반자동 경도 Microcomputed Tomography 기반 정량적 구조 분석 누드 쥐 척추 골절 골다공증 관련 모델의

Bioengineering

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Summary

이 프로토콜의 목표 경도 평가 vivo에 는 반자동된 microcomputed 단층 기반 정량적 구조 분석을 사용 하 여 될 수 있는 누드 쥐 척추 압축 골다공증 관련 골절 모델을 생성 하는 것입니다.

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Shapiro, G., Bez, M., Tawackoli, W., Gazit, Z., Gazit, D., Pelled, G. Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model. J. Vis. Exp. (127), e55928, doi:10.3791/55928 (2017).

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Abstract

골다공증 관련 척추 압축 골절 (OVCFs)는 세계 인구 나가로 보급 증가 함께 일반적이 고 임상 unmet 필요. 동물 OVCF 모델 변환 조직 엔지니어링 전략의 전 임상 개발에 필수적입니다. 다양 한 모델은 현재 존재 하는 동안 단일 누드 쥐에서 여러 높은 재현성 척추 결함을 유도 하는 최적화 된 방법을이 프로토콜에 설명 합니다. 소설 경도 반자동된 microcomputed 단층 촬영 (µCT)-척추 결함의 정량적 구조 분석을 기반으로 또한 선발. 간단히, 쥐 여러 시간 포인트 수술에 몇 군데 있었다. 1 일 검사 표준 위치로 방향도 고 관심의 표준 볼륨 정의 되었다. 각 쥐의 후속 µCT 스캔 했다 동일한 볼륨의 다음 새로운 뼈 형성에 대 한 평가 분석 그래서 하루 1 스캔을 자동으로 등록 됩니다. 이 다재 다능 한 접근 어디 경도 영상 기반 분석 정확한 3 차원 반자동된 정렬에서 혜택을 수 있는 다른 모델의 다양 한 적응 될 수 있다. 함께 찍은,이 프로토콜에서는 골다공증 및 뼈 연구를 위한 쉽게 정량 하 고 쉽게 재현 가능한 시스템을 설명 합니다. 제안 된 프로토콜은 4 개월 누드 ovariectomized 쥐 및 생성, 이미지, 조직 크기와 장비에 따라 두 개의 척추 결함 분석을 2.7 그리고 4 h 사이 골다공증을 유발 합니다.

Introduction

200 백만 이상의 사람들이 전세계 골다공증1에서 고통. 기본 병 적인 감소 뼈 미네랄 밀도 (BMD)에 하 고 변경 된 뼈 마이크로아키텍처 뼈 취약성 및, 따라서, 골절2의 상대 위험 증가. 골다공증은 너무 유행 하 고는 WHO가 정의 그것은 중요 한 공중 위생 관심사는 건강에 해로운. 또한, 세계의 인구는 예상 대로 나이에, 골다공증 되 더 일반적으로 예상 된다.

골다공증성 척추 압축 골절은 가장 일반적인 취약성 골절, 미국에서 1 년 이상 750000 추정. 그들은 많은 중요 한 병 적 상태와 관련 된 9 배 높은 사망률 평가3입니다. 임상 시험에서 현재 사용할 수 외과 개입, vertebroplasty, kyphoplasty, 등 가짜 치료4,5,이 환자에 게 통증 관리만 사용할 수를 떠나 보다 더 더 효과적인 것을 발견 했다. 현재 OVCF 치료 제한 때문에, 장애6,,78을 복제할 수는 동물 모델을 개발 하는 것이 필수적입니다. 현재 치료 방법의 조사와 임상 연습으로 번역할 것 이다 새로운 치료법의 개발에 수 같은 동물 모델을 용이 하 게. 골다공증 유발 되 고 ovariectomy1,,910,11, 와 함께에서 낮은 칼슘 식단 (LCD)의 관리를 통해 모델 동물에서 입은 12 , 13 , 14 , 15. 추가 모델 OVCFs와 관련 된 뼈 손실, 척추 뼈 결함 골다공증성 immunocompetent 쥐 16,17,,1819에 설치 되었다 20,,2122,,2324. 이 작품에서 모델 골다공증 immunocompromised 쥐의 척추 결함 모델 제공 됩니다. 이 새로운 모델은 다양 한 소스와 OVCFs 같은 어려운 골절의 복구에 대 한 종에서 파생 된 줄기 세포 관련 세포 기반 요법 평가 하 사용할 수 있습니다.

뼈 이미징 골절 및 뼈 질병의 평가의 중요 한 부분 이다. 고급 이미징 방법 뼈 구조 변경 및 재생 전략25의 정확한 평가 위해 개발 되었다. 그 중 µCT 이미징 고해상도 3D 이미지를 제공 하는 비-침략 적, 쉬운--사용, 그리고 저렴 한 방법으로 떠오르고 있다. 고해상도 3D 마이크로아키텍처26 다음 양적 분석 수 있는 뼈 제공 µCT 이미징 골다공증 환자 평가에 다른 modalities에 몇몇 이점이 있다. 후자는 다음 사용할 수 있습니다 제안 된 치료의 치료 효과 비교. 실제로, µCT 이미징 vivo에서 척추 결함 재생1,,1627모니터링에 대 한 황금 표준입니다. 그러나, 몇 가지 간행물28,29,,3031 고용 사용자 종속성, 보간 편견, 및 µCT의 정밀도 오류를 최소화 하기 위해 자동화 등록 도구 이미징 기반 분석입니다. 최근에, 우리는이 프로토콜32 에 설명 된 대로, 표준화 된 뼈에서 뼈 재생의 분석을 개선 하기 위해 등록 절차를 사용 하는 첫번째 했다.

여기 설명 하는 방법을 OVCFs에 대 한 새로운 세포 치료의 효과 연구 하는 데 사용 될 수, 방해 받지 않는 호스트에 의해 T 세포 응답을 xenogeneic 또는 수용자 세포를 거부할 수 있습니다. 골다공증은 젊은 쥐 ovariectomy (OVX) 통해과 LCD의 4 개월에에서 유도 된다. OVX 쥐, LCD와 결합의 젊은 나이 있었습니다, 돌이킬 수 없는 뼈 손실을 선도 하 여 폐 경 후 골다공증을 흉내 낸 낮은 피크 뼈 질량에 도달. 이 사실은, LCD 중 리 모델링을 모델링 하는 뼈에서 쥐 전환 나이의 3 달 주변에 상 추33, 위에 골다공증을 유지의 가능성을 증가에 의해 분할 설명 될 수 있다 시간입니다. 젊은 동물을 사용 하 여 게이 모델 보다 비용 효과적인, 그들은 적은 비용으로. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 본질적으로 하지 노화 동물의 생물 학적 변화에 대 한 회계에 의해 제한 됩니다.

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Protocol

모든 동물 실험 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 삼목 시 나이 의료 센터 (프로토콜 # 3609)의 프로토콜에서 수행 했다. 마 취는 모든 이미징 및 수술 절차에 대 한 관리 되었다. 모든 동물 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 보관 되어 있었다.

참고:이 프로토콜의 실험 설계는 그림 1에 표시 됩니다. 그들의 난소를 수술로 제거 하 고 그들을 먹 여 0.01% 칼슘과 0.77% 인산으로 구성 된 LCD와 6 주 된 쥐를 구입. LCD의 4 개월의 기간 후에 네 번째 및 다섯 번째 요 추 척추 기관 (L4-L5) 중요 한 크기 척추 결함 드릴. 수술, 다음 주 1와 주 2, 4, 8, 및 12 결함 설립 후에 쥐를 이미지. 하루 1 스캔에 결함 여백, 표준 위치로 방향을 찾아서 관심 (목소리 야)의 원통형 볼륨을 정의 합니다. 자동으로 해당 주 1 스캔에 대해 정의 된 표준 위치에 각 쥐의 후속 µCT 검사 (, 2, 4, 8, 및 12 주)을 등록 합니다. 하루에 1 미리 목소리 야 등록된 검사에 적용. 볼륨 골밀도 및 명백한 조밀도 내가의 평가.

1. 골다공증의 유도

  1. 0.01% 칼슘과 0.77% 인산으로 구성 된 LCD의 4 개월 6 주 오래 된 athymic ovariectomized 쥐 입었다.
  2. 스위치 다시 정상적인 다이어트.
    참고: 이러한 쥐 것 이다 라고도 " 골다공증성 쥐 "이.

2. 척추 결함 모델

참고: 타이밍은 동물 마다 40-50 분.

  1. 압력솥 모두 수술 전에 수술 도구.
  2. 여러 수술의 경우 모든 수술 도구를 소독.
    1. 도구를 세척 하 고 배치할 sonicator 욕조에 5 분 넣어 뜨거운 비드 소독 기 세트 20 미 허용에 대 한 250 ° c에서 5 분에 대 한 진정 도구에 대 한
  3. 뽑기 마 취.
    1. 장소 유도 실에서 골다공증성 쥐를 마 취 기계 중앙 청소 시스템에 첨부. 100% 산소에 5 %isoflurane 사용 하 여 마 취를 유발 하 고 2-3 %isoflurane 원뿔을 통해 유지. 눈에 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 수 의사 연 고를 사용.
    2. 는 발가락 꼬집어 자극 마 취의 적절 한 평면을 보장 하기 위해 적용 됩니다. 응답을 언급 하는 경우 프로시저 시작.
  4. 마 취 쥐 지 recumbency 난방 패드 (37 ° C)에 놓고 자기 fixator 철회 시스템 ( 그림 2A)를 사용 하 여 팔 다리를 스트레칭.
    참고:가 열 패드의 온도 저체온증, 예방에 대 한 중요 한 마 취 쥐의 체온을 조절할 수 없기 때문.
  5. 쉐이브 전기 면도기를 사용 하 여 복 부 지역. 70% 에탄올 뒤 0.5% 요오드 기반 살 균과 액체 gluconate와 면봉.
  6. 수술 절차를 시작 하기 전에 carprofen (5 mg/kg 체중 (BW), 피하 (SQ))와 쥐를 주입.
  7. 살 균 메스를 사용 하 여 피부를 잘라. 칼 프로세스 아래 1 ㎝ 절 개를 시작 하 고 중간 선 (~ 5-8 cm) ( 그림 2B) 극복.
  8. 수술가 위는 교육을 통해 aponeurosis의 절 개를 사용 하 여 복 부 구멍 ( 그림 2C)에 액세스 하는 알바.
  9. 브래킷으로 ( 그림 2D)를 사용 하 여 복 부 구멍 노출.
  10. 편향 복 부 대동맥과 왼쪽된 신장 ( 그림 2E) 노출 하는 쥐의 오른쪽에 내장. 그것을 폭로 하기 전에 허리 척추를 만져 탈수를 피하기 위해를 사용 하 여 메 마른 젖된 gauzes 멸 균 생리 식 염 수와 내부 장기를 포장.
  11. 층에서 요 추 척추 기관 L4-5의 앞쪽 측면을 노출 하 고 주변 결합 조직 및 근육에서 그들을 격리 사용 thermocautery ( 그림 2F -G).
    참고: Thermocautery는 해 부 동안 출혈 제어 하에 사용 해야 합니다.
  12. L4 척추에서 혈액과 잔여 조직을 제거 하는 멸 균 면봉 멸 균 식 염 수로 포화를 사용 합니다. 살 균 판형 드릴 가시 (지름 ~ 2 mm)를 사용 하 여 척추 체의 노출된 앞쪽 측면의 중앙에 5 m m-깊은 뼈 결함 드릴 (그림 2 H-나).
    참고:만 복 부 피 질과 기본 배수 뼈; 드릴스루 최소한의 압력 등 피 질을 드릴을 하지 마십시오. 참고 골다공증 쥐의 척추는 매우 허약 하다. 면봉을 사용 하 여 결함을 청소 하 고 있는 경우, 출혈을 멈추게 하는 압력을 적용 하.
  13. 쥐 ( 그림 2J) 당 2 결함의 총 만들 L5 척추 골에 반복 단계 2.11.
  14. 복 강 내장 돌아갑니다.
  15. Vicryl 합성 흡수 성 수술 용 봉합을 사용 하 여 (3-0 vicryl 미색 27 " SH 테이퍼) aponeurosis ( 그림 2 K) 봉합에 연속 패턴.
  16. 간단한 중단된 패턴 ( 그림 2 L)에 4-0 monofilament 나일론 비 흡수 봉합 사를 사용 하 여 피부를 닫습니다.
  17. 피부 봉합의 위에 그리고 피부의 완전 한 폐쇄 되도록 그들 사이 국 소 피부 접착제의 적용 100 µ L.
  18. 따뜻한 (37 ℃) lactated 벨 쥐 주입 ' 저체온증과 탈수를 방지 하기 위해 s 솔루션 (1CC/100 g BW, SQ).
  19. 필요에 따라 수술 및 수술 후 통증에 대 한 모든 8-12 h 이전 buprenorphine (0.5 mg/kg BW, SQ)와 쥐를 주입.
  20. 두지 마십시오 동물 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지. 또한, 그것은 완전히 복구 될 때까지 다른 동물의 회사를 수술 겪은 동물을 반환 하지 않습니다.
  21. 동물 난방 패드에 회복 후 돌아가기 그것의 감 금.
    참고: 집 쥐 개별적으로 (즉, 별도 새 장에)는 봉합의 쥐 쥐 절단을 방지 하 여 상처.
  22. 차 우 쥐 음식에 도달 수 있도록 몇 일 수술에 대 한 새 장 바닥에 페 트리 접시에 물에 담가 놓습니다.
  23. Carprofen (5 mg/kg BW, SQ) 통증 모든 24 h에 대 한 수술 24 시간 후 필요에 따라 관리.
  24. 동물 2% 미만 동안 피부 봉합을 제거 isoflurane 마 취 10-14 일 후 작업.

3. MicroCT 스캔

참고: 타이밍은 동물 마다 30 ~ 40 분.

  1. 수술 다음 날에는 마 취 기계 중앙 청소 시스템에 연결 된 유도 실에서 골다공증성 쥐 장소. 100% 산소에 5 %isoflurane 사용 하 여 마 취를 유도 하 고 2-3 %isoflurane 원뿔을 통해 유지.
  2. vivo에서 µCT 스캐너를 사용 하 여 검색 합니다. 뼈 재생의 경도 분석에 대 한 검사를 반복.
    참고: 모든 동물 (즉, x-선 에너지, 매체, 강도, 복 셀 크기와 이미지 해상도 스캔)에 동일한 설정을 사용 하 여 검색을 확인 한 simila에r 방향입니다. 예: x 선 에너지, 55 kVP; 전류, 145 µ A; 복 셀 크기, 35 µ m; 증가, 115 µ m; 그리고 통합 시간, 200 ms; 와 함께 PBS에서 샘플. Bouxtein 외. 참조 추가 설명 및 설치류 µCT 뼈 미세의 평가 대 한 검색에 관련 된 고려 사항에 대 한 34. 이상적으로, 가능한 높은 스캔 해상도 사용 모든 검사; 그러나, 높은 해상도 스캔 긴 수집 시간을 요구, 큰 데이터 세트를 생성 고 동물 더 이온화 방사선을 노출. 후자는 원치 않는 효과 줄된 골절 치유를 포함 하 여 발생할 수 있습니다. 따라서, 추가적인 데이터 및 검색 시간 사이의 거래와 신중 하 게 고려해 야.

4. 척추 분리

참고: 타이밍은 샘플 당 20-30 분.

  1. 그림 3A에서 같이 관심의 척추를 등고선-I. 인접 척추에 속하는 부분을 제외 하는 동안 척추의 모든 부분을 포함 하도록 확인 하십시오.
    1. 클릭 " µCT 평가 프로그램 " 하 고 메뉴에서 샘플을 선택 합니다.
    2. 마우스를 사용 하 여 각 슬라이스에 컨투어.
    3. 사용 된 " Z " 다음 슬라이스로 이동 바.
  2. Contoured 척추를 별도 파일로 저장 ( 그림 3J -K)를 클릭 하 여 " 파일 " → " 저장 GOBJ " 조각 2.

5. 경도 양적 평가 대 한 정의 목소리 야의

참고: 다음 단계 (참조 척추) 수술 후 1 일에서 또는 후속 시간 포인트 (스캔 인지에 따라 달라 집니다 척추를 대상).

  1. 참조 척추.
    참고: 타이밍 샘플 당 20-30 분입니다.
    1. Z-회전, 결함의 센터에서 XY 슬라이스를 사용 하 여 여백의 각도 측정 ( 그림 4A -B).
      1. Z 평면에는 척추 결함이 대부분 명확 하 고 화면 캡처는 척추 골의 영역으로 이동.
      2. 프레 젠 테이 션 소프트웨어에서 결함에 맞는 사각형 모양의 개체를 준비.
      3. 그런 결함 얼굴 위쪽 척추의 이미지를 회전 및 결함 여백은 사각형의 양쪽에 병렬.
      4. 회전의 각도 측정 (이미지를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 → " 형식 그림 " → " 크기 ").
      5. 측정된 각도 사용 하 여 ( 그림 4C) 척추를 회전.
        1. 새로운 DECterm 창을 열고 (" 세션 관리자 " → " 응용 프로그램 " → " DECterm ").
        2. 실행 " ipl ":
        3. Ipl > turn3d
        4. -입력 [in] >
        5. -출력 [out] >
        6. -turnaxis_angles [0.000 90.000 90.000] > 90 90 0
        7. -turnangle [0.000] > 측정된 각도
        8. -img_interpol_option [1] >
    2. X-회전, 결함의 센터에서 YZ-슬라이스를 사용 하 여 여백의 각도 측정 ( 그림 4D -E). 측정된 각도 사용 하 여 ( 그림 4 층) 척추를 회전.
      1. 클릭 " YZ "에 " uCT 평가 프로그램 " 및 반복 단계 5.1.1.1-5.1.1.5.2.
      2. Ipl > isq
      3. -[에] aim_name >
      4. -isq_filename [default_file_name] > 삽입 ISQ 파일 디렉터리 (예: " DK0: [MICROCT. 데이터입니다. GAZIT입니다. MAXIM.80.DAY1]Z2102970입니다. ISQ ")
      5. -pos [0 0 0] >
      6. -희미 한 [-1-1-1] >
    3. ZX 평면 XY-평면을 변경 하 여 회전 된 척추를 플립.
      1. 새로운 DECterm 창을 열고 (" 세션 관리자 " → " 응용 프로그램 " → " DECterm ").
      2. 실행 " ipl ":
      3. Ipl > 플립
      4. -입력 [in] > 밖으로
      5. -입력 [out] > out2
      6. -new_xydir [yz] > zx
    4. 정의 목소리 야.
      1. 무승부는 원형에서 원형 윤곽 아이콘을 선택 하 여 결함의 센터에서 분할 영역을 사용 하 여 결함의 컨투어 " uCT 평가 프로그램 " ( 그림 6A). 등고선을 결함 ( 그림 6B)에서 모든 조각에 그것을 붙여 복사.
        참고: 모든 결함은 동일한 절차를 사용 하 여 생성 된, 이후 분석 조각 하 고, 그 후, 모든 샘플에 대 한 전체 볼륨 (TV)의 동일한 수.
  2. 대상 척추.
    참고: 타이밍 샘플 당 10-20 분입니다. 대상 및 이미지 분석 소프트웨어의 메인 윈도우를 참조 척추의
    1. 부하는 DICOM 파일.
      참고: 회색 음영 값 변화를 피하기 위해, 같은 정의 출력 데이터 형식 로드 메뉴에 원래 DICOM 파일로.
    2. 레지스터 참조에 척추입니다.
      1. 발사는 " 3 차원 복 등록 " 모듈 입력으로 참조 척추는 " 베이스 볼륨 " 고로 대상 척추는 " 일치 볼륨. " 클릭 " 등록 " 척추 등록 ( 그림 5).
    3. 는 등록 된 파일을 사용 하 여 동일한 데이터 형식 및 µCT 환경에 가져올 저장.
    4. 는 목소리 야 적용 됩니다. 클릭 하 여 등록된 대상 척추를 참조 척추에 대해 정의 된
      1. 적용은 목소리 야 " uCT 평가 프로그램 " → " 파일 " → " 부하 GOBJ " 이전에 만든 GOBJ를 선택 하 고. 목소리 야와 결함 동심 되는지 확인 하십시오.

6. MicroCT 분석

참고: 타이밍은 샘플 당 10-20 분.

  1. 보내기 µCT 평가 프로그램 ( 그림 6)를 사용 하 여 평가 대 한 목소리 야.
    참고: 모든 내가 분석할 때 동일한 매개 변수를 사용 하 여 있는지 확인 합니다. 임계값 생략 하는 최소한의 손실 뼈의 배경 잡음을 충분히 높게 설정 되어 있는지 확인 합니다. 방사선 불 투과성 소재를 사용 하는 경우 다양 한 전략 뼈 형성 분석에 사용 될 수 있습니다. 소재 및 뼈 조직 밀도 차이 경우는 소재 35 , 36 개 세그먼트 수 있습니다. 그렇지 않으면, 조사 실험 그룹 사이 뼈 형성에 차이 평가 질적 수.

7. 안락사

  1. PPlace 골다공증성 쥐 유도 실에서 마 취 기계에 연결. 100% 산소를 사용 하 여 5 %isoflurane 마 취 유도.
  2. 코 콘을 통해 마 취를 유지 하 고 안락사를 수행 incising 양자 매 37 생산 하 흉으로.

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Representative Results

이 프로토콜을 사용 하 여, 하나 이미지 수와 n의 재생성을 계량 다른 시간 지점에서 8 모델된 골다공증성 척추 결함을 =. 등록 절차에 의해 얻은 해부학 경기 모든 시간 지점에서 동일한 목소리 야의 분석에 대 한 수 있습니다. 이 원래 결함의 여백은 더 이상 인식할 수 있는 경우에 정확한 경도 3D histomorphometric 분석 결과. 우리는 뼈 재생 (그림 7)의 경도 평가 대 한 예를 들어 5 시간 포인트 (1 일, 2 주, 4 주, 주 8, 및 12 주)을 사용. 재생 ( 그림 7A에서 그림)로 3D 영상과 2D 횡단면의 질적 평가 뼈 수량 (BVD) 및 품질 (광고) (그림 7B)의 양적 비교 하 여 평가할 수 있습니다. 새로 형성된 된 뼈에 대 한 다음과 같은 형태학 인덱스를 확인할 수 있습니다: (i) TV, 뼈 및 소프트-조직 볼륨 (TV, m m3);를 포함 하 여 (ii) 양의 광물 화 된 조직 (BV, m m3); (iii) 골밀도 볼륨 (BV/텔레비젼); 그리고 (iv) 뼈 미네랄 밀도 (BMD, cm3당 mg hydroxyapatite). 특히, 최소한의 골 형성 (골밀도 볼륨 5% 증가) 결함 설립 후 2 주 동안 관찰 되었다. 2 주 후, 뼈 형성에 중요 한 차이가 나중 시간 포인트에 비교 될 때 관찰 되었다. 전반적으로, 어느 정도의 주 8에 의해 약 10%를 뾰족해지고, 뼈 형성 되었지만 시간이 지남에 void 뼈를 유지 하기 위해 충분히 최소한의 이었다.

Figure 1
그림 1: 프로토콜 디자인. 프로토콜의 주요 단계에 설명 되어 있습니다. 첫째, ovariectomized 낮은 칼슘 식단 (LCD)의 4 개월을 복종 된 누드 쥐 두 요 추 척추 기관에서 표준 크기의 중요 한 결함을 만들에 따라 운영 했다. 쥐 주 1와 2, 4, 8, 및 12 주 수술에 몇 군데 있었다. 1 일 검사 표준 위치로 방향도 이었고 원통형 목소리 야 결함 여백 사용 하 여 정의 되었다. 각 쥐의 후속 µCT 검사는 해당 주 1 스캔에 대해 정의 된 표준 위치에 자동으로 등록 되었다. 하루 1 미리 정의 된 목소리 야 후 등록된 검사에 적용 했다. 볼륨 골밀도는 목소리 야의 명백한 조밀도 새로운 뼈 형성을 평가 하기 위해 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 척추 결함 수술. 척추 결점의 외과 생성에 중요 한 단계는 설명 됩니다. 먼저, 쥐가 열 패드 (A)에 배치 했다. 중간 절 개를 통해 피부 (B) 그리고에 교육 되었다 알바 (C) 복 부 구멍 (D) 노출. 내장 노출 후부 복 벽 (E), 반영 했다 고 허리 척추 thermocautery (화살표, F-G)을 사용 하 여 노출 되었다. 결함 4 (H, 드릴;를 가리키는 화살표에에서 교 련된 했다 , 결함을 가리키는 화살표) 및 5 (J, 결함을 가리키는 화살표가) 요 추 척추 기관. 마지막으로, aponeurosis (K)와 피부 (L) 봉합 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 척추 분리. 관심의 척추 골의 윤곽에 주요 단계가 표시 됩니다. (A-난) Contoured (녹색 선) 대표적인 2D 조각 길이 축는 척추의 표시 됩니다. 전체 척추 (J)의 3D 표현 분리 된 척추 (K)에 비교할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 척추 위치 참조. 표준 위치로 회전 전후는 척추의 대표적인 조각 2 개의 비행기에 표시 됩니다. 첫째, 사용 하 여 대표 XY-슬라이스 (A), (B, 녹색) 각도 회전 결함 (B, 붉은 광장) (B, 노란색) y 축에 평행 하 게 되도록 하는 데 필요한 결정 고 (C 회전 된 이미지를 생성 하는 데 사용 ). 다음, 대표 YZ-슬라이스 (D)를 사용 하 여 각도 (E, 녹색) (E, 붉은 광장) (E, 노란색) z 축에 평행 되는 결함을 회전 하는 데 필요한 결정 이며 (F 회전 된 이미지를 생성 하는 데 사용 ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 척추 등록 대상. 대상 척추 (에 표시 된 녹색) 및 (A C) 전에 참조 척추 (빨간색으로 표시 된)의 3 개의 평면에서 대표적인 조각 후 (D-E) 등록 표시 됩니다. 대상 및 기준 척추 및 재생, 뼈 형성을 나타내는 후 녹색 뼈를 가리키는 하얀 화살표 사이의 중복을 나타내는 노란색 note 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 목소리 야 분석. 대표적인 조각 contoured 볼륨의 2 개의 비행기에 표시 됩니다. 원형 컨투어 대표 ZX-조각 (A)에서 결함의 중심에 배치 됩니다. 모든 ZX-조각 컨투어링, 후 완전 한 결함 볼륨 XY-평면 (B)에서 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: 척추 결함 중생의 경도 분석. 질적 및 양적 대표 뼈 재생 분석 결과가 표시 됩니다. 다양 한 시간 시점 (A) A 대표 척추 결함 빨간색에서 표시 무효에 뼈 대형 정면 3D 이미지 (맨 위 패널), 화살 2D 이미지 (중간 패널), 및 축 2D 이미지 (하단 패널)으로 각 패널에 묘사 된다. 빈 공간에 뼈 형성의 정량 분석을 수행 했습니다. 볼륨을 뼈 밀도 (B) 및 명백한 조밀도 (C) 계산 했다를 반복 사용 하 여 비교 다중 비교 Bonferroni 보정으로 양방향 ANOVA를 측정. 오차 막대를 나타내는 SEM. * * *-p < 0.0001. 그녀를 클릭 하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 e.

단계 문제 가능한 이유 솔루션
2.3 동물 마 취 허 걱 초과 isoflurane 배달 동물에 전달 isoflurane의 농도 줄일 수 있습니다.
핀치를 발가락에 응답 하는 동물 부족 isoflurane 배달 Isoflurane의 농도 증가.
2.7-2.12 무거운 출혈 혈관 손상 멸 균 면봉을 사용 하 여 압력 또는 출혈을 멈추게 하는 적용.
동물에는 호흡 곤란 횡 경 막 구멍은 질 식 방지 하기 위해 동물 안락사
장 내용 누설 위장은 구멍 추가 합병증을 방지 하기 위해 동물 안락사 자르기 전에 기본 창에서 aponeurosis를 해제 하 여 그것을 방지.
혈액 드릴링 사이트에서 나온다 혈관은 구멍 출혈이 중지까지 멸 균 면봉을 적용 합니다.
동물 훈련 도중 갑자기 떨 려 너무 깊이 드릴 갔다가 척수 손상 추가 합병증을 방지 하기 위해 동물 안락사
뼈 결함 보이는 불완전 한 드릴 깊이 만큼 가지 않 았 어 결함 내부 드릴 머리를 재배치 하 고 깊은 드릴
2.15-2.24 봉합 나누기 봉합은 너무 밀접 하 게 끌려 전체 봉합을 교체 합니다. 자주 깨는 경우 크기 두꺼운 봉합을 사용 합니다.
동물 마 취에서 회복 하는 동물은 저체온증 가 열 패드의 온도 증가 하거나 (예: 난방 램프) 난방의 추가 소스를 적용 합니다.
봉합은 오픈 봉합 느슨하게, 배치 또는 동물 격렬 한 활동 봉합을 다시 적용 하 고 그들 사이 Dermabond는 봉합에 직접 적용.
3 스캔 한 이미지는 낮은 해상도, 시끄러운 또는 흩어져 나타납니다. 검색 매개 변수를 조정할 필요가 검색 프로토콜의 매개 변수를 조정 합니다. 검색에 대 한 자세한 지침을 Bouxsein 그 외 여러분을 참조 하십시오.
스캔 한 이미지 흐리게 나타납니다. 스캔 과정에서 이동 하는 동물 동물을 재검색 합니다. 운동 계속 되 면 isoflurane 농도 증가.
5 대상 척추의 등록 성공 하지 척추 분리가 제대로 완료 되지 않았습니다. Recontour는 척추: 척추의 모든 부분 포함 및 제외 모든 인접 한 구조 다는 것을 확인.
척추의 위치에 큰 차이 대상 척추 회전을 사용 하 여 참조 척추로 같은 방향으로 위치를 변경 하 고 (단계 29A)를 플립.
분석 뼈 구조를 인식할 수 없습니다 제대로 등록 모듈 뼈 샘플에서 배경 잡음을 제거 하는 임계값을 적용 합니다.
등록 된 척추는 다른 당신의 샘플의 3d 이미지를 생성 하 고 다른 시간 지점에서 올바른 척추를 일치.
6 총 볼륨 (TV)는 견본 사이 다른 조각의 다른 번호 또는 다른 윤곽 사용 되었다 항상 동일한 윤곽선 크기와 조각 같은 수를 사용 해야 합니다.
뼈 미네랄 밀도 (BMD) 값은 비정상적인 MicroCT의 불 충 분 한 교정 올바른 hydroxyapatite 표준 microCT 보정

표 1: 문제 해결. 잠재적인 문제 및 솔루션에 대 한 프로토콜에서 다른 단계 제공 됩니다.

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Discussion

골다공증은 척추 압축 골절은 척추와 척추 체의 붕괴에서 그 결과에 로드가 증가 의해 발생의 가장 널리 퍼진 원인. 그러나, 그것은 실질적으로 진정한 비슷한 척추 붕괴를 복제 하는 설치류에서 상해를 생성할 수입니다. 대신, 연구원은 OVCFs16,17,18,19,20,,2124 를 모방 하기 위해 척추 신체 중앙에 원통형 무효 만들 , 38 , 39. 결함 크기 측면에서 문학에 아니 일관성이 있기 때문에, 임계 크기 결함 치유 하지 않는 자발적으로 완전히 3 개월 수술16,17이내 개입 없이 하나로 정의 되었다.

빠르게 골다공증을 유발 하는 LCD와 ovariectomy을 결합 하는 방법 이전에 게시1,13, 비록 우리가 최초로 보여 그를 athymic 쥐, 급속,이 접근을 적용 하 고 배수 척추에 돌이킬 수 없는 감소 볼륨 및 미네랄 밀도40뼈. 이 설치류 면역 시스템에 의해 방해 받지 않는 재현할 수 작은 동물 모델 이며 그 않습니다 하지 위한 필요 추가 면역 억제, 다른 사람에 의해 사용 되는24.

우리의 수술 프로토콜 여러 중요 한 요 추 척추 결함의 동일한40생성. 동물에서 매우 일관 되 고 쉽게 비교 고 같지는 결함 발생합니다. 우리가 믿는이 접근을 사용 하 여 제작 결함 척추 결함 모델 쥐 꼬리 있는 biomechanical 세력에 복종 하기 때문에 꼬리 척추1,,1941 에서 생성 된 우수 하다는 크게 그 쥐 요 추 척추와 관련 된 다른.

이 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 LCD 후 ovariectomized 누드 쥐의 깨지기 쉬운 척추를 드릴 때 내 요원 저체온증과 복용 주의 피하고 포함 됩니다. 척추 결함, 생성 후 그것 뼈 수리의 경도 평가 대 한 설정된 시간 포인트에서 µCT 검사 vivo에서 의 시간적 순서를 통해 모니터링 됩니다. 같은 스캔 설정을 유지 하는 것이 중요 합니다. 척추 contoured 그리고 검사의 나머지 부분에서 분리 됩니다. 모든 검사는 척추의 동일한 총 볼륨 컨투어링 및 회색 음영 값 변화를 피하는 중요 합니다. 상업적으로 사용할 수 있는 여러 이미지 등록 알고리즘의 추출을 용이 하 게 해부학 해당 기준선 내가 모든 후속 시간 포인트. 마지막으로,이 내가 뼈 볼륨, 명백한 조밀도, 등등에 대 한 분석 된다. 그것은 모든 내가 동일한 매개 변수를 사용 하 여 분석 하는 중요 한입니다. 이 기술은 사용자에 종속 되지 않는 매우 정확 하 고 간단 경도 3D µCT 분석을 제공 합니다.

이 메서드는 모든 경도 뼈 결함 재생 분석에 적용할 수 있습니다. 여기에 사용 되는 척추 결함 모델은이 응용 프로그램에 대 한 편리한 모델의 뼈 구조 고유와 동일한 해부학 적 위치를 쉽게 등록할 수 있습니다. 그러나, 어떤 뼈 재생 제대로 경도 검사 통해 관심의 동일한 뼈를 분리 하 여 동일한 조건 하에서 분석 될 수 있습니다. 동일한 해 부 특징을 가진 분리 된 뼈 샘플을 포함 하는 것이 필수적입니다. 이 문제 및 다른 사람 설명 표 1을 가능한 원인 및 제안 합니다. 등록 절차에 의해 얻은 해부학 일치 샘플 같은 해부학 적 기능을 포함 하는 경우에 발생할 수 있습니다. 등록 첫 번째 스캔의 정확한 미리 정의 된 목소리 야 시간이 지남에 따라 고도로 정확한 3D histomorphometric 분석 결과 모든 나머지 시간 포인트를 적용할 사용자를 허용할 것 이다. 볼륨 골밀도 및 명백한 조밀도 목소리 야의 새로운 뼈 형성을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

잠재적으로 광범위 하 게 적용 하는 동안 제한 없이 여기에 제시 된 모델 하지은. 그것은 잠재적으로 중요 한 재생 될 수 있습니다. 있는 몇 가지 면역 중재 프로세스를 마스크 수 있습니다.로 athymic 누드 쥐의 사용 제한, 간주 될 수 있습니다. 둘째, 이전에 게시1,13, ovariectomy와 젊은 쥐에서 LCD의 결합을 통해 골다공증을 모델링 노인 환자 인구의 생물학을 모방 하는 기능에 제한 됩니다. 셋째, OVCFs 했다 골다공증 관련 골절을만 하 게 다른 동물이 영장류42로, 수술에 의해 모델링 됩니다. 마지막으로, 쥐 동안 요 추 척추 인간의 허리 척추에 대 한 최상의 가능한 모델은-대부분 척추 골절 개발-설치류 척추에 베어링 축 중량의 부족은 또한 제한.

이 프로토콜은 모듈형 이며 따라서 쉽게 수정할 수 연구자의 요구에. 예를 들어 athymic ovariectomized 쥐 다른 골다공증 관련 골절 연구 사용 될 수 있습니다. 연구원 반자동된 뼈 재생 분석에 우리의 접근을 사용 하 여 선택 해야, 경도 구조 이미징, 하지 반드시 마이크로-단층 촬영을 사용 하 여 모든 골절 모델에 적용 될 수 있습니다. 또한, 동시에 자기 공명 영상 같은 추가적인 이미징 형식을 사용 하 여 추가 정보를 수집 될 수 있습니다.

이 프로토콜에서 제시 하는 OVCF 모델은이 임상 unmet 필요에 새로운 치료 접근을 공부 하 사용 될 수 있습니다. 또한, 우리의 반자동된 분석 접근 덜 사용자 종속적 이며16다른 방법 보다 더 나은 정확도 제공 한다 유사한 분석을 수행을 성공적으로 사용할 수 있습니다. 특히 주목할 만한 사실은 우리가 사용 하는 모든 연구원에 의해 사용 될 수 있는 상업적으로 사용 가능한 시각화 및 분석 소프트웨어-자기 공명 영상, 핵 영상 등 추가 이미징 형식을 지 원하는 소프트웨어. 따라서, 우리는이 방법은 매우 받아들이기는 이며 vivo에서 이미징 기능과 등록 소프트웨어의 가용성에 의해 제한만 믿습니다.

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Disclosures

이 연구에 대 한 재생 의학 (CIRM) (TR2 01780) 캘리포니아 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

Acknowledgments

연구에 대 한 재생 의학 (CIRM) (TR2 01780) 캘리포니아 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane MWI Animal Health, Pasadena, CA 501017
BetadineSolution MWI Animal Health, Pasadena, CA 4677
Chlorhexidine Gluconate 2% scrub MWI Animal Health, Pasadena, CA 510083
Isopropyl Alcohol 70%-quart MWI Animal Health, Pasadena, CA 501044
Carprofen MWI Animal Health, Pasadena, CA 26357
Buprenorphine 0.3 mg/mL MWI Animal Health, Pasadena, CA 56163
Ovariectomized Athymic nude rats Harlan Laboratories, Indianapolis, IN Hsd:RH-Foxn1 rnu
Low calcium food Newco Distributors, Inc., CA 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium)
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation 14190250
Dermabond J AND J ETHICON DHVM12
Anesthesia machine Patterson Scientific TEC 3EX
Slide Top Induction Chambers Patterson Scientific 78917833
ProStation Heated Workstation Patterson Scientific 78914731
Surgical drape HALYARD HEALTH INC 89101
Magnetic fixator retraction system Fine Science Tools, Inc., CA 18200-50
Dissecting Scissors, 10 cm, Curved, SS World Precision Instruments, FL 14394
Iris Scissors, 11.5 cm, 45 °Angle, Serrated, Sharp/Sharp World Precision Instruments, FL 503225
Forceps, no. 5 World Precision Instruments, FL 555048FT
Micro Mosquito Hemostatic Forceps World Precision Instruments, FL 503360
Sterile cotton gauze Medtronic, MINNEAPOLIS, MN 9024
Absorption Spears - Mounted/Sterile Fine Science Tools, CA 18105-01
Syringe, 1 mL TERUMO TERUMO MED SS-01T
Needle, 25 gauge BD MED SYS INJECTION SYS 305127
Laminar flow hood Baker SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet
Thermal Cautery Unit World Precision Instruments, FL 501292
Micro-Drill OmniDrill115/230V World Precision Instruments, FL 503598
Trephines for Micro Drill, 2 mm diameter Fine Science Tools, CA 18004-20
3-0 Vicryl undyed 27” SH taper J AND J ETHICON 1663G
4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting J AND J ETHICON 1954G
Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) Scanco Medical vivaCT 40
SCANCO Medical microCT systems software suite Scanco Medical vivaCT 40
Analyze software Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN Analyze 12 Image analysis software
Veterenery eye ointment

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References

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