Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando

Neuroscience

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Summary

Este protocolo fornece instruções para a observação direta de neurônios corticais que migram radialmente. A eletroporação in utero , a cultura de fatia organotípica e a imagem confocal de lapso de tempo são combinadas para estudar de forma direta e dinâmica os efeitos da sobre-expressão ou downregulation de genes de interesse em neurônios migratórios e analisar sua diferenciação durante o desenvolvimento.

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Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (125), e55886, doi:10.3791/55886 (2017).

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Abstract

A eletroporação in utero é uma abordagem rápida e poderosa para estudar o processo de migração radial no córtex cerebral do desenvolvimento de embriões de ratos. Ele ajudou a descrever os diferentes passos da migração radial e caracterizar os mecanismos moleculares que controlam esse processo. Para analisar de forma direta e dinâmica os neurônios migratórios, eles devem ser rastreados ao longo do tempo. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho que combina in utero eletroporação com cultura de fatias organotípicas e imagens confocais temporizadas, o que permite um exame direto e análise dinâmica de neurônios corticais de migração radial. Além disso, é possível caracterizar detalhadamente neurônios migratórios, como velocidade de migração, perfis de velocidade, bem como mudanças de orientação radial. O método pode ser facilmente adaptado para realizar análises funcionais de genes de interesse em neurônios corticais de migração radial por perda e ganho de função, bem como experiências de resgate. Espaço de tempoA imagem dos neurônios migratórios é uma técnica de última geração que, uma vez estabelecida, é uma ferramenta potente para estudar o desenvolvimento do córtex cerebral em modelos de ratos de transtornos de migração neuronal.

Introduction

O neocórtex é o principal site de funções cognitivas, emocionais e sensório-motoras. É composto de seis camadas horizontais orientadas em paralelo à superfície do cérebro. Durante o desenvolvimento, as células progenitoras na parede lateral do telencefalo dorsal dão origem a neurônios de projeção que migram radialmente para a superfície do pial e adquirem uma identidade neuronal específica do tipo de camada. Depois de serem geradas nas zonas ventriculares / subventriculares (VZ / SVZ), esses neurônios se tornam transitoriamente multipolar e diminuem sua migração. Após uma curta permanência na zona intermediária (IZ), eles mudam para uma morfologia bipolar, se prende ao andaime radial e continuam a migração orientada radialmente para a placa cortical (CP). Ao atingir o objetivo final, os neurônios de projeção se separam dos processos de glial radiais e adquirem identidade específica da camada. Mutações em genes que afetam diferentes etapas da migração neuronal podem causar malformação cortical grave, como lissencHematopia de IFF ou de matéria branca 1 , 2 .

A eletroporação in utero é uma técnica rápida e poderosa para transfectar células progenitoras neurais no cérebro em desenvolvimento de embriões de roedores 3 , 4 . Com esta técnica, é possível derrubar e / ou sobre-expressar genes de interesse para estudar suas funções no desenvolvimento de neurônios. Este método ajudou especificamente a descrever os detalhes morfológicos e a caracterizar os mecanismos moleculares do processo de migração radial 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Os neurônios de migração radial sofrem alterações dinâmicas na forma celular, velocidade de migração, bem como direção migratória, que requerem observação direta e contínua ao longo do tempo. Cultivo de fatias organotípicasA imagem confocal re e time-lapse de cérebros eletroporados permite observar diretamente os neurônios migratórios ao longo do tempo. Usando essa abordagem combinada, é possível analisar características distintas de neurônios migratórios que não podem ser investigados em seções de tecido fixo de cérebros eletroporados.

Recentemente, aplicamos imagens confocais de lapso de tempo de neurônios migratórios em culturas de fatia de cérebros eletroporados para estudar o papel do fator de transcrição CLL / linfoma 11a (Bcl11a) durante o desenvolvimento cortical 10 . Bcl11a é expressa em jovens neurônios corticais migratórios e utilizamos um alelo Bcl11a condicional condicional ( Bcl11a flox ) 11 para estudar suas funções. A eletroporação da recombinase Cre juntamente com a proteína fluorescente verde (GFP) em progenitores corticais dos cérebros BCL11a flox / flox nos permitiu criar uma situação de mutante de mosaico, na qual apenas algumas células são mutadas em umaDe outra forma, tipo selvagem. Desta forma, foi possível estudar as funções autônomas celulares de Bcl11a no nível de célula única. Descobrimos que os neurônios mutantes Bcl11a exibem velocidade reduzida, mudanças em seus perfis de velocidade, bem como mudanças de orientação aleatórias durante a migração 10 . No protocolo delineado, descrevemos um fluxo de trabalho para a eletroporação bem sucedida e preparação de cultura de fatia 12 de cérebros de mouse, bem como imagens confocais de lapso de tempo de culturas de fatia cortical.

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Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comité de Assistência Ambiental Animal (Regierungspräsidium Tübingen) e executados de acordo com a Lei alemã de bem-estar animal e a Diretiva da UE 2010/63 / UE.

1. Em Utero Electroporation

  1. Agulhas de microinjecção
    1. Puxe os capilares de vidro de borosilicato (diâmetro externo: 1,0 mm, diâmetro interno: 0,58 mm, comprimento: 100 mm) em agulhas de microinjeção usando um extrator de micropipetas com um filamento de caixa (2,5 mm x 2,5 mm) e o seguinte programa: HEAT: 540, PULL : 125, VELOCIDADE: 20 e DELAY: 140. Determine o valor HEAT para cada filamento individual realizando uma prova RAMP (valor HEAT: RAMP + 25).
    2. Agulhas de bisel num ângulo de 38 ° e velocidade de rotação intermediária a alta com um microgrinder para obter um tamanho de ponta de 20 a 30 μm para injetar no dia embrionário (E) 13,5 ou mais jovens e 30 a 40 μm para injetar em embriões mais velhosestágios. Para o armazenamento, coloque as agulhas em uma caixa ou placa Petri com argila de modelagem para evitar danos nas dicas.
  2. Solução de DNA de plasmídeo
    1. Prepare a construção de DNA de plasmídeo contendo proteína repórter fluorescente ( por exemplo, GFP) usando um kit de preparação maxi sem endotoxina de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Diluir a solução de DNA de plasmídeo até uma concentração final de 1 - 2 μg / μL em tampão Tris-EDTA isento de endotoxina contendo Fast Green a uma concentração final de 0,01%. Solução alíquota e armazenar a -20 ° C.
  3. Solução Bacteriostática de Cloreto de Sódio
    1. Prepare a solução de cloreto de sódio bacteriostático adicionando álcool benzílico até uma concentração final de 0,9% na solução de cloreto de sódio isotônico a 0,9%. Solução de filtro estéril imediatamente antes da utilização.
  4. Solução de Injeção de Carprofen
    1. Prepare a solução de injeção de carprofen porAdicionando carprofeno a uma concentração final de 0,5 mg / mL a solução de cloreto de sódio isotônico esterilizado a 0,9%. Armazenar a 4 ° C por até 28 dias.
  5. Anestesia, injeção de DNA e eletroporação
    1. Pesar um mouse E14.5 cronometrado por gravidez e colocá-lo em uma câmara de anestesia transparente conectada a um vaporizador e saturada com 5% de isoflurano. Quando o animal estiver inconsciente, transfira-o para uma máscara de anestesia anexada a uma placa de aquecimento de 37 ° C e mantenha-se anestesiado com 1.8 a 2.2% de isoflurano.
      Nota: Avalie o desenvolvimento da anestesia cirúrgica por perda de pinça e reflexos do pedal (pressão do dedo do pé).
    2. Para analgesia, injete 100 μL de solução de injeção de carprofen por 10 mg de peso corporal do mouse (5 mg / kg de peso corporal) por via subcutânea. Vire o mouse com as costas voltadas e cubra cuidadosamente os olhos com vaselina para evitar que se sectem.
    3. Espalhe delicadamente os membros e repare-osPara a placa de aquecimento com fita cirúrgica. Esterilizar o abdômen com etanol a 70% seguido de solução de iodo (7,5 mg / mL) utilizando cotonete de celulose. Repita este procedimento três vezes para garantir uma desinfecção adequada.
    4. Cubra o abdômen com gaze estéril em que uma incisão foi cortada para poupar um campo (diâmetro: 2 - 2,5 cm) para a incisão abdominal. Molhe a gaze com solução bacteriostática de cloreto de sódio.
      Cuidado: Reavaliar o desenvolvimento da anestesia cirúrgica pela perda do reflexo do pedal.
    5. Usando Microps de Micro Adson (serrilhado, comprimento: 12 cm) e tesoura fina (angulado ao lado, comprimento: 9 cm) corte a pele aproximadamente 1,5 cm ao longo da linha média do abdômen. Corte o músculo subjacente ao longo da linea alba.
    6. Remova um cuerno uterino com fórceps de anel (comprimento: 9 cm, diâmetro externo: 3 mm, diâmetro interno: 2,2 mm) e coloque-o suavemente sobre a gaze úmida.
      Cuidado: segure o cuerno uterino com fórceps de anel apenas entre embriões eD não perturbe as placentas ou quaisquer vasos de abastecimento. Mantenha o útero úmido o tempo todo com solução bacteriostática de cloreto de sódio.
    7. Coloque cuidadosamente um embrião com fórceps de anel e localize o ventrículo lateral, que se apresenta como uma sombra em forma de crescente paralela ao seio sagital. O local da injeção situa-se aproximadamente no meio de uma linha entre o olho pigmentado e a confluência dos seios, onde o seio sagital se ramifica para dois seios transversais. Empurre a agulha de microinjeção através da parede uterina e no ventrículo lateral.
      Nota: Se necessário, a profundidade da injeção pode ser corrigida pela retração da agulha.
    8. Injetar 1 a 2 μL de solução de DNA no ventrículo lateral com um microinjetor, que é operado com um pedal, usando as seguintes configurações: 25 psi, 10 a 20 ms por pulso e 5 a 10 pulsos. A injeção bem sucedida pode ser monitorada pela solução de DNA colorida, que deve preencher o sistema ventricular.
    9. Coloque os eletrodos de tipo pinça (diâmetro de 3 mm para E13.5 ou mais novo e 5 mm de diâmetro para E14.5 ou mais) de tal forma que o terminal "positivo" esteja do mesmo lado que o ventrículo injetado e o "negativo" O terminal está no lado oposto do ventrículo injetado abaixo da orelha da cabeça do embrião.
    10. Humedecer o local de eletroporação com algumas gotas de solução bacteriostática de cloreto de sódio e aplicar 5 pulsos de corrente elétrica (35 V para E13,5 ou mais jovens e 40 V para E14,5 ou mais) com uma duração de 50 ms com intervalos de 950 ms.
      Nota: Correntes de 60 a 90 mA são geralmente suficientes para uma eletroporação bem-sucedida. As correntes mais baixas não vão efetivamente transfectar neurônios, enquanto correntes mais altas podem levar à morte embrionária.
    11. Repita o procedimento (ver Etapa 1.5.7 a 1.5.10.) Para cada embrião do cuerno uterino e coloque-o suavemente na cavidade abdominal.
    12. Remova o chifre uterino do outro lado e repita o procEdure descrito no Passo 1.5.7. Para 1,5.11.
    13. Feche a cavidade abdominal suturando a camada muscular antes de suturar a pele usando o MicroAdson Forceps, o suporte da agulha Mathieu (carboneto de tungstênio, comprimento: 14 cm) e a sutura cirúrgica não absorvível (3/8 círculo, 13 mm, ponto afilado).
      Cuidado: tenha cuidado para não capturar o útero ou quaisquer outros órgãos durante a sutura.
    14. Desinfecte cuidadosamente a sutura da pele com solução de iodo (7,5 mg / mL) e remova suavemente o excesso periocular de vaselina usando cotonetes de celulose. Coloque o mouse sob uma lâmpada infravermelha até que ele acorde. Monitore o mouse com atenção de perto durante os próximos dois dias. Repita o tratamento com analgesia conforme descrito na Etapa 1.5.2 após 12 a 24 h.

2. Cultura Organotypic Slice

  1. Laminin Stock Solution
    1. Dissolver 1 mg de laminina liofilizada em água estéril para obter uma solução de reserva de laminina de 1 mg / mL. Prepare alíquotas de 50 μL aE armazenar a -80 ° C.
  2. Solução de estoque de poli-L-lisina
    1. Dissolver 50 mg de poli-L-lisina em água estéril para obter uma solução de reserva de poli-L-lisina de 1 mg / mL. Prepare alíquotas de 0,5 mL e armazene a -20 ° C.
  3. Complete a solução de sal equilibrada de Hank (Complete HBSS)
    1. Prepare o HBSS completo combinando 50 mL de solução de HBSS 10x, 1,25 mL de tampão HEPES 1 M (pH 7,4), 15 mL de solução de D-glicose 1 M, 5 mL de solução de cloreto de cálcio 100 mM, 5 mL de sulfato de magnésio 100 mM Solução e 2 mL de solução de hidrogenocarbonato de sódio 1 M. Adicione água estéril até 0,5 L, filtro estéril e armazene a 4 ° C.
  4. Slice Culture Medium
    1. Combine 35 mL de Águia Média Basal (BME), 12,9 mL de HBSS completo (ver secção 2.3.1.), 1,35 mL de D-glucose em 1 M, 0,25 mL de L-glutamina 200 mM e 0,5 mL de penicilina-estreptomicina para Obter 50 mL de cultura de fatiamédio. Filtro estéril e adicione soro de cavalo a uma concentração final de 5%. Armazenar a 4 ° C por até 4 semanas.
  5. Solução de Agarose de baixo ponto de fusão (LMP)
    1. Prepare 3% de solução de agarose de LMP dissolvendo 1,5 g de agarose de LMP em 50 mL de HBSS completo por aquecimento em um forno de microondas durante 1 a 2 minutos com potência intermediária.
      Nota: Monitorar o calor cuidadosamente para evitar o excesso durante a ebulição.
    2. Coloque a solução em banho-maria a 38 ° C até estar pronta para uso. Armazenar a 4 ° C e reutilizar uma vez.
  6. Revestimento de inserções de membrana
    1. Adicione uma alíquota da solução-mãe de laminina (ver Etapa 2.1.1.) E uma alíquota de solução de reserva de poli-L-lisina (ver Etapa 2.2.1.) A 6 mL de água estéril para obter solução de revestimento (suficiente para 6 inserções) .
    2. Coloque as inserções de membrana em uma placa de 6 poços contendo 2 mL de água estéril no fundo de cada poço. Adicione 1 mL de solução de revestimento(Ver Passo 2.6.1.) Em cima de cada membrana e incubar durante a noite a 37 ° C e 5% de atmosfera de dióxido de carbono.
      Nota: use apenas inserções com membranas opticamente limpas, como a membrana de politetrafluoroetileno (PTFE).
    3. Lave as membranas três vezes com 1 mL de água estéril e seque. Use membranas revestidas no mesmo dia ou guarde em uma placa limpa de 6 poços a 4 ° C por até quatro semanas.
  7. Dissecção e Incorporação de Cérebro
    1. Dois dias após a eletroporação, coloque o mouse em uma câmara transparente conectada a um vaporizador e saturada com 5% de isoflurano. Quando o animal está inconsciente, remova-o da câmara e sacrifique-o pela luxação cervical.
    2. Remova o útero que contém os embriões e coloque-o em uma placa de Petri de 10 cm com HBSS completo gelado.
      Nota: A partir deste momento, mantenha todas as soluções, embriões e cérebros no gelo.
    3. Use um estereomicroscópio, pinça com ponta fina (reta,11 cm) e um par de tesouras de mola Vannas Tübingen (angulado, comprimento: 9,5 cm) para separar cada embrião do útero e transferi-lo para outro prato de Petri contendo HBSS completo gelado.
    4. Faça uma incisão ao nível do tronco cerebral e corte ao longo da linha medial sagital. Retire a pele e a cartilagem cobrindo o cérebro. Então, corte o tronco cerebral logo atrás dos hemisférios e remova o cérebro do crânio. Transfira o cérebro com uma espátula de microcuadrinha (185 mm x 5 mm) para uma placa de 12 poços contendo HBSS completa gelada. Recolher todos os cérebros da ninhada na placa de 12 poços.
    5. Use um estereomicroscópio fluorescente para exibir os cérebros na placa de 12 poços para brilho de fluorescência, bem como o tamanho da região eletroporada. Selecione 2 a 4 cérebros com sinais fluorescentes brilhantes no córtex somatossensorial presumido para posterior processamento.
    6. Despeje 3% de solução de agarose LMP mantida a 38 ° C em um molde de encaixe descartável descartável. RemoçãoE cérebro da placa de 12 poços com uma espátula de microcuadrinha e drenar cuidadosamente excesso de HBSS completo ao redor do cérebro usando papel de seda fino.
    7. Coloque o cérebro suavemente na solução de agarose, empurre-o para o fundo do molde e ajuste cuidadosamente sua posição usando uma agulha de calibre 20. Para seções coronais, oriente o cérebro com as lâmpadas olfativas apontando para cima. Mantenha o molde sobre gelo até que a solução de agarose seja solidificada e continue com o corte do cérebro.
  8. Vibratome Seção e Cultura de fatia
    1. Remova o bloco de agarose do molde e coloque-o sobre a tampa de uma placa de Petri estéril. Cortar o excesso de agarose com uma lâmina de barbear limpa deixando aproximadamente 2 a 3 mm abaixo das lâmpadas olfativas e 1 mm de agarose nos outros lados. Corrija o bloqueio de agarose aparado com as lâmpadas olfativas apontando para baixo em um estágio de amostra usando cola de cianoacrilato.
      Nota: esterilize instrumentos e equipamentos com 70% de etanoAntes da seção.
    2. Transfira o estágio da amostra para a câmara de corte de um microtome de lâmina vibratória contendo HBSS completo gelado e posicione o cérebro com o lado dorsal em direção à lâmina. Corte fatias cerebrais de 250 μm de espessura contendo a região eletroporada com uma amplitude baixa a moderada de 0,9 mm e uma velocidade de corte muito lenta de 0,09-0,12 mm / s. Geralmente, 4 a 6 fatias com sinal fluorescente brilhante são obtidas de cada cérebro eletroporado com sucesso.
    3. Com uma espátula de microcuadre dobrada e uma pinça de pontas finas, transfira cuidadosamente as fatias de cérebro com a agarose circundante para uma placa de 6 poços contendo HBSS completo gelada.
      Cuidado: tenha cuidado para não danificar o tecido cerebral, apenas tocando na borda de agarose em torno das seções com a pinça durante a transferência.
    4. Processe todos os cérebros selecionados conforme descrito nas Etapas 2.8.1. Para 2.8.3.
    5. Humedecer as inserções de membrana com 100 μL de HBSS completo antes de colocar o cérebro slGelifica as membranas para facilitar o posicionamento das fatias. Podem ser colocadas até 5 fatias em 1 inserção de membrana.
    6. Transfira com cuidado as fatias para as membranas usando uma espátula de microcuadrinha dobrada e fórceps de ponta fina. Puxe suavemente uma fatia sobre a espátula, tocando apenas o rebordo de agarose com a pinça e empurre suavemente a fatia da espátula para dentro da membrana. Posicione a fatia usando fórceps e continue a transferir as fatias restantes. Remova o excesso de HBSS completo com uma pipeta.
      Nota: Não se sobrepõem as fatias entre si.
    7. Com a ajuda das pinças, coloque cuidadosamente as inserções de membrana com as fatias em uma placa de 6 poços contendo 1,8 mL de meio de cultura de fatia (ver Etapa 2.4.1) e incuba a 37 ° C e 5% de atmosfera de dióxido de carbono até o lapso de tempo Imagem.

3. Time-Lapse Imaging

  1. Configuração do microscópio
    1. Defina uma câmara climática colocada no palco de umMicroscópio confocal invertido a 37 ° C e 5% de atmosfera de dióxido de carbono. Use um detector híbrido para reduzir a intensidade do laser e melhorar a viabilidade celular. Para uma análise detalhada, use uma distância de trabalho extra-longa com objetivo 40X seco com uma abertura numérica de 0,6 ou superior.
      Nota: Todos os componentes do microscópio precisam ser pré-aquecidos a 37 ° C por 2 a 3 h antes da imagem para fornecer um foco estável durante o processo de imagem.
  2. Imagem de fatia
    1. Selecione uma fatia de cérebro para imagem a partir da placa de 6 poços contendo as inserções de membrana usando um microscópio de fluorescência invertido.
      Cuidado: Evite o tempo prolongado de exposição à luz ultravioleta, pois isso pode causar fotodiodo celular.
      Nota: Selecione uma fatia com neurônios simples brilhantes na SVZ superior, migrando radialmente para a superfície do pia da fatia. Processos finos fluorescentes de células gliais radiais que abrangem todo o CP indicam um andaime radial glato intacto, que é usadoD por neurônios corticais que migram radialmente.
    2. Transfira a inserção da membrana com a fatia, que foi selecionada para imagens de lapso de tempo, em um prato de fundo de vidro de 50 mm de diâmetro contendo 2 ml de meio de cultura de fatia com a ajuda da pinça. Coloque o prato na câmara climática do microscópio confocal.
    3. Defina a resolução para 512 em 512 pixels e aumente a velocidade de varredura de 400 Hz para 700 Hz para aumentar a taxa de quadros de cerca de 1,4 a cerca de 2,5 quadros por segundo, respectivamente. Não utilize mais de duas vezes a média. Defina uma pilha z através da região eletroporada (geralmente 400-100 μm) com um tamanho de passo de 1,5 μm. Coletivamente, essas configurações permitem uma resolução e brilho suficientes da imagem, mantendo o fotodamato baixo durante a aquisição. Comece a série de lapso de tempo pegando uma empilha em z de cada 30 min.
      Nota: A exposição prolongada da fatia à luz laser irá induzir a fotodinâmica reduzindo a viabilidade das células. Ajustar o expTempo de exposição à luz laser em conformidade.
    4. Analise as séries de lapso de tempo usando o software ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) ou equivalente.

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Representative Results

Anteriormente, mostrámos que a eliminação genética de BCL11A por electroporação em útero prejudica a migração radial da camada superior de neurónios de projecção final-nascido 10. A eletroporação de um vector de plasmídeo de DNA contendo Cre-IRES-GFP eliminou eficientemente Bcl11a em cérebros Bcl11a flox / flox condicionais 11 . Quando analisamos os céreos eletroporados E14.5 três dias após a eletroporação, a maioria dos neurônios de controle migraram para o CP, enquanto muitos neurônios mutantes Bcl11a foram paralisados ​​ao longo da rota migratória no IZ e VZ / SVZ. Além disso, encontramos um aumento no número de células multipolar à custa de células bipolares especificamente na deleção IZ após Bcl11a sugerindo defeitos na polarização 10 .

Para analisar de forma direta e dinâmica migraComportamento tory de neurônios mutantes de Bcl11a usamos imagens confocais de lapso de tempo de neurônios migratórios em cultura de fatia organotípica preparada a partir de cérebros eletroporados. A série de tempo-lapso de visão geral usando um objetivo 10X com uma abertura numérica de 0,4 confirmou nossos resultados, que os neurônios de projeção de mutantes Bcl11a apresentam defeitos na migração radial. Dentro de 36 h, muitos neurônios de controle migraram para a CP, enquanto que apenas alguns neurônios mutantes de Bcl11a deixaram o IZ e migraram para o CP. Curiosamente, parecia que muitos neurônios mutantes Bcl11a não migraram diretamente para a superfície do cérebro, mas diminuíram a migração e se tornaram tangencial ou mesmo de volta ao ventrículo (Filme 1). Para analisar ainda mais essas descobertas, geramos séries de lapso de tempo com maior ampliação usando um objetivo de 40x com uma abertura numérica de 0,6. Nossos dados mostram que os neurônios mutantes Bcl11a não conseguiram polarizar eficientemente e continuar migrando orientado radialmenteNo CP. Dentro de 12 h, muitos neurônios mutantes de Bcl11a não conseguiram mudar de uma polaridade multipolar para uma morfologia bipolar e, em vez disso, projetaram e retraíram muitos processos para o ambiente circundante (filme 2, figura 1A ).

Além disso, rastreamos os caminhos de migração de neurônios individuais em diferentes séries de lapso de tempo e os utilizamos para calcular parâmetros específicos de neurônios migratórios. Descobrimos que os neurônios mutantes de Bcl11a repetidamente passam por fases de duração de várias horas com velocidade de migração reduzida e mudanças de orientação aleatórias ( Figura 3, Figura 1B , pontas de seta vermelhas). Em particular, o perfil de velocidade dos neurônios mutantes Bcl11a foi deslocado da velocidade mais alta (25 μm / h) para a menor velocidade (5 μm / h) em comparação com os neurônios de controle ( Figura 1C ). De acordo com isso, a velocidade de migração global de Bcl11Os neurônios mutantes foram significativamente reduzidos de 10,34 ± 0,34 μm / h nos controles para 6 ± 0,54 μm / h (p = 2.4889E-05) ( Figura 1D ). Finalmente, o desvio da migração direcionada para a superfície pial do cérebro foi significativamente aumentado de 17,15 ± 2,13 ° no controle para 40,16 ± 4,42 ° em neurônios mutantes Bcl11a (p = 0,0002) ( Figura 1E ). Juntos, esses resultados demonstram que a imagem confocal de lapso de tempo de neurônios eletroporados de GFP na cultura de fatia organotípica é um método valioso para estudar mecanismos moleculares que controlam o processo de migração neuronal.

Filme 1
Filme 1: Migração do controle rotulado com GFP em comparação com os neurônios mutantes Bcl11a em fatias corticais. Os cérebros Bcl11a flox / flox foram electroporados emE14.5 com um vector plasmídico contendo IRES-GFP (A) ou Cre-IRES-GFP (B) e culturas em fatia foram preparados em E16.5. VZ / SVZ; Zonas ventriculares / subventriculares; IZ, zona intermediária; CP, placa cortical. Barra de escala = 100 μm. O filme é composto por 108 quadros à taxa de 5 quadros / s. Reimpresso de Wiegreffe et al. 10 com permissão de Elsevier. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)

Filme 2
Filme 2: Polarização de um controle rotulado GFP em comparação com neurônios mutantes Bcl11a em fatias corticais. Os cérebros Bcl11a flox / flox foram electroporados em E14.5 com um vetor plasmídico contendo IRES-GFP (A) ou Cre-IRES-GFP (B) e culturas em fatia Estavam preparados em E16.5. Barra de escala = 10 μm. O filme é composto por 25 quadros à taxa de 5 quadros / s. Reimpresso de Wiegreffe et al. 10 com permissão de Elsevier. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)

Filme 3
Filme 3: traços animados com 1 h de resolução de intervalo de controle representativo e neurônios mutantes Bcl11a . Os traços de neurônios migratórios foram obtidos a partir de séries de lapso de tempo de culturas de fatia E16.5 de cérebros Bcl11a flox / flox que foram electroporadas em E14.5 com um vetor plasmídico contendo IRES-GFP ( A ) ou Cre-IRES-GFP ( B ) . Barra de escala = 20 μm. Reimpresso de Wiegreffe et al.> 10 com permissão de Elsevier. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)

figura 1
Figura 1: Comportamento da migração de neurônios corticais de camada superior mutante Bcl11a .
( A ) Imagens representativas de neurônios GFP positivos migratórios em culturas de fatia E16.5 de cérebros Bcl11a flox / flox electroporados em E14.5 com Cre-IRES-GFP ou um vetor de controle durante um período de imagem total de 12 h. ( B ) Traços representativos com resolução de intervalo de 1 hora de neurônios GFP positivos migratórios em E16.5 culturas de fatia de cérebros Bcl11a flox / flox electroporados em E14.5 com Cre-IRES-GFP ou um vetor de controle em períodos de imagem total deAté 22 h. Os neurônios mutantes Bcl11a freqüentemente sofrem fases repetitivas de velocidade de migração reduzida e orientação alterada aleatoriamente (marcada por pontas de seta vermelhas). ( C ) Perfis de velocidade calculados a partir dos vestígios de neurônios migratórios, conforme mostrado em B. ( DE ) Quantificação da velocidade ( D ) e ângulo de desvio da orientação radial ( E ) dos neurônios migratórios GFP em E16.5 culturas de fatia de Bcl11a flox / flox Cérebro electroporado em E14.5 com Cre-IRES-GFP ou um vetor de controle (n = 15). Média ± sem; Teste t de Student; *** p <0,001. Barra de escala = 10 μm. Reimpresso de Wiegreffe et al. 10 com permissão de Elsevier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A migração radial é um processo chave no desenvolvimento do neocórtex. As mutações em genes que afetam diferentes etapas deste processo podem causar malformações corticais graves, incluindo hepatite lissencefálica e heterotopia de matéria branca 1 , 2 . Recentemente, mostramos que Bcl11a, que é expressa em jovens neurônios de projeção cortical migratória, desempenha um papel na migração radial. Utilizamos imagens confocais de lapso de tempo de neurônios migratórios em fatias corticais agudas de cérebros eletroporados para demonstrar diretamente que a deleção genética de Bcl11a em neurônios migratórios causa defeitos de polarização e migração. As séries de lapso de tempo foram usadas para traçar caminhos de migração de neurônios individuais e calcular parâmetros específicos de neurônios migratórios, incluindo perfis de velocidade, velocidade média de migração e direção migratória 10 .

Este protocolo descreve uma abordagem importante ao estudar moléculaR mecanismos na migração radial. Ao usar plasmídeos de expressão de RNA ou DNA de curto crescimento, quase todos os genes de interesse podem ser derrubados ou sobreexpressos, respectivamente. É uma abordagem poderosa para combinar electroporação com o sistema Cre-LoxP. A transfecção de cérebros de ratos mutantes condicionais ("floxed") com Cre recombinase gera uma situação de mutante em mosaico e permite a análise seletiva de neurônios mutantes únicos que estão rodeados por células de tipo selvagem. Desta forma, os mecanismos moleculares autônomos das células nos neurônios migratórios podem ser investigados. Além disso, as experiências de resgate funcional são facilmente realizadas. A preparação de séries de lapso de tempo de fatias de cérebro eletroporadas permite analisar dinamicamente o comportamento migratório de neurônios migratórios únicos, o que fornece muito mais informações do que podem ser obtidas a partir de seções fixas do cérebro. In utero electroporation 3 , 4 requer treinamento inicial, mas - uma vez masterizado - é umTécnica rápida e direta para transfectar neurônios reprodutores do córtex cerebral in vivo . No protocolo descrito aqui, utilizamos a eletroporação do útero em E14.5, quando nasceram neurônios de projeção neocortical de camada superior de nascida tardia. Para o estudo de neurônios de projeção de camada profunda iniciados no útero, a eletroporação deve ser realizada no estágio de desenvolvimento anterior ( ie E12.5) 13 . Em princípio, o protocolo também pode ser usado para estudar a migração de outras subpopulações neuronais no cérebro que podem ser transfectadas com eletroporação, incluindo migração de interneurônios 14 e células granulares cerebelares 15 .

O protocolo de cultura de fatia que descrevemos foi adaptado de Polleux e Gosh 12 e anteriormente, nós o usamos para a eletroporação ex utero 16 , 17 para o estudoDy desenvolvimento do hipocampo. Mais importante ainda, as fatias do cérebro devem ser tratadas com cuidado ao longo do procedimento para manter sua viabilidade. Utilizamos um microscópio invertido e pratos de fundo de vidro de qualidade óptica para a imagem da cultura de fatia em repouso sobre uma inserção de cultura de células. Esta configuração é muito fácil de configurar e permite condições estéreis, uma vez que o objetivo nunca entra em contato com a cultura ou o meio da fatia. No entanto, são necessários longos objetivos de distância de trabalho (> 2 mm) com uma abertura numérica suficientemente alta (0,6 ou superior). Outros estudos colocaram a fatia do cérebro diretamente no fundo do vidro e usaram uma matriz de colágeno 18 , 19 para consertar a fatia no lugar, o que torna possível o uso de objetivos com uma distância de trabalho livre mais curta. No entanto, o uso de inserções de cultura de células fornece resultados fáceis de manipulação, reproduzíveis e permite ao pesquisador imagem das fatias até 1 a 2 dias após a sua preparação sem coViabilização da fatia do cérebro (dados não apresentados). Outra questão crítica diz respeito a danificar as fatias pela luz laser. Utilizamos um detector híbrido altamente sensível, que nos permitiu reduzir o poder do laser ao mínimo, enquanto ainda obtivemos sinais fluorescentes suficientes para imagens de lapso de tempo. A utilização de imagens de multiphoton reduziria ainda mais o fotodemato e permitiria uma penetração mais profunda do tecido, bem como uma detecção de luz mais eficiente em comparação com a microscopia confocal convencional.

Apesar da sua utilidade para estudar migração neuronal, o protocolo tem limitações e não pode preservar completamente a situação dos neurônios migratórios no cérebro intacto. A matriz extracelular, os contatos intercelulares adesivos e a vasculatura dentro da zona migratória podem influenciar dinamicamente os neurônios que migram radialmente 20 , 21 . Especificamente, os neurônios da camada superior dependem de processos gliais radiais alongados paraSua migração 22 . Para imagens bem sucedidas, é importante selecionar fatias cerebrais com células gliais radiais eletroporadas de GFP que estendam seus processos através de toda a largura cortical. As "fatias oblíquas", nas quais o andaime radial foi cortado antes de atingir a superfície do pial do cérebro, devem ser descartadas para análise posterior. Às vezes, a morte celular pode ocorrer na superfície do ar da fatia do cérebro, o que restringe a aquisição da imagem para uma região mais profunda dentro da amostra. Os neurônios electroporados em fatias de cérebro cultivadas podem migrar de forma menos eficiente em comparação com neurônios eletroporados in vivo , o que pode ser causado por recuperação insuficiente da preparação. Isso requer análises de múltiplas culturas de fatia para situações experimentais e de controle e interpretação crítica de conjuntos de dados representativos. Em alguns casos, os insultos associados à eletroporação in utero podem causar morte embrionária ou alteração estrutural.Íons do cérebro, incluindo ventrículos aumentados, córtex assimétrico ou uma formação de cicatrizes gliais resultantes da injeção de DNA. Nesses casos, a amostra deve ser descartada de uma análise posterior.

Enquanto as fatias de cérebro de dadores embrionários sobrevivem bem nas inserções de membrana 23 , as análises são restritas a eventos de desenvolvimento precoce, incluindo a migração neuronal, e não a usamos para estudar eventos posteriores, como desenvolvimento de dendrina ou sinaptogênese. Em resumo, fornecemos um protocolo detalhado para estudar de forma direta e dinâmica a migração neuronal de neurônios eletroporados em culturas em fatias, que podem ser facilmente adaptadas para analisar as funções dos genes envolvidos em distúrbios do desenvolvimento neurológico.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

Agradecemos Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka e Matthias Toberer por uma excelente assistência técnica, bem como por Victor Tarabykin para discussões úteis. Este trabalho foi apoiado por uma concessão da Deutsche Forschungsgemeinschaft à SB (BR-2215).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
isoflurane Abbott Laboratories  506949 Forene
6-well plate Corning 351146
12-well plate Corning 351143
non-absorbable surgical suture Ethicon K890H 3/8 circle, 13 mm, taper point
Micro Adson Forceps Fine Science Tools 11018-12 serrated, length: 12 cm
fine scissors Fine Science Tools 14063-09 angled to side, length: 9 cm
Mathieu Needle Holder Fine Science Tools 12510-14 tungsten carbide, length: 14 cm
fine tipped forceps Fine Science Tools 11370-40 straight, 11 cm
Vannas Tübingen Spring Scissors Fine Science Tools 15005-08 angled up, 9.5 cm
ring forceps Fine Science Tools 11103-09 OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm
HBSS (10X) Gibco 14180046
L-Glutamine Gibco 25030081
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
horse serum Gibco 26050088
BME Gibco 41010026
borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus 30-0016 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm
anesthsesia system Harvard Apparaus 72-6471
anesthetizing chamber Harvard Apparaus 34-0460
fluosorber filter canister Harvard Apparaus 34-0415
low melting point agarose Invitrogen 16520100
vibrating blade microtome Leica VT1200 S
fluorescence stereo microscope Leica M205 FA
stereo microscope Leica M125
inverted fluorescence tissue culture microscope Leica DM IL LED
confocal laser scanning microscope Leica TCS SP5II
hybrid detector Leica HyD
objective, 40x/0.60 NA Leica 11506201
microscope temperature control system Life Imaging Services Cube, Brick & Box
cell culture insert Millipore PICM0RG50
microgrinder Narishige EG-45 use 38° angle for beveling
microinjector Parker Hannifin  052-0500-900 Picospritzer III
carprofen Pfizer Animal Health NDC 61106-8507 Rimadyl
emdedding mold Polysciences 18986-1
endotoxin-free plasmid maxi kit Qiagen 12362
fast green Sigma F7252
laminin Sigma L2020
poly-L-lysine Sigma P5899
HEPES Sigma H4034
D-glucose Sigma G6152
calcium chloride Sigma C7902
magensium sulfate Sigma M2643
sodium bicarbonate Sigma S6297
square wave electroporator Sonidel CUY21EDIT
tweezers with 5 mm platinum disk electrodes Sonidel CUY650P5
micropipette puller Sutter Instrument P-97
box filament Sutter Instrument FB255B 2.5 mm x 2.5 mm
micro-spoon spatula VWR 231-0191 185 mm x 5 mm
glass bottom dish, 50 mm World Precision Instruments FD5040-100

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References

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