核密度分析的天然染色质沉淀测序文库的生成

Genetics
 

Summary

我们提出了一个改良的本地染色质沉淀测序 (芯片-seq) 的方法, 以生成序列数据集适合核密度芯片-seq 分析框架集成 micrococcal 核酸 (MNase) 可及性组蛋白修饰测量。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lorzadeh, A., Lopez Gutierrez, R., Jackson, L., Moksa, M., Hirst, M. Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis. J. Vis. Exp. (130), e56085, doi:10.3791/56085 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

我们提出了一个改进的本地染色质沉淀测序 (芯片-seq) 实验协议兼容的高斯混合分布的分析方法 (核密度芯片序列; ndChIP-seq), 使生成的micrococcal 核酸 (MNase) 可及性与组蛋白修饰的联合测量。核位置和局部密度, 以及对其组蛋白亚基的后修饰, 协同调节局部转录状态。组合测量的核可达性与组蛋白修饰产生的 ndChIP-seq 允许同时审讯这些功能。ndChIP-seq 方法适用于基于交联的芯片-seq 协议的小数目的原电池。在一起, ndChIP-seq 使测量组蛋白修饰结合局部核密度, 以获得新的洞察力的共享机制, 调节 RNA 转录在稀有的原细胞群体。

Introduction

真核细胞基因组被包装成染色质通过重复核结构, 包括两个副本的四组蛋白 (例如, H2A, H2B, H3, 和 H4) 的限制由146基对的 DNA1,2。染色质重塑复合体在基因启动子边界内控制核位置, 并通过改变 DNA 对转录因子的可及性来参与基因表达的调控, 并对 RNA 聚合酶机械3, 4

核内组蛋白的氨基末端尾端受到各种共价键的修饰, 包括乙酰化、甲基、磷酸、化、sumo、甲, 以及特定氨基酸的羟氨酸5,6,7,8. 这些修改的位置和程度决定了染色质的状态, 影响染色质结构和控制通路的分子配合物, 允许转录活化的7。考虑到核密度和组蛋白修饰在基因转录的局部控制中起着作用, 我们开发了一种本机芯片方法, 可以同时测量核密度和组蛋白修饰9, 10

本机芯片-seq 利用切 micrococci 核酸 (MNase) 在细胞核内的原生状态中消化完整的染色质11,12, 该属性已被杠杆映射核定位13,14,15. 核密度芯片-seq (ndChIP) 利用 MNase 对染色质的开放区域的优先访问性的特性来生成将 MNase 可访问性与组蛋白修饰10相结合的测量。ndChIP-seq 适用于在罕见的原代细胞, 组织和培养细胞的组蛋白修饰的分析。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 使序列数据集的生成适合于先前描述的分析框架工作10 , 它集成了片段大小后沉淀, 由配对端读取边界确定, 以同时调查 MNase 的可访问性与组蛋白修饰测量。此前, 本议定书适用于1万个主要的人脐血衍生 CD34+细胞和人类胚胎干细胞揭示染色质结构和组蛋白修饰之间的独特关系在这些细胞类型中10.考虑到它能够同时测量核的可访问性和组蛋白修饰, ndChIP-seq 能够在单个核级别的单元格中揭示表特征, 并将异构签名解析为组成元素。通过 ndChIP-seq 研究异质细胞群的一个例子是对二价促进剂的调查, 其中两个 H3K4me3, 一个活跃标记, 和 H3K27me3, 一个镇压标记, 存在10

Protocol

注: 该协议的最小输入为每一个免疫-沉淀 (IP) 反应的1万细胞。打印出所提供的实验工作表, 并以此为指导来规划实验。孵化在室温下被假定为22° c。所有的缓冲区食谱都在表 1中提供。所有的缓冲器应储存在4° c, 并保持在冰的过程中, 除非另有说明。

1. 细胞制备

  1. 培养细胞
    1. 用1毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤细胞, 用例准确测定细胞浓度。如果有超过100万细胞, 增加 PBS 的体积。
    2. 根据细胞计数, 分相当于7000万细胞成一个无菌1.5 毫升管, 并在 500 x g 旋转下来6分钟在4° c。使用吸管, 慢慢地去除和丢弃上清 (不干扰细胞颗粒) 和重 ice-cold 裂解缓冲剂 + 1x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒 (PIC) 的浓度为1000细胞/µL. 混合好由移上下20-30次.细胞团簇被破坏是至关重要的。尽量不要制造气泡。
    3. 直接到1天 (2 节) 的 ndChIP-seq 协议或闪存冻结细胞颗粒在液氮和存储在-80 ° c。
  2. 排序单元格
    1. 收集7000万排序的16细胞到1.5 毫升管与350µL 的汉克的缓冲盐溶液 (HBSS), 或 PBS + 2% 胎牛血清 (FBS)。
    2. 向下旋转每个细胞分在 500 x g 为6分钟在4° c。使用吸管, 慢慢地去除上清 (不干扰细胞颗粒) 和重在 ice-cold 裂解缓冲 + 1x PIC 到最后浓度1000细胞/µL. 在裂解缓冲液中混合均匀, 移上下20-30 次。确保细胞团簇被破坏。尽量不要制造气泡。
    3. 直接进行 ndChIP-seq 协议的1天 (2 节), 或在液氮中冻结细胞颗粒, 在-80 ° c 贮存。

2. 1 天: ndChIP-seq

  1. 抗体珠复合物的制备
    1. 准备一个37° c 的水浴和一个冰桶。工作在冰, 准备 1x IP buffer/1x PIC 和1x 抗体 (Ab) 稀释缓冲, 并保持他们在冰上。检索蛋白质 A (或 G) 磁性珠子 (参见讨论为选择标准) 从4° c 存贮, 和混合非常好由柔和的脉冲涡流。把它放在冰上
      注: 脉冲涡流意味着每次在管内形成完整的涡旋时, 涡流停止。
    2. 转移24µL 的蛋白质 a (或 G) 磁珠每 IP 反应到一个新的2毫升管。记录珠子的体积, 把管子放在冰上。例如, 对于 7 IPs, 使用24µL x 7 = 168 µL。
    3. 把管子放在管上磁铁上, 等待溶液变得清晰, 指示珠分离。没有干扰的珠子, 小心删除上清使用吸管和丢弃。把管子从管磁铁上拿下来放在冰上。
    4. 添加一个相等的卷 (, 初始体积的珠子) 的 ice-cold IP 缓冲区 + 1x PIC 混合。移上下混合。不要涡流。
    5. 将 IP 缓冲器 + 1x PIC + 珠子放回管磁铁上, 等待解决方案变得清晰指示珠分离。没有干扰的珠子, 小心删除上清使用吸管和丢弃。重复冷 IP 缓冲区 + 1X PIC 洗两次, 共3洗。
    6. 最后的洗涤后, 重的珠子在一个相等的体积 (, 初始体积珠) 的 ice-cold IP 缓冲区 + 1x PIC 混合。移上下混合。不要涡流。把管子放在冰上。
    7. 在冰上, 倒入10毫升的 IP 缓冲 + PIC 到一个25毫升 V 形油藏。使用多通道吸管, 添加130µL ice-cold IP 缓冲 + 1x PIC 混合到单个井的一个干净的 V 底 96-井板。每个 IP 填充一个井。把盘子贴上 "Ab 珠情结"。
    8. 添加12µL 的洗涤蛋白 A (或 G) 磁珠进入每个井包含 IP 缓冲区 + PIC, 并混合移上下。把剩下的水洗珠留在冰上。
    9. 如果需要的话, 从冷库中获得经验证的抗体并在冰上解冻。在冰上工作, 用 1x Ab 稀释缓冲液将抗体稀释到表 2中所示的浓度。
    10. 对 Ab 珠复合板的每一个井, 增加1µL 适当, 稀释抗体 (表 1)。将井记录到抗体键。使用多通道吸管, 每行混合移上下20次。更改行之间的提示。用铝板盖将 Ab 珠复合板密封好, 在旋转平台上孵育4° c, 至少2小时。
      注意: 这种孵化可以继续, 直到开始步骤2.4。
  2. 细胞裂解与染色质消化
    1. 在冰上工作, 准备1x 裂解缓冲液 + 1x PIC 和1毫升的 MNase I 稀释缓冲器 (表 3) 并将它们放在冰上。
    2. 从他们的-80 ° c 存储器 (或从冰, 如果新鲜地准备) 检索细胞小球。在一个十年代的37° c 水浴中解冻每个细胞颗粒, 然后转移到冰。
    3. 对每个细胞颗粒立即添加 ice-cold 1x 裂解缓冲 + 1x PIC 到最后浓度 1万 cells/20 µL, 并混合10倍, 由移上下, 不创造气泡。例如, 对于7万单元格, 最终卷是140µL。
    4. 在冰上工作, 分20µL/井的结果裂解成一个96井板。用塑料封口盖住盘子, 在冰上孵育20分钟, 贴上盘子 "MNase 消化" 的标签, 并将油井记录到模板钥匙上。为了保证染色质消化反应的确切时间, 不要一次进行超过2排样品的消化。
    5. 就在20分钟的溶解是完整的, 稀释 MNase i 酵素与 MNase i 稀释缓冲, 到最后集中 20 U 或µL, 并且保持它在冰。
    6. 在冰上工作, 准备 MNase 我消化主混合根据表 4和分20µL 的混合每行样品加5µL 死体积成一排96井储层板, 并保持在冰上。对于两行, 该卷应为: (20 µL x 2) + 5 µL = 45 µL。
    7. 裂解完成孵化后, 从冰中取出 MNase 消化板。使用多通道吸管, 添加20µL MNase 我消化大师混合到每行样品, 并混合10倍移上下。更改行之间的提示。在室温下孵育整整5分钟。
    8. 5分钟后, 停止反应, 使用多通道吸管添加6µL 250 µM 乙酸酸 (EDTA) 到每行样品和混合上下几次。更改行之间的提示。EDTA 添加后, 将吸管的设置切换到20µL, 并通过移上下混合10次, 以保证消化反应的完全停止。更改行之间的提示。
    9. 使用多通道吸管, 每行的 MNase 消化样品, 增加6µL 的10x 裂解缓冲和混合良好的移上下10次。用塑料密封盖, 在冰上孵育15分钟。
  3. 输入分离和 pre-clearing
    1. 继15分钟的孵化, 工作在冰, 池所有水井为同一细胞颗粒/模板成一个无菌, pre-chilled 在冰上, 1.5 毫升管 (pre-labeled 与模板 ID) 和混合彻底, 但慢慢地使用吸管, 以避免洗涤剂起泡。
    2. 对于每个细胞颗粒/模板, 转移8µL 的消化染色质成一个新的无菌, 0.5 毫升管 (pre-labeled 与模板 ID), 并存储在4° c 过夜。这将用作输入控件。
    3. 将消化染色质的剩余体积分布在48µL 等分, 放入一个新的96井板中。细胞颗粒/模板1进入水井 A01-A06, 细胞颗粒/模板2进入油井 A07-A12, etc。将油井记录到模板键上。标签的板 "预结算"。
    4. 使用多通道吸管, 添加120µL 的 1x IP 缓冲 + 1x PIC 和12µL 的洗涤蛋白 a (或 G) 磁珠的每一个良好的预结算板从步骤2.3.3。将每行混合移10次。更改行之间的提示。用铝板盖将钢板密封好, 在4° c 的旋转平台上孵育至少2小时。
  4. 沉淀反应
    1. 在开始这一步之前, 确保 Ab 珠复合板 (步骤 2.1.10) 和预结算板 (步骤 2.3.4) 已经孵化至少 2 h. 快速旋转两个板块由离心十年代在 200 x g。
    2. 将 Ab 珠复合板 (从台阶 2.1.10) 放在平板磁铁上, 等待十五年代的解决方案变得清晰。小心地用吸管除去和丢弃上清, 而不干扰珠子。从板磁铁中取出盘子, 并将其放在冰上。
    3. 安置预清洗反应板 (从步 2.3.4) 在板材磁铁和等待十五年代为珠子分离和为解答变得清楚。在不干扰珠子的情况下, 小心地用吸管将上清液转移到在冰上的 Ab 珠复合板的相应井中, 并由移上下搅拌15次。用铝板盖将钢板密封好, 在旋转平台上在4° c 的夜间孵育 (12-18 小时)。重新标签的板块 "IP 反应"。

3. 2 天: ndCHIP-seq

  1. 洗涤和洗脱
    1. 将加热搅拌机设置为65° c。在冰上, 准备一个低盐洗涤缓冲和盐洗涤缓冲。快速自旋的 IP 反应板从步骤2.4.3 为十年代在 200 x g。
    2. 将 IP 反应板放在平板磁铁上, 等待十五年代的解决方案变得清晰。使用多通道吸管, 不干扰珠子, 小心地去除和丢弃上清。把盘子从磁铁上拿下来放在冰上。
    3. 对每行样品的 IP 反应板, 添加150µL ice-cold 低盐洗涤缓冲器和混合缓慢10倍上下, 以充分重的珠子。
    4. 将 IP 反应板放回极板磁铁上, 等待珠子分开, 用多通道吸管, 不干扰珠子的去除和丢弃上清液。把盘子放回冰上, 重复步骤3.1.3 和 3.1.4, 共洗2遍。
    5. 在冰上, 对每一排样品在 IP 反应板, 添加150µL 的高盐洗涤缓冲和混合缓慢的10倍移上下, 以充分重的珠子。
    6. 将 IP 反应板放回极板磁铁上, 等待珠子分开, 用多通道吸管, 不干扰珠子的去除和丢弃上清液。将 IP 反应板放在冰上, 并在它旁边 pre-chill 一个新的96井板。
    7. 对每行样品的 IP 反应板, 添加150µL 的高盐洗涤缓冲器和混合缓慢的10倍移上下, 以充分重的珠子。悬浮后, 将每行样品转移到新的、pre-chilled、96井板的对应行。标签的板块 "IP 反应"。扔掉旧盘子。
    8. 将新的 IP 反应板放在极板磁铁上, 等待珠子分开。使用多通道吸管, 不干扰珠子, 小心地去除和丢弃上清。把盘子放在室温下。
    9. 对每行样品的 IP 反应板, 添加30µL 的芯片洗脱缓冲 (EB) 和混合缓慢的10倍移上下。确保防止气泡形成。
    10. 用 PCR 盖子将钢板封好, 在65° c 的加热混合器中孵育1.5 小时, 搅拌速度为 1350 rpm。
    11. 经过1.5 小时的孵化, 旋转下来的 IP 反应板在 200 x g 1 分钟, 在4° c。将加热搅拌机的设置改为50° c。
    12. 旋转后, 将 IP 反应板放在极板磁铁上, 等待解决方案清除。使用多通道吸管, 不干扰珠子, 小心地转移30µL 的上清成一个新的96井板。每行使用新的提示。标签的板块 "IP 反应", 并保持在室温。
  2. 蛋白质消化
    1. 从4° c 冰箱中取出 30% PEG/1 M 氯化钠磁珠17 (缓冲成分表) 解决方案, 并在室温下保持至少 30 min. 关键: 确保在进行前, 磁珠溶液完全达到室温。
    2. 从4° c 存储 (步骤 2.3.2) 和快速旋转中检索输入控制样本。使用吸管测量体积, 并在每个输入控制中添加超纯水, 最终体积为30µL. 将输入控制样本转移到所选定的输入井 (空井) 的 IP 反应板 (步骤 3.1.12)。记录井到样品钥匙。
    3. 在冰上, 准备蛋白质消化大师组合如所示, 在表 5和分相等的体积成一排96井油藏板块。
    4. 使用多通道吸管, 每行样品在 IP 反应板, 添加40µL 的蛋白质消化主混合和混合缓慢10倍上下。用 PCR 盖子将钢板封好, 在 200 x g 处旋转1分钟, 在50° c 的加热搅拌器中孵育30分钟, 在 650 rpm 处进行。当板材正在孵化时, 准备新鲜的70% 乙醇 (乙醇) 并保持室温。
    5. 在30分钟孵育完成后, 旋转 IP 反应板在 200 x g 为 1 min, 4 ° c。把盘子放在室温下。
      注: 总容积应为现在的70µL/井。
  3. 用 30% PEG/1 M 氯化钠磁珠溶液进行微珠清理
    1. 分的室温30% 的 PEG/1 M 氯化钠磁珠溶液成一排干净的96井储层板 (75 µL 每个样本 x # 行)。
    2. 在室温下工作, 使用多通道吸管, 增加70µL (1:1 比) 的 30% PEG/1 M 氯化钠磁珠解决方案的每行样品在 IP 反应板和混合10倍的移上下。更改行之间的提示。在室温下孵育板材15分钟。
    3. 放置在板磁铁和孵化5分钟, 让珠子分开。
    4. 使用吸管, 不干扰珠子, 小心地去除和丢弃上清。把珠子留着
    5. 当 IP 反应板仍然在板磁铁, 使用多通道吸管, 对每行样品, 增加150µL 室温70% 乙醇和孵育三十年代。三十年代以后, 使用多通道吸管, 去除和丢弃上清液。重复此步骤一次, 共2洗。
    6. 第二次乙醇洗涤后, 在平板磁铁上孵育 "干" 板3分钟, 目视检查板, 确保所有的乙醇被蒸发。如果没有, 孵化的板材为1分钟以上干燥的珠子导致了较低的产量。
    7. 把板上的磁铁和使用多通道吸管, 添加35µL EB (材料表)。移10倍, 上下搅拌均匀。更改行之间的提示。室温孵育3分钟至洗。
    8. 孵化后, 将 IP 反应板放回极板磁铁上, 孵育2分钟。珠子应该分开, 解决方案将变得清晰。
    9. 使用多通道吸管, 在不干扰珠子的情况下, 小心地将上清液转移到一个新的96孔板的对应井中。
    10. 用铝板盖封板, 标签 "IPed + 输入 DNA", 并贮存在4° c 过夜, 或在-20 ° c 长期 (> 48 h) 存储。

4. 3 天: 图书馆建筑

  1. 末端修理和磷酸化
    1. 最终修复/磷酸化反应的输入是 IPed + 输入板从步骤3.3.10。解冻后, 在4° c 的1分钟旋转板, 在 200 x g, 并保持在冰上。
    2. 从-20 ° c 的冷冻库中检索所需的所有试剂 (除了酶), 用于结束修复/磷酸化反应 (表 6), 并在室温下解冻, 然后立即转到冰上。
    3. 在冰上工作, 请按照表 6在无菌、1.5 毫升离心管中设置最终修复/磷酸化主组合。在加入所有的非成分后, 用脉冲涡流混合, 然后将管子放回冰上。
    4. 将相关酶从冷藏和运输到冷冻管冷却机架中的工作台中回收。混合每一个酶的管, 快速旋转, 并把它放回冷冻管冷却机架。当移酶时, 慢慢抽吸以保证准确的容积转移。添加后, 在主组合中移向上和向下清洗笔尖。
    5. 一旦添加了酶, 轻轻的脉冲涡流的主混合5倍, 以确保均匀分布的所有组成部分, 然后快速旋转, 立即把管回冰。
    6. 在冰上, 分一个适当的数量的最终修复/磷酸化主混合成一排的新的96井油藏板块;卷要 aliquoted: (15 µL x # 行) + 5 µL 死卷。两行的示例计算: (15 µL x 2) + 5 µL = 35 µL/井。
    7. 使用多通道吸管, 增加15µL 的最终修复/磷酸化主混合的每行样品和混合10倍移上下。更改行之间的提示。用塑料盖封板, 在4° c 下旋转 200 x g, 1 分钟, 在室温下孵育30分钟。
  2. 末端修复和磷酸化后的珠清理
    1. 从4° c 冰箱, 检索 20% PEG/1 m 氯化钠磁珠溶液和 30% PEG/1 m 氯化钠溶液, 室温孵育至少30分钟。
      注: 30% PEG/1 M 氯化钠溶液不含磁性珠子。
    2. 在两个解决方案达到室温后, 为每个样品准备80µL 1:2 混合 30% PEG/1 m 氯化钠和 20% PEG/1 m 氯化钠磁性珠解决方案。一个例子为24样品:80 µL x 24 = 1920 µL (640 µL 30% PEG/1 m 氯化钠并且1288µL 20% PEG/1 m 氯化钠磁性珠解答)。
    3. 分将珠溶液混合, 相等体积, 放入一排96井的储层板中, 并保持在室温下。分 EB 缓冲器 (40 µL 每样本 x # 行) 成一排干净的96井储层板块。两行的示例:40 µL x 2 = 80 µL/井。
    4. 使用多通道吸管, 添加75µL 的珠混合准备在步骤4.2.2 每行的样品从步骤4.1.7 和混合上下10次。更改行之间的提示。在室温下孵育15分钟, 继续执行步骤 3.3. 3-3. 3.10 中所述的珠清洁程序。盖上塑料密封板, 快速旋转, 并把它放在冰上。继续执行步骤4.3。
  3. A-尾矿反应
    1. 从-20 ° c 的冰箱中检索 A-尾矿反应所需的所有试剂 (除了酶) (表 7), 在室温下解冻, 然后立即转移到冰上。
    2. 在冰上工作, 请按照表 7在无菌、1.5 毫升离心管中设置 a 型尾矿母料组合。遵循步骤 4.1. 4-4. 1.6 中概述的一般酶酿造装置说明。
    3. 使用多通道吸管, 增加15µL 的 a-尾矿主混合的每行样品和混合10倍的移上下。更改行之间的提示。用 PCR 盖子将钢板封住, 在4° c 下旋转 200 x g, 在37° c 的 thermocycler 中孵育30分钟。在孵化后, 将钢板在 200 x g 处旋转1分钟, 并保持室温。
  4. 尾砂后的珠清理
    1. 执行步骤4.2 中描述的步骤。盖上塑料密封板, 标签 "a-尾巴 + BC", 快速旋转, 并把它放在冰上。继续执行步骤4.5。
  5. 接头结扎
    1. 从-20 ° c 的冰箱中检索适配器结扎反应所需的所有试剂 (除了酶) (表 8), 在室温下解冻, 然后立即转到冰上。
    2. 检索10µM PE 适配器 (补充表 1) 库存解决方案, 并使用 EB 将其稀释到0.5 µM。用脉冲涡流混合好。所需的体积是3µL x # 的样品。工作在冰, 分0.5 µM PE 适配器, 相等的容量, 入12口井一个干净的96井储层板材。把它放在冰上
    3. 在冰上工作, 请按照表 8设置适配器结扎主混合在一个无菌, 1.5 毫升离心管。遵循步骤 4.1. 4-4. 1.6 中概述的一般酶酿造装置说明。确保在使用前, 5X 快速结扎缓冲液完全解冻且混合良好。
    4. 在冰上, 分适当的容量的适配器结扎主混合成一排一个新的96井油藏板块。例如, 计算两行: (23 µL x 2) + 5 µL = 51 µL/井。把盘子放在冰上。
    5. 使用多通道吸管, 添加2µL 0.5 µM 配对端 (PE) 适配器到每行的样品从步骤4.4.1 和混合。更改行之间的提示。
    6. 使用多通道吸管, 增加23µL 的适配器结扎主混合到每行样品和混合15倍的移上下。更改行之间的提示。用金属盖子封住盘子, 贴上 "结扎" 的标签, 在4° c 下旋转 200 x g, 在室温下过夜。
  6. 4天: 适配器结扎后 #1 珠清理
    1. 从4° c 冰箱, 检索 20% PEG/1 M 氯化钠磁珠溶液, 室温孵育至少30分钟。而解决方案是均衡准备新鲜70% 乙醇。
    2. 分 20% PEG/1 M 氯化钠磁珠溶液, 每样55µL, 成一排96井储层板, 并保持室温。两行的示例:55 µL x 2 = 110 µL/井。
    3. 分 EB 缓冲器, 每样50µL, 成一排干净的96井储层板。两行的示例:50 µL x 2 = 100 µL/井。
    4. 使用多通道吸管, 增加48µL 的 20% PEG/1 M 氯化钠磁珠解决方案的每行样品的结扎板从步骤4.5.6 和混合上下10倍。更改行之间的提示。在室温下孵育15分钟, 继续执行步骤 3.3. 3-3. 3.7 中所述的珠清洁程序。
    5. 把板上的磁铁和使用多通道吸管, 添加45µL EB (材料表)。移10倍, 上下搅拌均匀。更改行之间的提示。在室温下孵育3分钟至洗。
    6. 孵化后, 将 IP 反应板放回板磁铁上, 孵育2分钟. 使用多通道吸管, 不干扰珠子, 小心地将上清液转移到新的96孔板的相应井中。标签的板 "结扎 + 1 BC"。
    7. 每个井加5µL 的 10x PCR 高保真缓冲和混合良好的移上下。更改行之间的提示。盖上塑料密封板, 快速旋转, 并保持在室温下。
  7. 适配器结扎后 #2 珠清理
    1. 执行4.6 节中所述的微珠清理: 在结扎 + 1 BC 板 (步骤 4.6.7) 和洗中, 添加60µL 20% PEG/1 M 氯化钠磁珠溶液, 使用35µL 的 EB 缓冲器。标签的板 "结扎 + 2 BC", 并保持在冰上。
  8. pcr 扩增
    1. 从-20 ° c 冰箱中检索 PCR 反应所需的所有试剂 (除了酶) (表 9), 在室温下解冻, 然后立即将它们放在冰上。
    2. 在冰上工作, 请按照表 9在无菌、1.5 毫升离心管中设置 PCR 主混合。按照步骤 4.1. 4-4. 1.5 中概述的一般 brew 设置说明进行操作。在冰上, 分一个适当的容量 PCR 大师混合入一列一个新的96井储层板。把它放在冰上有关示例计算, 请参见步骤4.5.4。
    3. 在冰上工作, 使用多通道吸管, 增加2µL 的每一个独特的12.5 µM PCR 反向索引底漆 (补充表 2) 到每个井在结扎 + 2 BC 板块 (步骤 4.7.1) 和混合缓慢向上和向下。更改行之间的提示。把盘子放在冰上。
    4. 在冰上工作, 使用多通道吸管, 添加23µL 的 PCR 大师混合到每行样品从步骤4.8.3 和混合10倍的移上下。用 pcr 盖子封住盘子, 在 200 x g 处旋转1分钟, 在 thermocycler 中孵育 (参见表 10进行 pcr 循环条件)。
  9. PCR 扩增后的珠清除
    1. PCR 扩增后, 在 200 x g 的1分钟, 4 ° c 旋转板。执行4.6 节中所述的磁珠清理, 并进行以下更改: 在每个 PCR 反应中添加51µL 20% PEG/1 的氯化钠磁珠溶液, 并使用25µL 的 EB 缓冲液从珠子中洗。用铝盖封住板, 在 200 x g 处旋转1分钟, 将样品存放在-20 ° c。
    2. 为了验证构建的库, 使用荧光检测进行 DNA 定量化, 使用芯片毛细管电泳分析仪 (高灵敏度检测) 对最终产品进行可视化, 并运行富集定量 PCR (qPCR) (参见具有代表性的结果, 通过 qPCR 验证 ndChIP 序列库的质量。

Representative Results

染色质消化剖面
MNase 消化的优化对于本协议的成功至关重要。这是至关重要的生成一个消化剖面由单一的核片段大小, 而不是 over-digested, 以允许恢复更高阶核片段。理想的消化剖面由大多数单一的核片段组成, 小的片段代表小的和大于单个核的碎片。图 1显示了理想的、over-digested 的和 under-digested 的大小分布配置文件的示例。注意, 染色质的次优消化也将在从 IP 材料生成的排序库的轮廓中明显 (图 2)。

用 qPCR 验证 ndChIP 序列库质量
qPCR 是一种行之有效的评估芯片质量的方法18,19,20。在1万细胞上执行 ndChIP 时, 核酸的产率将低于1。因此, 在图书馆建设后进行 qPCR, 对目标区域的相对富集进行背景评估是十分必要的。为了提供一个背景估计, 由 MNase 消化染色质 (输入) 构建的图书馆产生。对于每个 IP 库, 需要两组引物 (请参阅补充表 3 , 以了解常用组合蛋白标记的底漆的列表)。一个入门集应该是特定的一个基因组区域, 这是一贯的相关联蛋白修饰的兴趣 (积极的目标) 和另一个区域, 没有标记组蛋白修饰的兴趣 (负目标)。芯片-seq 库的质量将被评估为对输入库的折叠丰富。折叠富集可以使用以下公式计算, 该方程假定目标基因组区域的指数放大: 2Ct输入-ctIP。我们定制的 R 统计软件包, qcQpcr_v1.2, 适用于低输入本地芯片序列库的 qPCR 富集分析 (补充代码文件)。图 3表示成功和不成功的芯片 seq 库的 qPCR 结果。良好质量的 ndChIP-seq 库的最小预期褶皱富集值为 16, 如 H3K4me3, 宽标记为 7, 例如 H3K27me3。

建模 MNase 可访问性
计算分析的芯片-seq 是复杂和独特的每一个实验设置。由国际人类表联合会 (IHEC) 和 DNA 元素百科全书 (编码) 建立的一套准则可用于评估芯片 seq 库21的质量。值得注意的是, 库的排序深度影响了富区域20的检测和解析。检测到的峰值数增加, 并接近于读深度增加的高原。我们建议按照5000万对窄标记 (例如、H3K4me3) 和1亿配对读取 (5000万片段) 的 IHEC 建议对 ndChIP 序列库进行排序, 以显示宽标记 (例如、H3K27me3) 和输入22。这些测序深度为检测最重要的峰值提供了足够的序列对齐方法, 使用广泛使用的芯片 seq 峰值调用方, 如 MACS2 和荷马, 没有达到饱和度23,24。一个高质量的哺乳动物 ndChIP-seq 库具有 PCR 重复率 < 10% 和参考基因组对齐率 > 90% (包括重复读取)。成功的 ndChIP seq 库将包含高度相关的复制, 其中有很大一部分 (> 40%) 在 MACS222中对齐的读取进行识别, 并在基因组浏览器上检查对齐的读取, 以视觉方式显示与输入库 (图 4) 相比, 可检测的富。此外, 利用高斯混合分布算法 (w1 * n(x), ndChIP 可用于评估核密度。μ1,σ1) + w2 * n(x; μ2, σ2) = 1) 在 MACS2 确定的丰富区域模型核密度的定义 MNase 可访问的边界。在该模型中, w1表示单核分布权重, w2表示 di 核分布权重。如果 w1大于 w2, 则存在单核片段的优势, 反之亦然。此分析要求以配对结束的方式对库进行排序, 以便可以定义片段大小。为了应用高斯混合分布算法, 首先确定了具有统计学意义的富集区域。我们建议峰值呼叫与 MACS2 使用输入作为一个控制, 并与默认设置为窄标记和 q 值截止0.01 的宽标记。许多统计软件包采用高斯混合分布算法, 可从广泛使用的统计软件包。利用平均碎片大小, 由 IPed 样本的配对端读取边界确定, 在 MACS2 识别的富集促进器上的分布, 和一个高斯混合分布算法可以应用到每个启动器使用 R 统计包Mclust 版本 3.025以计算加权分布。在此应用程序中, 我们建议消除包含少于30对齐的片段的启动子, 因为在这个阈值下, 由此产生的权重估计变得不可靠。一个良好的质量 ndChIP-seq 库生成一个高斯混合分布, 其中包括两个主要组成部分的平均值对应于单, di 核片段长度。

Figure 1
图 1: 在生成库之前对 MNase 消化进行评估.芯片毛细管电泳分析仪 MNase 消化 (A)、under-digested (B) 和 over-digested (C) 染色质的最佳配置文件。生物复制显示为蓝色, 红色和绿色的痕迹。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 库生成后 MNase 消化的评估.(A) 开机自检库结构配置文件 (生物复制; 红色、绿色、黑色) 和 ip (生物复制; 青色、紫色、蓝色) 和 (B) 次优输入 (生物复制; 红色、绿色、蓝色) 和 ip (生物复制;青色、紫色、橙色) 库。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 后库结构定量 PCR 可用于评估 ndChIP 的质量.关于输入库的 H3K4me3 ip 库的折叠富集计算为 2(ip 的输入-ct ct) , 用于使用 qcQpcr_v1.2 的正负目标。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 具有代表性的 ndChIP-seq 库, 由1万主 CD34+脐带血细胞组成.皮尔逊相关性 H3K4me3 信号 (读取每百万映射读取) 计算在发起人 (TSS+/-2Kb) 之间的3生物复制, (A) 复制1和 2, (B) 复制1和 3, (C) 复制2和3。(D) UCSC 从每个 ip 100万单元生成的交联芯片序列的 HOXA 基因簇的浏览器视图, 从每个 ip 的1万单元成功地 ndChIP-seq, 从每 ip 1万单元中获得不成功的 ndChIP 序列。(红色: H3K27me3, 绿色: H3K4me3, 黑色: 输入)。(E) MACS2 中的映射读取的分数, 标识了 H3K4me3 (黑色) 和 H3K27me3 (灰色) 的丰富区域。请单击此处查看此图的较大版本.

缓冲组合
1. 沉淀缓冲器 (IP)
20毫米三盐酸盐 pH 值7。5
2毫米 EDTA
150毫米氯化钠
0.1% 海卫 X-100
0.1% 胆酸
10毫米丁酸钠
2. 低盐洗涤缓冲液
20毫米三盐酸盐 pH 值8。0
2毫米 EDTA
150毫米氯化钠
1% 海卫 X-100
0.1% SDS
3. 高盐洗涤缓冲器
20毫米三盐酸盐 pH 值8。0
2毫米 EDTA
500毫米氯化钠
1% 海卫 X-100
0.1% SDS
4. 芯片洗脱缓冲器
100 mM NaHCO3
1% SDS
5. 1x 溶解缓冲液–1毫升
0.1% 海卫一
0.1% 胆酸
10毫米丁酸钠
6. Ab 稀释缓冲器
0.05% (w/v) 叠氮化
0.05% 广谱抗菌剂 (ProClin 300)
在 PBS
7. 30% PEG/1M 氯化钠磁珠解决方案 (参考16)
30% PEG
1 M 氯化钠
10毫米三盐酸盐 pH 值7。5
1毫米 EDTA
1毫升水洗顺珠
8. 20% PEG/1M 氯化钠磁珠解决方案 (参考16)
30% PEG
1 M 氯化钠
10毫米三盐酸盐 pH 值7。5
1毫米 EDTA
1毫升水洗顺珠

表 1: ndChIP-seq 缓冲成分。

组蛋白修饰 浓度 (µg/µL)
H3K4me3 0.125
H3K4me1 0.25
H3K27me3 0.125
H3K9me3 0.125
H3K36me3 0.125
H3K27ac 0.125

表 2: ndChIP seq. 所需抗体量

Reganet 卷 (µL)
超纯水 478
1 M 三盐酸盐 pH 值7。5 10
0.5 M EDTA 10
5 M 氯化钠 2
甘油 500
总容积 1000

表 3: MNase 稀释缓冲器的配方。

试剂 卷 (µL)
超纯水 13
20毫米数码 1
10x MNase 缓冲器 4
20 U/µl Mnase 2
总容积 20

表 4: MNase 主组合的配方。

试剂 卷 (µL)
洗脱缓冲器 30
缓冲区 G2 8
蛋白酶 2
总容积 40

表 5: DNA 纯化主配料配方。

试剂 卷 (µL)
超纯水 3。3
10x 限制切缓冲区 (例如NEBuffer) 5
25毫米 ATP 2
10毫米 dNTPs 2
T4 核苷酸激酶 (10 U/µl) 1
T4 DNA 聚合酶 (3 U/µl) 1。5
DNA 聚合酶 I, 大 (克莱诺) 片段 (5 U/µl) 0。2
总容积 15

表 6: 最终修复主组合的配方。

试剂 卷 (µL)
超纯水 8
10x 限制切缓冲区 (例如NEBuffer) 5
10毫米 dATP 1
克莱诺 (3 '-5 ' 外型) 1
总容积 15

表 7: 尾矿母料配方

试剂 卷 (µL)
超纯水 4。3
5x 快速结扎缓冲 12
T4 DNA 连接 (2000 U/µl) 6。7
总容积 23

表 8: 适配器结扎主组合的配方。

试剂 卷 (µL)
超纯水 7
25 uM PCR 引物1。0 2
5x 高频缓冲器 12
1。5
DNA 聚合酶 0。5
总容积 23

表 9: PCR 大师组合的配方。

温度 (° c) 持续时间 (s) 周期数
98 60 1
98 30
65 15 10
72 15
72 300 1
4 举行 举行

表 10: PCR 运行方法。

序列 修改
PE_adapter 1 5 "-/5 磷/CGG AAG AGC GGT TCA 配合力 GGA ATG CCG AG-3" 5 ' 修改: 磷酸化
PE_adapter 2 5 '-ACA ctc TTT 的反恐委员会 3的修改: * T 为硫键

补充表 1: 生成 PE 适配器的寡序序列。

底漆名称 序列 索引 IndexRevC (用于测序)
PCR 反标引物1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT CGTGAT atcacg
PCR 反标引物2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT CTGATC gatcag
PCR 反标引物3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGGGTTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT GGGGTT aacccc
PCR 反标引物4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGGGTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT CTGGGT acccag
PCR 反标引物5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGCTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT AGCGCT agcgct
PCR 反标引物6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT CTTTTG caaaag
PCR 反标引物7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT TGTTGG ccaaca
PCR 反标引物8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTAGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT AGCTAG ctagct
PCR 反标引物9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCATCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT AGCATC gatgct
PCR 反标引物10 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGATTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT CGATTA taatcg
PCR 反标引物11 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATTCACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT CATTCA tgaatg
PCR 反标引物12 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT GGAACT agttcc
PCR 反标引物13 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT ACATCG cgatgt
PCR 反标引物14 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT AAGCTA tagctt
PCR 反标引物15 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAAGTTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT CAAGTT aacttg
PCR 反标引物16 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCGGTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT GCCGGT accggc
PCR 反标引物17 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGCCTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT CGGCCT aggccg
PCR 反标引物18 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT TAGTTG caacta
PCR 反标引物19 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGTGGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT GCGTGG ccacgc
PCR 反标引物20 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTATAGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT GTATAG ctatac
PCR 反标引物21 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTTGCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT CCTTGC gcaagg
PCR 反标引物22 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTGTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT GCTGTA tacagc
PCR 反标引物23 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGGCACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT ATGGCA tgccat
PCR 反标引物24 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT TGACAT atgtca

补充表 2: PCR 反向索引引物序列。

序列
ZNF333_genic_H3K9me3_F 5 "-AGCCTTCAATCAGCCATCATCCCT-3"
ZNF333_genic_H3K9me3_R 5 "-TCTGGTATGGGTTCGCAGATGTGT-3"
HOXA9-10_F 5 "-ACTGAAGTAATGAAGGCAGTGTCGT-3"
HOXA9-10_R 5 "-GCAGCAYCAGAACTGGTCGGTG-3"
GAPDH_genic_H3K36me3_F 5 "-AGGCAACTAGGATGGTGTGG-3"
GAPDH_genic_H3K36me3_R 5 "-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3"
GAPDH-F 5 "-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3"
GAPDH 河 5 "-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3"
组蛋白修饰 积极目标 负目标
H3K4me3 gapdh HOXA9-10
H3K4me1 GAPDH_genic ZNF333
H3K27me3 HOXA9-10 ZNF333
H3K27ac gapdh ZNF333
H3K9me3 ZNF333 HOXA9-10
H3K36me3 GAPDH_genic ZNF333

补充表 3: 常用组蛋白标记 (H3K4me3、H3K4me1、H3K27me3、H3K27ac、H3K9me3 和 H3K36me3) 的底漆的列表。

补充文件 1: ndChIP-seq 工作表.请单击此处下载此文件.

补充代码文件: qcQpcr_v1.2.R 统计软件包, 用于低输入本地芯片序列库的 qPCR 富集分析。请单击此处下载此文件.

Discussion

考虑到染色质修饰和核定位在转录调控中的组合性质, 一种能够同时测量这些特性的方法可能会为表观遗传学的调控提供新的见解。这里介绍的 ndChIP-seq 协议是一种本地芯片-seq 协议, 用于在稀有的主单元中同时对组蛋白修饰和核密度进行审讯,9,10。ndChIP-seq 利用酶消化染色质, 当耦合到配对结束大规模并行排序和高斯混合分布模型, 允许调查组蛋白修饰在单一的核水平和由种群内异质性驱动的表剖面的反褶积。使用此协议, 我们以前报告了免疫沉淀片段大小的唯一分布, 由配对结束读取边界确定, 与 ChromHMM10,24定义的特定染色质状态相关。

ndChIP 序列库的质量取决于多种因素, 如抗体特异性和敏感性、最佳 MNase 消化条件和染色质质量。使用的抗体的特异性是关键的生产成功的 ndChIP-seq 库。一个理想的抗体显示高亲和性的表位的兴趣与小交叉反应性与其他抗原。同样重要的是选择磁性珠与最高亲和力的抗体选择。

MNase 消化是该协议中的一个关键和时间浓度敏感的反应。因此, 在处理多个样本时, 每个反应都必须在相当的时间内孵化 (参见步骤 2.2)。染色质的质量是另一个因素, 显着影响的结果 ndChIP-seq. 分裂染色质导致一个次优 MNase 消化剖面和结果在低信噪比的图书馆。本协议不推荐使用低细胞活性或降解染色质的初级样品, 如福尔马林固定石蜡 (FFPE) 组织。

在染色质提取过程中添加 PIC 可以减少不受欢迎的 (, 随机) 染色质碎片, 并保留组蛋白尾部的完整性。因此, PIC 需要添加到裂解缓冲区和沉淀缓冲区, 才使用。在通过流式细胞仪选择细胞时, 选择可行的细胞, 并确保细胞以较低的流速排列, 以提高细胞数估计的准确性和生存能力。避免将单元格直接分类到裂解缓冲区。鞘缓冲液会稀释裂解缓冲液, 防止细胞膜的有效性 MNase。根据类型的细胞或生物体, 滴定 MNase 可能需要获得最佳的消化。

哺乳动物细胞的 ndChIP-seq 需要最小测序深度为5000万配对读 (2500万片段) 为狭窄的标记和1亿配对读 (5000万片断) 为宽广的标记和输入。高斯混合分布算法对已被测序到深度显著低于本建议的库, 将无法达到最佳性能。ndChIP-seq 将不分类促进者, 很少分离之间的加权分布值的单一和 di 核片段长度成单或 di 核主导的发起人。因此, 在随后的分析中必须删除这些启动子。可以生成生物复制, 以增加对预测分布的信心, 并确定 MNase 消化和图书馆建设中的技术变异性。

与本机芯片序列协议的以前的迭代不同, ndChIP 提供了通过利用片段大小后沉淀来整合核密度来研究染色质结构和组蛋白修饰的组合效应的方法,由 MNase 的可及性决定, 组蛋白修饰测量。ndChIP 在原发性细胞和组织中的应用, 将为表观遗传调控的综合性质提供新的见解, 并能识别由于群体内异质性而导致的后生特征。

Disclosures

作者声明他们没有竞争的金融利益。

Acknowledgements

a.1 得到加拿大卫生研究院的加拿大研究生奖学金的支持。这项工作得到了来自不列颠哥伦比亚省和加拿大卫生研究院 (CIHR-120589) 的赠款的支持, 这是加拿大的遗传学、环境和健康研究联合会倡议的一部分, 也是由特里福克斯研究所计划提供的。项目赠款 #TFF-122869 M.H. 和一个特里福克斯研究所新的研究员奖 (授予 1039) 到 M.H。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1M Tris-HCl –pH 7.5 Thermo Scientific 15567-027
1M Tris-HCl –pH 8 Thermo Scientific 15568-025
0.5M EDTA Thermo Scientific AM9260G
5M NaCl Sigma 1001385276
Triton X-100 Sigma 1001412354
Sodium-Deoxycholate Sigma 1001437582
SDS Thermo Scientific 15525-017
Sodium-Bicarbonate Fisher Scientific S233-500
100% EtOH NA NA
V-bottom 96 well plate (AB 1400) Thermo Scientific AB-1400-L
Gilson P2 pipetman Mandel F144801
Gilson P10 pipetman Mandel F144802
Gilson P20 pipetman Mandel F123600
Gilson P100 pipetman Mandel F123615
Gilson P200 pipetman Mandel F123601
Gilson P1000 pipetman Mandel F123603
Micrococcal Nuclease  NEB M0247S
Thermo Mixer C (Heating block mixer) Eppendorf 5382000023
Multi 12-channel Pippet P20 Rainin 17013803
Multi 12-channel Pippet P200 Rainin 17013805
1.5 ml LoBind tube Eppendorf 22431021
0.5 ml LoBind tube Eppendorf 22431005
Plastic Plate Cover Edge Bio 48461
PCR cover Bio Rad MSD-1001
Aluminum Plate Cover Bio Rad MSF-1001
Elution buffer (EB buffer) Qiagen 19086
1M DTT Sigma 646563
Eppendorf 5810R centrifuge  Eppendorf 22625004
Ultrapure water Thermo Scientific 10977-015
Protein G dynabeads Thermo Scientific 10001D
Protein A dynabeads Thermo Scientific 10001D
Protease inhibitor Cocktail Calbiochem 539134
Rotating platform Mandel 1b109-12052010
Plate magnet Alpaqua 2523
Domed 12-cap strip Bio Rad TCS1201
Buffer G2 Qiagen 1014636
Protease Qiagen 19155
Tube Magnet (DynaMag-2) Thermo Scientific 12321D
Tube Magnet (DynaMag-2) LabCore 730-006
V shape Plastic reservoir Mandel S0100A
Vortex Mandel C1801
Mini Fuge Mettler Toledo XS2035
Analytical scale Mandel LB109-12052010
Quick Ligation Reaction Buffer, 5X NEB B6058S
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment NEB M0210S
Klenow Fragment (3'-5' exo) NEB M0212S
T4 DNA Polymerase NEB M0203S
T4 Polynucleotide Kinase NEB M0201S
Deoxynucleotide Solution mix, 10mM NEB N0447S
dATP Solution 10mM NEB N0440S
Quick T4 DNA Ligase NEB M0202T
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP), 25mM NEB P0756S
DNA Polymerase Thermo Scientific F549L
NEBuffer 2 NEB B7002S
Hank's buffered salt solution Thermo Scientific 14025076
Fetal bovine serum  Thermo Scientific A3160702
phosphate buffer saline  Thermo Scientific 10010023
H3K4me3 Cell Signaling 9751S
H3K4me1 Diagenode C15410037
H3K27me3 Diagenode pAb-069-050
H3K36me3 Abcam ab9050
H3K9me3 Diagenode C15410056
SeraMag  super-paramagnetic beads

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simpson, R. T. Nucleosome Positioning: Occurrence, Mechanisms, and Functional Consequences. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 40, Issue C 143-184 (1991).
  2. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundmamental particle of the eukaryotic chromosome. Cell. 98, 285-294 (1999).
  3. Schones, D. E., et al. Dynamic regulation of nucleosome positioning in the human genome. Cell. 132, (5), 887-898 (2008).
  4. Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442, (7104), 772-778 (2006).
  5. Shiio, Y., Eisenman, R. N. Histone sumoylation is associated with transcriptional repression. PNAS. 100, (23), 13225-13230 (2003).
  6. Li, L., Lorzadeh, A., Hirst, M. Regulatory variation: An emerging vantage point for cancer biology. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 6, (1), 37-59 (2014).
  7. Jiang, J., et al. Investigation of the acetylation mechanism by GCN5 histone acetyltransferase. PLoS ONE. 7, (5), (2012).
  8. Kouzarides, T. Histone methylation in transcriptional control. Curr. Opin. Genet. Dev. 12, (2), 198-209 (2002).
  9. Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat. Commun. 6, 6033 (2015).
  10. Lorzadeh, A., et al. Nucleosome Density ChIP-Seq Identifies Distinct Chromatin Modification Signatures Associated with MNase Accessibility. Cell Rep. 17, (8), 2112-2124 (2016).
  11. Noll, M., Kornberg, R. D. Action of micrococcal nuclease on chromatin and the location of histone H1. J. Mol. Biol. 109, (3), 393-404 (1977).
  12. Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating high-resolution maps of genome wide protein binding. eLife. 4, 09225 (2015).
  13. Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. -P., Widom, J. A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution. Nature. (2012).
  14. Cui, K., Zhao, K. Genome-wide approaches to determining nucleosome occupancy in metazoans using MNase-Seq. Methods Mol. Biol. 833, 413-419 (2012).
  15. Mieczkowski, J., et al. MNase titration reveals differences between nucleosome occupancy and chromatin accessibility. Nat. Commun. 7, 11485 (2016).
  16. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). JOVE. (41), (2010).
  17. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22, (5), 939-946 (2012).
  18. Zheng, Y., Josefowicz, S. Z., Kas, A., Chu, T. T., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Genome-wide analysis of Foxp3 target genes in developing and mature regulatory T cells. Nature. 445, (7130), 936-940 (2007).
  19. Krishnakumar, R., Gamble, M. J., Frizzell, K. M., Berrocal, J. G., Kininis, M., Kraus, W. L. Reciprocal Binding of PARP-1 and Histone H1 at Promoters Specifies Transcriptional Outcomes. Science. 319, (5864), 819-821 (2008).
  20. Mendenhall, E. M., et al. Locus-specific editing of histone modifications at endogenous enhancers. Nat. Biotechnol. 31, (12), 1133-1136 (2013).
  21. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, (9), 1813-1831 (2012).
  22. Reference Epigenome Standards - IHEC. Available from: http://ihec-epigenomes.org/research/reference-epigenome-standards/ (2017).
  23. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol. Cell. 38, (4), 576-589 (2010).
  24. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat. Protoc. 7, (9), 1728-1740 (2012).
  25. Fraley, C., Raftery, A. E. MCLUST: Software for Model-Based Cluster Analysis. J. Classif. 16, (2), 297-306 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics