구슬 눈물 Cytokine 프로 파일의 분석에 대 한 다중 분석 결과 기반으로

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

눈물 영화 cytokines의 분석은 다양 한 안구 질환을 공부에 도움이 됩니다. 비드 기반 다중 분석 간단 하 고 민감한 고 작은 볼륨으로 샘플에서 여러 대상의 테스트를 활성화. 우리가 눈물 영화 cytokine 사용 하 여 프로 파일링에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기 비드 다중 분석 결과 기반으로.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Balne, P. K., AU, V. B., Tong, L., Ghosh, A., Agrawal, M., Connolly, J., Agrawal, R. Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles. J. Vis. Exp. (128), e55993, doi:10.3791/55993 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

눈물 영화 윤 활, 영양 및 원본 셀에 대 한 보호를 제공 하는 눈의 외부 표면을 커버 하는 지질, 단백질과 미네랄의 복잡 한 혼합물 이다. 눈물의 분석 예측, 진단, 및 각종 눈 질병의 예 후에 대 한 생체의 식별에 대 한 신흥 지역 이다. 눈물은 쉽게 접근할 수 있는 하 고 그들의 컬렉션은 비 침략 적 이다. 따라서, 발전 기술 여러 analytes 단백질 또는 대사 산물 구성과 연관의 병 적인 조건에 변화를 공부 하는 눈물에서의 식별에 대 한 굴지를 얻고 있다. 눈물 cytokines 안구 표면 상태를 공부에 대 한 이상적인 생체 이며 또한 건조 눈 질병 및 vernal 결막염 같은 다른 안구 표면 질환의 메커니즘을 이해에 도움이. 비드 기반 다중 분석 실험의 높은 감도와 적은 양의 샘플에서 여러 analytes를 감지 기능이 있다. 우리가 눈물 샘플 컬렉션의 표준화 된 프로토콜을 설명 하는 여기, 추출 및 cytokine 구슬을 사용 하 여 프로 파일링 분석 기반 다중 분석 결과.

Introduction

눈물 눈물 동맥 액세서리 땀 샘에 의해 생산 하 고 눈의 외부 표면 코트. 눈물 영화 외부 지질 층 및 수용 성 단백질을 포함 하는 내부 수성 층의 구성, mucins과 막 바인딩된 mucins. 눈물 미생물 침입 방지, 영양분을 공급 하 고 눈 표면에 윤 활을 제공 합니다. 눈물은 공기와 각 막에 산소 수송을 위한 조직 간의 인터페이스 역할을 합니다. 1 눈물 영화 단백질, 탄수화물, 지질, 전해질의 구성 되어 있습니다. 눈 및 조직의 질병 눈물 단백질 사이 협회 같은 당뇨병 mellitus, vernal 결막염, 건조 한 눈 질환, 녹 내장, 갑 상선 관련 orbitopathy 및 암 여러 연구에서 발견 되었습니다. 2 , 3 , 4 눈물 샘플을 microcapillary 관에 의해 수집 될 수 있습니다 또는 눈물 흐름 스트립 (Schirmer 스트립). 또한, Schirmer의 시험 각 막 굴절 수술 클리닉, cytokine 분석 분석 실험의 결과 사용할 수 있습니다에서 수행 하는 표준 절차입니다. 비-침략 적 샘플 컬렉션, 생물 표본의 접근성 및 다양 한 생리 및 병리학 조건 눈물 구성의 협회 영화 여러 눈 및 전신 질환에 대 한 생체의 눈물 확인 합니다. 4 , 5 , 6

눈물 cytokines 안구 표면 상태를 공부 하 고 다양 한 눈 질환의 염증 성 조건에서 중요 한 역할을 한다. 7 눈물 샘플에서 여러 가지 cytokines의 비정상적인 농도 건조 눈 질병, vernal 성 각 결막염 (VKC), 아 토 피 성 각 결막염 (AKC), 계절 알레르기 결막염, 그리고 포도와 관련 된 것으로 알려졌다. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 눈물 단백질 질량 분석, 서 부 럽 고 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA) 같은 전통적인 방법으로 분석할 수 있습니다. 14 , 그러나 15 , 이러한 방법의 한계는 불 쌍 한 감도 각 환자에서 여러 눈물 cytokines의 분석에 필요한 샘플의 더 큰 볼륨. 16 , 17 비드 기반 다중 분석 실험 분석 하는 복잡 한 혼합 샘플에 여러 analytes를 개발 하 고 되었습니다 눈물 샘플을 분석 하는 다른 질병에 여러 cytokines에 성공적으로 적용. 6 , 샌드위치 ELISA의 18 A 조합과 흐름 cytometry 기술을 단일 샘플에서 여러 analytes의 정량화에 대 한 엘리 사 보다 더 민감한 되기 이러한 분석 가능 19 이 메서드는 다양 한 임상 및 세포 문화 supernatants 샘플과 여러 병 태 생리 조건에서 면역 반응의 연구에 도움이에 적용할 수 있습니다. 20 , 21 , 22 , 23 , 24

여러 연구 비교 기반 비드 멀티플렉스와 ELISA 분석 실험 방법 사이의 상관 관계를 보고 있다. 화장실 외. 비해 구슬 resistin, leptin 및 인간의 혈 청 또는 플라스마 견본에 렐 adiponectin의 검출에 대 한 기존의 ELISA 다중 분석 결과 기반으로 하 고 강한 상관 관계를 보고 (r > 0.9)는 분석 실험 사이. 25 듀 폰 외. 보고 IL 1β의 검출에 대 한 비드 기반 다중 분석 실험 및 ELISA 사이 강한 상호 관계 일리노이-4, IL-5, 일리노이-6, 일리노이-10, IFN-ϒ, 및 phytohemagglutinin에 lipopolysaccharide TNF-α 전 혈 자극 임산부에서 수집. 26 피커링 외. 보고 Haemophilus 인플루엔자 b 형 다 당 류를 혈 청 항 체의 검출에 대 한 비드 기반 다중 분석 결과 엘리 사 사이 또 다른 강한 상관 관계 (r = 0.96), 의 toxoids Clostridium tetani (r = 0.96), 그리고 Corynebacterium diphtheriae (r = 0.91). 27 Biagini 그 외 여러분 보고 높은 긍정적인 상관 관계 (r = 0.852) 구슬 기반 다중 분석 결과 균 결국 안티-PA IgG 혈 청 샘플에서의 검출 ELISA 사이. 28외. 보고 알츠하이머병 바이오 마커의 아 밀 로이드 β 42의 검출에 대 한 비드 기반 다중 분석 결과 엘리 사 사이 상관 관계 (r = 0.77), 총 타우 (r = 0.94), 그리고 아미노산 181에 phosphorylated 타우 (r = 0.82)에 척수 샘플입니다. 29 이러한 연구 구슬의 적용 다양 한 임상 샘플, 작은 샘플 볼륨 요구 사항 및 표준 ELISA와 상관 관계는 유망한 비드 기반 다중 분석 실험에 다중 분석을 기반으로 증명 다른 유형의 다른 질병 고기에서 샘플에 여러 analytes의 검출을 위한 전통적인 ELISA 방법에 대안. 여기 우리가 cytokine Schirmer 스트립을 사용 하는 건강 한 과목에서 수집 된 눈물 샘플에서 41 analytes에 대 한 프로 파일링에 대 한 비드 기반 다중 분석 결과 대 한 표준화 된 프로토콜을 설명 합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

이 연구에 사용 되는 프로토콜 탄 딱 셍 병원, 싱가포르의 기관 검토 위원회에 의해 승인 했다.

1. Cytokine 분석 눈물

  1. 눈물의 컬렉션:
    1. 주제는 검사의 자에 편안 하 게 앉아 고 머리 받침에 대 한 자신의 머리를 물어.
    2. 주제 조회, 신중 하 게 (Whatman 여과 지 no. 41의 만든) Schirmer 스트립을 열고 및 스트립의 둥근된 끝에 눈의 열 등 한 fornix 놓고 5 분 동안 눈을 지시를 요구 하십시오. 수집 하는 동안 눈물 눈 표면 접촉을 최소화 하기 위해 주의 걸릴. 30
    3. 스트립을 제거 하 여 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 자신의 눈을 열어 주제 요청. 즉시 전송 튜브 실험실 또는 상점에서-80 o C cytokine 프로 파일링 테스트까지.
  2. 눈물 흐름 스트립에서 눈물 샘플의 차입:
    1. 눈물 흐름 스트립 (표준화 테스트할 눈물의 양)을 0.5 c m의 길이로 잘라 멸 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에.
    2. 추가 30 µ l의 버퍼를 시험 하 고 1 분에 대 한 14000 x g에서 튜브 centrifuging 뒤 5 분 동안 실 온에서 품 어
    3. 다른 1.5 mL microcentrifuge 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 스트립을 폐기. 얼음에 튜브를 포함 하는 샘플을 놓고 cytokine 프로 파일링 eluted 눈물 샘플을 즉시 사용.
  3. 시 약의 준비:
    참고: 41 analytes 구슬 기반 다중 분석 결과 의해 각 샘플에서 테스트 하는 인터 루 킨 (IL)-1α, IL 1β, IL Rα, 일리노이-2, 일리노이-3, 일리노이-4, IL-5, 일리노이-6, 일리노이-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13 일-15, IL-17A, 인터페론-알파 (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-감마-유도할 수 있는 단백질 10 (IP-10, CXCL10), 대 식 세포에서 파생 된 chemokine (MDC), 대 식 세포의 염증 성 단백질 (MIP)-1α 및 MIP-1β, monocyte 혈 단백질 (MCP)-1, TNF-β, 성장 규제 oncogene (촉진제), 종양 성장 인자 알파 (TGF-α), 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), 표 피 성장 인자 (EGF), 섬유, MCP-3, 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α) 성장 인자 (FGF)-2, 혈소판 파생 된 성장 인자 (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, granulocyte 콜로 니 자극 인자 (G-CSF), granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF), eotaxin, fractalkine, 녹는 CD40 ligand (sCD40L), Fms 처럼 티로신 키 니 아 제 3 ligand (Flt-3 L) 및 활성화 시 규제, 정상적인 T 세포 표현 및 분 비 단백질 (RANTES).
    1. 실내 온도 (20-25 o C)을와 동 항 체 비드 솔루션 (50 X) 튜브 1 분에 대 한 튜브를가지고
    2. 분석 결과에 필요한 우물의 수를 계산 하 고 전체 항 체 비드 칵테일 솔루션 (잘 당 25 µ L) 및 분석 결과에 필요한 각 항 체 비드 솔루션 (50 X)의 수량 계산.
    3. 비드 희석제의 남은 금액을 추가 하 여 원하는 최종 볼륨을 각 항 체 비드 솔루션 및 채우기의 계산된 금액을 추가 하 여 칵테일 솔루션을 준비 합니다. 칵테일에 각 항 체의 최종 농도가 1 X 인지 확인 합니다. 항상 준비 하는 적어도 20 %pipetting 오류가 발생할 경우 칵테일 솔루션의 추가 볼륨.
      참고: 예를 들어, 96-잘 분석 결과 3000 µ L 항 체 비드 칵테일 솔루션의 준비. 각 항 체 비드 솔루션의 필요한 금액 = 3000/재고 농도의 각 항 체 비드 솔루션; 3000/50 = 각 항 체 비드 솔루션
      1. 41 항 체 비드 솔루션의 추가 60 µ L의 60 µ L (60 X 41 = 2460 µ L) 칵테일으로 병 하 고 최종의 3000 µ L을 항 체 비드 혼합물에 구슬 희석제 솔루션의 540 µ L를 추가 작업 솔루션 (X 1).
      2. 를 사용 하기 전에 제대로 구슬 칵테일 솔루션 혼합. 분석 결과 최대 30 일 동안 2-8 o C에서 나머지 볼륨을 저장 후.
    4. 250 µ L 이온된 물 QC 1 및 QC 2 주식에 추가 하 여 품질 컨트롤 (QC)를 준비.
    5. 혼합 제대로 반전 병 여러 번와 소용돌이 10 미 전송에 대 한 솔루션을 제대로 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브를 표시 하 고 최대 30 일 동안 사용 될 수 있는-20 ° C에서 나머지 솔루션 저장.
    6. 준비 10 X 30 ml 270 mL 이온된 수를 추가 하 여 워시 버퍼 버퍼 솔루션을 세척 하 고 잘 혼합 (희석, 전에 실내 온도에 10 X 버퍼를가지고 혼합 하 여 모든 소금 침전을 용 해). 최대 30 일 동안 사용 될 수 있는 2-8 ° C에 사용 하지 않는 워시 버퍼 (1 X) 저장.
    7. 재고 유리병에 250 µ L 이온된 수를 추가 하 여 인간의 cytokine 표준 주식 (모든 analytes의 10000 pg/mL)을 준비 합니다. 여러 번와 소용돌이 10 유리병을 반전 하 여 잘 혼합 미 수 10 분 동안 서 서 하 고 제대로 표시 된 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브 재고 솔루션을 전송. 분석 결과, 후-20 ° c, 최대 30 일 동안 사용할 수 있는 나머지 솔루션 저장.
    8. 작업 인간의 cytokine 표준 5 직렬 희석 하 여 준비 (50 µ L-> 200 µ L) 2000 년을 분석 결과 버퍼 400, 80, 16, 및 3.2 pg/mL.
    9. 표준 준비 후 60 분 이내 작업 표준을 사용 하 고 분석 결과 버퍼를 사용 하 여 빈/배경으로 (-pg/mL).
  4. 다중 분석 결과 기반으로 구슬에 의해 프로 파일링 Cytokine:
    1. 결정 96 잘 접시에 그들을 추가 하기 전에 5-10 초 동안 실내 온도 소용돌이에 모든 시 약을가지고. O C 분석 결과, 이전 얼음에 얼어붙은 눈물 추출 물 해 동 및 5 분에 대 한 1000 X g에서 원심 eluted 눈물 샘플-80에 저장 된 경우
    2. 인간의 cytokine 표준 작업에 대 한 수직 구성 분석 결과 작업 시트 준비 [0 (비어 있음), 3.2, 16, 80, 400, 2000, 그리고 10000 pg/mL], QC2와 샘플 QC1.
    3. 워시 버퍼 각 X 1의 추가 200 µ L 접시의 잘, 플레이트 마감재와 인감 및 실내 온도 (20-25 o C) 10 분 대에 판 통에 그것을 유지합니다
    4. 접시를 반전 하 여 1 X 워시 버퍼를 가만히 따르다을 누릅니다 그것 흡수 성 수건에 여러 번 우물에서 어떤 잔여 양의 워시 버퍼를 제거 하.
    5. 추가 25 µ L의 각 작업 인간의 cytokine 표준, QC1, QC2, 빈 (분석 결과 버퍼)와 적절 한 우물에 샘플.
    6. 각 우물에 분석 결과 버퍼의 추가 25 µ L.
    7. 1 X의 추가 25 µ L 항 체 비드 칵테일 솔루션 각 우물에. 빛에 민감한 항 체 비드 솔루션으로, 플레이트 플레이트 마감재와 밀봉 하 고 분석 결과 동안 빛에서 그것을 보호 하기 위해 알루미늄 호 일 커버.
    8. 4 o C 하룻밤에 통에서 접시를 품 어.
    9. 자동 자석 접시 세탁기의 접시 선반에 접시를 놓습니다. 우물의 바닥에 자석 구슬을 정착 잘 내용을 발음을 1 분 동안 앉아 보자. 잘 당 워시 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 그것을 1 분 동안 앉아 다음 잘 내용을 발음. 다시 한번 세척을 반복 (접시 세척 키트 제조 업체에 따라 ' s 지침).
    10. 각 탐지 항 체 솔루션의 추가 25 µ L 잘, 접시를 봉인, 알루미늄 호 일, 그것을 커버 하 고 통에 60 분 동안 실내 온도에 품 어.
    11. 추가 Streptavidi의 25 µ L각 음에 n Phycoerythrin 솔루션 인감 접시, 알루미늄 호 일, 커버와 통에 30 분 동안 실 온에서 품 어.
    12. 자석 접시 세탁기에 접시를 놓습니다. 그것은 1 분 동안 앉아 다음 잘 내용을 발음 하자. 잘 당 워시 버퍼의 200 µ L를 추가 합니다. 그것은 1 분 동안 앉아 다음 잘 내용을 발음 하자. 다시 한번 세척 반복.
    13. Resuspend 항 체 비즈를 실 온에서 5 분 통에 접시를 각각 잘 칼 집 액체의 추가 150 µ L.
    14. 접시는 비드를 사용 하 여 즉시 다중 분석 결과 플레이트 리더를 기반으로 읽었고 5 매개 변수 커브 피팅 알고리즘을 사용 하 여 사이토카인 농도 분석. 눈물 cytokine 프로 파일링의 흐름 회로도 그림 1에 표시 됩니다.
  5. 분석 결과 플레이트 (악기 설정) 및 데이터 분석:
    1. 구슬에 스위치 기반 다중 분석 결과 리더와 사전 따뜻한 30 분에 대 한 레이저
    2. 구슬 기반 다중 분석 소프트웨어를 시작합니다. 아래는 ' 자동 유지 보수 ' 탭을 선택은 ' 교정 확인 ' 옵션. 지정 된 우물에 각 시 약의 소용돌이 각 시 약 유리병 교정 및 검증 구슬의 30 s. 장소 5에 대 한 삭제 합니다. 이온을 제거 된 물, 70% 에탄올에 채워 지정된 저수지.
    3. 만들기 새 프로토콜
      1. 열는 ' 프로토콜 ' 페이지 그리고는 ' 프로토콜 ' 클릭 " 만들 새로운 ProtocolŔ는 ' 설정 ' 탭 열립니다.
      2. 에 ' 이름 ' 상자는 프로토콜의 이름을 입력 합니다.
      3. 의 오른쪽 상자에 설명을 입력 합니다 ' 이름 ' 상자.
      4. 에 ' 버전 ' 상자는 프로토콜의 버전을 입력 합니다.
      5. 에 ' 제조 업체 ' 상자는 프로토콜에 대 한 제조 업체 정보를 입력 합니다.
      6. 정의 설정에는 ' 수집 설정 ' 섹션을 다음과 같습니다. 설정 ' 볼륨 ': 100 µ L, ' 제한 시간 ': 60 s; ' DD 게이팅 ': 8000 15000; ' 기자 이득 ': 표준 PMT; ' 유형 구슬 ': 마그네틱 비드.
      7. 정의 설정에는 ' 분석 설정 ' 섹션, 선택 ' 정량 ' 분석 유형으로. 설정 ' 표준의 번호 ': 6; ' 컨트롤의 번호 ': 0; 진드기는 ' 복제의 의미 ' 상자;
        진드기는 ' 결과 분석 하는 샘플을 수집 하는 동안 ' 상자.
      8. 클릭 " NextŔ는 ' Analytes ' 열립니다 탭, 번호 분석 표에 원하는 analytes (ID 비드)에 클릭.
      9. 클릭 하 고 해당 분석 이름을 입력은 ' 이름 ' 분석 표의 오른쪽 열 (analytes ' 이름 및 해당 구슬 지역 세부 정보는 표 1에서 언급 했다).
      10. 클릭에서 원하는 단위 (예: pg/mL)를 입력 하 고는 ' 단위 '의 왼쪽에 상자는 ' 적용 모든 ' 버튼. 다음을 클릭 합니다 " 모든 적용 ".
      11. 클릭 하 고 유형 원하는 구슬 (즉, 50)에서 각 분석에 대 한 카운트는 ' Count ' 상자. 클릭 " 모든 ".
      12. 클릭 " NextŔ 플레이트 레이아웃 탭이 열립니다. 표준 및 선택에 대 한 웰 스 강조 " 2 " 아래 수를 복제 하 고 클릭할는 " S " 표준 단추. 이 단계를 반복 하는 배경에 대 한 " B " 및 샘플 " U " 우물.
      13. 클릭 " 저장 ".
    4. 새로운 표준/제어 많은 만들
      1. 오픈는 ' 프로토콜 ' 페이지, 그리고는 ' 표준 & 컨트롤 ' 클릭 " 새로운 표준/제어 많은 만들 ".
      2. 열기는 ' 프로토콜 선택 ' 상자. 1.5.3 단계에서 만든 프로토콜을 선택 하십시오.
      3. 기준의 정보에 따라 키: 성병/Ctrl 키트 번호, 성병/Ctrl 키트 이름, 만료, 및 제조 업체.
      4. 키 각 분석 (즉, 10000 pg/mL)에 대 한 높은 기준 값에. 5 희석에서 키를 클릭 " 적용 모든 " 기준의 나머지 부분에 대 한 예상된 농도 자동으로 생성 하.
      5. 클릭 " 저장 ".
    5. 만들기 기존 프로토콜에서 새로운 일괄 처리
      1. 오픈는 ' 배치 ' 페이지와 클릭 합니다 " 기존 프로토콜에서 새로운 탭을 만드는 ".
      2. 에 배치 이름을 입력은 ' 일괄 처리 이름 ' 상자에 일괄 처리에 대 한 설명을 입력 하 고는 ' 입력 옵션 설명 ' 상자.
      3. 이전 (1.5.3 단계)에서 생성 하는 프로토콜을 클릭 합니다.
      4. 클릭 " NextŔ는 다음 탭이 있는 ' 성병 & Ctrls ' 탭 분석 결과 표준 및 선택의 세부 사항을 볼 " 다음 ".
      5. 에 ' 접시 레이아웃 ' 탭,이 일괄 처리에 대 한 잘 명령을 할당을 클릭 " 저장 " 배치 정보를 저장 하는 ' 보류 중인 일괄 처리 ' 목록.
      6. 구슬 기반 다중 분석 결과 플레이트 리더에 접시를 로드, 5 분 동안 그것을 동요 하 고 보류 중인 일괄 처리 목록에서 일괄 처리를 실행. 인수 데이터.csv 파일 형식으로 저장 됩니다.
  6. 데이터 분석
    1. rbx 변환 소프트웨어를 사용 하 여.rbx 파일 (결과 데이터 파일) 형식으로 구슬 기반 다중 분석 소프트웨어에서 생성 된.csv 파일을 변환. 변환 소프트웨어를 실행, 선택 xPONENT 파일에서.csv 파일을 선택 하 고 클릭 합니다 " 생성 " 단추; .rbx 파일을 선택 된 출력 폴더에 저장 됩니다.
    2. 분석 소프트웨어를 시작 하 고.rbx 파일을 엽니다.
    3. 는 4PL/5PL 곡선 적합을 사용 하 여 표준 곡선을 최적화 합니다.
      1. 선택에서 다음은 ' 표준 곡선 ' 탭: ' 회귀 유형 ': ' 물류-5PLƆ ' 축 변환 ': ' Log(x)-선형 (y) Ɔ 진드기는 ' 광 범위 라인 표시 ' 상자, 체크는 ' 표시 알 수 없는 샘플 ' 상자; 진드기는 ' 표시 컨트롤 샘플 ' 상자; 진드기는 ' 모든 analytes에 걸쳐 적용 ' 상자; 진드기는 ' 최적화 후 보고서 표시 ' 상자.
      2. 클릭는 " 최적화 " 자동 최적화 버튼.
    4. 아래 샘플 id 라벨 ' 입력 샘플 정보 ' 탭
    5. 얻을에서 관찰 된 농도 ' 보고서 테이블 ' 탭을 클릭 " 보고서 테이블 내보내기 " 추가 분석에 대 한 스프레드시트 파일에서 데이터를 생성 하.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

눈물 샘플 눈물 흐름 스트립을 사용 하 여 4 건강 한 주제의 8 눈에서 수집 된 고 cytokine 레벨 위에서 언급 한 프로토콜을 사용 하 여 분석 했다. 모든 과목은 남성 및 4 명의 과목의 연령은 36, 42, 44, 52 년 각각. 안구 표면 상태 및 건조 눈 질병에 따라 임상 시험 (눈물 영화 휴식 시간, Schirmer의 시험, 각 막 얼룩, conjunctival 얼룩, 뚜껑/meibomian 동맥 검사, 각 막 눈물과 시각적 표시 증상과)에 의해 평가 되었다는 국제 건조 눈 워크숍, 2007 지침 및 과목의 어떤 징후와 건조 안과 질환의 증상을 보여주었다. 31

분석 41 cytokines에서 31 cytokines에에서 검색 된 모든 눈물 샘플, IL-17A, MIP 1β 및 TNF-α에서에서 발견 되었습니다. 7 눈의 4 과목, 일리노이-4, 4 주제의 6 눈에서 검색 되었습니다. IFN-γ의 3 과목, 6 눈에서 검색 되었습니다. IL-1A의 3 제목 5 눈에서 검색 되었습니다.. 학점, eotaxin 및 IL-9 했다 감지 2 과목, 3 눈에서 IL-3 샘플의 아무도에서 1 눈에 밉-1α 검색 되었습니다. 비드 기반 다중 분석 결과 (그림 2)를 사용 하 여 건강 한 과목에서 감지 41 cytokines의 평균 ± SD 농도 표 2에 언급 했다. 분석 41 cytokines에서 IL 1ra 203.9 ± 52.6 ng/mL의 평균 ± SD와 모든 샘플에서 높은 표현을 발견 되었고 271.7 ng/mL 129.64 ng/mL에서 배열 했다. Cytokines IP-10, GRO, MCP-1, PDGF AA, Fractalkine, 일리노이 8, EGF, PDGF BB, VEGF, G-CSF는 또한 매우 건강 한 과목의 눈물에서 (ng/mL 수량)를 표현 및 나머지 cytokines pg/mL 수량 (표 2)에 표현 했다. 눈물 cytokine의 최저 측정된 농도 평균 ± SD 27.25 ± 19.97 pg/mL의와 TNF-α 이었고 10.75 pg/mL에서 56.02 pg/mL에 배열 했다. 모든 샘플에서 발견 된는 31 cytokines에서 아무도 농도에 통계적으로 유의 한 차이 보였다 (p> 0.05) t-검정 (그림 3)에 의해 좌우 눈 사이.

Figure 1
그림 1: 눈물 cytokine 프로 파일링의 흐름 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 건강 한 사람들에서 cytokine 단면도 찢 어. 보여주는 로그 평균 ± SD 농도에서 41 cytokines의 대표 scatterplot 눈물 건강 한 과목에서 수집 된 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 건강 한 과목 간 눈 눈물 cytokine 프로필 차이. 아무 통계적으로 유의 한 차이 보여주는 대표 scatterplot (p> 0.05) 31의 평균 농도 간 눈에 건강 한 과목에서 cytokines를 찢 어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

S. 제 Analytes 비드 지역
1 EGF 12
2 FGF-2 13
3 Eotaxin 14
4 TGF-Α 15
5 G-CSF 18
6 Flt-3 L 19
7 GM-CSF 20
8 Fractalkine 21
9 IFNΑ2 22
10 IFNΓ 25
11 촉진제 26
12 IL-10 27
13 MCP-3 28
14 IL-12 P 40 29
15 MDC 30
16 IL-12 P 70 33
17 PDGF AA 34
18 IL-13 35
19 PDGF-AB/BB 36
20 IL-15 37
21 sCD40L 38
22 IL-17A 39
23 IL 1RA 42
24 IL-1Α 44
25 IL-9 45
26 IL-1Β 46
27 일리노이-2 48
28 IL-3 51
29 IL-4 53
30 IL-5 55
31 일리노이-6 57
32 일리노이-7 61
33 IL-8 63
34 IP-10 65
35 MCP-1 67
36 성능 측정-1Α 72
37 성능 측정-1Β 73
38 RANTES 74
39 TNFΑ 75
40 TNFΒ 76
41 VEGF 78

표 1: Analytes의 이름 및 해당 구슬 지역 세부 사항.

S. 제 사이토카인 눈의 수 과목의 수 평균 농도 SD
1 EGF 8 4 2610.29 1711.56
2 Eotaxin 3 2 404.73 260.76
3 FGF-2 8 4 827.73 262.44
4 Flt-3 L 8 4 475.4 133.6
5 Fractalkine 8 4 4179.08 1888.38
6 G-CSF 8 4 1287.57 633.16
7 GM-CSF 8 4 93.03 28.1
8 촉진제 8 4 23176.87 18692.07
9 IFNa2 8 4 641.4 253.55
10 IFNg 6 3 76.6 42.81
11 IL-10 8 4 101.32 41.52
12 IL-12 p40 8 4 245.46 133.01
13 IL-12
p70 8 4 165.53 73.09 14 IL-13 8 4 685.84 272.92 15 IL-15 8 4 104.4 30.66 16 IL-17A 7 4 164.32 28.69 17 IL-1a 5 3 286.79 166.87 18 IL-1b 8 4 63.98 18.29 19 IL 1ra 8 4 203892.58 52593.48 20 일리노이-2 8 4 78.35 25.15 21 IL-3 1 1 38.2 0 22 IL-4 6 4 268.94 120.84 23 IL-5 8 4 74.96 23.8 24 일리노이-6 8 4 86.97 27.78 25 일리노이-7 8 4 384.08 153.57 26 IL-8 8 4 3615.21 4677.5 27 IL-9 3 2 35.22 5.11 28 IP-10 8 4 87546.26 33256.53 29 MCP-1 8 4 10074.73 8205.5 30 MCP-3 8 4 376.13 120.68 31 MDC 8 4 968.08 309.39 32 성능 측정-1b 7 4 199.72 84.79 33 PDGF AA 8 4 5174.06 4103.97 34 PDGF BB 8 4 2567.61 919.01 35 RANTES 8 4 742.41 457.57 36 TGF-a 8 4 407.82 339.12 37 TNFa 7 4 27.25 19.97 38 TNFb 8 4 124 24.16 39 VEGF 8 4 1601.2 776.85 40 sCD40L 8 4 932.1 509.27 41 성능 측정-1a 0 0 0 0

표 2: 건강 한 과목에서 cytokine 프로필 눈물. ± SD 농도 41 cytokines 비드 기반 다중 분석 결과 사용 하 여 건강 한 과목에서 발견의 의미.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cytokines는 작은 세포 분 비 단백질 면역 반응을 조절 하는 강력한 면역 변조기. 32 눈물 샘플 눈과 프로필 질병 pathogenesis의 메커니즘을 이해, 눈 건강의 상태를 확인 하는 데 도움이 cytokine에 대 한 연구의 다양 한 병 적인 조건에 관련 된 다양 한 cytokines의 식 프로필 질병의 심각도, 진단 및 진행입니다. 2 , 5 더 낮은 단백질 농도 및 작은 샘플 볼륨 눈물 cytokine 단면도의 분석에 대 한 같은 ELISA 분석 실험의 사용을 제한 하는 전통적인 방법의 주요 과제는. 33 비드 기반 다중 분석 ELISA에 비해 뚜렷한 장점이 있는 immunoassays는. 비드 기반 다중 분석 여러 analytes의 분석에 대 한 작은 샘플 볼륨을 요구 하 고 매우 민감한, 생물 학적 체액에서 단백질의 picogram 농도 감지 할 수 있습니다. 34

여기 우리는 비드 기반 다중 분석 결과 사용 하 여 건강 한 사람들에서 41 눈물 cytokines의 정량 분석에 대 한 표준화 된 프로토콜을 보고 합니다. 패널에서 41 cytokines에서 비드 기반 다중 분석 결과 눈물 샘플에 40 cytokines를 감지 하 고 밉-1α를 감지할 수 없습니다. 이 부정적인 결과 건강 한 눈물 샘플에서 또는 작은 양의 눈물 밉-1α의 감지 수준이 있었기 때문에 수 있습니다. 눈물 샘플 Schirmer 스트립을 사용 하 여 수집 microcapillary 튜브와 스폰지 같은 다른 컬렉션 방법에 비해 이점을. 예를 들어, 여러 임상 조건에 눈물 액체 볼륨 측정 될 수 있다 Schirmer 스트립 및 눈물에 의해 유체 측정 후 동일한 스트립에서 eluted 고 수 cytokine 분석에 사용. 35 microcapillary 튜브는 정기적으로 눈물을 수집 하 고 보다 일관성 있는 눈물 프로필을 생성 하는 데 사용 됩니다, 하지만 절차 스트립 방법 보다 더 많은 시간이 걸립니다, 그리고 더 지루한, 그리고 어린이 다른 환자에 대 한 불편 될 수 있습니다. 또한,이 방법은 수 있습니다 또한 결 막으로 반사 눈물 생산을 유발 하 고 따라서 분석 결과의 재현성에 영향을 미치는 기저 눈물에 비해 cytokine 프로필의 변수 결과. 36 건조 안과 질환 같은 일부 임상 조건에 눈물 샘플 컬렉션 Schirmer 스트립에 의해 단백질 분석에 대 한 신뢰할 수 있는 이며 바이오 마커의 식별에 도움이 됩니다. 37 , 38

비드 기반 다중 분석 cytometry의 조합 그리고 멀티플렉스 ELISA는 샘플에서 analytes는 특정 항 체 코팅 및 색상 사이 끼여는 코딩 자석 구슬 또는 스피어와 biotinylated 탐지 항 체. 이 단지는 기자 분자 Streptavidin Phycoerythrin (PE) 공액 듀얼 레이저 시스템에 후속 노출 수정된 흐름 cytometry 기반 악기에 추가 하 여 검색할 수 있습니다. 39 듀얼 레이저 시스템에 하나의 레이저 자극 내부 염료와 신호 코팅된 특정 항 체를 나타냅니다. 두 번째 레이저 흥분 복잡 한 탐지 항 체에 바인딩된 보고 분자 PE 공액 고 신호 강도 분석의 농도 나타냅니다.

다양 한 농도의 염료로 코딩 하는 스피어의 능력 100 다른 analytes는 단일 잘에서 샘플의 작은 볼륨에서까지 감지 하는 분석 결과 사용 합니다. 39 비록 비드 기반 다중 분석 신속 하, 재현, 고 표준 ELISA 분석 실험,34,40 이 방법을 사용 하려면 전용된 악기 키트의 평가 및 표준화에 대 한 프로토콜의 비교 다양 한 생물 표본입니다. 39 자동-임상 견본에 있는 항 체의 존재로에 구슬 기반 다중 결과 영향을 수 있습니다. 34 , 39 임상 설정에서 이러한 분석의 사용, 그것은 것이 좋습니다 한 특정 제조 업체에서 시험 키트를 사용 하 여. 감도, cytokines, 고 재현성의 절대 농도의 탐지는 다른 키트와 함께 다양 하 게 보고 되었다. 41 항 체 microarrays 또는 막 microarrays는 매우 중요 한, 작은 양의 샘플에서 여러 analytes를 감지 하 고에 성공적으로 적용할 수 있는 저렴 한 대체 높은 처리량 기법 눈물의 분석에 대 한 샘플 cytokines 그리고 다른 단백질입니다. 35 , 그러나 42 , 수많은 한계 존재, 이러한 분석은 시간이 소요, 반 정량, 높은 신호 대 잡음 비율을 전시 하 고 표준화 된 프로토콜을 부족. 19 , 43

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 없다. 아니 금융 관심 또는 상충입니다.

Acknowledgments

연구 작업 탄 딱 셍 병원 맞춤형 씨앗 자금 프로그램 2015;에서 센터 그랜트에 의해 지원 되었다 싱가포르 눈 연구 연구소 파일럿 그랜트와 탄 딱 셍 병원 피치 기금 부여합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit Merck, USA HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex instrument  Luminex Corp, Austin, TX, USA
xPonent software  Luminex Corp, Austin, TX, USA
RBXGenerator software BIO-RAD, France
Bio-Plex Manager 6.1 BIO-RAD, France
Plate shaker Corning, USA
TECAN Microplate Washer Tecan, Switzerland HydroSpeed
Vortex Genie 2 Scientific Industries inc, USA G560E
Pipettes Mettler Toledo, CA, USA
1.5ml microcentrifuge tube Axygen, USA MCT-150-C
Schirmer tear flow test strip Eye Care and Cure, USA 101657
Flexmap 3D Calibration Kit Luminex Corp, Austin, TX, USA 40-028
Flexmap 3D Verfication Kit Luminex Corp, Austin, TX, USA 40-029
Ocular examination chair

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conrady, C. D., Joos, Z. P., Patel, B. C. Review: The Lacrimal Gland and Its Role in Dry Eye. J Ophthalmol. 7542929, (2016).
  2. von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. 126-137 (2013).
  3. Pieragostino, D., D'Alessandro, M., di Ioia, M., Di Ilio, C., Sacchetta, P., Del Boccio, P. Unraveling the molecular repertoire of tears as a source of biomarkers: beyond ocular diseases. Proteomics Clin Appl. 9, (1-2), 169-186 (2015).
  4. Azkargorta, M., Soria, J., Acera, A., Iloro, I., Elortza, F. Human tear proteomics and peptidomics in ophthalmology: Toward the translation of proteomic biomarkers into clinical practice. J Proteomics. 150, 359-367 (2017).
  5. Hagan, S., Martin, E., Enríquez-de-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: potential use for predictive, preventive and personalised medicine. EPMA J. 7, 15 (2016).
  6. Rentka, A., et al. Membrane array and multiplex bead analysis of tear cytokines in systemic sclerosis. Immunol Res. 64, (2), 619-626 (2016).
  7. Zhou, L., Beuerman, R. W. Tear analysis in ocular surface diseases. Prog Retin Eye Res. 31, (6), 527-550 (2012).
  8. Jackson, D. C., et al. Tear Interferon-Gamma as a Biomarker for Evaporative Dry Eye Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, (11), 4824-4830 (2016).
  9. Agrawal, R., et al. A distinct cytokines profile in tear film of dry eye disease (DED) patients with HIV infection. Cytokine. 88, 77-84 (2016).
  10. Uchio, E., Ono, S. Y., Ikezawa, Z., Ohno, S. Tear levels of interferon-gamma, interleukin (IL) -2, IL-4 and IL-5 in patients with vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis and allergic conjunctivitis. Clin Exp Allergy. 30, (1), 103-109 (2000).
  11. Leonardi, A., Curnow, S. J., Zhan, H., Calder, V. L. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast cultures. Clin Exp Allergy. 36, (6), 777-784 (2006).
  12. Enríquez-de-Salamanca, A., Calonge, M. Cytokines and chemokines in immune-based ocular surface inflammation. Expert Rev Clin Immunol. 4, (4), 457-467 (2008).
  13. Carreño, E., et al. Cytokine and chemokine tear levels in patients with uveitis. Acta Ophthalmol. (2016).
  14. Bjerrum, K. B., Prause, J. U. Collection and concentration of tear proteins studied by SDS gel electrophoresis. Presentation of a new method with special reference to dry eye patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232, (7), 402-405 (1994).
  15. Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31, (20), 3420-3427 (2010).
  16. Thakur, A., Willcox, M. D. Cytokine and lipid inflammatory mediator profile of human tears during contact lens associated inflammatory diseases. Exp Eye Res. 67, (1), 9-19 (1998).
  17. Wei, Y., Gadaria-Rathod, N., Epstein, S., Asbell, P. Tear cytokine profile as a noninvasive biomarker of inflammation for ocular surface diseases: standard operating procedures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, (13), 8327-8336 (2013).
  18. Topcu-Yilmaz, P., et al. Determination of tear and serum inflammatory cytokines in patients with rosacea using multiplex bead technology. Ocul Immunol Inflamm. 21, (5), 351-359 (2013).
  19. Hagan, S., Tomlinson, A. Tear fluid biomarker profiling: a review of multiplex bead analysis. Ocul Surf. 11, (4), 219-235 (2013).
  20. Choi, R., et al. Serum inflammatory profiles in pulmonary tuberculosis and their association with treatment response. J Proteomics. 149, 23-30 (2016).
  21. Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56, (4), 484-493 (2012).
  22. Staples, E., Ingram, R. J., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. J Immunol Methods. 394, (1-2), 1-9 (2013).
  23. Inic-Kanada, A., et al. Comparison of ophthalmic sponges and extraction buffers for quantifying cytokine profiles in tears using Luminex technology. Mol Vis. 18, 2717-2725 (2012).
  24. Moncunill, G., Aponte, J. J., Nhabomba, A. J., Dobaño, C. Performance of multiplex commercial kits to quantify cytokine and chemokine responses in culture supernatants from Plasmodium falciparum stimulations. PLoS One. 8, (1), e52587 (2013).
  25. Loo, B. M., Marniemi, J., Jula, A. Evaluation of multiplex immunoassays, used for determination of adiponectin, resistin, leptin, and ghrelin from human blood samples, in comparison to ELISA assays. Scand J Clin Lab Invest. 71, (3), 221-226 (2011).
  26. Dupont, N. C., Wang, K., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J Reprod Immunol. 66, (2), 175-191 (2005).
  27. Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clin Diagn Lab Immunol. 9, (4), 872-876 (2002).
  28. Biagini, R. E., Sammons, D. L., Smith, J. P., MacKenzie, B. A., Striley, C. A., et al. Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins. Clin Diagn Lab Immunol. 11, (1), 50-55 (2004).
  29. Wang, L. S., Leung, Y. Y., Chang, S. K., Leight, S., Knapik-Czajka, M., et al. Comparison of xMAP and ELISA assays for detecting cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 31, (2), 439-445 (2012).
  30. Kalsow, C. M., Reindel, W. T., Merchea, M. M., Bateman, K. M., Barr, J. T. Tear cytokine response to multipurpose solutions for contact lenses. Clin Ophthalmol. 7, 1291-1302 (2013).
  31. The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). The ocular surface. 5, (2), 75-92 (2007).
  32. Stenger, S., Röllinghoff, M. Role of cytokines in the innate immune response to intracellular pathogens. Ann Rheum Dis. 60, (2001).
  33. Li, S., et al. Antibody protein array analysis of the tear film cytokines. Optom Vis Sci. 85, (8), 653-660 (2008).
  34. Tighe,, Negm, O., Todd, I., Fairclough, L. Utility, reliability and reproducibility of immunoassay multiplex kits. Methods. 61, (1), 23-29 (2013).
  35. Dionne, K., Redfern, R. L., Nichols, J. J., Nichols, K. K. Analysis of tear inflammatory mediators: A comparison between the microarray and Luminex methods. Mol Vis. 22, 177-188 (2016).
  36. Sitaramamma, T., Shivaji, S., Rao, G. N. HPLC analysis of closed, open, and reflex eye tear proteins. Indian J Ophthalmol. 46, (4), 239-245 (1998).
  37. Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31, (20), 3420-3427 (2010).
  38. VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
  39. Khalifian, S., Raimondi, G., Brandacher, G. The use of luminex assays to measure cytokines. J Invest Dermatol. 135, (4), e31 (2015).
  40. Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. J Biomol Screen. 15, (5), 562-568 (2010).
  41. Berthoud, T. K., et al. Comparison of commercial kits to measure cytokine responses to Plasmodium falciparum by multiplex microsphere suspension array technology. Malar J. 10, 115 (2011).
  42. Boehm, N., Riechardt, A. I., Wiegand, M., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proinflammatory cytokine profiling of tears from dry eye patients by means of antibody microarrays. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, (10), 7725-7730 (2011).
  43. Sack, R., Conradi, L., Beaton, A., Sathe, S., McNamara, N., Leonardi, A. Antibody array characterization of inflammatory mediators in allergic and normal tears in the open and closed eye environments. Exp Eye Res. 85, (4), 528-538 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics