiven Zellen keine Gliazellen, die aus Ratten-DRGs stammen, verunreinigen. Maßstäbe = 100 μm.

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Discussion

Es ist wichtig, die "Stämme" von MSCs vor der Anreicherung von neuronalen Vorläufern durch hypoxische Vorkonditionierung und Neurosphären-Kultur zu bewahren. Aus unserer Erfahrung können multipotenten MSCs zuverlässig durch ihre langgestreckte fibroblastenartige Morphologie identifiziert werden. Im Gegensatz dazu nehmen MSCs, die eine abgeflachte, viereckige Morphologie mit prominenten zytoskeletalen Stressfasern angenommen haben, nicht leicht neurales Zellschicksal an und sollte verworfen werden. Im Allgemeinen nutzen wir keine MSCs mit Durchgangszahlen größer als acht. Um ihre Stämme zu bewahren, ist es entscheidend, umgehend MSCs zu vermitteln, bevor sie 100% Konfluenz erreichen. Umgekehrt ist die Aufrechterhaltung von MSCs bei einem zu geringen Zusammenfluss unerwünscht. Aus unserer Erfahrung, Seeding MSCs mit einer Dichte von 40.000 Zellen / cm 2 , oder einfach passieren Zellen, die 80% konfluent im Verhältnis 1: 2 sind, ermöglicht die besten Ergebnisse.

Die ordnungsgemäße Einrichtung und Instandhaltung des DRG-Netzes ist ein KritikerAl Determinante des Kokulturerfolgs Die für die DRG-Ernte erforderliche Zeit sollte auf ein Minimum reduziert werden. Einzelne Ganglien sollten atraumatisch gehandhabt werden, besonders bei der Ablösung vom Rückenmark, wenn es am besten ist, nur die Nervenwurzeln zu behandeln. Im Allgemeinen streben wir eine Zeitspanne von weniger als 2 h zwischen der Zeit des Tieropferns und der enzymatischen Verdauung von geernteten DRGs an, da eine verlängerte Ernte zu Gewebemazeration und dem Verlust der Zelllebensfähigkeit führt. Die Ablösung von DRG-Neuronen aus dem Substrat während der Kultur ist oft aufgetreten. Um dies zu verhindern, sollte die Beschichtung frisch zubereitet und in der Nähe der Zeit der Gewebeernte durchgeführt werden. Im Allgemeinen lösen sich große, unverdaute DRG-Cluster häufiger und geben keinen Kokulturerfolg. Die Dauer der enzymatischen Verdauung und die Menge an Verreibung kann angepasst werden, mit dem Ziel, ein Netzwerk mit einem Erscheinungsbild zu erreichen, das Abbildung 5 ähnelt.

Während unser CocuLture-Plattform veranlasst konsequent das Schicksal-Engagement, nur 20-30% der Kulturen, die in parallelen Ausfällen durchgeführt werden, schlagen die engagierten Schwann-Zellen 7 , 13 . Wir bereiten daher genügend DRGs und SCLCs vor, um gleichzeitig Kokulturen in drei bis vier 6-Well-Kulturplatten durchzuführen. Wir vermuten, dass eine Kombination von Faktoren, die mit dem zugrundeliegenden DRG-Netzwerk zusammenhängen, einschließlich ihres embryonalen Alters, der Zelllebensfähigkeit, der Dichte und der Topographie, den Erfolg der Kokultur beeinflussen. Diese zugrunde liegenden Variablen müssen weiter untersucht und standardisiert werden. Abgesehen von Einschränkungen in der Kokulturausbeute sollte ein Mittel zur Verhängung der Anforderung an Ratten-abgeleitete DRG-Neuronen und tierische Produkte angestrebt werden. Außerdem sollte die Dauer des Protokolls verkürzt werden. Als abgekürzte Modifikation unseres Protokolls haben wir bei der Ableitung von reifen Schwann-Zellen ab Tag 10 Neurosphären, die direkt auf gereinigte DRG-Neuronen geimpft wurden, ohne die vorherige Generation von SCLCs Erfolg gehabt , 10 .

Neurosphären, die über unsere Methode angereichert sind, dienen als robuste Quelle von Zellen neuronaler und glialer Linien. Unsere Plattform für die Leitung von Vorläuferzellen zum Schicksalsverpflichtung hat den Vorteil, dass die genetische Manipulation mit ihren inhärenten Risiken vermieden wird und die resultierenden Zellen für die Zelltransplantation, die Krankheitsmodellierung und die Untersuchung der Glialdifferenzierung von Bedeutung sind.

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Disclosures

Alle Autoren dieses Manuskripts haben keine Offenbarungen.

Acknowledgments

Die Autoren möchten Dr. Nai-Sum Wong für die Bereitstellung des Hypoxie-Kammerapparates und Frau Alice Lui für die technische Unterstützung anerkennen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
αMEM Sigmaaldrich M4526
DMEM/F12 Thermofisher scientific 12400-024
Neurobasal medium Thermofisher scientific 21103-049
FBS Biosera FB-1280/500
B27 Thermofisher scientific 17504-001
Epidermal growth factor (EGF) Thermofisher scientific PHG0313
Basic fibroblast growth factor (bFGF)  Peprotech 100-18B/100UG
Nerve growth factor (NGF)  Millipore NC011
Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) Peprotech 100-13A
Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) Millipore 01-201
Uridine Sigmaaldrich U3003
5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU) Sigmaaldrich F0503
Poly-D-lysine (PDL) Sigmaaldrich P7886-1G
Laminin Thermofisher scientific 23017015
GlutaMAX Thermofisher scientific 35050061
Penicillin / streptomycin (P/S) Thermofisher Scientific 15140-122
TrypLE Express Thermofisher Scientific 12604-013
10 cm plate for adherent culture TPP 93100 Used for selection of MSCs by tissue culture adherence
6-well plate for adherent culture TPP 92006 Used for expansion of MSCs following passaging
UltraLow 6-well plate for non-adherent culture Corning 3471 Used for neural progenitor enrichment
anti-human CD90(Thy-1) BD Biosciences 555593
anti-human CD73 BD Biosciences 550256
anti-human/rat STRO-1 R&D Systems MAB1038
anti-human nestin R&D Systems MAB1259
anti-human CD45 BD Biosciences 555480
anti-rat CD90(Thy-1) BD Biosciences 554895
anti-rat CD73 BD Biosciences 551123
anti-rat nestin BD Biosciences MAB1259
anti-rat CD45 BD Biosciences 554875
Anti-S100β Dako Z031101
Anti-p75 Millipore MAB5386
Anti-GFAP Sigmaaldrich G3893
Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) Covance MMS-435P
Anti-Human nuclei Millipore MAB1281
Hypoxia chamber Billups-Rothenberg MIC-101
HEPES buffer Sigmaaldrich H4034-100G

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References

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