L'imagerie confocale temporelle des neurones migrateurs dans la culture de tranches organotypiques du cerveau embryonnaire de souris en utilisant

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Ce protocole fournit des instructions pour l'observation directe des neurones corticaux migrant radialement. L' électroporation in utero , la culture de tranche organotypique et l'imagerie confocale temporelle sont combinés pour étudier directement et dynamiquement les effets de la surexpression ou la régulation négative des gènes d'intérêt dans les neurones migrateurs et d'analyser leur différenciation au cours du développement.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (125), e55886, doi:10.3791/55886 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

L' électroporation in utero est une approche rapide et puissante pour étudier le processus de migration radiale dans le cortex cérébral du développement d'embryons de souris. Il a aidé à décrire les différentes étapes de la migration radiale et à caractériser les mécanismes moléculaires qui contrôlent ce processus. Pour analyser directement et dynamiquement les neurones migrateurs, ils doivent être tracés dans le temps. Ce protocole décrit un flux de travail qui combine l' électroporation utérotique avec la culture de tranche organotypique et l'imagerie confocale temporelle, ce qui permet un examen direct et une analyse dynamique des neurones corticaux migrant radialement. En outre, une caractérisation détaillée des neurones migrateurs, tels que la vitesse de migration, les profils de vitesse, ainsi que les changements d'orientation radiale, est possible. La méthode peut facilement être adaptée pour effectuer des analyses fonctionnelles de gènes d'intérêt pour la migration radiale des neurones corticaux par perte et gain de fonction ainsi que des expériences de sauvetage. Laps de tempsL'imagerie des neurones migrateurs est une technique de pointe qui, une fois établie, est un outil puissant pour étudier le développement du cortex cérébral dans les modèles de souris des troubles de la migration neuronale.

Introduction

Le néocortex est le principal site de fonctions cognitives, émotionnelles et sensoriomotrices. Il est composé de six couches horizontales orientées parallèlement à la surface du cerveau. Au cours du développement, les cellules progénitrices dans la paroi latérale du télencephalon dorsal donnent lieu à des neurones de projection qui migrent radialement vers la surface du pial et qui acquièrent une identité neuronale spécifique au type de couche. Après avoir été généré dans les zones ventriculaires / subventriculaires (VZ / SVZ), ces neurones deviennent transitoirement multipolaires et ralentissent leur migration. Après un court séjour dans la zone intermédiaire (IZ), ils passent à une morphologie bipolaire, attachent à l'échafaudage radial et poursuivent une migration orientée radialement vers la plaque corticale (CP). Après avoir atteint leur cible finale, les neurones se détachent des processus de glande radiale et acquièrent une identité spécifique de la couche. Les mutations dans les gènes affectant différentes étapes de la migration neuronale peuvent causer de graves malformations corticales, telles que lissencL'hétérotopie de l'ephalie ou de la matière blanche 1 , 2 .

L' électroporation in utero est une technique rapide et puissante pour transfecter des cellules progénitrices neurales dans le cerveau en développement d'embryons de rongeurs 3 , 4 . Avec cette technique, il est possible de supprimer et / ou de surexprimer les gènes d'intérêt afin d'étudier leurs fonctions dans le développement des neurones. Cette méthode a spécifiquement aidé à décrire les détails morphologiques et à caractériser les mécanismes moléculaires du processus de migration radiale 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Les neurones qui migrent radialement subissent des changements dynamiques dans la forme de la cellule, la vitesse de migration, ainsi que la direction migratoire, qui nécessitent une observation directe et continue au fil du temps. Cultivé en tranches organotypiquesL'imagerie confocale à temps réel et temporelle des cerveaux électroporés permet d'observer directement les neurones migrateurs dans le temps. En utilisant cette approche combinée, il est possible d'analyser des caractéristiques distinctes des neurones migrateurs qui ne peuvent pas être étudiées dans des coupes fixes de tissus de cerveaux électroporés.

Nous avons récemment appliqué l'imagerie confocale temporelle des neurones migrateurs dans les cultures en tranche de cerveaux électroporés pour étudier le rôle du facteur de transcription CLL / lymphome 11a (Bcl11a) pendant le développement cortical 10 . Bcl11a s'exprime chez les jeunes neurones corticaux migrateurs et nous avons utilisé un allèle Bcl11a mutant conditionnel ( Bcl11a flox ) 11 pour étudier ses fonctions. L'électroporation de Cre recombinase avec la protéine fluorescente verte (GFP) dans les progéniteurs corticaux des cerveaux Bcl11a flox / flox nous a permis de créer une situation de mutant de mosaïque, dans laquelle seulement quelques cellules sont mutées dans unSinon un arrière-plan de type sauvage. De cette façon, il était possible d'étudier les fonctions autonomes de cellules de Bcl11a au niveau de cellule unique. Nous avons constaté que les neurones mutants Bcl11a affichent une vitesse réduite, des changements dans leurs profils de vitesse, ainsi que des changements d'orientation aléatoires pendant leur migration 10 . Dans le protocole décrit, nous décrivons un flux de travail pour l'élimination réussie de l'électroporation et la préparation des cultures en tranche 12 du cerveau de la souris, ainsi que l'imagerie confocale temporelle des cultures corticales en tranches.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité du bien-être animal (Regierungspräsidium Tübingen) et effectuées conformément à la loi allemande sur le bien-être animal et à la directive européenne 2010/63 / UE.

1. Dans Utero Electroporation

  1. Aiguilles de micro-injection
    1. Tirez les capillaires en verre de borosilicate (diamètre extérieur: 1,0 mm, diamètre intérieur: 0,58 mm, longueur: 100 mm) dans des aiguilles de micro-injection à l'aide d'un extracteur à micropipettes avec un filament de boîte (2,5 mm x 2,5 mm) et le programme suivant: HEAT: 540, PULL : 125, VELOCITY: 20, et DELAY: 140. Déterminez la valeur HEAT pour chaque filament individuel en effectuant un test RAMP (HEAT value: RAMP + 25).
    2. Aiguilles à biseau à un angle de 38 ° et vitesse de révolution intermédiaire à élevée avec un micro-broyeur pour obtenir une taille de pointe de 20 à 30 μm pour l'injection au jour embryonnaire (E) 13,5 ou plus jeune et de 30 à 40 μm pour l'injection à un embryonnaire plus ancienétapes. Pour le stockage, fixez les aiguilles dans une boîte ou une boîte à pétri avec de l'argile de modélisation pour éviter d'endommager les pointes.
  2. Solution d'ADN plasmidique
    1. Préparer une construction d'ADN plasmidique contenant une protéine rapporteur fluorescente ( p. Ex. GFP) en utilisant un kit de préparation maxi sans endotoxine conformément aux instructions du fabricant.
    2. Diluer la solution d'ADN plasmidique à une concentration finale de 1 à 2 μg / μL dans un tampon Tris-EDTA sans endotoxine contenant Fast Green à une concentration finale de 0,01%. Solution aliquote et entreposez à -20 ° C.
  3. Solution de chlorothérapie isotopique
    1. Préparer une solution bactériostatique de chlorure de sodium en ajoutant de l'alcool benzylique à une concentration finale de 0,9% à une solution isotonique à 0,9% de chlorure de sodium. Solution de filtre stérile immédiatement avant utilisation.
  4. Solution d'injection de Carprofène
    1. Préparer la solution d'injection de carprofène parEn ajoutant du carprofène à une concentration finale de 0,5 mg / ml dans une solution stérile isotonique à 0,9% de chlorure de sodium. Conservez à 4 ° C jusqu'à 28 jours.
  5. Anesthésie, injection d'ADN et électroporation
    1. Peser une souris enceinte temporaire E14.5 et la placer dans une chambre d'anesthésie transparente reliée à un vaporisateur et saturée d'isoflurane à 5%. Lorsque l'animal est inconscient, transférez-le à un masque anesthésiant attaché à une plaque chauffante de 37 ° C et conservez-le anesthésié avec 1,8 à 2,2% d'isoflurane.
      Note: Évaluer le développement de l'anesthésie chirurgicale par perte du pincement de la queue et des réflexes des pédales (pincement du pied).
    2. Pour l'analgésie, injecter 100 μL de solution d'injection de carprofène par 10 mg de poids corporel de souris (5 mg / kg de poids corporel) par voie sous-cutanée. Tournez la souris vers l'arrière et recouvrez soigneusement les yeux avec de la vaseline afin de les empêcher de sécher.
    3. Étendez doucement les membres et réparez-lesÀ la plaque chauffante avec un ruban chirurgical. Stériliser l'abdomen avec de l'éthanol à 70% puis une solution d'iode (7,5 mg / ml) en utilisant des écouvillons de cellulose. Répétez cette procédure trois fois pour assurer une bonne désinfection.
    4. Couvrir l'abdomen avec de la gaze stérile dans laquelle une incision a été coupée pour retirer un champ (diamètre: 2 à 2,5 cm) pour l'incision abdominale. Humidifiez la gaze avec une solution bactériostatique de chlorure de sodium.
      Attention: réévaluer le développement de l'anesthésie chirurgicale par la perte du réflexe du pédale.
    5. À l'aide de la Forceps Micro Adson (dentelée, longueur: 12 cm) et des ciseaux fins (angulés au côté, longueur: 9 cm), couper la peau d'environ 1,5 cm le long de la ligne médiane de l'abdomen. Couper le muscle sous-jacent le long de la lignea alba.
    6. Enlevez une corne utérine avec une pince à anneaux (longueur: 9 cm, diamètre extérieur: 3 mm, diamètre intérieur: 2,2 mm) et placez-la doucement sur la gaze humide.
      Attention: Tenez la corne utérine avec une pince à anneaux uniquement entre embryons etD ne pas perturber les placentas ou les navires d'approvisionnement. Gardez l'utérus humide en tout temps avec une solution bactériostatique de chlorure de sodium.
    7. Positionnez soigneusement un embryon avec une pince à anneaux et localisez le ventricule latéral, qui se présente comme une ombre en forme de croissant parallèle au sinus sagittale. Le site d'injection est approximativement au milieu d'une ligne entre l'oeil pigmenté et la confluence des sinus, où le sinus sagittal se ramifie vers deux sinus transversaux. Pousser l'aiguille de micro-injection à travers la paroi utérine et dans le ventricule latéral.
      Remarque: Si nécessaire, la profondeur de l'injection peut être corrigée par rétraction de l'aiguille.
    8. Injecter 1 à 2 μl de solution d'ADN dans le ventricule latéral avec un micro-injecteur, qui fonctionne avec une pédale, en utilisant les réglages suivants: 25 psi, 10 à 20 ms par impulsion et 5 à 10 impulsions. L'injection réussie peut être surveillée par la solution d'ADN colorée, qui doit compléter le système ventriculaire.
    9. Placez les électrodes de type pincée (diamètre 3 mm pour E13,5 ou moins et 5 mm de diamètre pour E14,5 ou plus) de telle sorte que la borne «positive» se trouve du même côté que le ventricule injecté et le «négatif» Le terminal se trouve du côté opposé du ventricule injecté sous l'oreille de la tête de l'embryon.
    10. Humidifiez le site d'électroporation avec quelques gouttes de solution bactériostatique de chlorure de sodium et appliquez 5 impulsions de courant électrique (35 V pour E13,5 ou moins et 40 V pour E14,5 ou plus) de 50 ms avec des intervalles de 950 ms.
      Remarque: Les courants de 60 à 90 mA sont généralement suffisants pour une électroporation réussie. Les courants inférieurs ne transfèrent pas efficacement les neurones, tandis que les courants plus élevés peuvent entraîner une mort embryonnaire.
    11. Répétez la procédure (cf Étape 1.5.7 à 1.5.10.) Pour chaque embryon de la corne utérine et placez-la délicatement dans la cavité abdominale.
    12. Retirez la corne utérine de l'autre côté et répétez le procDécrit à l'étape 1.5.7. À 1.5.11.
    13. Fermez la cavité abdominale en suturant la couche musculaire avant de suturer la peau en utilisant MicroAdson Forceps, titulaire d'aiguille Mathieu (carbure de tungstène, longueur: 14 cm) et suture chirurgicale non absorbable (3/8 cercle, 13 mm, point conique).
      Attention: veillez à ne pas capturer l'utérus ou tout autre organe pendant la suture.
    14. Désinfectez soigneusement la suture de la peau avec une solution d'iode (7,5 mg / ml) et retirez doucement l'excès périoculaire de la vaseline en utilisant des écouvillons de cellulose. Placez la souris sous une lampe infrarouge jusqu'à ce qu'elle se réveille. Surveillez attentivement la souris au cours des deux prochains jours. Répétez le traitement par analgésie comme décrit à l'étape 1.5.2 après 12 à 24 h.

2. Culture de coupe organotypique

  1. Laminin Stock Solution
    1. Dissoudre 1 mg de laminine lyophilisée dans de l'eau stérile pour obtenir une solution mère de laminine 1 mg / mL. Préparer des aliquotes de 50 μL aNd à -80 ° C.
  2. Solution de stockage de poly-L-Lysine
    1. Dissoudre 50 mg de poly-L-lysine dans de l'eau stérile pour obtenir une solution mère de 1 mg / ml de poly-L-lysine. Préparer des portions aliquotes de 0,5 mL et conserver à -20 ° C.
  3. Complétez la solution de sel équilibré de Hank (Complete HBSS)
    1. Préparer le HBSS complet en combinant 50 mL de solution 10x HBSS, 1.25 mL de tampon HEPES 1 M (pH 7.4), 15 mL de solution 1-M de D-glucose, 5 mL de solution 100 mM de chlorure de calcium, 5 mL de sulfate de magnésium 100 mM Solution, et 2 ml de solution de sodium à 1 M d'hydrogénocarbonate. Ajouter de l'eau stérile jusqu'à 0,5 L, filtre stérile, et conserver à 4 ° C.
  4. Slice Culture Medium
    1. Combinez 35 ml d'Eagle moyen basique (BME), 12,9 ml d'HBSS complet (cf section 2.3.1.), 1,35 ml de D-glucose 1 M, 0,25 ml de L-glutamine 200 mM et 0,5 mL de pénicilline-streptomycine à Obtenir 50 ml de culture en tranchemoyen. Filtre stérile et ajouter du sérum de cheval à une concentration finale de 5%. Conservez à 4 ° C jusqu'à 4 semaines.
  5. Solution d'agarose à faible point de fusion (LMP)
    1. Préparez une solution à 3% de LMP agarose en dissolvant 1,5 g d'agarose LMP dans 50 ml d'HBSS complet en chauffant dans un four à micro-ondes pendant 1 à 2 minutes à puissance intermédiaire.
      Remarque: Surveiller soigneusement la chaleur pour éviter le débordement pendant l'ébullition.
    2. Mettre la solution dans un bain d'eau à 38 ° C jusqu'à ce qu'elle soit prête à l'emploi. Conserver à 4 ° C et réutiliser une fois.
  6. Revêtement des inserts membranaires
    1. Ajouter une partie aliquote de la solution mère de laminine (cf étape 2.1.1.) Et une aliquote de solution mère de poly-L-lysine (cf étape 2.2.1) à 6 mL d'eau stérile pour obtenir une solution de revêtement (assez pour 6 inserts) .
    2. Placez les inserts de membrane dans une plaque de 6 puits contenant 2 ml d'eau stérile dans le fond de chaque puits. Ajouter 1 ml de solution de revêtement(Cf Étape 2.6.1.) Au-dessus de chaque membrane et incuber pendant une nuit à 37 ° C et 5% d'atmosphère de dioxyde de carbone.
      Remarque: N'utilisez que des inserts avec des membranes optiquement nettes, telles que la membrane de polytétrafluoroéthylène (PTFE).
    3. Laver les membranes trois fois avec 1 mL d'eau stérile et sécher. Utilisez les membranes revêtues le même jour ou rangez-les dans une assiette propre de 6 puits à 4 ° C pendant 4 semaines maximum.
  7. Dissection et incorporation de cerveau
    1. Deux jours après l'électroporation, placez la souris dans une chambre transparente reliée à un vaporisateur et saturée avec 5% d'isoflurane. Lorsque l'animal est inconscient, retirez-le de la chambre et sacrifiez-le par dislocation cervicale.
    2. Retirez l'utérus contenant les embryons et placez-le dans une boîte de Petri de 10 cm avec un HBSS complet glacé.
      Note: À partir de ce moment, conservez toutes les solutions, les embryons et les cerveaux sur la glace.
    3. Utilisez un stéréomicroscope, une pince à pointe fine (droite,11 cm) et une paire de ciseaux à ressort Vannas Tübingen (angulaire, longueur: 9,5 cm) pour séparer chaque embryon de l'utérus et le transférer dans une autre boîte à pétales contenant HBSS complet glacé.
    4. Faire une incision au niveau du tronc cérébral et couper le long de la ligne médiane sagittale. Éloignez la peau et le cartilage qui recouvrent le cerveau. Ensuite, coupez le tronc cérébral juste derrière les hémisphères et retirez le cerveau du crâne. Transférer le cerveau avec une spatule à microcupe (185 mm x 5 mm) dans une plaque de 12 puits contenant un HBSS complet glacé. Recueillir tous les cerveaux de la litière dans la plaque à 12 puits.
    5. Utilisez un stéréomicroscope fluorescent pour filtrer les cerveaux dans la plaque à 12 puits pour la luminosité de fluorescence ainsi que la taille de la région électroporée. Sélectionnez 2 à 4 cerveaux avec des signaux fluorescents lumineux dans le cortex somatosensoriel présumé pour un traitement ultérieur.
    6. Verser une solution d'agarose à 3% de LMP maintenue à 38 ° C dans un moule d'encastrement jetable élastique. EnleverE cerveau de la plaque à 12 puits avec une spatule à microcupe et égoutter soigneusement l'excès de HBSS complet autour du cerveau à l'aide de papier de soie fin.
    7. Placez le cerveau doucement dans la solution d'agarose, poussez-le vers le bas du moule et ajustez-la soigneusement en utilisant une aiguille de calibre 20. Pour les sections coronales, orientez le cerveau avec les ampoules olfactives orientées vers le haut. Gardez le moule sur de la glace jusqu'à ce que la solution d'agarose soit solidifiée et continuez à sectionner le cerveau.
  8. Vibratome Sectioning et Slice Culture
    1. Retirez le bloc d'agarose du moule et placez-le sur le couvercle d'une boîte de Petri stérile. Découper l'excès d'agarose avec une lame de rasoir propre en laissant environ 2 à 3 mm en dessous des ampoules olfactives et 1 mm d'agarose sur les autres côtés. Fixez le bloc d'agarose taillée avec les ampoules olfactives dirigées vers le bas vers un stade de spécimen en utilisant de la colle cyanoacrylate.
      Note: stériliser les instruments et l'équipement avec 70% d'éthanoL avant la section.
    2. Transférez le stade de l'échantillon à la chambre de tranchage d'un microtome à lame vibrante contenant un HBSS complet glacé et positionnez le cerveau avec son côté dorsal vers la lame. Couper des tranches de cerveau de 250 μm d'épaisseur contenant la région électroporée avec une amplitude faible à modérée de 0,9 mm et une vitesse de sectionnement très lente de 0,09 à 0,12 mm / s. Habituellement, 4 à 6 tranches avec un signal fluorescent lumineux sont obtenues à partir de chaque cerveau électroporé avec succès.
    3. Avec une spatule à microcupe courbée et une pince à pointe fine, transférez soigneusement les tranches de cerveau avec l'agarose environnant dans une assiette de 6 puits contenant un HBSS complet glacé.
      Attention: veillez à ne pas endommager le tissu cérébral en touchant seulement la jante d'agarose autour des sections avec la pince pendant le transfert.
    4. Traiter tous les cerveaux sélectionnés comme décrit dans les étapes 2.8.1. À 2.8.3.
    5. Humidifiez les inserts de membrane avec 100 μL d'HBSS complet avant de placer le cerveau slGlace sur les membranes pour faciliter le positionnement des tranches. Jusqu'à 5 tranches peuvent être placées sur 1 insert de membrane.
    6. Transférer soigneusement les tranches sur les membranes à l'aide d'une spatule à microcupe courbée et d'une pince à pointe fine. Retirez délicatement une tranche sur la spatule en appuyant uniquement sur le bord de l'agarose avec la pince et poussez doucement la tranche de la spatule sur la membrane. Placez la tranche à l'aide d'une pince et continuez à transférer les tranches restantes. Retirer l'excès d'HBSS complet avec une pipette.
      Remarque: Ne pas chevaucher les tranches entre elles.
    7. À l'aide des pinces, placez les inserts de membrane avec les tranches dans une plaque de 6 puits contenant 1,8 ml de milieu de culture en tranche (cf Etape 2.4.1) et incube à 37 ° C et 5% d'atmosphère de dioxyde de carbone jusqu'à l'expiration du temps Imagerie.

3. Time-Lapse Imaging

  1. Configuration du microscope
    1. Mettre une chambre climatique placée sur la scène d'unMicroscope confocal inversé à 37 ° C et à 5% d'atmosphère de dioxyde de carbone. Utilisez un détecteur hybride pour réduire l'intensité du laser et améliorer la viabilité cellulaire. Pour une analyse détaillée, utilisez une distance de travail extra-longue 40X objectif sec avec une ouverture numérique de 0,6 ou plus.
      Remarque: Tous les composants du microscope doivent être préchauffés à 37 ° C pendant 2 à 3 heures avant l'imagerie afin de fournir une mise au point stable lors du processus d'imagerie.
  2. Imagerie en tranche
    1. Sélectionnez une tranche de cerveau pour l'imagerie à partir de la plaque à 6 puits contenant les inserts de membrane à l'aide d'un microscope à fluorescence inversée.
      Attention: Évitez le temps d'exposition prolongé à la lumière ultraviolette car cela peut provoquer une photodamaté cellulaire.
      Remarque: Sélectionnez une tranche avec des neurones simples lumineux dans la SVZ supérieure qui migrent radialement vers la surface de la tranche. Les processus fluorescents fins des cellules de gliale radiale qui couvrent l'ensemble du CP indiquent un échafaudage glial radial intact, qui est utiliséD par la migration radiale des neurones corticaux.
    2. Transférer l'insert de membrane avec la tranche, qui a été sélectionnée pour l'imagerie temporelle, dans un plat de fond de verre de 50 mm de diamètre contenant 2 ml de milieu de culture en tranche à l'aide d'une pince. Placez le plat dans la chambre climatique du microscope confocal.
    3. Réglez la résolution sur 512 par 512 pixels et augmentez la vitesse de balayage de 400 Hz à 700 Hz afin d'augmenter la fréquence d'image d'environ 1,4 à environ 2,5 images par seconde, respectivement. N'utilisez pas plus de deux fois la moyenne. Définissez une pile z dans la région électroporée (généralement 400-100 μm) avec une taille de pas de 1,5 μm. Collectivement, ces paramètres permettent une résolution et une luminosité suffisantes de l'image tout en conservant la photodamation faible pendant l'acquisition. Commencez la série time-lapse en prenant une pile z toutes les 30 min.
      Remarque: L'exposition prolongée de la tranche à la lumière laser entraînera une photodamation réduisant la viabilité des cellules. Ajuster l'expTemps d'exposition à la lumière laser en conséquence.
    4. Analysez la série Time-lapse à l'aide du logiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) ou équivalent.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Auparavant, nous avons montré que la suppression génétique de Bcl11a par l' électroporation in uuer altère la migration radiale des neurones de projection de la couche supérieure tardive 10 . L'électroporation d'un vecteur plasmidique d'ADN contenant Cre-IRES-GFP supprimé efficacement Bcl11a dans des cerveaux BCL11a flox / flox conditionnels 11 . Lorsque nous avons analysé le cerveau électroporué E14.5 trois jours après l'électroporation, la plupart des neurones de contrôle ont migré vers le CP, alors que de nombreux neurones mutants Bcl11a ont été bloqués le long de la voie migratoire dans les IZ et VZ / SVZ. En outre, nous avons constaté une augmentation du nombre de cellules multipolaires au détriment des cellules bipolaires spécifiquement dans la délétion IZ sur Bcl11a suggérant des défauts de polarisation 10 .

Analyser directement et dynamiquement MigComportement syntaxique des neurones mutants de Bcl11a , nous avons utilisé l'imagerie confocale temporelle des neurones migrateurs dans une culture de tranche organotypique préparée à partir de cerveaux électroporés. Vue d'ensemble, la série de temporisation à l'aide d'un objectif 10X avec une ouverture numérique de 0,4 a confirmé nos résultats, que les neurones de projection mutants Bcl11a présentent des défauts de migration radiale. Dans les 36 h, de nombreux neurones de contrôle avaient migré vers le CP, alors que peu de neurones mutants Bcl11a avaient quitté le IZ et avaient migré vers le CP. Fait intéressant, il semblait que de nombreux neurones mutants Bcl11a ne migrent pas directement vers la surface pial du cerveau, mais ralentissaient la migration et tournaient tangentiellement ou même vers le ventricule (film 1). Pour analyser davantage ces résultats, nous avons généré des séries de temporisation à un grossissement plus élevé en utilisant un objectif 40x avec une ouverture numérique de 0,6. Nos données montrent que les neurones mutants Bcl11a ont échoué à polariser efficacement et à continuer à migrer radialementDans le CP. Dans les 12 h, de nombreux neurones mutants Bcl11a ont échoué à passer d'une morphologie multipolaire à une morphologie bipolaire et ont plutôt projeté et rétracté de nombreux processus dans l'environnement environnant (Movie 2, Figure 1A ).

En outre, nous avons tracé les chemins de migration des neurones individuels dans différentes séries de temporisation et les avons utilisés pour calculer des paramètres spécifiques des neurones migrateurs. Nous avons constaté que les neurones mutants Bcl11a subissaient de façon répétitive des phases de plusieurs heures de durée avec une vitesse de migration réduite et des changements d'orientation aléatoire (film 3, figure 1B , pointes de flèche rouges). En particulier, le profil de vitesse des neurones mutants Bcl11a a été déplacé de la plus haute vitesse (25 μm / h) vers une vitesse inférieure (5 μm / h) par rapport aux neurones témoins ( figure 1C ). Conformément à cela, la vitesse de migration globale de Bcl11Un neurone mutant a été considérablement réduit de 10,34 ± 0,34 μm / h dans les témoins à 6 ± 0,54 μm / h (p = 2,4889E-05) ( figure 1D ). Enfin, l'écart par rapport à la migration dirigée vers la surface pial du cerveau a été considérablement augmenté de 17,15 ± 2,13 ° en contrôle à 40,16 ± 4,42 ° dans les neurones mutants Bcl11a (p = 0,0002) ( figure 1E ). Ensemble, ces résultats démontrent que l'imagerie confocale temporelle des neurones GFP électroporés dans la culture de tranche organotypique est une méthode précieuse pour étudier les mécanismes moléculaires contrôlant le processus de migration neuronale.

Film 1
Film 1: Migration du contrôle marqué GFP par rapport aux neurones mutants Bcl11a dans les tranches corticales. Les cerveaux Bcl11a flox / flox ont été électroporés auE14.5 avec un vecteur plasmidique contenant IRES-GFP (A) ou Cre-IRES-GFP (B) et des cultures en tranche ont été préparés à E16.5. VZ / SVZ; Zones ventriculaires / subventriculaires; IZ, zone intermédiaire; CP, plaque corticale. Barre d'échelle = 100 μm. Le film comprend 108 images au taux de 5 images / s. Réimprimé de Wiegreffe et al. 10 avec l'autorisation d'Elsevier. Cliquez ici pour voir cette vidéo. (Cliquez avec le bouton droit de la souris pour télécharger.)

Movie 2
Film 2: Polarisation d'un contrôle étiqueté GFP par rapport aux neurones mutants Bcl11a dans les tranches corticales. Les cerveaux Bcl11a flox / flox ont été électroporés à E14.5 avec un vecteur plasmidique contenant IRES-GFP (A) ou Cre-IRES-GFP (B) et des cultures en tranche Ont été préparés à l'E16.5. Barre d'échelle = 10 μm. Le film comprend 25 images au rythme de 5 images / s. Réimprimé de Wiegreffe et al. 10 avec l'autorisation d'Elsevier. Cliquez ici pour voir cette vidéo. (Cliquez avec le bouton droit de la souris pour télécharger.)

Film 3
Film 3: traces animées avec 1 h de résolution d'intervalle de contrôle représentatif et de neurones mutants Bcl11a . Des traces de neurones migrateurs ont été obtenues à partir d'une série de cultures en tranches E16.5 de cerveaux Bcl11a flox / flox qui ont été électroporées à E14.5 avec un vecteur plasmidique contenant IRES-GFP ( A ) ou Cre-IRES-GFP ( B ) . Barre d'échelle = 20 μm. Réimprimé de Wiegreffe et al.> 10 avec la permission d'Elsevier. Cliquez ici pour voir cette vidéo. (Cliquez avec le bouton droit de la souris pour télécharger.)

Figure 1
Figure 1: Comportement migratoire des neurones corticaux de la couche supérieure mutante Bcl11a .
( A ) Des images représentatives des neurones positifs GFP migrateurs dans E16.5 coupent des cultures à partir de cerveaux Bcl11a flox / flox électroporés à E14.5 avec Cre-IRES-GFP ou un vecteur de contrôle pendant une période d'imagerie totale de 12 h. ( B ) Traces représentatives avec une résolution d'intervalle de 1 heure des neurones positifs GFP migrateurs dans E16.5 cultures en tranche à partir de cerveaux Bcl11a flox / flox électroporés à E14.5 avec Cre-IRES-GFP ou un vecteur de contrôle sur les périodes d'imagerie totales deJusqu'à 22 h. Les neurones mutants de Bcl11a subissent fréquemment des phases répétitives de vitesse de migration réduite et d'orientation modifiée aléatoirement (marquée par des pointes de flèche rouges). ( C ) Profils de vitesse calculés à partir des traces de neurones migrateurs comme montré dans B. ( DE ) Quantification de la vitesse ( D ) et angle de déviation par rapport à l'orientation radiale ( E ) des neurones positifs GFP migrateurs dans E16.5 cultures en tranche de Bcl11a flox / flox Cerveau électroporé à E14.5 avec Cre-IRES-GFP ou un vecteur témoin (n = 15). Moyenne ± sem; Test t de Student; *** p <0,001. Barre d'échelle = 10 μm. Réimprimé de Wiegreffe et al. 10 avec l'autorisation d'Elsevier. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La migration radiale est un processus clé dans le développement de neocortex. Les mutations dans les gènes affectant différentes étapes de ce processus peuvent provoquer des malformations corticales sévères, y compris lissencéphalie et hétérotopie blanche 1 , 2 . Nous avons récemment montré que Bcl11a, qui s'exprime dans les jeunes neurones de projection corticale migratoire, joue un rôle dans la migration radiale. Nous avons utilisé une imagerie confocale temporelle de neurones migrateurs dans des tranches corticales aiguës de cerveaux électroporés pour démontrer directement que la suppression génétique de Bcl11a dans les neurones migrateurs provoque des défauts de polarisation et de migration. Les séries Time-lapse ont été utilisées pour tracer les chemins de migration des neurones individuels et calculer les paramètres spécifiques des neurones migrateurs, y compris les profils de vitesse, la vitesse moyenne de migration et la direction migratoire 10 .

Ce protocole décrit une approche importante lors de l'étude de moléculesR mécanismes de migration radiale. En utilisant des plasmides d'expression d'ARN ou d'ADN à courte épingle à cheveux, presque tous les gènes d'intérêt peuvent être renversés ou surexprimés, respectivement. C'est une approche puissante pour combiner l'électroporation avec le système Cre-LoxP. La transfection de cerveaux de souris mutantes conditionnelles ("floxed") avec Cre recombinase génère une situation de mutant de mosaïque et permet une analyse sélective de neurones mutants uniques entourés de cellules de type sauvage. De cette façon, des mécanismes moléculaires autonomes cellulaires dans les neurones migrateurs peuvent être étudiés. En outre, les expériences de sauvetage fonctionnelles sont faciles à réaliser. La préparation de séries chronologiques de tranches de cerveau électroporées permet d'analyser dynamiquement le comportement migratoire des neurones migrateurs simples, ce qui fournit beaucoup plus d'informations que celles obtenues à partir de sections cérébrales fixes. In utero electroporation 3 , 4 nécessite une formation initiale mais - une fois maîtrisé - est unTechnique rapide et directe pour reproduire de manière reproductible les neurones du cortex cérébral in vivo . Dans le protocole décrit ici, nous avons utilisé l' électroporation de l' utérus chez E14.5, lorsque des neurones de projection néocortical à couche supérieure sont nés. Pour l'étude des neurones de projection de couches profondes initiales dans l' électroporation utero, il faut effectuer une étape de développement antérieure ( c.-à-d. E12.5) 13 . En principe, le protocole peut également être utilisé pour étudier la migration d'autres sous-populations neuronales dans le cerveau qui peuvent être transfectées par électroporation, y compris la migration des interneurones 14 et des cellules granuleuses cérébelleuses 15 .

Le protocole de culture en tranche que nous décrivons était adapté de Polleux et Gosh 12 et, auparavant, nous l'avons utilisé pour l' électroporation ex utero 16 , 17 à stuDy développement de l'hippocampe. Plus important encore, les tranches de cerveau doivent être manipulées avec soin tout au long de la procédure pour maintenir leur viabilité. Nous utilisons un microscope inversé et des plaques de fond de verre de qualité optique pour imaginer la culture en tranche reposant sur un insert de culture cellulaire. Cette configuration est très facile à mettre en place et permet des conditions stériles, car l'objectif n'est jamais en contact avec la culture ou le milieu de tranche. Cependant, des objectifs de longue distance de travail (> 2 mm) avec une ouverture numérique suffisamment élevée (0,6 ou plus) sont nécessaires. D'autres études ont mis la tranche de cerveau directement sur le fond de verre et ont utilisé une matrice de collagène 18 , 19 pour réparer la tranche en place, ce qui rend l'utilisation des objectifs avec une distance de travail libre plus courte possible. Cependant, l'utilisation d'inserts de culture cellulaire fournit une manipulation facile, des résultats reproductibles et permet au chercheur d'imaginer les tranches même 1 à 2 jours après leur préparation sans coOptimisation de la viabilité de la tranche de cerveau (données non représentées). Un autre problème critique concerne l'endommagement des tranches par la lumière laser. Nous avons utilisé un détecteur hybride très sensible, ce qui nous a permis de réduire au minimum le pouvoir laser tout en obtenant suffisamment de signaux fluorescents pour l'imagerie temporelle. L'utilisation de l'imagerie multiphotonique réduirait davantage la photodamation et permettrait une pénétration plus profonde des tissus ainsi qu'une détection de lumière plus efficace par rapport à la microscopie confocale conventionnelle.

Malgré son utilité pour étudier la migration neuronale, le protocole a des limites et ne peut pas conserver entièrement la situation des neurones migrateurs dans le cerveau intact. La matrice extracellulaire, les contacts intercellulaires adhésifs et la vascularisation dans la zone migratoire peuvent influencer dynamiquement les neurones qui migrent radialement 20 , 21 . Plus précisément, les neurones de la couche supérieure dépendent des processus de glande radiale allongée pourLeur migration 22 . Pour une imagerie réussie, il est donc important de sélectionner des tranches de cerveau avec des cellules gliales radiales électroporées GFP qui étendent leurs processus à travers toute la largeur corticale. Les «tranches obliques», dans lesquelles l'échafaudage galique radial a été coupé avant d'atteindre la surface du pie du cerveau, devraient être jetés à partir d'analyses ultérieures. Parfois, la mort cellulaire peut se produire à la surface de l'air de la tranche du cerveau, ce qui limite l'acquisition d'image à une région plus profonde dans l'échantillon. Les neurones électroporés dans des tranches de cerveau cultivées peuvent migrer moins efficacement par rapport aux neurones électroporés in vivo , ce qui peut être dû à une récupération insuffisante de la préparation. Cela nécessite des analyses de cultures de coupes multiples pour des situations expérimentales et de contrôle, et une interprétation critique des ensembles de données représentatifs. Dans certains cas, les insultes associées à l' électroporation in ute peuvent provoquer une mort embryonnaire ou une altération structurelleIons du cerveau, y compris les ventricules agrandis, le cortex asymétriquement éclairci, ou une formation de cicatrice gliale résultant de l'injection d'ADN. Dans ces cas, l'échantillon devrait être écarté d'une analyse plus poussée.

Alors que les tranches de cerveau des donneurs embryonnaires survivent bien sur les inserts membranaires 23 , les analyses sont limitées aux événements de développement précoces, y compris la migration neuronale, et nous ne l'avons pas utilisé pour étudier des événements ultérieurs, comme le développement de la dendrite ou la synaptogenèse. En résumé, nous fournissons un protocole détaillé pour étudier directement et dynamiquement la migration neuronale des neurones électroporés dans les cultures en tranche, ce qui peut être facilement adapté pour analyser les fonctions des gènes impliqués dans les troubles du développement neurologique.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgements

Nous remercions Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka et Matthias Toberer pour une excellente assistance technique, ainsi que Victor Tarabykin pour des discussions utiles. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft à SB (BR-2215).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
isoflurane Abbott Laboratories  506949 Forene
6-well plate Corning 351146
12-well plate Corning 351143
non-absorbable surgical suture Ethicon K890H 3/8 circle, 13 mm, taper point
Micro Adson Forceps Fine Science Tools 11018-12 serrated, length: 12 cm
fine scissors Fine Science Tools 14063-09 angled to side, length: 9 cm
Mathieu Needle Holder Fine Science Tools 12510-14 tungsten carbide, length: 14 cm
fine tipped forceps Fine Science Tools 11370-40 straight, 11 cm
Vannas Tübingen Spring Scissors Fine Science Tools 15005-08 angled up, 9.5 cm
ring forceps Fine Science Tools 11103-09 OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm
HBSS (10X) Gibco 14180046
L-Glutamine Gibco 25030081
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
horse serum Gibco 26050088
BME Gibco 41010026
borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus 30-0016 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm
anesthsesia system Harvard Apparaus 72-6471
anesthetizing chamber Harvard Apparaus 34-0460
fluosorber filter canister Harvard Apparaus 34-0415
low melting point agarose Invitrogen 16520100
vibrating blade microtome Leica VT1200 S
fluorescence stereo microscope Leica M205 FA
stereo microscope Leica M125
inverted fluorescence tissue culture microscope Leica DM IL LED
confocal laser scanning microscope Leica TCS SP5II
hybrid detector Leica HyD
objective, 40x/0.60 NA Leica 11506201
microscope temperature control system Life Imaging Services Cube, Brick & Box
cell culture insert Millipore PICM0RG50
microgrinder Narishige EG-45 use 38° angle for beveling
microinjector Parker Hannifin  052-0500-900 Picospritzer III
carprofen Pfizer Animal Health NDC 61106-8507 Rimadyl
emdedding mold Polysciences 18986-1
endotoxin-free plasmid maxi kit Qiagen 12362
fast green Sigma F7252
laminin Sigma L2020
poly-L-lysine Sigma P5899
HEPES Sigma H4034
D-glucose Sigma G6152
calcium chloride Sigma C7902
magensium sulfate Sigma M2643
sodium bicarbonate Sigma S6297
square wave electroporator Sonidel CUY21EDIT
tweezers with 5 mm platinum disk electrodes Sonidel CUY650P5
micropipette puller Sutter Instrument P-97
box filament Sutter Instrument FB255B 2.5 mm x 2.5 mm
micro-spoon spatula VWR 231-0191 185 mm x 5 mm
glass bottom dish, 50 mm World Precision Instruments FD5040-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
  2. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, (9), 1535-1546 (2012).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, (1), 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, (4), 865-872 (2001).
  5. LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29, (7), 407-413 (2006).
  6. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, (2), 136-144 (2004).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23, (31), 9996-10001 (2003).
  8. Pacary, E., et al. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69, (6), 1069-1084 (2011).
  9. Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Medical Molecular Morphology. 49, (2), 63-75 (2016).
  10. Wiegreffe, C., et al. Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c. Neuron. 87, (2), 311-325 (2015).
  11. John, A., et al. Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development. Development. 139, (10), 1831-1841 (2012).
  12. Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), pl9 (2002).
  13. Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity. Nat Rev Neurosci. 14, (11), 755-769 (2013).
  14. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
  15. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
  16. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  17. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31, (13), 2922-2936 (2012).
  18. Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice. J Neurosci. 29, (49), 15520-15530 (2009).
  19. Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4, (2), 143-150 (2001).
  20. Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 21, (7), 1465-1474 (2011).
  21. Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i32-i41 (2009).
  22. Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128, (1), 29-43 (2007).
  23. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics