Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando

Neuroscience

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Summary

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell'utilizzo dell'elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l'imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.

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Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (125), e55886, doi:10.3791/55886 (2017).

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Abstract

Nell'utero l' elettroporazione è un approccio veloce e potente per studiare il processo di migrazione radiale nella corteccia cerebrale degli embrioni di topo di sviluppo. Ha contribuito a descrivere i diversi passi della migrazione radiale e caratterizzare i meccanismi molecolari che controllano questo processo. Per analizzare in modo diretto e dinamico i neuroni migrativi, essi devono essere rintracciati nel tempo. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro che combina in elettroporazione utero con la cultura di fetta organotypica e imaging confocale a tempo intervallo, che consente un esame diretto e un'analisi dinamica dei migratori radiali di neuroni corticali. Inoltre, è possibile la caratterizzazione dettagliata dei neuroni migranti, quali velocità di migrazione, profili di velocità e cambiamenti di orientamento radiale. Il metodo può essere facilmente adattato per eseguire analisi funzionali di geni di interesse per la migrazione radiale dei neuroni corticali mediante perdita e guadagno di funzione, nonché esperimenti di salvataggio. Lasso di tempoL'imaging dei neuroni migratori è una tecnica all'avanguardia che una volta stabilita è un potente strumento per studiare lo sviluppo della corteccia cerebrale nei modelli di mouse dei disturbi della migrazione neuronale.

Introduction

Il neocortex è il principale sito di funzioni cognitive, emotive e sensoriali. È composto da sei strati orizzontali orientati in parallelo alla superficie del cervello. Durante lo sviluppo, le cellule progenitrici nella parete laterale del telencephalon dorsale danno origine a neuroni di proiezione che migrano radialmente verso la superficie del piolo e acquisiscono un'identità neuronale specifica di tipo strato. Dopo essere stati generati nelle zone ventricolari / subventricolari (VZ / SVZ) questi neuroni diventano temporaneamente multipolari e rallentano la loro migrazione. Dopo un breve periodo di permanenza nella zona intermedia (IZ) si passa alla morfologia bipolare, si collega all'impianto radiale dell'altile e continua la migrazione orientata radialmente nella piastra corticale (CP). Al raggiungimento del loro obiettivo finale di proiezione i neuroni si staccano dai processi radiali degli gliali e acquisiscono un'identità specifica del livello. Le mutazioni nei geni che colpiscono varie fasi della migrazione neuronale possono causare gravi malformazioni corticali, come lissencEfalia o eterotopia della materia bianca 1 , 2 .

Nell'utero l' elettroporazione è una tecnica rapida e potente per trasfettare le cellule progenitrici neurali nel cervello in sviluppo degli embrioni di roditore 3 , 4 . Con questa tecnica è possibile sconnessioni e / o sovrapressione di geni di interesse per studiare le loro funzioni nello sviluppo di neuroni. Questo metodo ha contribuito in modo specifico a descrivere i dettagli morfologici e caratterizzare i meccanismi molecolari del processo di migrazione radiale 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . I neuroni che migrano radicalmente subiscono variazioni dinamiche in forma cellulare, velocità di migrazione e direzione migratoria, che richiedono un'osservazione diretta e continua nel tempo. Cultu di fetta organotipicaLa riqualificazione e la temporanea imaging confocale dei cervelli elettroporati permettono di osservare direttamente i neuroni migranti nel tempo. Utilizzando questo approccio combinato, è possibile analizzare le caratteristiche distinte dei neuroni migratori che non possono essere studiati in sezioni di tessuti fissi di cervelli elettroporati.

Abbiamo recentemente applicato l'imaging confocale dei migratori neuronali in culture di fetta di cervelli elettroporati per studiare il ruolo del CLL / linfoma 11a (Bcl11a) della cellula B della trascrizione nel corso dello sviluppo corticale 10 . Bcl11a è espresso in giovani neuroni corticali migranti e abbiamo utilizzato un mutante Bcl11a allele ( Bcl11a flox ) 11 condizionato per studiare le sue funzioni. L'elettroporazione di Cre ricombinasi insieme a proteine ​​fluorescenti verdi (GFP) nei progenitori corticali di cervelli flox / flox Bcl11a ci ha permesso di creare una situazione di mutante mosaico, in cui solo alcune cellule sono mutate in unAltrimenti sfondo di natura selvaggia. In questo modo, è stato possibile studiare le funzioni autonome delle cellule Bcl11a a livello di singola cellula. Abbiamo scoperto che i neuroni mutanti Bcl11a mostrano velocità ridotte, spostamenti nei loro profili di velocità, nonché cambiamenti di orientamento casuale durante la loro migrazione 10 . Nel protocollo descritto descriviamo un flusso di lavoro per l'elettroporazione di successo e la preparazione della coltura di fetta 12 dei cervelli del topo, nonché l'imaging confocale delle colture corticali di fetta.

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Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato per il benessere degli animali (Regierungspräsidium Tübingen) e sono state eseguite in conformità con la legge tedesca del benessere degli animali e la direttiva UE 2010/63 / UE.

1. In Urolo elettroporazione

  1. Aghi da microinezione
    1. Tirare i capillari di vetro borosilicato (diametro esterno: 1,0 mm, diametro interno: 0,58 mm, lunghezza: 100 mm) in aghi di microinezione usando un estrattore a micropipetta con filo di scatola (2,5 mm x 2,5 mm) e il seguente programma: HEAT: 540, PULL : 125, VELOCITY: 20 e DELAY: 140. Determinare il valore HEAT per ogni singolo filamento eseguendo un test RAMP (valore HEAT: RAMP + 25).
    2. Gli aghi smussati ad angolo di 38 ° e velocità intermedia a alta velocità con microgrinder per ottenere una dimensione di punta da 20 a 30 μm per l'iniezione a giorni embrionali (E) 13,5 o minori e da 30 a 40 μm per l'iniezione di embrioni anzianistadi. Per l'immagazzinamento, agganciare gli aghi in una scatola o un piatto di petri con l'argilla di modellazione per evitare danni alle punte.
  2. Soluzione del DNA plasmidico
    1. Preparare il DNA del plasmide contenente proteine ​​reporter fluorescenti ( ad es. GFP) usando un kit di preparazione maxi senza endotossina secondo le istruzioni del produttore.
    2. Diluire la soluzione del DNA plasmidico a una concentrazione finale di 1 - 2 μg / μL in tampone Tris-EDTA privo di endotossina contenente Fast Green in una concentrazione finale dello 0,01%. Soluzione alcolica e conservazione a -20 ° C.
  3. Soluzione batteriostatica di cloruro di sodio
    1. Preparare la soluzione di cloruro di sodio batteriostatico aggiungendo l'alcool benzilico ad una concentrazione finale dello 0,9% alla soluzione isotonica 0,9% di cloruro di sodio. Soluzione filtrante sterile immediatamente prima dell'uso.
  4. Soluzione iniettabile per Carprofen
    1. Preparare la soluzione di iniezione di carprofenL'aggiunta di carprofene ad una concentrazione finale di 0,5 mg / ml alla soluzione sterile isotonica 0,9% di cloruro di sodio. Conservare a 4 ° C per un massimo di 28 giorni.
  5. Anestesia, Iniezione del DNA e Elettroporazione
    1. Pesare un mouse E14.5 in gravidanza temporizzato e collocarlo in una camera anestetizzante trasparente collegata ad un vaporizzatore e saturata con 5% isoflurano. Quando l'animale è incosciente, trasferirlo in una maschera anestetizzante attaccata a una piastra riscaldante a 37 ° C e mantenerla anestetizzata con 1,8-2,2% isoflurano.
      Nota: Valutare lo sviluppo dell'anestesia chirurgica da perdita di pizzicamento della coda e di pedale (pizzicotto del piede).
    2. Per analgesia, iniettare 100 μL di soluzione di iniezione di carprofen per 10 mg di peso corporeo del mouse (5 mg / kg di peso corporeo) sottocutanea. Girare il mouse con la schiena verso il basso e coprire con cura gli occhi con la gelatina di petrolio per impedire l'essiccazione.
    3. Spalmare delicatamente le membra e fissarleAlla piastra riscaldante con nastro chirurgico. Sterilizzare l'addome con il 70% di etanolo seguito da una soluzione di iodio (7,5 mg / ml) utilizzando tamponi di cellulosa. Ripetere questa procedura tre volte per assicurare una corretta disinfezione.
    4. Coprire l'addome con garza sterile in cui è stata tagliata un'incisione per risparmiare un campo (diametro 2 - 2,5 cm) per l'incisione addominale. Inumidire la garza con soluzione di cloruro di sodio batteriostatico.
      Attenzione: riesaminare lo sviluppo dell'anestesia chirurgica perdendo il riflesso del pedale.
    5. L'utilizzo di Micro Adson Forceps (dentata, lunghezza: 12 cm) e forbici (angolate a lato, lunghezza: 9 cm) tagliano la pelle di circa 1,5 cm lungo la linea mediana dell'addome. Tagliare il muscolo sottostante lungo linea alba.
    6. Rimuovere un corno uterino con pinze ad anello (lunghezza: 9 cm, diametro esterno: 3 mm, diametro interno: 2,2 mm) e metterlo delicatamente sulla garza inumidita.
      Attenzione: Tenere il corno uterino con le pinze dell'anello solo tra embrioni anD non perturbare le placenta o qualsiasi vaso di approvvigionamento. Tenere l'utero umido in qualsiasi momento con soluzione di cloruro di sodio batteriostatico.
    7. Posizionare con cura un embrione con pinze anelli e individuare il ventricolo laterale, che presenta come un'ombra a forma di mezzaluna parallela al sinus sagittale. Il sito di iniezione si trova approssimativamente al centro di una linea tra l'occhio pigmentato e la confluenza dei seni, dove il seno sagittale si rade a due seni trasversali. Spingere l'ago di microinezione attraverso la parete uterina e nel ventricolo laterale.
      Nota: Se necessario, la profondità dell'iniezione può essere correggita mediante ritiro dell'ago.
    8. Iniettare da 1 a 2 μL di soluzione DNA nel ventricolo laterale con un microinjector, che viene azionato con un pedale, utilizzando le seguenti impostazioni: 25 psi, 10 a 20 ms per impulso e 5 a 10 impulsi. L'iniezione di successo può essere monitorata dalla soluzione DNA colorata, che dovrebbe riempire il sistema ventricolare.
    9. Posizionare gli elettrodi tipo tweezers (diametro 3 mm per E13.5 o più piccolo e diametro 5 mm per E14.5 o più vecchi) in modo tale che il terminale "positivo" sia sullo stesso lato del ventricolo iniettato e del "negativo" Il terminale è sul lato opposto del ventricolo iniettato sotto l'orecchio della testa dell'embrione.
    10. Inumidire il sito di elettroporazione con alcune gocce di soluzione di cloruro di sodio batteriostatico e applicare 5 impulsi di corrente elettrica (35 V per E13.5 o minori e 40 V per E14.5 o più) di durata di 50 ms con intervalli di 950 ms.
      Nota: le correnti di 60 a 90 mA sono di solito sufficienti per una corretta elettroporazione. Le correnti più basse non transfettano efficacemente i neuroni, mentre le correnti più alte possono portare a morte embrionale.
    11. Ripetere la procedura (cf Punto 1.5.7 - 1.5.10) per ogni embrione del corno uterino e riportarla delicatamente nella cavità addominale.
    12. Rimuovere il corno uterino dall'altro lato e ripetere la procDescritto nel passaggio 1.5.7. A 1.5.11.
    13. Chiudere la cavità addominale suturando lo strato muscolare prima di suturare la pelle utilizzando Micro Adson Forceps, Mathieu Needle Holder (carburo di tungsteno, lunghezza: 14 cm) e sutura chirurgica non assorbibile (cerchio 3/8, 13 mm, punto conica).
      Attenzione: Fare attenzione a non catturare l'utero o altri organi durante la sutura.
    14. Disinfettare con cautela la sutura cutanea con soluzione iodica (7,5 mg / ml) e rimuovere delicatamente l'eccesso periocular di gelatina di petrolio utilizzando tamponi di cellulosa. Posizionare il mouse sotto una lampada a infrarossi finché non si sveglia. Monitorare attentamente il mouse durante i prossimi due giorni. Ripetere il trattamento analgesico come descritto nel passaggio 1.5.2 dopo 12 - 24 h.

2. Cultura Organotypic Slice

  1. Laminin Stock Solution
    1. Sciogliere 1 mg di laminina liofilizzata in acqua sterile per ottenere una soluzione di stock laminina da 1 mg / ml. Preparare le aliquote di 50 μL aNd a -80 ° C.
  2. Soluzione di magazzino Poly-L-Lysine
    1. Sciogliere 50 mg di poli-L-lisina in acqua sterile per ottenere una soluzione di stock di poli-L-lisina da 1 mg / ml. Preparare aliquote di 0,5 mL e conservare a -20 ° C.
  3. Soluzione salina bilanciata completa di Hank (Complete HBSS)
    1. Preparare HBSS completo combinando 50 ml di soluzione 10x HBSS, 1,25 ml di 1 M HEPES tampone (pH 7,4), 15 ml di soluzione di glucosio da 1 M, 5 ml di soluzione di cloruro di calcio da 100 mM, 5 ml di 100 mM di solfato di magnesio Soluzione e 2 mi di 1 M soluzione di carbonato di idrogeno di sodio. Aggiungere acqua sterile fino a 0,5 L, filtro sterile e conservare a 4 ° C.
  4. Slice Medium di coltura
    1. Combinare 35 ml di Basal Medium Eagle (BME), 12,9 ml di HBSS completo (cf paragrafo 2.3.1), 1,35 ml di 1 M D-glucosio, 0,25 ml di 200 mM L-glutammina e 0,5 ml di penicillina-streptomicina a Ottenere 50 ml di coltura di fettamedio. Filtro sterile e aggiungere siero di cavallo ad una concentrazione finale del 5%. Conservare a 4 ° C fino a 4 settimane.
  5. Soluzione agarosa a basso punto di fusione (LMP)
    1. Preparare la soluzione di agarosio 3% di LMP sciogliendo 1,5 g di agarosio LMP in 50 ml di HBSS completo riscaldando in un forno a microonde per 1 a 2 minuti a potenza intermedia.
      Nota: controllare con cautela il calore per evitare il trabocco durante la bollitura.
    2. Mettere la soluzione in un bagno d'acqua a 38 ° C fino all'uso pronto. Conservare a 4 ° C e riutilizzarlo una volta.
  6. Rivestimento di inserti a membrana
    1. Aggiungere una aliquota della soluzione di stock laminina (cf Punto 2.1.1) e una aliquota della soluzione di stock di poli-L-lisina (cf Punto 2.2.1) a 6 ml di acqua sterile per ottenere una soluzione di rivestimento (sufficiente per 6 inserti) .
    2. Inserire gli inserti della membrana in una piastra a 6 pozzetti contenenti 2 ml di acqua sterile nella parte inferiore di ciascun pozzetto. Aggiungere 1 ml di soluzione di rivestimento(Cf Passo 2.6.1) sopra ogni membrana e incubare per una notte a 37 ° C e 5% in atmosfera di anidride carbonica.
      Nota: Utilizzare solo inserti con membrane ottiche chiare, come la membrana politetrafluoroetilene (PTFE).
    3. Lavare le membrane tre volte con 1 ml di acqua sterile e asciugare. Utilizzare le membrane rivestite nello stesso giorno o conservare in un piatto a 6 pozzetti puliti a 4 ° C per un massimo di quattro settimane.
  7. Dissezione del cervello e embedding
    1. Due giorni dopo l'elettroporazione posizionare il mouse in una camera trasparente collegata ad un vaporizzatore e saturata con 5% isoflurano. Quando l'animale è incosciente, toglierlo dalla camera e sacrificarlo con la dislocazione cervicale.
    2. Rimuovere l'utero contenente gli embrioni e collocarlo in un piatto di Petri da 10 cm con HBSS completo di ghiaccio.
      Nota: Da questo punto in avanti mantenere tutte le soluzioni, embrioni e cervelli sul ghiaccio.
    3. Utilizzare uno stereomicroscopio, pinze a punta fine (diritto,11 cm) e un paio di forbici a molla Vannas Tübingen (angolato fino, lunghezza: 9,5 cm) per separare ogni embrione dall'utero e trasferirlo ad un altro piatto di Petri contenente HBSS completo ghiacciato.
    4. Fare un'incisione al livello del gambo cerebrale e tagliate lungo la linea mediana sagittale. Sbucciate la pelle e la cartilagine che copre il cervello. Poi, tagliare il cervello proprio dietro gli emisferi e rimuovere il cervello dal cranio. Trasferire il cervello con una spatola di micro-cucchiaio (185 mm x 5 mm) su una piastra a 12 pozzetti contenente HBSS completo di ghiaccio. Raccogli tutti i cervelli dalla lettiera nella piastra a 12 pozzetti.
    5. Utilizzare un stereomicroscopio fluorescente per schermare i cervelli nella lastra a 12 pozzetti per la luminosità della fluorescenza e la dimensione della regione elettroporata. Selezionare 2 a 4 cervelli con segnali luminosi fluorescenti nella corteccia somatosensoriale presuntiva per ulteriori elaborazioni.
    6. Versare la soluzione di agarosio al 3% di LMP mantenuta a 38 ° C nello stampo monouso di stoccaggio. RemovIl cervello dalla piastra a 12 pozzetti con una spatola di micro-cucchiaio e scoraggiare attentamente l'eccesso di HBSS completo intorno al cervello utilizzando carta velina fine.
    7. Posizionare il cervello dolcemente nella soluzione agarosa, spingerla verso il fondo dello stampo e regolare con precisione la posizione usando un ago da 20 gauge. Per le sezioni coronali, orientare il cervello con le lampadine olfattive rivolte verso l'alto. Tenere lo stampo sul ghiaccio finché la soluzione agarosa non si solidifica e continua a tagliare il cervello.
  8. Vibratome Sezione e Cultura Slice
    1. Rimuovere il blocco agarosio dallo stampo e metterlo sul coperchio di un piatto petri sterile. Togliere l'agarosio in eccesso con una lama pulita pulita lasciando circa 2 a 3 mm sotto le lampadine olfattive e 1 mm di agarosio sulle altre parti. Fissare il blocco di agarosio tagliato con le lampadine olfattive che puntano verso il basso verso una fase di campionamento utilizzando colla cianoacrilato.
      Nota: Sterilizzare gli strumenti e le attrezzature con il 70% di etanoL prima della sezione.
    2. Trasferire lo stadio del campione alla camera di taglio di un microtomo a vibrazione della lama contenente HBSS completo di ghiaccio e posizionare il cervello con il suo lato dorsale verso la lama. Tagliare fette di cervello di 250 μm contenenti la regione elettroporata con un'ampiezza bassa o moderata di 0,9 mm e una velocità di taglio molto lenta di 0,09-0,12 mm / s. Di solito 4 a 6 fette con segnale luminoso fluorescente sono ottenuti da ciascun cervello elettroporato con successo.
    3. Con una spatola micro-cucchiaio piegata e pinze a punta fine, trasferire con cura le fette del cervello con l'agarosio circostante su una piastra a 6 pozzetti contenente HBSS completo di ghiaccio.
      Attenzione: Fare attenzione a non danneggiare il tessuto cerebrale solo toccando il cerchio agarosio attorno alle sezioni con le pinze durante il trasferimento.
    4. Processare tutti i cervelli selezionati come descritto in Fasi 2.8.1. A 2.8.3.
    5. Inumidire gli inserti a membrana con 100 μL di HBSS completo prima di mettere il cervello slGetta sulle membrane per facilitare il posizionamento delle fette. Possono essere posizionati fino a 5 fette su un inserto a membrana.
    6. Trasferire con cautela le fette sulle membrane usando una spatola piegata di micro-cucchiaio e fine pinze a punta. Tirare delicatamente una fetta sulla spatola toccando il cerchio agaroso con le pinze e spingere delicatamente la fetta dalla spatola sulla membrana. Posizionare la fetta con le pinze e continuare a trasferire le restanti fette. Rimuovere l'HBSS in eccesso completo con una pipetta.
      Nota: non sovrapporre le fette tra di loro.
    7. Con l'aiuto delle pinze posizionare con cura le inserti a membrana con le fettine in una piastra a 6 pozzetti contenenti 1,8 ml di terreno di coltura a fetta (cf Punto 2.4.1) e incubare a 37 ° C e al 5% di anidride carbonica fino al tempo imaging.

3. Imaging Time-Lapse

  1. Impostazione del microscopio
    1. Impostare una camera di clima posta sul palco di unMicroscopio confocale invertito a 37 ° C e atmosfera di anidride carbonica del 5%. Utilizzare un rivelatore ibrido per ridurre l'intensità laser e migliorare la vitalità cellulare. Per un'analisi dettagliata, utilizzare una distanza di lavoro extra lunga 40X con un apertura numerica di 0,6 o superiore.
      Nota: Tutti i componenti del microscopio devono essere pre-riscaldati a 37 ° C per 2-3 ore prima dell'immagine per fornire un fuoco stabile durante il processo di imaging.
  2. Slice Imaging
    1. Selezionare una fetta del cervello per l'imaging dalla piastra a 6 pozzetti contenenti gli inserti a membrana utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito.
      Attenzione: Evitare il tempo di esposizione prolungato alla luce ultravioletta, in quanto ciò può causare fotodamage cellulare.
      Nota: Selezionare una fetta con neuroni singoli luminosi nella SVZ superiore che si sposta radialmente verso la superficie pialla della fetta. Processi fluorescenti fine di cellule gliali radiali che attraversano l'intero CP indicano un impalcatura radiale radiale intatta, che è l'usoD emettendo radialmente i neuroni corticali.
    2. Trasferire l'inserto a membrana con la fetta, selezionata per l'imaging di tempo, in un piatto di vetro di 50 mm di diametro contenente 2 ml di terreno di coltura a fetta con l'aiuto di pinze. Posizionare il piatto nella camera di clima del microscopio confocale.
    3. Impostare la risoluzione a 512 di 512 pixel e aumentare la velocità di scansione da 400 Hz a 700 Hz per aumentare la frequenza di fotogramma da rispettivamente da 1,4 a circa 2,5 fotogrammi al secondo. Non utilizzare più di due volte la media. Definire una z-stack attraverso la regione elettroporata (di solito 400-100 μm) con un passo di 1,5 μm. Insieme, queste impostazioni consentono una risoluzione e una luminosità sufficienti dell'immagine mantenendo inalterate la fotodamiglia durante l'acquisizione. Avviare la serie di time-lapse prendendo una z-stack ogni 30 min.
      Nota: L'esposizione prolungata della fetta alla luce laser indurirà il fotodamage riducendo la vitalità delle cellule. Regolare l'esRispecchiare il tempo alla luce laser di conseguenza.
    4. Analizza la serie di time-lapse usando il software ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) o equivalente.

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Representative Results

In precedenza, abbiamo mostrato che la delezione genica di Bcl11a da parte dell'utero elettroporzionale compromette la migrazione radiale dei neuroni di proiezione di strato superiore 10 . L'elettroporazione di un vettore plasmidico DNA contenente Cre-IRES-GFP ha eliminato efficacemente Bcl11a nei cervelli condizionati Bcl11a flox / flox 11 . Quando abbiamo analizzato il cervello E14.5 elettroporato tre giorni dopo l'elettroporazione, la maggior parte dei neuroni di controllo si era migrata nel CP, mentre molti neuroni mutanti Bcl11a sono stati bloccati lungo il percorso migratorio nel IZ e nel VZ / SVZ. Inoltre, abbiamo riscontrato un aumento del numero di cellule multipolari a scapito delle cellule bipolari specificamente nell'eliminazione IZ su Bcl11a che suggerisce difetti nella polarizzazione 10 .

Analizzare direttamente e in modo dinamico la migraComportamento dei neuroni mutanti Bcl11a abbiamo utilizzato l'imaging confocale dei neuroni migratori nella cultura organica di fetta preparata da cervelli elettropatici. La serie di time-lapse panoramica che utilizza un obiettivo 10x con apertura numerica di 0,4 ha confermato i nostri risultati, che i neuroni di proiezione mutante Bcl11a presentano difetti nella migrazione radiale. Entro 36 h molti neuroni di controllo erano stati migrati nel CP, mentre pochi neuroni mutanti Bcl11a avevano lasciato l'IZ e migrarono nel CP. È interessante notare che molti neuroni mutanti Bcl11a non migrarono direttamente verso la superficie del cervello, ma rallentarono la migrazione e si trasformarono tangenzialmente o addirittura verso il ventricolo (Movie 1). Per analizzare ulteriormente questi risultati abbiamo generato una serie di time-lapse ad un ingrandimento superiore utilizzando un obiettivo 40x con un'apertura numerica di 0,6. I nostri dati mostrano che i neuroni mutanti Bcl11a non hanno potuto polarizzare in modo efficiente e continuare la migrazione orientata radialmenteIone nel CP. Entro 12 h, molti neuroni mutanti Bcl11a non sono riusciti a passare da un multipolare a una morfologia bipolare e proiettare e ritirare molti processi nell'ambiente circostante (Movie 2, Figura 1A ).

Inoltre, abbiamo tracciato i percorsi di migrazione dei singoli neuroni in diverse serie di time-lapse e li abbiamo utilizzati per calcolare parametri specifici dei neuroni migratori. Abbiamo riscontrato che i neuroni mutanti Bcl11a ripetutamente subiscono fasi di durata di parecchi ore con una ridotta velocità di migrazione e cambiamenti di orientamento casuale (Movie 3; Figura 1B , frecce rosse). In particolare, il profilo di velocità dei neuroni mutanti Bcl11a è stato spostato dalla velocità più alta (25 μm / h) verso una velocità minore (5 μm / h) rispetto ai neuroni di controllo ( Figura 1C ). In linea con questa, la velocità di migrazione globale di Bcl11Un neurone mutante è stato significativamente ridotto da 10.34 ± 0.34 μm / h nei controlli a 6 ± 0.54 μm / h (p = 2.4889E-05) ( Figura 1D ). Infine, la deviazione dalla migrazione diretta verso la superficie piale del cervello è stata significativamente aumentata da 17,15 ± 2,13 ° nel controllo a 40,16 ± 4,42 nei neuroni mutanti Bcl11a (p = 0,0002) ( Figura 1E ). Insieme questi risultati dimostrano che l'imaging confocale dei GFP neuroni elettroporati nella coltura organica di fetta è un metodo prezioso per studiare meccanismi molecolari che controllano il processo di migrazione neuronale.

Film 1
Film 1: Migrazione del controllo etichettato GFP in confronto ai neuroni mutanti Bcl11a in fette corticali. I cervelli di flox / flox Bcl11a sono stati elettroporati aE14,5 con un vettore plasmidico contenente IRES-GFP (A) o Cre-IRES-GFP (B) e colture di fetta sono state preparate a E16.5. VZ / SVZ; Zone ventricolari / subventricolari; IZ, zona intermedia; CP, piastra corticale. Barra di scala = 100 μm. Il film è composto da 108 fotogrammi alla velocità di 5 fotogrammi / s. Ristampato da Wiegreffe et al. 10 con autorizzazione di Elsevier. Clicca qui per visualizzare questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Film 2
Film 2: Polarizzazione di un controllo etichettato GFP in confronto ai neuroni mutanti Bcl11a in fette corticali. I cervelli flox / flox Bcl11a sono stati elettroporati a E14.5 con un vettore plasmidico contenente IRES-GFP (A) o Cre-IRES-GFP (B) e colture di fetta Sono stati preparati a E16.5. Barra di scala = 10 μm. Il film è costituito da 25 fotogrammi alla velocità di 5 fotogrammi / s. Ristampato da Wiegreffe et al. 10 con autorizzazione di Elsevier. Clicca qui per visualizzare questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Movie 3
Film 3: Tracce animate con risoluzione di intervalli di 1 h del Controllo Rappresentante e Neuroni Mutanti Bcl11a . Le tracce dei neuroni migratrici sono state ottenute da una serie di colture di fetta di E16.5 di Bcl11a flox / flox che sono stati elettroporati a E14.5 con un vettore plasmidico contenente IRES-GFP ( A ) o Cre-IRES-GFP ( B ) . Barra di scala = 20 μm. Ristampato da Wiegreffe et al.> 10 con autorizzazione di Elsevier. Clicca qui per visualizzare questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Figura 1
Figura 1: Comportamento migrativo dei neuroni corticali del mutante superiore Bcl11a .
( A ) Immagini rappresentative dei neuroni positivi GFP migranti in colture E16.5 di fetta da braccia Bcl11a flox / flox elettroporzionate a E14.5 con Cre-IRES-GFP o un vettore di controllo per un periodo complessivo di imaging di 12 h. ( B ) Tracce rappresentative con risoluzione di intervalli di 1 ora di neuroni positivi GFP migranti in colture di fetta E16.5 da Bcl11a flox / flox brain electroporated a E14.5 con Cre-IRES-GFP o un vettore di controllo su periodi di imaging totaleFino a 22 h. I neuroni mutanti Bcl11a spesso subiscono fasi ripetitive di ridotta velocità di migrazione e orientamento casuale (contrassegnato da frecce rosse). ( C ) Profili di velocità calcolati da tracce di neuroni migranti come mostrato in B. ( DE ) Quantificazione della velocità ( D ) e angolo di deviazione dall'orientamento radiale ( E ) dei neuroni positivi GFP migranti in colture E16.5 di fetta da Bcl11a flox / flox I cervelli sono stati electroporati a E14.5 con Cre-IRES-GFP o un vettore di controllo (n = 15). Mean ± sem; Il test t degli studenti; *** p <0,001. Barra di scala = 10 μm. Ristampato da Wiegreffe et al. 10 con autorizzazione di Elsevier. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La migrazione radicale è un processo fondamentale nello sviluppo del neocortex. Le mutazioni in geni che influenzano diverse fasi di questo processo possono causare gravi malformazioni corticali, tra cui lissencefalia e della sostanza bianca eterotopia 1, 2. Recentemente abbiamo mostrato che Bcl11a, che si esprime nei giovani neuroni di proiezione corticale migratori, svolge un ruolo nella migrazione radiale. Abbiamo utilizzato l'imaging confocale dei migratori neuronali in fettine acute corticali di cervelli elettroporati per dimostrare direttamente che la delezione genica di Bcl11a nei neuroni migratori provoca polarizzazioni e difetti di migrazione. La serie di Time-lapse è stata utilizzata per tracciare i percorsi migratori dei singoli neuroni e calcolare parametri specifici dei neuroni migranti, inclusi i profili di velocità, la velocità di migrazione media e la direzione migratoria 10 .

Questo protocollo descrive un approccio importante quando studia la molecolaR in migrazione radiale. Utilizzando brevi brecciati RNA o plasmidi di espressione di DNA, quasi tutti i generi di interesse possono essere abbattuti o sovraespressi, rispettivamente. È un approccio potente per combinare l'elettroporazione con il sistema Cre-LoxP. La trasfezione dei cervelli di topi mutanti condizionati ("floxed") con Cre ricombinasi genera una situazione di mutante mosaico e consente l'analisi selettiva di singoli neuroni mutanti circondati da cellule di tipo selvatico. In questo modo, i meccanismi molecolari autonomi delle cellule nei neuroni migranti possono essere studiati. Inoltre, esperimenti di salvataggio funzionale sono facilmente eseguiti. La preparazione di una serie di fasce cerebrali elettroporate permette di analizzare in modo dinamico i comportamenti migratori dei singoli neuroni migratori, che fornisce molte più informazioni di quanto possa essere ottenuto dalle sezioni fisse del cervello. Nell'utero electroporation 3 , 4 richiede formazione iniziale ma - una volta masterizzato - è unTecnica veloce e diretta per trasfigurare in modo riproduttivo i neuroni della corteccia cerebrale in vivo . Nel protocollo qui descritto abbiamo usato in utero elettroporazione a E14.5, quando i neuroni corticali di proiezione di livello superiore tardo-nati sono nati. Per lo studio dei neuroni di proiezione profondo strato primi nati in utero elettroporazione deve essere eseguita sul precedente fase di sviluppo (cioè E12.5) 13. In linea di principio, il protocollo può essere utilizzato anche per studiare la migrazione di altre sottopopolazioni neuronali nel cervello che possono essere trasfettate con elettroporazione, compresa la migrazione di interneuroni 14 e di cellule cerebrali cerebrali 15 .

Il protocollo di coltura della fetta che descriviamo è stato adattato da Polleux e Gosh 12 e precedentemente, l'abbiamo usata per l'elettroporazione ex utero 16 , 17 a stuDue sviluppo ippocampale. Soprattutto, le fette del cervello devono essere gestite con cura durante tutta la procedura per mantenere la loro vitalità. Utilizziamo un microscopio invertito e piatti di fondo in vetro ottico di qualità per rappresentare la coltura della fetta poggiata su un inserto di coltura cellulare. Questa configurazione è molto facile da installare e permette condizioni sterili, in quanto l'obiettivo non entra mai in contatto con la cultura della fetta o il mezzo. Tuttavia, sono necessari obiettivi di lunga distanza di lavoro (> 2 mm) con apertura numerica sufficientemente elevata (0,6 o superiore). Altri studi hanno messo la fetta del cervello direttamente sul fondo del vetro e hanno utilizzato una matrice di collagene 18 , 19 per fissare la fetta in posizione, rendendo possibile l'utilizzo di obiettivi con una distanza di lavoro più breve possibile. Tuttavia, utilizzando gli inserti della coltura cellulare fornisce risultati facili da gestire e riproducibili e consente al ricercatore di immaginare le fette anche da 1 a 2 giorni dopo la loro preparazione senza coImmaginando la vitalità della fetta del cervello (dati non mostrati). Un'altra questione critica riguarda il danneggiamento delle fette con luce laser. Abbiamo utilizzato un rivelatore ibrido altamente sensibile, che ci ha permesso di ridurre al minimo il potere laser, pur ottenendo ancora sufficienti segnali fluorescenti per la scansione temporale. L'utilizzo di immagini multifotografiche riduce ulteriormente il fotodamage e consentirebbe una penetrazione più profonda del tessuto così come un'efficace rilevazione della luce rispetto alla microscopia convenzionale confocale.

Nonostante la sua utilità per studiare la migrazione neuronale, il protocollo ha limitazioni e non può interamente preservare la situazione dei neuroni migranti nel cervello intatto. La matrice extracellulare, i contatti intercellulari adesivi e la vasculatura all'interno della zona migratoria possono influenzare dinamicamente i neuroni radiali migratori 20 , 21 . In particolare, i neuroni del livello superiore dipendono da processi allargati radiali allungati perLa loro migrazione 22 . Per un'immagine di successo, è quindi importante selezionare le fettucce del cervello con le cellule gliali radiali elettroporlate GFP che estendano i loro processi attraverso l'intera larghezza corticale. Le "fette oblique", in cui l'impalcatura radiale degli iali è stata tagliata prima di raggiungere la superficie del piolo del cervello, dovrebbero essere scartati da ulteriori analisi. A volte, la morte cellulare può verificarsi sulla superficie dell'aria della fetta del cervello, che limita l'acquisizione di immagini in una regione più profonda all'interno del campione. I neuroni elettroporati in fette cerebrali coltivate possono migrare in modo meno efficiente rispetto ai neuroni elettroporati in vivo , che possono essere causati da una insufficiente ripresa dalla preparazione. Ciò richiede l'analisi di più culture di fetta per le situazioni sperimentali e di controllo e l'interpretazione critica di set di dati rappresentativi. In alcuni casi gli insulti associati all'elettroporazione utero possono causare morte embrionale o alterazioni strutturaliIoni del cervello, compresi i ventricoli ingranditi, la corteccia asimmetrica ombreggiata o una formazione di cicline gliale risultante dall'iniezione del DNA. In questi casi, il campione dovrebbe essere scartato da ulteriori analisi.

Mentre le fette del cervello da donatori embrionali sopravvivono bene sugli inserti a membrana 23 , le analisi sono limitate a eventi di sviluppo iniziali, inclusa la migrazione neuronale, e non l'abbiamo usata per studiare eventi successivi, come lo sviluppo del dendrite o la sinaptogenesis. In sintesi, forniamo un protocollo dettagliato per studiare direttamente e dinamicamente la migrazione neuronale dei neuroni elettroporati nelle colture di fetta, che possono essere facilmente adattate per analizzare le funzioni dei geni coinvolti nei disturbi neurodevelopmentali.

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Disclosures

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Acknowledgements

Ringraziamo Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka e Matthias Toberer per un'ottima assistenza tecnica, nonché Victor Tarabykin per discussioni utili. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft a SB (BR-2215).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
isoflurane Abbott Laboratories  506949 Forene
6-well plate Corning 351146
12-well plate Corning 351143
non-absorbable surgical suture Ethicon K890H 3/8 circle, 13 mm, taper point
Micro Adson Forceps Fine Science Tools 11018-12 serrated, length: 12 cm
fine scissors Fine Science Tools 14063-09 angled to side, length: 9 cm
Mathieu Needle Holder Fine Science Tools 12510-14 tungsten carbide, length: 14 cm
fine tipped forceps Fine Science Tools 11370-40 straight, 11 cm
Vannas Tübingen Spring Scissors Fine Science Tools 15005-08 angled up, 9.5 cm
ring forceps Fine Science Tools 11103-09 OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm
HBSS (10X) Gibco 14180046
L-Glutamine Gibco 25030081
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
horse serum Gibco 26050088
BME Gibco 41010026
borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus 30-0016 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm
anesthsesia system Harvard Apparaus 72-6471
anesthetizing chamber Harvard Apparaus 34-0460
fluosorber filter canister Harvard Apparaus 34-0415
low melting point agarose Invitrogen 16520100
vibrating blade microtome Leica VT1200 S
fluorescence stereo microscope Leica M205 FA
stereo microscope Leica M125
inverted fluorescence tissue culture microscope Leica DM IL LED
confocal laser scanning microscope Leica TCS SP5II
hybrid detector Leica HyD
objective, 40x/0.60 NA Leica 11506201
microscope temperature control system Life Imaging Services Cube, Brick & Box
cell culture insert Millipore PICM0RG50
microgrinder Narishige EG-45 use 38° angle for beveling
microinjector Parker Hannifin  052-0500-900 Picospritzer III
carprofen Pfizer Animal Health NDC 61106-8507 Rimadyl
emdedding mold Polysciences 18986-1
endotoxin-free plasmid maxi kit Qiagen 12362
fast green Sigma F7252
laminin Sigma L2020
poly-L-lysine Sigma P5899
HEPES Sigma H4034
D-glucose Sigma G6152
calcium chloride Sigma C7902
magensium sulfate Sigma M2643
sodium bicarbonate Sigma S6297
square wave electroporator Sonidel CUY21EDIT
tweezers with 5 mm platinum disk electrodes Sonidel CUY650P5
micropipette puller Sutter Instrument P-97
box filament Sutter Instrument FB255B 2.5 mm x 2.5 mm
micro-spoon spatula VWR 231-0191 185 mm x 5 mm
glass bottom dish, 50 mm World Precision Instruments FD5040-100

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References

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