समयबद्धता संगठनात्मक स्लाइस में प्रवासित न्यूरॉन्स के कन्फोकल इमेजिंग भ्रूण माउस मस्तिष्क का प्रयोग करना

Neuroscience

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Summary

यह प्रोटोकॉल त्रिविकूल रूप से पका हुआ कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए निर्देश प्रदान करता है। Utero electroporation में, organotypic टुकड़ा संस्कृति, और समय चूक confocal इमेजिंग संयुक्त करने के लिए संयुक्त रूप से और गतिशील overexpression या पलायन न्यूरॉन्स में ब्याज की जीन के downregulation के प्रभावों का अध्ययन और विकास के दौरान उनके भेदभाव का विश्लेषण करने के लिए संयुक्त कर रहे हैं।

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Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (125), e55886, doi:10.3791/55886 (2017).

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Abstract

Utero electroporation में माउस भ्रूण विकसित करने के मस्तिष्क प्रांतस्था में रेडियल प्रवास की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक तेज़ और शक्तिशाली दृष्टिकोण है। इसने रेडियल प्रवासन के विभिन्न चरणों का वर्णन करने और इस प्रक्रिया को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्रों को चिह्नित करने में मदद की है। माइग्रेट करने वाले न्यूरॉन्स का प्रत्यक्ष और गतिशील रूप से विश्लेषण करने के लिए उन्हें समय के साथ पता होना चाहिए। यह प्रोटोकॉल एक वर्कफ़्लो का वर्णन करता है जो कि अंगोटेपिक स्लाइस संस्कृति और समय-समाप्ति confocal इमेजिंग के साथ utero electroporation में जोड़ती है , जो सीधे परीक्षा और कॉर्डिकल न्यूरॉन्स को आंशिक रूप से पलायन के गतिशील विश्लेषण की अनुमति देता है। इसके अलावा, माइग्रेशनिंग न्यूरॉन्स, जैसे कि माइग्रेशन स्पीड, स्पीड प्रोफाइल, रेडियल ओरिएंटेशन परिवर्तन के विस्तृत लक्षण वर्णन संभव है। विधि आसानी से क्षतिग्रस्त होकर कार्य के लाभ के रूप में अच्छी तरह से बचाव प्रयोगों द्वारा कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को आंशिक रूप से माइग्रेट करने में रुचि के जीनों के कार्यात्मक विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। समय समाप्तमाइग्रेट करने वाले न्यूरॉन्स की इमेजिंग एक अत्याधुनिक तकनीक है जो एक बार स्थापित की गई है जो न्यूरॉनल माइग्रेशन विकारों के माउस मॉडल में मस्तिष्क प्रांतस्था के विकास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

Introduction

नेकोटेक्स संज्ञानात्मक, भावनात्मक और संवेदी कार्यों के प्रमुख स्थल है। यह मस्तिष्क की सतह के समानांतर में उन्मुख छह क्षैतिज परतों से बना है। पृष्ठीय टेलिन्फोलोन की पार्श्व की दीवार के विकास वाले पूर्व कोशिकाओं के दौरान प्रक्षेपण न्यूरॉन्स को जन्म देते हैं जो त्रिआयामी सतह को पियाल की ओर स्थानांतरित करते हैं और परत प्रकार-विशिष्ट न्यूरोनल पहचान प्राप्त करते हैं। वेन्ट्रिकुलर / सब्विन्टिकुलर जोन (वीजेड / एसवीजेड) में उत्पन्न होने के बाद ये न्यूरॉन्स ट्रांज़िर्योर मल्टीपोलर हो जाते हैं और उनके प्रवास को धीमा करते हैं। इंटरमीडिएट ज़ोन (आईजेड) में थोड़ी देर रहने के बाद वे एक द्विध्रुवी आकारिकी पर स्विच करते हैं, रेडियल ग्लिल स्कैफोल्ड से संलग्न होते हैं और कॉर्टिकल प्लेट (सीपी) में रेडियल ओरिएंटेड माइग्रेशन जारी करते हैं। अपने अंतिम लक्ष्य प्रक्षेपण न्यूरॉन्स तक पहुंचने पर रेडियल ग्लियाल प्रक्रियाओं से अलग होकर और परत-विशिष्ट पहचान हासिल कर लेते हैं। न्यूरॉनल प्रवासन के विभिन्न चरणों को प्रभावित करने वाले जीन में उत्परिवर्तन, गंभीर कॉर्टिकल कुरूपता, जैसे कि लिसेनकएफ़ीली या सफ़ेद मामला उत्थान 1 , 2

Utero electroporation में कृंतक भ्रूण 3 , 4 के विकासशील मस्तिष्क में तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए एक तेज़ और शक्तिशाली तकनीक है। इस तकनीक के साथ, न्यूरॉन्स के विकास में अपने कार्यों का अध्ययन करने के लिए यह पछाड़ना और / या ब्याज की अत्यधिक विषैले जीनों के लिए संभव है। इस विधि ने रूपात्मक विवरणों का वर्णन करने और रेडियल प्रवासन 5 , 6 , 7 , 8 , 9 की प्रक्रिया के आणविक तंत्रों को विशेष रूप से वर्णन करने में मदद की है। रेडियल माइग्रेटिंग न्यूरॉन्स सेल आकृति, माइग्रेशन स्पीड, साथ ही प्रवासी दिशा में गतिशील परिवर्तन से गुजरती हैं, जो समय के साथ प्रत्यक्ष और निरंतर अवलोकन की आवश्यकता होती है। ऑर्गोटाइपिक स्लाइस कंटूElectroporated दिमाग के फिर से और समय चूक confocal इमेजिंग समय के साथ सीधे नज़र रखने माइग्रेट करने की अनुमति देता है। इस संयुक्त दृष्टिकोण का उपयोग करना, माइग्रेट करने वाले न्यूरॉन्स की अलग-अलग विशेषताओं का विश्लेषण करना संभव है, जो कि electroporated दिमाग के निश्चित ऊतक वर्गों में जांच नहीं की जा सकती।

हमने हाल ही में electroporated दिमाग की टुकड़ा संस्कृतियों में न्यूरॉन्स पलायन cortical विकास 10 के दौरान प्रतिलेखन कारक बी सेल CLL / लिंफोमा 11A (Bcl11a) की भूमिका का अध्ययन करने के लिए आवेदन किया की समय-अंतराल कोंफोकल इमेजिंग। बीसीएलएलएए युवा प्रवासी काउर्टेलिक न्यूरॉन्स में व्यक्त किया गया है और हमने इसके कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक सशर्त उत्परिवर्ती बीसीएलएलएएएएलएलएए ( बीसीएलएलएए फ्लॉक्स ) 11 का इस्तेमाल किया है। बीसीएलएलएए फ्लक्स / फ्लॉक्स दिमाग के कॉर्टिकल प्राइजनीटर्स में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के साथ क्रै रिंकंबेनेस के इलेक्ट्रोप्रोरेज ने हमें एक मोज़ेक उत्परिवर्ती स्थिति बनाने की अनुमति दी, जिसमें केवल कुछ कोशिकाओं में उत्परिवर्तित किया जाता हैअन्यथा जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि इस तरह, एकल सेल स्तर पर बीसीएलएलएए के सेल-स्वायत्त कार्यों का अध्ययन करना संभव था। हमने पाया है कि Bcl11a उत्परिवर्ती न्यूरॉन्स उनके प्रवास 10 के दौरान कम गति, उनकी गति प्रोफाइल में बदलाव के साथ-साथ यादृच्छिक की तरह उन्मुखीकरण परिवर्तन प्रदर्शित करते हैं। उल्लिखित प्रोटोकॉल में हम सफल इलेक्ट्रोफ़ोरेशन और स्लाइस कल्चर की तैयारी के लिए वर्कफ़्लो का वर्णन करते हैं, 12 माउस दिमाग के साथ-साथ कॉर्टिकल स्लाइस संस्कृतियों के समय-अंतराल confocal इमेजिंग।

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Protocol

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाएं पशु कल्याण समिति (रेगेरींग्सप्रिसीडिम ट्यूबिन्गेन) द्वारा अनुमोदित थीं और जर्मन पशु कल्याण अधिनियम और यूरोपीय संघ के निर्देशक 2010/63 / यूरोपीय संघ के अनुसार किए गए थे।

1. यूटरो इलेक्ट्रोपोरेज में

  1. माइक्रोइन्जेक्शन सुइयों
    1. एक बॉक्स फिलामेंट (2.5 मिमी x 2.5 मिमी) और निम्न प्रोग्राम के साथ माइक्रोप्रोप्लेट पुलर का उपयोग करके माइक्रोइंजेंस सुइयों में ऊपरी व्यास: 1.0 मिमी, आंतरिक व्यास: 0.58 मिमी, लंबाई: 100 मिमी) को खींचें और निम्न प्रोग्राम: HEAT: 540, पुल : 125, वैल्यूसिटी: 20, और देरी: 140. रैम परीक्षण (हिट वैल्यू: रैंप + 25) प्रदर्शन करके प्रत्येक व्यक्तिगत रेशा के लिए हिट वैल्यू निर्धारित करें।
    2. भ्रूण के दिन (ई) 13.5 या उससे छोटी और 30 से 40 माइक्रोन में इंजेक्शन लगाने के लिए 20 से 30 माइक्रोग्राम के टिप आकार प्राप्त करने के लिए एक माइक्रोग्रंडर के साथ 38 डिग्री के कोण पर मध्यवर्ती और उच्च क्रांति की गति पर बेवेल सुई पुराने भ्रूणचरणों। भंडारण के लिए, किसी बॉक्स या पेट्री डिश में सुइयों को सुधारने के लिए युक्तियों को नुकसान पहुंचाने के लिए मॉडलिंग मिट्टी के साथ ठीक करें
  2. प्लाज्मिड डीएनए समाधान
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एन्डोटॉक्सिन मुक्त मैक्सी तैयारी किट का उपयोग करते हुए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन ( जैसे GFP) युक्त प्लाज्मिड डीएनए का निर्माण करें।
    2. 0.01% की अंतिम एकाग्रता में फास्ट ग्रीन वाली एंडोसॉक्सिन मुक्त ट्रिस-ईडीटीए बफर में 1-2 μg / μL के अंतिम एकाग्रता में प्लाज्मिड डीएनए समाधान को पतला करें। अनियंत्रित समाधान और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
  3. बैक्टीरियोस्टैटिक सोडियम क्लोराइड समाधान
    1. बैक्साइल अल्कोहल 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान के लिए 0.9% की अंतिम एकाग्रता को जोड़कर जीवाणुरोधी सोडियम क्लोराइड समाधान तैयार करें। उपयोग करने के तुरंत बाद बाँझ फिल्टर का समाधान
  4. कारप्रफ़ेन इंजेक्शन समाधान
    1. कारप्रोफेन इंजेक्शन समाधान तैयार करें0.5 एमजी / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए कारप्रोफ़ेन को 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान में बाँझ Iotonic जोड़ना। 4 दिनों के लिए 28 दिन तक स्टोर करें।
  5. संज्ञाहरण, डीएनए इंजेक्शन, और इलेक्ट्रोप्रोरेज
    1. ई 14.5 समय-गर्भवती माउस का वजन करें और इसे वाष्पीकरणिक से जुड़े पारदर्शी अनैस्टेटीशिज कक्ष में रखें और 5% आइसफ्लुरेन के साथ संतृप्त। जब जानवर बेहोश हो जाता है, तो उसे 37 डिग्री सेल्सियस वार्मिंग प्लेट से जुड़ी एक एनेस्थेटिटिंग मुखौटा में स्थानांतरित करें और इसे 1.8-2.2% आइसफ्लुरेन के साथ संवेदनाहट रखो।
      नोट: पूंछ चुटकी और पेडल रिफ्लेक्सिस (पैर की अंगुली चुटकी) के नुकसान से सर्जिकल संज्ञाहरण के विकास का आकलन करें।
    2. एनालजेसिया के लिए, 50 मिलीग्राम कारपोरोफेन इंजेक्शन समाधान के 10 मिलीग्राम माउस बॉडीवेट (5 मिलीग्राम / किग्रा के वजन वाले वजन) के ऊपर इंजेक्ट करें। माउस को अपनी पीठ के नीचे से घुमाकर सावधानीपूर्वक आंखों को पेट्रोलियम जेली से सूखने से रोकने के लिए कवर करें।
    3. धीरे से अंग फैलाए और उन्हें ठीक करेंसर्जिकल टेप के साथ वार्मिंग प्लेट के साथ सेलूलोज़ swabs का उपयोग कर आयोडीन समाधान (7.5 मिलीग्राम / एमएल) के बाद 70% इथेनॉल के साथ पेट को जीवाणुरहित करें। उचित कीटाणुशोधन के लिए यह प्रक्रिया तीन बार दोहराएं।
    4. उदर की ढंका के लिए पेट को कवर करें जिसमें पेट की चीरा के लिए एक फ़ील्ड (व्यास: 2 - 2.5 सेमी) को बाहर निकालने के लिए एक चीरा कटौती की गई है। जीवाणुरोधी सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ धुंध का आना।
      सावधानी: पेडल रिफ्लेक्स के नुकसान से सर्जिकल संज्ञाहरण के विकास का पुनर्मिलन करें।
    5. सूक्ष्म Adson संदंश (दाँतेदार, लंबाई: 12 सेमी) का उपयोग करना और ठीक कैंची (कोण से लंबाई, 9 सेमी) पेट का मध्य रेखा के साथ लगभग 1.5 सेमी की त्वचा काटते हैं। लाइनिया अल्बा के साथ अंतर्निहित मांसपेशियों को काटें
    6. अंगूठी संदंश (लंबाई: 9 सेंटीमीटर, बाहरी व्यास: 3 मिमी, आंतरिक व्यास: 2.2 मिमी) के साथ एक गर्भाशय के सींग को निकालें और धीरे से गीला दाग पर रखें।
      सावधानी: केवल भ्रूण के बीच में अंगूठी संदंश के साथ गर्भाशय के सींग को पकड़ोडी प्लेसेंटास या किसी आपूर्ति पोत को परेशान नहीं करते जीवाणुरोधी सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ हर समय गर्भाशय को नम रखें।
    7. अंगूठी संदंश के साथ एक भ्रूण को सावधानीपूर्वक रखें और पार्श्व वेंट्रिकल का पता लगाएं, जो कि अर्धवर्तुष की छाया के रूप में सागिटल साइनस के समानांतर प्रस्तुत करता है। इंजेक्शन साइट लगभग आंखों की आंखों और साइनस के संगम के बीच की रेखा के मध्य में स्थित होती है, जहां बायांपटल साइनस शाखाएं दो अनुक्रमिक साइनस के लिए होती हैं। गर्भाशय की दीवार के माध्यम से और पार्श्वीय वेंट्रिकल में सूक्ष्म-सूजन सुई को पुश करें।
      नोट: यदि आवश्यक हो, इंजेक्शन की गहराई सुई के पीछे हटने से ठीक किया जा सकता है।
    8. माइक्रो इंजेक्टर के साथ पार्श्व वेंट्रिकल में डीएनए समाधान के 1 से 2 μL इंजेक्षन करें, जो निम्न सेटिंग का उपयोग करते हुए पैर पेडल के साथ संचालित होता है: 25 एसईआई, 10 से 20 एमएस प्रति पल्स और 5 से 10 दालों। सफल इंजेक्शन को रंगीन डीएनए समाधान द्वारा मॉनिटर किया जा सकता है, जो निलय तंत्र को भरना चाहिए।
    9. इस तरह से 'सकारात्मक' टर्मिनल इंजेक्ट वेंट्रिकल और 'नेगेटिव' के रूप में एक ही तरफ है, ऐसे चिमटी प्रकार के इलेक्ट्रोड (ई 13.5 या छोटे और 5 मिमी व्यास के लिए E14.5 या पुराने के लिए 3 मिमी व्यास) टर्मिनल भ्रूण के सिर के नीचे इंजेक्शन वेंट्रिकल के विपरीत दिशा में है।
    10. बैक्टीरियोस्टैटिक सोडियम क्लोराइड समाधान की कुछ बूंदों के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन साइट को मिलाएं और 950 एमएस के अंतराल के साथ 50 एमएस की अवधि के 5 विद्युत दालों (35 डिग्री सेल्सियस ई 13.5 या छोटा और 40 वी के लिए E14.5 या अधिक) लागू करें।
      नोट: 60 से 9 0 एमए की धाराएं सफल इलेक्ट्रोपायर के लिए आमतौर पर पर्याप्त होती हैं। निचली धाराएं न्यूरॉन्स को प्रभावी रूप से ट्रांसफ़ेक्ट नहीं कर सकती हैं, जबकि उच्च धाराओं से भ्रूण मृत्यु हो सकती है।
    11. गर्भाशय के सींग के हर भ्रूण के लिए प्रक्रिया को दोहराएं (सीएफ चरण 1.5.7। 1.5.10।) और धीरे-धीरे इसे पेट की गुहा में डाल दें।
    12. दूसरी तरफ से गर्भाशय के सींग को निकालें और proc को दोहराएंचरण 1.5.7 में वर्णित शिक्षा 1.5.11 के लिए
    13. माइक्रो एडोसॉन फोर्ब्स, मैथ्यू सुई होल्डर (टंगस्टन कार्बाइड, लंबाई: 14 सेमी), और गैर-शोषक शल्य सिवनी (3/8 सर्कल, 13 मिमी, शराब बिंदु) का उपयोग कर त्वचा की सूजन करने से पहले मांसपेशियों की परत को सुखाकर पेट की गुहा को बंद करें।
      सावधानी: सीवन के दौरान गर्भाशय या किसी अन्य अंग को पकड़ने के लिए सावधान रहें।
    14. ध्यान से आयोडीन समाधान (7.5 मिलीग्राम / एमएल) के साथ त्वचा सीवन कीटाणुरहित और धीरे-धीरे पेट्रोलियम जेली के सेल्यूलोज swabs का उपयोग करके पेरूक्यूलर अतिरिक्त हटा दें। एक अवरक्त दीपक के नीचे माउस रखें, जब तक यह जाग न हो। अगले दो दिनों के दौरान माउस की निगरानी करें। चरण 1 में वर्णित analgesia उपचार के दोहराएँ 1.5.2 12 से 24 घंटे के बाद

2. अंगोलापीक स्लाइस संस्कृति

  1. लैमिनिन स्टॉक सोल्यूशन
    1. एक मिलीग्राम / एमएल लमिनिन स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए बाँझ पानी में 1 मिलीग्राम लैओफीलाइज्ड लैमिनिन भंग करें। 50 μL aliquots तैयार करें-80 डिग्री सेल्सियस पर एन डी स्टोर
  2. पॉली एल एलिसिन स्टॉक सोल्यूशन
    1. 1 मिलीग्राम / एमएल पाली-एल-लाइसिन स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए बाँझ पानी में 50 मिलीग्राम पाली-एल-लाइसिन को भंग करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 एमएल अलोकुट्स और स्टोर तैयार करें
  3. पूर्ण हैक बैलेंस्ड नमक समाधान (पूर्ण एचबीएसएस)
    1. 50 एमएल का 10x एचबीएसएस समाधान, 1 एम HEPES बफर (पीएच 7.4), 15 एमएल 1 एम डी-ग्लूकोस समाधान, 5 एमएल का 100 एमएम कैल्शियम क्लोराइड समाधान, 5 एमएल का 100 एमएम मैग्नीशियम सल्फेट के 5 एमएल के संयोजन से पूर्ण एचबीएसएस तैयार करें। समाधान, और 2 एमएल 1 एम सोडियम हाइड्रोजन कार्बोनेट समाधान। 0.5 एल, बाँझ फ़िल्टर तक बाँझ पानी जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
  4. स्लाइस संस्कृति मध्यम
    1. बेसल मध्यम ईगल (बीएमई) के 35 एमएल, 12.9 एमएल का पूरा एचबीएसएस (सीएफ खंड 2.3.1), 1.35 एमएल 1 एम डी ग्लूकोज, 0.25 एमएल का 200 एमएम एल-ग्लूटामाइन, और 0.5 एमएल ऑफ पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन को मिलाएं। 50 मिलीलीटर का टुकड़ा संस्कृति प्राप्त करेंमध्यम। बाँझ फिल्टर और 5% की अंतिम एकाग्रता में घोड़े सीरम जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस तक 4 सप्ताह तक स्टोर करें।
  5. लो मेल्टिंग प्वाइंट (एलएमपी) एगरोज़ सोल्यूशन
    1. इंटरमीडिएट पावर पर 1 से 2 मिनट के लिए माइक्रोवेव ओवन में हीटिंग द्वारा 50 एमएल के पूर्ण एचबीएसएस में 1.5 ग्राम एलएमपी एगरोज़ को भंग करके 3% एलएमपी एगरोज़ समाधान तैयार करें।
      नोट: उबलते दौरान अतिप्रवाह को रोकने के लिए गर्मी की निगरानी करें।
    2. उपयोग के लिए तैयार होने तक 38 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में जगह का समाधान करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और एक बार पुनः प्रयोग करें।
  6. झिल्ली आवेषण की कोटिंग
    1. लेमीनिन स्टॉक समाधान (सीएफ चरण 2.1.1।) का एक विभाज्य और पॉली-एल-लाइसिन स्टॉक समाधान (सीएफ चरण 2.2.1।) का एक विभाज्य पदार्थ को कोटिंग समाधान प्राप्त करने के लिए 6 एमएल बाँझ पानी में जोड़ें (6 आवेषण के लिए पर्याप्त) ।
    2. प्लेस झिल्ली प्रत्येक अच्छी तरह से तल में 2 एमएल बाँझ पानी युक्त 6-अच्छी तरह से प्लेट में डालता है। कोटिंग समाधान के 1 एमएल जोड़ें(सीएफ चरण 2.6.1।) प्रत्येक झिल्ली के ऊपर और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड वायुमंडल पर रातोंरात सेते हैं।
      नोट: केवल ऑप्टिटेक्ली स्पष्ट झिल्ली के साथ आवेषण का प्रयोग करें, जैसे कि पॉलीटेट्राफ्लूरोइथाइलीन (पीटीएफई) झिल्ली
    3. झिल्ली को तीन बार 1 एमएल बाँझ पानी और शुष्क से धो लें। एक ही दिन पर लेपित झिल्ली का प्रयोग करें या एक साफ 6-अच्छी तरह से थाली में 4 डिग्री सेल्सियस तक चार सप्ताह तक स्टोर करें।
  7. मस्तिष्क विच्छेदन और एम्बेडिंग
    1. इलेक्ट्रोपोरेशन के दो दिन बाद वाष्पीकरणिक से जुड़ा एक पारदर्शी कक्ष में माउस लगाकर 5% आइसफ्लुरेन से संतृप्त किया जाता है। जब जानवर बेहोश हो गया है, तो उसे कक्ष से हटा दें और इसे ग्रीवा अव्यवस्था से बलिदान करें।
    2. भ्रूण युक्त गर्भाशय को निकालें और इसे बर्फ-ठंडा पूर्ण एचबीएसएस के साथ 10 सेमी पेट्री डिश में रखें।
      नोट: इस बिंदु से आगे सभी समाधान, भ्रूण और बर्फ पर दिमाग रखने के लिए।
    3. एक स्टिरिओमिकोरोस्कोप का प्रयोग करें, ठीक संदंश संरेखित करें (सीधे,11 सेमी) और वर्नास टुबििंगन स्प्रिंग कैंची की एक जोड़ी (गुदगुदा, लंबाई: 9.5 सेमी) प्रत्येक गर्भ को गर्भाशय से अलग करने के लिए और इसे बर्फ-ठंडे पूर्ण एचबीएसएस युक्त अन्य पेट्री डिश में स्थानांतरित करने के लिए।
    4. मस्तिष्क के स्टेम के स्तर पर एक चीरा करें और बाण के बीच में कटौती करें त्वचा और मस्तिष्क को कवर उपास्थि दूर छील। फिर, गोलार्धियों के पीछे मस्तिष्क के स्टेम को काट लें और खोपड़ी से मस्तिष्क निकाल दें। मस्तिष्क को एक सूक्ष्म-चमचा रंग (185 मिमी x 5 मिमी) के साथ 12-अच्छी तरह से प्लेट में रखें जिसमें बर्फ-ठंडा पूर्ण एचबीएसएस है। 12-अच्छी तरह से प्लेट में कूड़े से सभी दिमाग ले लीजिए
    5. प्रतिदीप्ति चमक के लिए 12-अच्छी तरह से प्लेट के मस्तिष्क के साथ-साथ इलेक्ट्रोप्रोटेड क्षेत्र के आकार को स्क्रीन करने के लिए फ्लोरोसेंट स्टिरिओमोरिकस्कोप का उपयोग करें। अधिक प्रसंस्करण के लिए प्रमेय somatosensory प्रांतस्था में उज्ज्वल फ्लोरोसेंट संकेतों के साथ 2 से 4 दिमाग का चयन करें।
    6. छील-दूर डिस्पोजेबल एम्बेडिंग ढालना में 38 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया 3% एलएमपी एगरोज़ समाधान डालें। removएक मस्तिष्क चम्मच रंग के साथ 12-अच्छी तरह से थाली से ई मस्तिष्क और ठीक से टिशू पेपर का उपयोग करके मस्तिष्क के चारों ओर पूर्ण एचबीएसएस को ध्यान से खींचें।
    7. मस्तिष्क को धीरे-धीरे agarose समाधान में रखें, इसे ढालना के तल पर दबाएं, और 20-गेज सुई का उपयोग करके अपनी स्थिति को सावधानी से समायोजित करें। राज्याभिषेक वर्गों के लिए, मस्तिष्क को घ्राण बल्बों के ऊपर ओर इशारा करते हुए दिशानिर्देश दें। जब तक agarose का समाधान मजबूत नहीं हो जाता है तब तक बर्फ पर मोल्ड रखें और मस्तिष्क के सेक्शन के साथ जारी रखें।
  8. कंपन ग्रंथि और स्लाइस संस्कृति
    1. ढालना से agarose ब्लॉक निकालें और इसे एक बाँझ पेट्री डिश के ढक्कन पर रखें। एक साफ रेजर ब्लेड से अधिक agarose दूर छीलना घ्राण बल्ब के नीचे लगभग 2 से 3 मिमी और दूसरी तरफ 1 मिमी agarose छोड़ दें। घ्राण बल्बों के साथ छंटनी वाले agarose ब्लॉक को ठीक करके साइनोस्रीलाट गोंद का उपयोग करके एक नमूना स्तर पर नीचे की ओर इशारा करते हैं।
      नोट: 70% इथानो के साथ उपकरणों और उपकरणों को निर्वहन करेंएल सेक्शनिंग से पहले
    2. नमूना चरण को बर्फ-ठंडे पूर्ण एचबीएसएस युक्त एक हिल ब्लेड माइक्रोोटॉम के टुकड़े टुकड़े करने के लिए स्थानांतरित करें और ब्लेड की ओर उसके पृष्ठीय पक्ष के साथ दिमाग की स्थिति बनाएं। 0.9 मिमी के कम से मध्यम आयाम और 0.09-0.12 मिमी / एस की एक बहुत धीमी गति से सेक्शनिंग गति के साथ electroporated क्षेत्र युक्त 250 सुक्ष्ममापी मोटी मस्तिष्क स्लाइस कटौती। आमतौर पर 4 से 6 चमकदार फ्लोरोसेंट संकेत वाले स्लाइस प्रत्येक सफलतापूर्वक electroporated मस्तिष्क से प्राप्त कर रहे हैं।
    3. एक मूक सूक्ष्म चम्मच रंग और ठीक संदंश संरेखित करने के साथ, मस्तिष्क के स्लाइस को आसपास के एगरोज़ के साथ 6-अच्छी तरह से प्लेट में रखें जिसमें बर्फ-ठंडा पूर्ण एचबीएसएस है।
      सावधानी: स्थानांतरण के दौरान संदंश के साथ वर्गों के चारों ओर एगरोज रिम को छूकर मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान पहुंचाने के लिए सावधान रहें।
    4. चरण 2 में वर्णित सभी चयनित दिमागों पर प्रक्रिया करें .8.1। 2.8.3 के लिए
    5. मस्तिष्क स्ल रखने से पहले एचबीएसएस के 100 μL के साथ झिल्ली में सम्मिलित किया जाता हैस्लाइस की स्थिति को सुविधाजनक बनाने के लिए झिल्ली पर ices। 5 स्लाइस तक 1 झिल्ली डालने पर रखा जा सकता है।
    6. सावधानी से झुकाव पर एक तुला सूक्ष्म चमचा spatula और ठीक इत्तला दे दी संदंश का उपयोग कर स्लाइस हस्तांतरण। धीरे से संदंश के साथ agarose रिम को छूकर और आसानी से टुकड़ा झिल्ली पर स्टेटूला से धक्का करके स्पैटुला पर एक टुकड़ा खींचें। संदंश का उपयोग करके टुकड़ा की स्थिति और शेष स्लाइस को स्थानांतरित करना जारी रखें। विंदुक के साथ अतिरिक्त पूर्ण एचबीएसएस निकालें
      नोट: एक दूसरे के साथ स्लाइस को ओवरलैप न करें।
    7. संदंश की सहायता से झिल्ली के सम्मिलन को स्लाइस के साथ 6-अच्छी तरह से प्लेट में डालकर 1.8 एमएल का टुकड़ा संस्कृति माध्यम (सीएफ चरण 2.4.1।) होता है और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड वायुमंडल में समय चूक इमेजिंग।

3. समय-अंतराल इमेजिंग

  1. माइक्रोस्कोप सेटअप
    1. एक के मंच पर रखा एक जलवायु चैम्बर सेट करेंउलटे confocal सूक्ष्मदर्शी 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड वातावरण। लेजर तीव्रता को कम करने और सेल व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए एक हाइब्रिड डिटेक्टर का उपयोग करें। विस्तृत विश्लेषण के लिए, 0.6 या अधिक के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक अतिरिक्त-लंबी काम दूरी 40X शुष्क उद्देश्य का उपयोग करें।
      नोट: इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान एक स्थिर फोकस प्रदान करने के लिए इमेजिंग से पहले माइक्रोस्कोप के सभी घटकों को 37 डिग्री सेल्सियस से पूर्व में गरम किया जाना चाहिए।
  2. स्लाइस इमेजिंग
    1. 6-अच्छी तरह से थाली से इमेजिंग के लिए एक मस्तिष्क टुकड़ा चुनें, जिसमें उल्लिखित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का प्रयोग करके झिल्ली आवेषण होता है।
      सावधानी: पराबैंगनी प्रकाश के लिए लंबे समय तक संपर्क समय से बचें क्योंकि इससे सेलुलर फोटोडैमेज हो सकता है।
      नोट: ऊपरी SVZ में उज्ज्वल एकल न्यूरॉन्स के साथ एक स्लाइस का चयन करें जो त्रिज्या के टुकड़े के पियाल सतह की ओर पलायन करते हैं। रेडियल ग्लियाल कोशिकाओं की संपूर्ण फ्लोरोसेंट प्रक्रियाएं जो पूरे सीपी को फैलती हैं, एक अक्षुण्ण रेडियल ग्लिएल स्कैफोल्ड का संकेत देती हैं, जो उपयोग होती हैघ आंशिक रूप से कॉर्टिकल न्यूरॉन्स पलायन कर रहा है
    2. टुकड़े के साथ झिल्ली डालें, जो समय-चूक इमेजिंग के लिए चुना गया था, संदंश की सहायता से 2 मिलीलीटर का टुकड़ा संस्कृति माध्यम युक्त 50 मिमी व्यास का गिलास नीचे का डिब्बा। डिस्पोजेबल माइक्रोस्कोप के जलवायु चैम्बर में डिश रखें।
    3. संकल्प को 512 पिक्सल से 512 सेट करें और स्कैन गति को 400 हर्ट्ज से बढ़ाकर 700 हर्ट्ज़ तक बढ़ाएं ताकि क्रमशः 1.4 से 2.5 फ़्रेम प्रति सेकेंड फ्रेम दर बढ़ाई जा सके। औसतन दो गुणा औसत का उपयोग करें। 1.5 माइक्रोन के चरण आकार के साथ इलेक्ट्रोप्रोटेड क्षेत्र (आमतौर पर 400-100 माइक्रोन) के माध्यम से एक z- स्टैक को परिभाषित करें सामूहिक रूप से, इन सेटिंग से छवि के पर्याप्त संकल्प और चमक की अनुमति मिलती है, जबकि अधिग्रहण के दौरान फोटोडमेज कम रहता है। प्रत्येक 30 मिनट में एक z- स्टैक लेने के द्वारा समय चूक श्रृंखला शुरू करें
      ध्यान दें: स्लाइस के लेजर लाइट को लंबे समय तक फैलाने से कोशिकाओं की व्यवहार्यता को कम करने में फोटोडैमेज पैदा हो जाएगा। ऍक्स्प समायोजित करेंतदनुसार लेजर प्रकाश के लिए समय का आशय।
    4. ImageJ सॉफ़्टवेयर (https://imagej.nih.gov/iij/) या समकक्ष का उपयोग करके समयबद्धता श्रृंखला का विश्लेषण करें।

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Representative Results

इससे पहले, हमने दिखाया है कि गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरॉज द्वारा बीसीएलएलएए के आनुवांशिक विलोपन ने देर से जन्म के ऊपरी-परत प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स 10 के रेडियल प्रवास को बिगाड़ दिया हैडीआरए डीएनए प्लाज्मिड वेक्टर की इलेक्ट्रोपोरेशन जिसमें क्र- आईआरईएस -जीएफपी सशर्त बीसीएलएलएए फ्लॉक्स / फ्लॉक्स दिमाग 11 में प्रभावी रूप से बीसीएलएलएए हटा दिया गया है। जब हमने इलेक्ट्रोपायरिंग के तीन दिन बाद ई -14.5 इलेक्ट्रोप्रोटेड दिमाग का विश्लेषण किया तो ज्यादातर नियंत्रण न्यूरॉन्स सीपी में चले गए थे, जबकि कई बीसीएलएलएए उत्परिवर्ती न्यूरॉन्स आईजेड और वीजेड / एसवीजेड में प्रवासी मार्ग पर रुक गए थे। इसके अलावा, हमें द्विपक्षीय कोशिकाओं की कीमत पर विशेष रूप से ध्रुवीकरण 10 में दोषों का सुझाव देने वाले Bcl11a विलोपन पर IZ में बहुविध कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई।

माइग्रा के प्रत्यक्ष और गतिशील रूप से विश्लेषण करने के लिएबीसीएलएलएए उत्परिवर्ती न्यूरॉन्स के टॉरी व्यवहार ने हमने इलेक्ट्रोप्रोटेड दिमाग से तैयार किए गए अंगोटीपिक स्लाइस संस्कृति में प्रवासित न्यूरॉन्स के समय-विराम कबूतर इमेजिंग का उपयोग किया। 0.4 के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 10 एक्स उद्देश्य का उपयोग करते हुए समय चूक श्रृंखला का अवलोकन हमारे परिणामों की पुष्टि करता है, कि Bcl11a उत्परिवर्ती प्रक्षेपण न्यूरॉन्स रेडियल प्रवासन में दोष है। 36 घंटे के भीतर कई नियंत्रण न्यूरॉन्स सीपी में चले गए थे, जबकि केवल कुछ Bcl11a उत्परिवर्ती न्यूरॉन्स ने IZ छोड़ दिया था और सीपी में चले गए थे। दिलचस्प बात यह है कि ऐसा लगता है कि कई बीसीएलएलएए उत्परिवृत्त न्यूरॉन्स सीधे मस्तिष्क की पियाल सतह की ओर पलायन नहीं करते थे, लेकिन माइग्रेशन को धीमा कर दिया और वेंट्रिकल (मूवी 1) की तरफ गहराई से या फिर वापस कर दिया। इन निष्कर्षों का विश्लेषण करने के लिए हमने 0.6 के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 40x उद्देश्य का उपयोग करते हुए उच्च आवर्धन पर समय-समाप्त श्रृंखला तैयार की। हमारे डेटा से पता चलता है कि Bcl11a उत्परिवर्ती न्यूरॉन्स कुशलता से ध्रुवीकरण करने और अंधाधुंध उन्मुख माइग्रेट जारी रखने में विफल रहेसीओसी में आयन 12 घंटे के भीतर, कई बीसीएलएलएए उत्परिवर्ती न्यूरॉन्स बहुवृत्त से एक द्विध्रुवी आकारिकी पर स्विच करने में विफल रहे और इसके बजाय आसपास के वातावरण (मूवी 2, चित्रा 1 ए ) में कई प्रक्रियाओं का अनुमान लगाया और वापस ले लिया।

इसके अलावा, हमने विभिन्न समय-समाप्त श्रृंखला में अलग-अलग न्यूरॉन्स के माइग्रेशन पथ का पता लगाया और माइग्रेट करने वाले न्यूरॉन्स के विशिष्ट पैरामीटर की गणना करने के लिए इसका इस्तेमाल किया। हमने पाया कि बीसीएलएलएए उत्परिवर्ती न्यूरॉन्स दोहराए जाने के कई घंटे की अवधि के चरणों में कम प्रवास की गति और यादृच्छिक जैसे अभिविन्यास परिवर्तन (मूवी 3; चित्रा 1 बी , लाल तीर) विशेष रूप से, बीसीएलएलएए उत्परिवर्ती न्यूरॉन्स की स्पीड प्रोफाइल न्यूरॉन्स ( चित्रा -1 सी ) को नियंत्रित करने के मुकाबले कम गति (5 माइक्रोग्राम / एच) की तरफ उच्च गति (25 माइक्रोग्राम / एच) से स्थानांतरित की गई थी। इस के साथ, Bcl11 की समग्र माइग्रेशन गतिएक उत्परिवर्ती न्यूरॉन्स 10.34 ± 0.34 माइक्रोन / एच के नियंत्रण में 6 ± 0.54 माइक्रोग्राम / एच (पी = 2.4889 ई-05) ( चित्रा 1 डी ) से काफी कम हो गए थे। अंत में, मस्तिष्क की पियाल सतह की ओर निर्देशित माइग्रेशन से विचलन को 17.15 ± 2.13 डिग्री से बढ़ाकर बीसीएलएलए 1 म्यूटेंट न्यूरॉन्स (पी = 0.0002) ( चित्रा 1 ई ) में 40.16 ± 4.42 डिग्री तक बढ़ गया । इन परिणामों के साथ यह दर्शाता है कि जीनोमॉयल प्रवासन की प्रक्रिया को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्रों का अध्ययन करने के लिए जीनोमॉपीक स्लाइस कल्चर में जीएफपी इलेक्ट्रोफोरेटेड न्यूरॉन्स का समय-विलंब संबंधी इमेजिंग एक बहुमूल्य तरीका है।

मूवी 1
मूवी 1: कॉर्टिकल स्लाइस में बीसीएलएलएए उत्परिवर्ती न्यूरॉन्स की तुलना में जीएफपी लेबलिंग नियंत्रण का प्रवास। Bcl11a flox / flox दिमाग में electroporated थेE14.5, ईआरईएस-जीएफपी (ए) या क्रे-आईआरईएस-जीएफपी (बी) युक्त एक प्लाज्मिड वेक्टर और स्लाइस संस्कृतियों को ई 16.5 में तैयार किया गया था। VZ / SVZ; निलय / उपकेंद्र क्षेत्रों आईजेड, मध्यवर्ती क्षेत्र; सीपी, कॉर्टिकल प्लेट स्केल बार = 100 माइक्रोन फिल्म में 5 फ़्रेम / एस की दर से 108 फ़्रेम शामिल हैं। Wiegreffe एट अल से पुनर्प्रकाशित एल्सवीयर की अनुमति के साथ 10 कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

मूवी 2
मूवी 2: कॉर्टिकल स्लाइसें में बीसीएलएलएए उत्परिवर्ती न्यूरॉन्स की तुलना में जीएफपी लेबलिंग नियंत्रण के ध्रुवीकरण। बीसीएल 11फ्लॉक्स / फ्लॉक्स दिमाग ईईआरएस -जीएफपी (ए) या क्रे-आईआरईएस-जीएफपी (बी) युक्त एक प्लाज्मिड वेक्टर और स्लाइस संस्कृतियों के साथ E14.5 पर electroporated थे ई 16.5 में तैयार किए गए थे। स्केल बार = 10 माइक्रोन फिल्म में 5 फ़्रेम / एस की दर से 25 फ़्रेम शामिल हैं Wiegreffe एट अल से पुनर्प्रकाशित एल्सवीयर की अनुमति के साथ 10 कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

मूवी 3
मूवी 3: एनिमेटेड ट्रेसेज़ के साथ 1 एच एंटीवल रेज़ोल्यूशन ऑफ़ रिप्रेझेंटेटिव कंट्रोल और बीसीएलएलएए उत्परिवर्ती न्यूरॉन्स। माइक्रोसॉफ्ट न्यूरॉन्स के निशान बीसीएल 11फ्लक्स / फ्लॉक्स दिमाग के 16.5 स्लाइस संस्कृतियों की टाइम-लुप्त श्रृंखला से प्राप्त हुए थे जो इरोएस -जीएफपी ( ) या क्र-आईआरईएस-जीएफपी ( बी ) वाले प्लाज्मिड वेक्टर के साथ 14.5 पर electroporated थे। । स्केल बार = 20 माइक्रोन Wiegreffe एट अल से पुनर्प्रकाशित> एल्सवीयर की अनुमति के साथ 10 कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

आकृति 1
चित्रा 1: बीसीएलएलएए उत्परिवर्ती ऊपरी-परत कर्टिकल न्यूरॉन्स का माइग्रेशन व्यवहार।
( ) E6.5 फ्लक्स / फ्लॉक्स मस्तिष्क के E16.5 स्लाइस संस्कृतियों में माइग्रेटिंग जीएफपी पॉजिटिव न्यूरॉन्स की प्रतिनिधि छविएं जो ई -14.5 में पीईआरईआरएस -जीएफपी या 12 घंटे की कुल इमेजिंग अवधि पर एक नियंत्रण वेक्टर के साथ electroporated। ( बी ) प्रतिनिधि ईसी 15.5 स्लाइस संस्कृतियों में जीईपीआर पॉजिटिव न्यूरॉन्स को माइग्रेट करने के 1 घंटे अंतराल रिज़ोल्यूशन के साथ ईसीएचआरएए फ्लोक्स / फ्लॉक्स मस्तिष्क से -14.5 पर क्र-आईआरईएस -जीएफपी या कुल इमेजिंग अवधि के दौरान एक नियंत्रण वेक्टर के साथ electroporated।22 घंटे तक बीसीएलएलएए उत्परिवर्ती न्यूरॉन्स अक्सर कम माइग्रेशन गति के पुनरावर्तक चरणों से गुजरते हैं और यादृच्छिक रूप से बदलते अभिविन्यास (लाल तीर द्वारा चिह्नित)। ( सी ) स्पीड प्रोफाइल बी.एल.एल.ए.ए. फ्लॉक्स / फ्लॉक्स से 16.5 स्लाइस संस्कृतियों में माइग्रेटिंग न्यूरॉन्स के निशान से गणना की गई है, जैसा बी ( डी ) में दिखाया गया है, गति ( डी ) और विचलन कोण को रेडियल ओरिएंटेशन ( ) से जीएफपी पॉजिटिव न्यूरॉन्स की ओर पलायन करना। ईआईआरएस-जीएफपी या एक नियंत्रण वेक्टर (एन = 15) के साथ E14.5 पर मस्तिष्क का electroporated। माध्य ± सेमी; विद्यार्थी का परीक्षण; *** पी <0.001 स्केल बार = 10 माइक्रोन Wiegreffe एट अल से पुनर्प्रकाशित एल्सवीयर की अनुमति के साथ 10 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

रेडियल माइग्रेशन नेकोटेक्स्ट विकास में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। इस प्रक्रिया के विभिन्न चरणों को प्रभावित करने वाले जीन में उत्परिवर्तन, लिसेंसफैली और सफ़ेद पदार्थों के उत्थान 1 , 2 सहित गंभीर कॉर्टिकल विरूपताओं का कारण हो सकता है। हमने हाल ही में दिखाया है कि बीसीएलएलएए, जो युवा प्रवासित कॉर्टिकल प्रक्षेपण न्यूरॉन्स में व्यक्त है, रेडियल प्रवासन में भूमिका निभाता है। हमने न्यूरॉन्स में बीसीएलएलएए के आनुवांशिक विलोपन में सीधे प्रदर्शित करने के लिए, ध्रुवीकरण और माइग्रेशन दोषों का कारण बनने के लिए, इलेक्ट्रोप्रोटेड दिमागों के तीव्र कॉर्टिकल स्लाइस में माइग्रेटिंग न्यूरॉन्स के समय-विराम कबूतर इमेजिंग का उपयोग किया। समय चूक श्रृंखला अलग-अलग न्यूरॉन्स के प्रवासन पथों का पता लगाने के लिए और स्प्रैड प्रोफाइल, औसत माइग्रेशन गति, और प्रवासी दिशा 10 सहित माइग्रेट किए गए न्यूरॉन्स के विशिष्ट पैरामीटरों की गणना करने के लिए उपयोग किया गया था।

यह प्रोटोकॉल अणु का अध्ययन करते समय एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण का वर्णन करता हैरेडियल प्रवासन में आर तंत्र छोटे हेयरपीन आरएनए या डीएनए एक्सप्रेशन प्लास्मिड का उपयोग करके, ब्याज के लगभग किसी भी जीन को क्रमशः नीचे या ओवीसीपीड किया जा सकता है यह क्र-लॉक्स सिस्टम के साथ इलेक्ट्रोपायर को गठबंधन करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है। सशर्त उत्परिवर्ती ("फॉक्सेड") चूहों के क्रिम रीकॉम्बाइज के मस्तिष्क की अभिकर्मक एक मोज़ेक उत्परिवर्ती स्थिति उत्पन्न करता है और जंगली प्रकार की कोशिकाओं से घिरे एकल उत्परिवर्ती न्यूरॉन्स के चयनात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है। इस प्रकार, माइग्रेट न्यूरॉन्स में सेल स्वायत्त आणविक तंत्र की जांच की जा सकती है। इसके अलावा, कार्यात्मक बचाव प्रयोग आसानी से किया जाता है। इलेक्ट्रोप्रोटेड मस्तिष्क स्लाइस की समय-समाप्त श्रृंखला तैयार करना, एकल माइग्रेटिंग न्यूरॉन्स के प्रवासी व्यवहार का गतिशील रूप से विश्लेषण करती है, जो निश्चित मस्तिष्क वर्गों से प्राप्त की जा सकती है। Utero electroporation 3 में , 4 प्रारंभिक प्रशिक्षण की आवश्यकता है - लेकिन एक बार महारत हासिल है - यह एक हैविवो में प्रमस्तिष्क प्रांतस्था के पुनर्जन्मित न्यूरॉन्स के प्रत्यारोपण के लिए तेजी से और सीधी तकनीक। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में हमने E14.5 पर utero electroporation में उपयोग किया था , जब देर से जन्म हुआ ऊपरी परत neocortical प्रक्षेपण न्यूरॉन्स पैदा होते हैं। Utero electroporation में शुरुआती जन्म वाले गहरे परत प्रक्षेपण न्यूरॉन्स के अध्ययन के लिए पहले के विकास के चरण ( यानी E12.5) 13 पर किया जाना चाहिए। सिद्धांत रूप में, प्रोटोकॉल का उपयोग मस्तिष्क में अन्य न्यूरॉनल उप-जनसंपर्कों के प्रवासन के अध्ययन के लिए भी किया जा सकता है, जो कि इलेक्ट्रोपायर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है, जिसमें इंटर्न्यूरॉन 14 और सेरेबेलर ग्रेन्युल कोशिकाओं 15 का प्रवास शामिल है

टुकड़ा संस्कृति प्रोटोकॉल है कि हम का वर्णन Polleux और हे भगवान 12 से अनुकूलित किया गया था और पहले से, हम पूर्व गर्भ इलेक्ट्रोपोरेशन 16 के लिए यह प्रयोग किया जाता है, 17 का अध्ययन करने के लिएडी हिप्पोकैम्पल विकास सबसे महत्वपूर्ण बात, मस्तिष्क के स्लाइस को अपने व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए सभी प्रक्रियाओं में देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। हम एक सेल संस्कृति डालने पर स्लाइस कल्चर को इमेज में उल्टे माइक्रोस्कोप और ऑप्टिकल क्वालिटी कांच के नीचे व्यंजन का उपयोग करते हैं। इस विन्यास को स्थापित करना बहुत आसान है और बाँझ परिस्थितियों की अनुमति है, चूंकि यह उद्देश्य कभी टुकड़ा संस्कृति या माध्यम से संपर्क में नहीं आता है। हालांकि, एक पर्याप्त उच्च संख्यात्मक एपर्चर (0.6 या अधिक) के साथ लंबी दूरी की दूरी के उद्देश्य (> 2 मिमी) आवश्यक हैं। अन्य अध्ययनों ने ग्लास के नीचे सीधे मस्तिष्क का टुकड़ा डाल दिया है और जगह में टुकड़ा तय करने के लिए एक कोलेजन मैट्रिक्स 18 , 1 9 का उपयोग किया है, जो कि संभव के रूप में कम मुक्त काम दूरी के साथ उद्देश्यों के उपयोग का उपयोग करता है। हालांकि, सेल संस्कृति आवेषण का उपयोग आसानी से निपटने, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करता है, और बिना किसी बिना उनकी तैयारी के बाद भी 1 से 2 दिनों के लिए स्लाइडर छवि को संशोधक की अनुमति देता हैमस्तिष्क टुकड़ा (डेटा नहीं दिखाया गया है) की व्यवहार्यता को भुनाने के लिए एक और महत्वपूर्ण मुद्दा लेजर प्रकाश द्वारा स्लाइस को नुकसान पहुंचाता है। हमने एक अत्यधिक संवेदनशील हाइब्रिड डिटेक्टर का उपयोग किया है, जिसने हमें लेजर पावर को कम से कम करने की अनुमति दी है, जबकि अभी भी समय-चूक इमेजिंग के लिए पर्याप्त फ्लोरोसेंट सिग्नल प्राप्त करना है। मल्टीप्लटन इमेजिंग का उपयोग करने से फोटोडैमगे कम हो जाएगा और पारंपरिक टॉइज्यू प्रवेश के साथ-साथ परंपरागत confocal microscopy की तुलना में अधिक कुशल प्रकाश का पता लगाने के लिए अनुमति होगी।

न्यूरॉनल प्रवासन का अध्ययन करने के लिए इसकी उपयोगिता के बावजूद, प्रोटोकॉल की सीमाएं हैं और बरकरार मस्तिष्क में माइग्रेट करने वाले न्यूरॉन्स की स्थिति पूरी तरह से संरक्षित नहीं की जा सकतीं। उत्परिवर्तनीय मैट्रिक्स, चिपकने वाला कंट्रोलुलर संपर्क, और प्रवासी क्षेत्र के भीतर vasculature गतिशील रूप से आंशिक रूप से माइग्रेट न्यूरॉन्स 20 , 21 को प्रभावित कर सकता है। विशेष रूप से, ऊपरी परत न्यूरॉन्स लम्बी रेडियल ग्लियाल प्रक्रियाओं पर निर्भर करता हैउनके स्थानांतरण 22 सफल इमेजिंग के लिए, इसलिए जीएफपी electroporated रेडियल glial कोशिकाओं है कि पूरे cortical चौड़ाई के माध्यम से अपनी प्रक्रियाओं का विस्तार के साथ मस्तिष्क स्लाइस का चयन करना महत्वपूर्ण है। 'आच्छादन स्लाइस', जिसमें मस्तिष्क की पियाल सतह तक पहुंचने से पहले रेडियल ग्लील पाड़ काट दिया गया है, इसे आगे के विश्लेषण से हटा दिया जाना चाहिए। कभी-कभी, मस्तिष्क टुकड़े की हवा की सतह पर कोशिका मृत्यु हो सकती है, जो नमूना के भीतर गहरे क्षेत्र में छवि अधिग्रहण को प्रतिबंधित करती है। सुसंस्कृत मस्तिष्क स्लाइस में इलेक्ट्रोफोरेटेड न्यूरॉन्स विवो में इलेक्ट्रोफोरेटेड न्यूरॉन्स की तुलना में कम कुशलता से विस्थापित हो सकते हैं, जो तैयारी से अपर्याप्त पुनर्प्राप्ति के कारण हो सकता है। इसके लिए प्रयोगात्मक और नियंत्रण स्थितियों दोनों के लिए एकाधिक टुकड़ा संस्कृतियों का विश्लेषण और प्रतिनिधि डेटा सेट की महत्वपूर्ण व्याख्या की आवश्यकता है। कुछ मामलों में utero electroporation के साथ जुड़े अपमान भ्रूण मृत्यु या संरचनात्मक बदल सकता हैमस्तिष्क के आयनों, बढ़े हुए वेंट्रिकल, असम्मेट्रिक रूप से पाले हुए कंटैक्स या डीएनए इंजेक्शन के परिणामस्वरूप एक ग्लेलिक निशान संरचना शामिल है। उन मामलों में, नमूना को और विश्लेषण से हटा दिया जाना चाहिए।

जबकि भ्रूण दाताओं से मस्तिष्क स्लाइसें झिल्ली आवेषण पर अच्छी तरह से जीवित रहते हैं 23 , विश्लेषण न्यूरॉनल प्रवासन सहित शुरुआती विकास संबंधी घटनाओं तक ही सीमित हैं, और हमने इसे बाद में घटनाओं, जैसे डेंड्राइट विकास या सिनाइप्टोजेनेसिस के अध्ययन के लिए उपयोग नहीं किया है। संक्षेप में, हम स्लाइस संस्कृतियों में electroporated न्यूरॉन्स के न्यूरॉनल प्रवासन को प्रत्यक्ष और गतिशील रूप से अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जिसे आसानी से न्यूरोडेवमेंटिकल विकारों में शामिल जीनों के कार्यों का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgements

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए जैकलिन एंड्रेट्सके, ऐलेना वेरले, सच्चि टेकानेका, और माथियास टोबेरर के साथ-साथ उपयोगी चर्चाओं के लिए विक्टर टैराबीकिन का धन्यवाद करते हैं। इस काम को एसयू (बीआर -2215) के लिए ड्यूश फोर्सचुंगस्केमाइंस्काफ्ट के अनुदान के द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
isoflurane Abbott Laboratories  506949 Forene
6-well plate Corning 351146
12-well plate Corning 351143
non-absorbable surgical suture Ethicon K890H 3/8 circle, 13 mm, taper point
Micro Adson Forceps Fine Science Tools 11018-12 serrated, length: 12 cm
fine scissors Fine Science Tools 14063-09 angled to side, length: 9 cm
Mathieu Needle Holder Fine Science Tools 12510-14 tungsten carbide, length: 14 cm
fine tipped forceps Fine Science Tools 11370-40 straight, 11 cm
Vannas Tübingen Spring Scissors Fine Science Tools 15005-08 angled up, 9.5 cm
ring forceps Fine Science Tools 11103-09 OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm
HBSS (10X) Gibco 14180046
L-Glutamine Gibco 25030081
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
horse serum Gibco 26050088
BME Gibco 41010026
borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus 30-0016 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm
anesthsesia system Harvard Apparaus 72-6471
anesthetizing chamber Harvard Apparaus 34-0460
fluosorber filter canister Harvard Apparaus 34-0415
low melting point agarose Invitrogen 16520100
vibrating blade microtome Leica VT1200 S
fluorescence stereo microscope Leica M205 FA
stereo microscope Leica M125
inverted fluorescence tissue culture microscope Leica DM IL LED
confocal laser scanning microscope Leica TCS SP5II
hybrid detector Leica HyD
objective, 40x/0.60 NA Leica 11506201
microscope temperature control system Life Imaging Services Cube, Brick & Box
cell culture insert Millipore PICM0RG50
microgrinder Narishige EG-45 use 38° angle for beveling
microinjector Parker Hannifin  052-0500-900 Picospritzer III
carprofen Pfizer Animal Health NDC 61106-8507 Rimadyl
emdedding mold Polysciences 18986-1
endotoxin-free plasmid maxi kit Qiagen 12362
fast green Sigma F7252
laminin Sigma L2020
poly-L-lysine Sigma P5899
HEPES Sigma H4034
D-glucose Sigma G6152
calcium chloride Sigma C7902
magensium sulfate Sigma M2643
sodium bicarbonate Sigma S6297
square wave electroporator Sonidel CUY21EDIT
tweezers with 5 mm platinum disk electrodes Sonidel CUY650P5
micropipette puller Sutter Instrument P-97
box filament Sutter Instrument FB255B 2.5 mm x 2.5 mm
micro-spoon spatula VWR 231-0191 185 mm x 5 mm
glass bottom dish, 50 mm World Precision Instruments FD5040-100

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References

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