Semiautomated longitudinale Microcomputed tomografie gebaseerde kwantitatieve structurele analyse van een naakt-Rat Vertebrale fractuur osteoporose-gerelateerde Model

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Het doel van dit protocol is het genereren van een naakte rat Vertebrale compressie osteoporose bedrijfsgerelateerde fractuur model dat kan worden beoordeeld op overlangs in vivo met behulp van een semiautomated microcomputed tomografie gebaseerde kwantitatieve structurele analyse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shapiro, G., Bez, M., Tawackoli, W., Gazit, Z., Gazit, D., Pelled, G. Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model. J. Vis. Exp. (127), e55928, doi:10.3791/55928 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Osteoporose-gerelateerde Vertebrale compressie fracturen (OVCFs) zijn een gemeenschappelijk en klinisch onvervulde behoefte met toenemende prevalentie als de wereld bevolking vergrijst. Diermodellen OVCF zijn essentieel voor de preklinische ontwikkeling van translationeel weefsel engineering strategieën. Terwijl een aantal modellen bestaat, beschrijft dit protocol een geoptimaliseerde methode om meerdere zeer reproduceerbaar Vertebrale gebreken in een enkele naakt-rat. Een roman longitudinale semiautomated microcomputed tomografie (µCT)-gebaseerde kwantitatieve structurele analyse van de wervel gebreken is ook gedetailleerd. Ratten werden kort beeld op meerdere tijd punten post-op. De dag 1 scan werd omgevormd naar een standaard positie, en een standaard volume van belang was gedefinieerd. Latere µCT scans van elk rat werden automatisch geregistreerd voor de dag 1 scan dus hetzelfde volume van belang was vervolgens geanalyseerd om te beoordelen voor nieuwe biomineralisatie. Deze veelzijdige aanpak kan worden aangepast aan een verscheidenheid van andere modellen waar longitudinale imaging gebaseerde analyse zouden kunnen van nauwkeurige 3D semiautomated uitlijning profiteren. Samen genomen, beschrijft dit protocol een gemakkelijk meetbare en gemakkelijk reproduceerbaar systeem voor onderzoek van de osteoporose en bot. Het voorgestelde protocol duurt 4 maanden voor het opwekken van osteoporose in naakt ovariectomized ratten en tussen 2.7 en 4 h te genereren, beeld, en analyseren van twee Vertebrale gebreken, afhankelijk van de grootte van het weefsel en apparatuur.

Introduction

Meer dan 200 miljoen mensen wereldwijd lijden aan osteoporose1. De onderliggende pathologische afname Botmineraaldichtheid (BMD) en gewijzigde bot-microarchitectuur verhogen bot kwetsbaarheid en, bijgevolg, het relatieve risico van breuk2. Osteoporose is zo veel phishingtrucs en schadelijk voor de gezondheid dat de WHO een belangrijke openbare gezondheids-zorg heeft gedefinieerd. Bovendien, als de wereldbevolking naar verwachting aan leeftijd, osteoporose naar verwachting zelfs meer gemeengoed geworden.

Osteoporotisch Vertebrale compressie fracturen zijn de meest voorkomende onstabiele fracturen, geschat op meer dan 750.000 per jaar in de VS. Ze worden geassocieerd met significante morbiditeit en zo veel als een negen-maal hogere sterfte3. Klinische testen momenteel beschikbaar chirurgische ingrepen, zoals vertebroplasty en kyphoplasty, bleken te zijn niet effectiever dan een schijnvertoning behandeling4,5, verlaten alleen pijnbeheersing beschikbaar voor deze patiënten. Aangezien huidige behandelingen van de OVCF beperkt zijn, is het noodzakelijk om een dierlijk model dat de stoornis6,7,8kunt repliceren. Dergelijke dierlijke modellen kunnen vergemakkelijken zowel het onderzoek naar de huidige behandelingsmethoden en de ontwikkeling van nieuwe therapieën die in de klinische praktijk vertalen zal. Osteoporose is geïnduceerde en aanhoudend in model dieren door de administratie van een lage-calcium dieet (LCD) in combinatie met ovariotomie1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. om het model verder het botverlies gekoppeld aan OVCFs, Vertebrale bot gebreken werden opgericht in osteoporotisch immunocompetent ratten 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. In dit werk, wordt een model van de wervel defect van immuungecompromitteerde ratten met gemodelleerde osteoporose weergegeven. Dit nieuwe model kan worden gebruikt ter beoordeling van cel-gebaseerde therapieën stamcellen afkomstig uit verschillende bronnen en soorten voor de reparatie van uitdagende fracturen, zoals OVCFs.

Bot imaging is een cruciaal onderdeel van de evaluatie van fracturen en ziekten van het bot. Geavanceerde beeldvormende methoden zijn ontwikkeld voor de nauwkeurige beoordeling van het bot van de structurele veranderingen en regeneratie strategieën25. Onder hen, heeft µCT imaging ontpopt als een niet-invasieve, easy-to-use en goedkope methode waarmee high-resolution 3D-beelden. µCT imaging heeft diverse voordelen ten opzichte van andere modaliteiten bij de evaluatie van osteoporose-patiënten, want het biedt hoge resolutie 3D bone microarchitectuur26 dat vervolgens kwantitatief geanalyseerd kunnen worden. De laatste kan vervolgens worden gebruikt om te vergelijken de therapeutische effecten van de voorgestelde behandelingen. Inderdaad, in vivo µCT imaging is een gouden standaard voor Vertebrale defect regeneratie toezicht van1,16,27. Echter, enkele publicaties28,29,30,31 geautomatiseerde registratie hulpmiddelen tot een minimum beperken van de gebruiker-afhankelijkheid, interpolatie bias en precisie fout van µCT hebt gebruikt Imaging-gebaseerde analyse. Onlangs waren wij de eerste met een registratieprocedure te verbeteren van de analyse van bot regeneratie in een gestandaardiseerde bone void, zoals uiteengezet in dit protocol32 .

De hier beschreven methode kan worden gebruikt voor het bestuderen van het effect van nieuwe celtherapieën voor OVCFs, ongehinderd door host T-cel-respons die XENOGENECELLEN of allogene cellen kunnen verwerpen. Osteoporose wordt bij jonge ratten door middel van ovariotomie (OVX) en 4 maanden voor een LCD veroorzaakt. De jonge leeftijd van de OVX rats, gecombineerd met de LCD toegestaan, ons te bereiken van een piek van de lage botmassa, het nabootsen van postmenopauzale osteoporose door leiden tot onomkeerbare botverlies. Dit kan worden verklaard ten dele door het feit dat tijdens het LCD-scherm en bij ongeveer 3 maanden oud, de overgang van de ratten van het bot modellering te remodelleren fase in het lumbale wervels33, waardoor de kans op behoud van de osteoporose over tijd. Met behulp van jonge dieren maakt dit model rendabeler, aangezien ze minder kosten. Echter, het wordt beperkt door inherent niet boekhouding voor de biologische veranderingen in het dier veroudering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alle dierproeven werden uitgevoerd onder een protocol dat is goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Cedars-Sinai Medical Center (Protocol # 3609). Anesthesie werd toegediend voor alle beeldvorming en chirurgische procedures. Alle dieren zijn gehuisvest overeenkomstig erkende IACUC protocollen.

Opmerking: de proefopzet van dit protocol is afgebeeld in Figuur 1. Koop zes weken oude ratten met hun eierstokken operatief verwijderd en voeden hen een LCD 0,01% calcium en 0.77% fosfaat uit. Na een periode van 4 maanden van een LCD, boor een kritische omvang Vertebrale defect in de vierde en vijfde lumbale wervel lichamen (L4-L5). Beeld na de chirurgie, de ratten op dag 1 en weken 2, 4, 8 en 12 na oprichting van het defect. Zoek defect marges op de dag 1 scan, heroriënteren naar een standaard positie en het definiëren van een cilindrische volume van belang (VOI). De scans van latere µCT (dat wil zeggen, voor weken 2, 4, 8 en 12) van elke rat naar de standaard positie gedefinieerd voor de desbetreffende dag 1 scan automatisch kunnen registreren. Breng de dag 1 vooraf VOI tot de geregistreerde scans gedefinieerde. Beoordelen van de botdichtheid volume en de schijnbare dichtheid van de VOIs.

1. inductie van osteoporose

  1. 4 maanden van een LCD 0,01% calcium en 0.77% fosfaat uit te zetten in de zes weken oude athymic ovariectomized ratten.
  2. Schakelaar terug aan een normaal dieet.
    Opmerking: Deze ratten zal worden verwezen als " osteoporotisch ratten " hierna.

2. Vertebrale Defect Model

Opmerking: de timing is 40-50 min per dier.

  1. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten voorafgaand aan chirurgie.
  2. In het geval van veelvoudige chirurgie, steriliseren alle chirurgische gereedschappen.
    1. Wassen van de hulpprogramma's en plaats ze in een bad van ultrasoonapparaat voor 5 min. plaatst u ze in een hete kraal sterilisator ingesteld op 250 ° C gedurende 20 s. toestaan de hulpmiddelen om af te koelen gedurende 5 minuten
  3. Induce anesthesie.
    1. Place de osteoporotisch rat in de zaal inductie gekoppeld aan een verdoving machine met een centraal opruiming systeem. Anesthesie 5% Isofluraan met 100% zuurstof induceren en onderhouden via neus op 2-3% Isofluraan. Gebruik maken van dierenarts zalf op de ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
    2. Toepassing een teen-snuifje stimulans om voldoende vlak van anesthesie. Als geen antwoord wordt opgemerkt, leidt zij de procedure.
  4. Plaats van de narcose rat in dorsale lighouding op een verwarming pad (37 ° C) en rekken van de ledematen met behulp van een magnetische fixatiemiddel retractie systeem ( figuur 2A).
    Opmerking: De temperatuur van de verwarming pad is belangrijk voor de preventie van hypothermie, omdat een narcose rat is niet in staat om de lichaamstemperatuur te regelen.
  5. Scheren de buikstreek met behulp van een elektrisch scheerapparaat. Swab het met jodium gebaseerde antiseptische en chloorhexidine gluconaat 0,5% gevolgd door 70% ethanol.
  6. Injecteren de rat met carprofen (5 mg/kg lichaamsgewicht (BW), subcutaan (SQ)) voordat u begint met de chirurgische ingreep.
  7. Gebruik een steriel scalpel te snijden van de huid. Beginnen de incisie 1 cm onder de xiphoid process en snijden door de middellijn (~ 5-8 cm) ( figuur 2B).
  8. Chirurgische schaar gebruik te maken van een insnijding van de aponeurosis door middel van de linea alba voor toegang tot de buikholte ( figuur 2C).
  9. Bloot van de buikholte met behulp van oprolmechanismen ( figuur 2D).
  10. Afbuigen de ingewanden tot en met het recht van de rat op het blootstellen van de abdominale aorta en de linker nier ( figuur 2E). Palperen van de lumbale wervelkolom alvorens te worden blootgesteld. Voorkom uitdroging, steriele doorweekt gauzes met steriele zoutoplossing gebruiken om te laten teruglopen van de inwendige organen.
  11. Gebruik thermocautery bloot in lagen de anterior aspect van lumbale wervel lichamen L4-5 en hen te isoleren van de omliggende bindweefsel en spieren ( figuur 2F -G).
    Opmerking: Thermocautery moet worden gebruikt om controle bloeden tijdens de dissectie.
  12. Gebruiken een steriel katoenen doekje verzadigd met steriele zoutoplossing om bloed en resterende weefsel van de wervels L4. Een steriele Trephine boor bur (~ 2 mm diameter) gebruiken om te boren van een defect van de 5 mm diep bot in het midden van de blootgestelde anterior aspect van de wervel lichaam (figuur 2 H-ik).
    Let op: Aanvragen minimale druk om te boren via alleen de ventrale cortex en de onderliggende trabecular been; Vermijd boren door de dorsale cortex. Merk op dat de wervels van osteoporotisch ratten zeer kwetsbaar zijn. Gebruik een wattenstaafje te reinigen van het defect en toepassen van druk om te stoppen met bloeden, indien aanwezig.
  13. Herhaal stap 2.11 op de L5-wervel maken een totaal van 2 defecten per rat ( figuur 2J).
  14. De darmen terug te keren naar de buikholte.
  15. Gebruiken een vicryl synthetische absorbeerbare chirurgische hechtdraad (3-0 vicryl ongekleurd 27 " SH taper) in een continue patroon aan het suture van de aponeurosis ( Figuur 2 K).
  16. Sluit de huid met behulp van een 4-0 monofilamenten nylon niet-absorbeerbare Sutuur (geologie) in een eenvoudige onderbroken patroon ( Figuur 2 L).
  17. Toepassing 100 µL van actuele huid lijm op de top van de huid hechtingen en ertussen om de volledige stopzetting van de huid.
  18. De rat injecteren met warm (37 ° C) lactated Bel ' s oplossing (1CC/100 g BW, SQ) om te voorkomen hypothermie en uitdroging.
  19. De rat injecteren met buprenorfine (0,5 mg/kg BW, SQ) voorafgaand aan de operatie en elke 8-12 h voor verlichting van postoperatieve pijn desgewenst.
  20. Laat niet het dier zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen. Ook, niet de terugkeer van een dier dat heeft ondergaan chirurgie aan het gezelschap van andere dieren tot het volledig is hersteld.
  21. Nadat het dier heeft hersteld op de verwarming pad, terug te sturen naar zijn kooi.
    Opmerking: De ratten individueel huis (dat wil zeggen, in aparte kooien) ter voorkoming van rat-naar-rat verminking van de hechtingen en wond.
  22. Chow geweekt in water in een petrischaal op de vloer van de kooi voor een paar dagen postoperatieve om te helpen de rats bereiken van het voedsel plaats.
  23. Beheren van carprofen (5 mg/kg BW, SQ) 24u na chirurgie voor verlichting van de pijn elke 24 h desgewenst.
  24. Verwijderen van de hechtingen van de huid, terwijl het dier onder 2 is % Isofluraan verdoving 10-14 dagen post operatie.

3. MicroCT scannen

Opmerking: de timing is 30-40 min per dier.

  1. Op de dag na de chirurgische ingreep, plaatst u de osteoporotisch rat in de zaal van de inductie vast met de machine van een verdoving met een centraal opruiming systeem verbonden. Anesthesie 5% Isofluraan met 100% zuurstof induceren en onderhouden via neus op 2-3% Isofluraan.
  2. Scan de rat met behulp van een in vivo µCT scanner. Herhaal scannen voor de longitudinale analyse van bot regeneratie.
    Opmerking: Zorg ervoor dat alle dieren met dezelfde instellingen (dat wil zeggen, X-ray energie, medium, intensiteit, voxel grootte en afbeeldingsresolutie van de scannen) worden gescand en in een similao de oriëntatie. Bijvoorbeeld: X-ray energie, 55 kVP; huidige, 145 µA; Voxel grootte, 35 µm; stappen, 115 µm; en integratie tijd, 200 ms; met de monsters in PBS. Verwijzen naar Bouxtein et al. 34 voor verdere uitleg en overwegingen die betrokken zijn bij knaagdieren µCT scannen voor een beoordeling van de microstructuur van het bot. Ideaal, de hoogste scanresolutie beschikbaar zou worden gebruikt voor alle scans; echter vereist langere overname keer hogere resolutie scans, grote datasets te genereren, en de dieren meer ioniserende straling worden blootgesteld. Deze kunnen ongewenste effecten, met inbegrip van verminderde fractuur genezing invoeren. Daarom moet de afweging tussen aanvullende gegevens en scannen tijd zorgvuldig worden overwogen.

4. Vertebrale scheiding

Opmerking: de timing is 20-30 min per monster.

  1. Contour de wervel van belang, zoals aangetoond in figuur 3A-I. Zorg ervoor dat alle delen van de wervel terwijl met uitzondering van delen die deel uitmaken van aangrenzende wervels.
    1. Klik op " µCT evaluatie programma " en selecteer het monster in het menu.
    2. Contour elk segment met de muis.
    3. Gebruik het " Z " bar te gaan naar het volgende segment.
  2. De voorgevormde wervel als een afzonderlijk bestand opslaan ( figuur 3J -K) door te klikken op " bestand " → " GOBJ opslaan " om de paar plakjes.

5. definitie van de VOI voor longitudinale kwantitatieve evaluatie

Opmerking: de volgende stappen zijn afhankelijk van over de vraag of de scan vanaf dag 1 na de operatie (referentie wervel) of vanaf de daaropvolgende tijd punten ( target wervels).

  1. Referentie wervel.
    Nota: De timing is 20-30 min per monster.
    1. Voor Z-rotatie, het meten van de hoek van de marges met behulp van een XY-delige vanuit het midden van het defect ( figuur 4A -B).
      1. Op het Z-vlak, gaat u naar het gebied van de wervel waar het gebrek de meeste duidelijke en scherm vangen is de wervel.
      2. In een presentatie-software, bereiden een rechthoek-vormige object dat in het defect past.
      3. Draaien van het beeld van de wervel, zodanig dat het defect naar boven gekeerd zijde en de marges defect zijn parallel aan de zijden van de rechthoek.
      4. Meten van de hoek van de rotatie (Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding → " afbeelding opmaken " → " grootte ").
      5. Gebruik de gemeten hoek om te draaien van de wervel ( figuur 4C).
        1. Opent een nieuw venster van de DECterm (" Session manager " → " toepassingen " → " DECterm ").
        2. Uitvoeren " ipl ":
        3. Ipl > turn3d
        4. -input [in] >
        5. -uitgang [out] >
        6. -turnaxis_angles [0.000 90.000 90.000] > 90 90 0
        7. -turnangle [0.000] > gemeten hoek
        8. -img_interpol_option [1] >
    2. Voor X-rotatie, het meten van de hoek van de marges met behulp van een YZ-delige vanuit het midden van het defect ( Figuur 4 d -E). Gebruik de gemeten hoek om te draaien van de wervel ( figuur 4F).
      1. Klik op " YZ " in " uCT evaluatie programma " en herhaal stappen 5.1.1.1-5.1.1.5.2.
      2. Ipl > isq
      3. -aim_name [in] >
      4. -isq_filename [default_file_name] > de dossierfolder van ISQ invoegen (bijvoorbeeld " DK0: [MICROCT. GEGEVENS. GAZIT. MAXIM.80.DAY1]Z2102970. ISQ ")
      5. -pos [0 0 0] >
      6. -dim [-1-1 -1] >
    3. de gedraaide wervel Flip door het veranderen van de XY-oppervlakte aan de ZX-oppervlakte.
      1. Opent een nieuw venster van de DECterm (" Session manager " → " toepassingen " → " DECterm ").
      2. Uitvoeren " ipl ":
      3. Ipl > spiegelen
      4. -input [in] > uit
      5. -input [out] > out2
      6. -new_xydir [yz] > zx
    4. De VOI definiëren.
      1. Trekken een circulaire contour van het defect met behulp van een segment van het centrum van het gebrek door de circulaire contour pictogram in te selecteren " uCT evaluatie programma " ( figuur 6A). Kopie die contour en plak deze op alle segmenten in het defect ( figuur 6B).
        Opmerking: Aangezien alle gebreken zijn gemaakt volgens dezelfde procedure, analyseren hetzelfde aantal segmenten en vervolgens het totale volume (TV) voor alle monsters.
  2. Doel wervel.
    Nota: De timing is 10-20 min per monster.
    1. Belasting de DICOM-bestanden van zowel het doel als de wervels van de verwijzing naar het hoofdvenster van de software van de analyse van de afbeelding.
      Opmerking: Om te voorkomen, grijswaarden waardeveranderingen definiëren hetzelfde uitvoer gegevenstype als de oorspronkelijke DICOM-bestanden in het menu laden.
    2. Register bij de naslaginformatie over de wervel.
      1. Lancering de " 3D-Voxel registratie " module en de inbreng van de wervel referentie als de " Base Volume " en de wervel doel als de " Match Volume. " Klik op " registreren " te registreren van de wervels ( Figuur 5).
    3. Slaan de geregistreerde bestand met dezelfde gegevens typt en importeren in een µCT omgeving.
    4. Toepassing de VOI.
      1. Toepassen de VOI gedefinieerd voor de wervel van de verwijzing naar de geregistreerde doelgroep wervel door te klikken op " uCT evaluatie programma " → " bestand " → " last GOBJ " en het selecteren van de GOBJ eerder gemaakt. Controleer of de VOI en gebrek concentrische zijn.

6. MicroCT analyse

Opmerking: de timing is 10-20 min per monster.

  1. Verzenden de VOI voor evaluatie met behulp van een µCT evaluatie programma ( Figuur 6).
    Opmerking: Zorg ervoor dat u dezelfde parameters bij het analyseren van alle VOIs. Zorg ervoor dat de drempel ligt hoog genoeg om het weglaten van de achtergrondruis met minimaal verlies van bot. Als een radiopaak biomaterial wordt gebruikt, kan een aantal strategieën worden gebruikt voor het analyseren van biomineralisatie. Als er een verschil in dichtheid tussen de biomaterial en het bot weefsels is, kan de biomaterial worden gesegmenteerd uit 35 ,, 36. Anders, de onderzoekers de verschillen in biomineralisatie tussen experimentele groepen kwalitatief kunnen evalueren.

7. Euthanasie

  1. PPlace de osteoporotisch rat in de zaal inductie aangesloten op een machine van de verdoving. Anesthesie 5% Isofluraan met 100% zuurstof induceren.
  2. Onderhouden verdoving via de neus en het uitvoeren van de euthanasie door het gebeuren van de borstholte te produceren een bilaterale pneumothorax 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met behulp van dit protocol, kan een beeld en kwantificeren van de regeneratie van n = 8 gemodelleerde osteoporotisch Vertebrale gebreken op verschillende tijdstippen. De anatomische wedstrijd verkregen door de registratieprocedure zorgt voor de analyse van de dezelfde VOI op alle tijdstippen. Dit resulteert in een zeer nauwkeurige longitudinale 3D histomorphometric analyse, zelfs wanneer de marges van het originele gebrek niet langer herkenbaar. We gebruikten vijf keer punten (dag 1, week 2, week 4, week 8 en week 12) als een voorbeeld voor de longitudinale evaluatie van bot regeneratie (Figuur 7). Regeneratie kan worden geëvalueerd, zowel door de kwalitatieve beoordeling van dwarsdoorsneden van de 2D- en 3D-beelden (zoals geïllustreerd in figuur 7A) een kwantitatieve vergelijking van de bot kwantiteit (BVD) en kwaliteit (AD) (figuur 7B). De volgende indices van de Morfometrische kunnen worden bepaald voor de nieuw gevormde bot: (i) TV, met inbegrip van bot en de zachte-weefsel volumes (TV, mm3); (ii) volume van gemineraliseerde weefsel (BV, mm3); (iii) botdichtheid in volume (BV/TV); en (iv) Botmineraaldichtheid (BMD, mg hydroxyapatiet per cm3). In het bijzonder werd minimale biomineralisatie (5% toename in volume botdichtheid) waargenomen 2 weken na oprichting van het defect. Na twee weken, werden geen significante verschillen in biomineralisatie in vergelijking met latere tijdstippen waargenomen. Globaal, hoewel er een zekere mate van bot formatie, die ongeveer 10% van de Week 8 bedroeg, was het minimale genoeg om de bone void na verloop van tijd.

Figure 1
Figuur 1: Protocol ontwerp. De belangrijkste stappen in het protocol worden beschreven. Eerste, ovariectomized naakt ratten onderworpen aan vier maanden van een dieet met weinig calcium (LCD) werden geëxploiteerd op maken standaard kritische middelgrote gebreken in twee lumbale wervel lichamen. De ratten werden beeld op dag 1 en weken 2, 4, 8 en 12 post-op. De dag 1 scan werd omgevormd naar een standaard positie, en een cilindrische VOI was gedefinieerd met behulp van de marges van het defect. Latere µCT scans van elk rat werden automatisch geregistreerd voor de standaard positie gedefinieerd voor de desbetreffende dag 1 scan. De dag die 1 vooraf gedefinieerde VOI vervolgens op de geregistreerde scans toegepast werd. Het volume van de botdichtheid en de schijnbare dichtheid van de VOI werden gebruikt voor het beoordelen van nieuwe biomineralisatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Vertebrale Defect chirurgie. De belangrijkste stappen in de chirurgische generatie van Vertebrale gebreken worden geïllustreerd. Eerst, ratten werden geplaatst op een verwarming pad (A). Een middellijn snede werd gemaakt via de huid (B) en vervolgens de linea alba (C) de buikholte (D) bloot te stellen. De darmen zijn een uiting van de achterste buikwand (E) bloot te stellen, en de lumbale wervelkolom werd blootgesteld met behulp van thermocautery (pijl, F-G). Gebreken werden geboord in de vierde (H, pijl naar de boor; Ik, pijl naar het gebrek) en vijfde (J, pijlen die wijzen op gebreken) lumbale wervel lichamen. Tot slot werden de aponeurosis (K) en de huid (L) ingehecht. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: wervel scheiding. De belangrijkste stappen in de contouren van een wervel van belang worden weergegeven. (A-ik) Voorgevormde (groene lijn) vertegenwoordiger 2D segmenten langs de lengteas van een wervel worden weergegeven. Een 3D-weergave van de volledige stekel (J) kan worden vergeleken met de gescheiden wervel (K). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: verwijzen naar wervel positionering. Representatieve segmenten in twee vlakken staan van een wervel voor en na rotatie naar een standaard positie. Eerst wordt met behulp van een vertegenwoordiger XY-segment (A), de hoek (B, groen) die nodig zijn voor het draaien van het defect (B, rood vierkantje) om parallel aan de y-as (B, gele) bepaald en vervolgens gebruikt voor het maken van de geroteerde afbeelding (C ). Vervolgens is met een vertegenwoordiger YZ-segment (D), de hoek (E, groen) die nodig zijn voor het draaien van het defect (E, Rode plein) tot evenwijdig aan de z-as (E, gele) bepaald en vervolgens gebruikt voor het maken van de geroteerde afbeelding (F ). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Target Vertebra registratie. Representatieve segmenten op drie vlakken van de target wervel (gemarkeerd in groen) en de referentie wervel (gemarkeerd in het rood) voordat de (A-C) en na (D-E) registratie worden weergegeven. Opmerking de gele kleur, die overlapping tussen de wervels van de doelgroep en verwijzing, en de witte pijlen die wijzen naar groene bot na regeneratie, met vermelding van biomineralisatie aangeeft. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: VOI analyse. Representatieve segmenten in twee vlakken met de voorgevormde volume van belang worden weergegeven. Een circulaire contour is gepositioneerd in het midden van het gebrek in een vertegenwoordiger ZX-segment (A). Na de contouren alle ZX-segmenten, kan het volume volledig defect worden gezien in de XY-oppervlakte (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: Longitudinal Analysis of Vertebrale Defect regeneratie. De resultaten van de analyse van kwalitatieve en kwantitatieve representatieve bot regeneratie worden weergegeven. (A) A representatieve Vertebrale defect op verschillende tijdstippen in elk paneel wordt afgebeeld als een frontale 3D beeld (bovenzijde) met biomineralisatie in de leegte in het rood aangeduid, een Sagittaal 2D-afbeelding (middelste deelvenster) en een axiale 2D-afbeelding (onderkant). De kwantitatieve analyse van biomineralisatie in de vides werd uitgevoerd. Bone volume dichtheid (B) en schijnbare dichtheid (C) werden berekend en vergeleken met behulp van een herhaalde maatregelen two-way ANOVA met Bonferroni correctie voor meerdere vergelijkingen. De foutbalken vertegenwoordigen SEM. ***-p < 0,0001. Gelieve Klik hiere voor een grotere versie van dit cijfer.

Stappen Probleem Mogelijke oorzaak Oplossing
2.3 Dier hijgend onder verdoving Overtollige Isofluraan levering Vermindering van de concentratie van Isofluraan geleverd aan het dier.
Dierlijke reageert tot teen snuifje Onvoldoende Isofluraan levering De concentratie van Isofluraan vergroten
2.7-2.12 Heavy bloeden Vasculaire schade Gebruik een steriel katoenen doekje druk of brandijzer om te stoppen met bloeden toe te passen.
Het dier heeft moeite met ademhalen Het middenrif was doorboord Het dier om te voorkomen dat verstikking euthanaseren.
Lekkage van intestinale inhoud Het maag-darmkanaal was doorboord Euthanaseren van het dier om te voorkomen dat verdere complicaties. Voorkomen dat het door het opheffen van de aponeurosis uit de buurt van onderliggende darmen voor het snijden.
Bloed blijkt uit de boren site Een bloedvat was doorboord Een steriele wattenstaafje van toepassing tot het bloeden stopt.
Dier schudt plotseling tijdens het boren De boor te diep ging en het ruggenmerg beschadigd Euthanaseren van het dier om te voorkomen dat verdere complicaties.
Het bot defect lijkt onvolledig De boor gaan niet diep genoeg Verplaats de boorkop binnen het defect en boren dieper
2.15-2.24 Sutuur (geologie) pauzes De hechtdraad werd te strak getrokken Vervang de gehele hechtdraad. Als breken vaak optreedt, gebruikt u een maat dikkere hechtdraad.
Dier is traag om te herstellen van anesthesie Het dier is hypothermic Verhogen van de temperatuur van de verwarming pad of toepassen van een extra bron van verwarming (b.v. Verwarming lamp).
Hechtingen zijn open De hechtingen losjes werden geplaatst, of het dier deed inspannende activiteit Toepassen van de hechtingen en toepassen van Dermabond rechtstreeks naar de hechtingen en tussen hen.
3 Gescande afbeelding verschijnt met een lage resolutie, lawaaierige of verspreide Scannen parameters moeten worden aangepast Aanpassen van de parameters van het scannen protocol. Verwijzen naar Bouxsein et al. voor meer richtlijnen voor het scannen.
Gescande afbeelding verschijnt wazig Een dier overgebracht tijdens het scanproces Scannen van het dier. Als verkeer blijft, verhogen Isofluraan concentratie.
5 De registratie van doel wervel was niet succesvol Vertebrale scheiding was niet goed gedaan Recontour van de wervel: Zorg ervoor dat alle delen van de wervel worden opgenomen en uitgesloten van elke aangrenzende structuren.
Grote verschil in positionering van wervels Verplaats de wervel doel in dezelfde richting als de referentie wervel met behulp van rotaties en spiegelen (stap 29A).
Analyseren de beenstructuren niet goed wordt herkend Toepassing van een drempel in de registratiemodule de achtergrondgeluiden verwijderen uit bot monsters.
De geregistreerde wervels zijn verschillende Maak 3D-beelden van uw monsters en overeenkomen met de juiste wervels over de verschillende tijdstippen.
6 Het totale volume (TV) verschilt tussen de monsters Een verschillend aantal segmenten of een andere contour werd gebruikt Zorg dat je altijd gebruikt dezelfde omtrek grootte en hetzelfde aantal segmenten.
Bot mineraal dichtheid (BMD) waarde is abnormaal Onvoldoende kalibratie van microCT Kalibreren van het microCT voor juiste hydroxyapatiet normen

Tabel 1: probleemoplossing. Mogelijke problemen en oplossingen worden voorgesteld voor de verschillende stappen in het protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Osteoporose is de meest voorkomende oorzaak van Vertebrale compressie fracturen veroorzaakt door een hogere belasting op de rug en dat resultaat in de ineenstorting van de wervel lichaam. Het is echter praktisch onmogelijk voor het genereren van een blessure in een knaagdier die authentiek een soortgelijke Vertebrale ineenstorting repliceert. In plaats daarvan, onderzoekers maken een cilindrische leegte in het midden van de wervel lichaam na te bootsen OVCFs16,17,18,19,20,21,24 , 38 , 39. aangezien er geen consistentie in de literatuur in termen van omvang van het defect is, een kritische en middelgrote defect werd gedefinieerd als een die niet spontaan volledig zonder een interventie binnen 3 maanden post-op16,17 genezen doet.

Hoewel de methode van het combineren van ovariotomie met een LCD-scherm te snel bewegen osteoporose eerder gepubliceerde1,13 was, wij waren de eersten om te laten zien dat de toepassing van deze aanpak tot athymic ratten resultaten in een efficiënte, snelle, en onomkeerbare daling in Vertebrale trabecular bot volume en mineraal dichtheid40. Dit is een reproduceerbare kleine-dier-model dat is ongehinderd door het knaagdier immuunsysteem en dat doet niet hebben behoefte aan een toegevoegd immunosuppressiva, zoals gebruikt door anderen24.

Ons chirurgisch protocol gegenereerd meerdere identieke kritische lumbale wervel gebreken40. Dit resulteert in zeer consistent en gemakkelijk vergelijkbare en kwantificeerbare gebreken over dieren. Wij zijn van mening dat gebreken die zijn geproduceerd met behulp van deze aanpak superieur aan Vertebrale defect modellen gegenereerd in staartwervels1,19,41 zijn , omdat de staart van de rat is onderworpen aan de biomechanische krachten die zijn aanzienlijk afwijken waarbij de rat lumbale wervelkolom.

Kritische stappen binnen dit protocol omvatten het vermijden van intra-operatieve hypothermie en nemen voorzichtigheid bij het boren van de fragiele wervels van ovariectomized naakt ratten na een LCD. Na het genereren van de wervel defect, wordt het gecontroleerd via een temporele sequentie van in vivo µCT scans op ingestelde tijd punten voor de lengterichting beoordeling van bot reparatie. Behoud van de dezelfde scaninstellingen is van cruciaal belang. Vervolgens worden de wervels contouren en gescheiden van de rest van de scan. Contouren van een identieke totale volume voor alle scans van een wervel en het vermijden van grijswaarden waardeveranderingen zijn kritisch. Een commercieel beschikbare meerdere afbeelding registratie algoritme vergemakkelijkt de winning van anatomisch bijbehorende basislijn VOIs naar alle latere tijdstippen. Tot slot zijn deze VOIs geanalyseerd voor bot volume, schijnbare dichtheid, enz. Het is cruciaal voor het analyseren van alle VOIs met dezelfde parameters. Deze techniek biedt een zeer nauwkeurige en eenvoudig longitudinale 3D µCT-analyse is niet afhankelijk van de gebruiker.

Deze methode kan worden toegepast op een longitudinale bot defect regeneratie analyse. Het model van de wervel defect gebruikt hier is een handig model voor deze toepassing, zoals de botstructuur uniek is en kan gemakkelijk worden geregistreerd naar dezelfde anatomische positie. Echter kon bot regeneratie onder dezelfde voorwaarden door goed scheiden de zelfde been van belang op het gehele de longitudinale scans worden geanalyseerd. Het is noodzakelijk om gescheiden bot monsters met de zelfde anatomische eigenschappen. Dit potentiële probleem en anderen staan beschreven in tabel 1, samen met mogelijke oorzaken en aanbevolen oplossingen. De anatomische wedstrijd verkregen door de registratieprocedure kan alleen optreden als de monsters dezelfde anatomische kenmerken bevatten. De registratie kan de gebruiker aan de exacte voorgedefinieerde VOI van de eerste scan van toepassing op alle resterende tijd punten, wat resulteert in een zeer nauwkeurige 3D-histomorphometric-analyse na verloop van tijd. Volume van de botdichtheid en schijnbare dichtheid van de VOI kunnen worden gebruikt ter beoordeling van nieuwe biomineralisatie.

Terwijl potentieel breed toepasbaar is, is het hier gepresenteerde model niet zonder beperkingen. Het gebruik van athymic naakt ratten beschouwd als een beperking, zoals het mogelijk sommige immuun-gemedieerde processen die mogelijk van belang voor regeneratie kan maskeren. Ten tweede, modelleren van osteoporose door een combinatie van ovariotomie en een LCD-scherm bij jonge ratten, als eerder gepubliceerde1,13, wordt beperkt in zijn vermogen om na te bootsen de biologie van de oudere patiënt bevolking. Ten derde, OVCFs werden gemodelleerd door een chirurgische ingreep, zoals het alleen andere dieren te hebben van de fracturen osteoporose bedrijfsgerelateerde primaten42 zijn. Tot slot, terwijl de rat lumbale wervelkolom is het beste beschikbare model voor de menselijke lumbale wervelkolom — waar de meeste Vertebrale fracturen ontwikkelen — het ontbreken van axiale gewicht, rekening houdend met de knaagdier wervelkolom is ook een beperking.

Dit protocol is modulair en daarom kan eenvoudig worden aangepast aan de behoeften van de onderzoeker. Bijvoorbeeld, kunnen de athymic ovariectomized ratten worden gebruikt om te bestuderen van andere fracturen osteoporose bedrijfsgerelateerde. Moet een onderzoeker kiezen onze benadering van semiautomated bot regeneratie analyse, kan het worden toegepast op elk model van de breuk met behulp van longitudinaal structurele imaging, niet noodzakelijkerwijs micro-berekend tomografie. Bovendien kan aanvullende informatie worden verzameld door het gelijktijdig gebruik van extra beeldvormende modaliteiten zoals magnetische resonantie beeldvorming.

Het model van de OVCF gepresenteerd in dit protocol kan worden gebruikt om de studie van nieuwe therapeutische benaderingen van dit klinisch unmet behoefte. Bovendien, onze benadering van semiautomated analyse kan met succes worden gebruikt voor het uitvoeren van een soortgelijke analyse die is minder afhankelijk van de gebruiker en biedt betere nauwkeurigheid dan andere methoden16. Bijzonder opmerkelijk is het feit dat we verkrijgbare visualisatie en analyse software die worden door elke onderzoeker gebruikt kan gebruikt — software die extra beeldvormende modaliteiten, zoals magnetische resonantie beeldvorming en nucleaire beeldvorming ondersteunt. Wij zijn daarom van mening dat deze methode zeer gegeneraliseerd is en alleen door de beschikbaarheid van in vivo imaging mogelijkheden en registratie software beperkt wordt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie van het California Institute voor regeneratieve geneeskunde (CIRM) (TR2-01780).

Acknowledgements

Het onderzoek werd gesteund door een subsidie van het California Institute voor regeneratieve geneeskunde (CIRM) (TR2-01780).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane MWI Animal Health, Pasadena, CA 501017
BetadineSolution MWI Animal Health, Pasadena, CA 4677
Chlorhexidine Gluconate 2% scrub MWI Animal Health, Pasadena, CA 510083
Isopropyl Alcohol 70%-quart MWI Animal Health, Pasadena, CA 501044
Carprofen MWI Animal Health, Pasadena, CA 26357
Buprenorphine 0.3 mg/mL MWI Animal Health, Pasadena, CA 56163
Ovariectomized Athymic nude rats Harlan Laboratories, Indianapolis, IN Hsd:RH-Foxn1 rnu
Low calcium food Newco Distributors, Inc., CA 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium)
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation 14190250
Dermabond J AND J ETHICON DHVM12
Anesthesia machine Patterson Scientific TEC 3EX
Slide Top Induction Chambers Patterson Scientific 78917833
ProStation Heated Workstation Patterson Scientific 78914731
Surgical drape HALYARD HEALTH INC 89101
Magnetic fixator retraction system Fine Science Tools, Inc., CA 18200-50
Dissecting Scissors, 10 cm, Curved, SS World Precision Instruments, FL 14394
Iris Scissors, 11.5 cm, 45 °Angle, Serrated, Sharp/Sharp World Precision Instruments, FL 503225
Forceps, no. 5 World Precision Instruments, FL 555048FT
Micro Mosquito Hemostatic Forceps World Precision Instruments, FL 503360
Sterile cotton gauze Medtronic, MINNEAPOLIS, MN 9024
Absorption Spears - Mounted/Sterile Fine Science Tools, CA 18105-01
Syringe, 1 mL TERUMO TERUMO MED SS-01T
Needle, 25 gauge BD MED SYS INJECTION SYS 305127
Laminar flow hood Baker SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet
Thermal Cautery Unit World Precision Instruments, FL 501292
Micro-Drill OmniDrill115/230V World Precision Instruments, FL 503598
Trephines for Micro Drill, 2 mm diameter Fine Science Tools, CA 18004-20
3-0 Vicryl undyed 27” SH taper J AND J ETHICON 1663G
4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting J AND J ETHICON 1954G
Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) Scanco Medical vivaCT 40
SCANCO Medical microCT systems software suite Scanco Medical vivaCT 40
Analyze software Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN Analyze 12 Image analysis software
Veterenery eye ointment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, M. L., Massie, J., Perry, A., Garfin, S. R., Kim, C. W. A rat osteoporotic spine model for the evaluation of bioresorbable bone cements. Spine J. 7, (4), 466-474 (2007).
  2. Consensus development conference: prophylaxis and treatment of osteoporosis. Am J Med. 90, (1), 107-110 (1991).
  3. Center, J. R., Nguyen, T. V., Schneider, D., Sambrook, P. N., Eisman, J. A. Mortality after all major types of osteoporotic fracture in men and women: an observational study. Lancet. 353, (9156), 878-882 (1999).
  4. Buchbinder, R., et al. A randomized trial of vertebroplasty for painful osteoporotic vertebral fractures. N Engl J Med. 361, (6), 557-568 (2009).
  5. Kallmes, D. F., et al. A randomized trial of vertebroplasty for osteoporotic spinal fractures. N Engl J Med. 361, (6), 569-579 (2009).
  6. Kado, D. M., et al. Vertebral fractures and mortality in older women: a prospective study. Study of Osteoporotic Fractures Research Group. Arch Intern Med. 159, (11), 1215-1220 (1999).
  7. Silverman, S. L. The clinical consequences of vertebral compression fracture. Bone. 13, Suppl 2. S27-S31 (1992).
  8. Ross, P. D. Clinical consequences of vertebral fractures. Am J Med. 103, (2A), 30S-43S (1997).
  9. Saito, T., Kin, Y., Koshino, T. Osteogenic response of hydroxyapatite cement implanted into the femur of rats with experimentally induced osteoporosis. Biomaterials. 23, (13), 2711-2716 (2002).
  10. Koshihara, M., Masuyama, R., Uehara, M., Suzuki, K. Effect of dietary calcium: Phosphorus ratio on bone mineralization and intestinal calcium absorption in ovariectomized rats. Biofactors. 22, (1-4), 39-42 (2004).
  11. Martin-Monge, E., et al. Validation of an osteoporotic animal model for dental implant analyses: an in vivo densitometric study in rabbits. Int J Oral Maxillofac Implants. 26, (4), 725-730 (2011).
  12. Agata, U., et al. The effect of different amounts of calcium intake on bone metabolism and arterial calcification in ovariectomized rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 59, (1), 29-36 (2013).
  13. Govindarajan, P., et al. Bone matrix, cellularity, and structural changes in a rat model with high-turnover osteoporosis induced by combined ovariectomy and a multiple-deficient diet. Am J Pathol. 184, (3), 765-777 (2014).
  14. Govindarajan, P., et al. Implications of combined ovariectomy/multi-deficiency diet on rat bone with age-related variation in bone parameters and bone loss at multiple skeletal sites by DEXA. Med Sci Monit Basic Res. 19, 76-86 (2013).
  15. Alt, V., et al. A new metaphyseal bone defect model in osteoporotic rats to study biomaterials for the enhancement of bone healing in osteoporotic fractures. Acta Biomater. 9, (6), 7035-7042 (2013).
  16. Liang, H., et al. Use of a bioactive scaffold for the repair of bone defects in a novel reproducible vertebral body defect. Bone. 47, (2), 197-204 (2010).
  17. Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14, (3), 445-454 (2014).
  18. Fujishiro, T., et al. Histological evaluation of an impacted bone graft substitute composed of a combination of mineralized and demineralized allograft in a sheep vertebral bone defect. J Biomed Mater Res A. 82, (3), 538-544 (2007).
  19. Sheyn, D., et al. Gene-modified adult stem cells regenerate vertebral bone defect in a rat model. Mol Pharm. 8, (5), 1592-1601 (2011).
  20. Phillips, F. M., et al. In vivo BMP-7 (OP-1) enhancement of osteoporotic vertebral bodies in an ovine model. Spine J. 6, (5), 500-506 (2006).
  21. Kobayashi, H., et al. Long-term evaluation of a calcium phosphate bone cement with carboxymethyl cellulose in a vertebral defect model. J Biomed Mater Res A. 88, (4), 880-888 (2009).
  22. Turner, T. M., et al. Vertebroplasty comparing injectable calcium phosphate cement compared with polymethylmethacrylate in a unique canine vertebral body large defect model. Spine J. 8, (3), 482-487 (2008).
  23. Zhu, X. S., et al. A novel sheep vertebral bone defect model for injectable bioactive vertebral augmentation materials. J Mater Sci Mater Med. 22, (1), 159-164 (2011).
  24. Vanecek, V., et al. The combination of mesenchymal stem cells and a bone scaffold in the treatment of vertebral body defects. Eur Spine J. 22, (12), 2777-2786 (2013).
  25. Geusens, P., et al. High-resolution in vivo imaging of bone and joints: a window to microarchitecture. Nat Rev Rheumatol. 10, (5), 304-313 (2014).
  26. Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology (Oxford). 47, Suppl 4. 9-16 (2008).
  27. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6, (1), 105-110 (2011).
  28. Lambers, F. M., Kuhn, G., Schulte, F. A., Koch, K., Muller, R. Longitudinal assessment of in vivo bone dynamics in a mouse tail model of postmenopausal osteoporosis. Calcif Tissue Int. 90, (2), 108-119 (2012).
  29. de Bakker, C. M., et al. muCT-based, in vivo dynamic bone histomorphometry allows 3D evaluation of the early responses of bone resorption and formation to PTH and alendronate combination therapy. Bone. 73, 198-207 (2015).
  30. Lan, S. H., et al. 3D image registration is critical to ensure accurate detection of longitudinal changes in trabecular bone density, microstructure, and stiffness measurements in rat tibiae by in vivo microcomputed tomography (μCT). Bone. 56, (1), 83-90 (2013).
  31. Nishiyama, K. K., Campbell, G. M., Klinck, R. J., Boyd, S. K. Reproducibility of bone micro-architecture measurements in rodents by in vivo micro-computed tomography is maximized with three-dimensional image registration. Bone. 46, (1), 155-161 (2010).
  32. Sheyn, D., et al. PTH Induces Systemically Administered Mesenchymal Stem Cells to Migrate to and Regenerate Spine Injuries. Mol Ther. 24, (2), 318-330 (2016).
  33. Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comp Med. 58, (5), 424-430 (2008).
  34. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25, (7), 1468-1486 (2010).
  35. de Lange, G. L., et al. A histomorphometric and micro-computed tomography study of bone regeneration in the maxillary sinus comparing biphasic calcium phosphate and deproteinized cancellous bovine bone in a human split-mouth model. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 117, (1), 8-22 (2014).
  36. Ramalingam, S., et al. Guided bone regeneration in standardized calvarial defects using beta-tricalcium phosphate and collagen membrane: a real-time in vivo micro-computed tomographic experiment in rats. Odontology. 104, (2), 199-210 (2016).
  37. Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. (2013).
  38. Wang, M. L., Massie, J., Allen, R. T., Lee, Y. P., Kim, C. W. Altered bioreactivity and limited osteoconductivity of calcium sulfate-based bone cements in the osteoporotic rat spine. Spine J. 8, (2), 340-350 (2008).
  39. Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14, (3), 445-454 (2013).
  40. Sheyn, D., et al. PTH induces systemically administered mesenchymal stem cells to migrate to and regenerate spine injuries. Mol Ther. 24, (2), 318-330 (2015).
  41. Matthieu, R., et al. A new rat model for translational research in bone regeneration. Tissue Eng Part C Methods. (2015).
  42. Turner, A. S. Animal models of osteoporosis--necessity and limitations. Eur Cell Mater. 1, 66-81 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics