التنميط المضادة لل Neu5Gc مفتش في المصل البشري مع سيالوغليكان ميكروأري الفحص

Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ويمكن إجراء مقايسة ميكروأري سيالوغليكان لتقييم الأجسام المضادة لمكافحة neu5Gc في الأمصال البشرية، مما يجعل من المحتمل فحص الإنتاجية العالية التشخيص للسرطان وغيرها من الأمراض المزمنة التي تسببها التهابات الإنسان.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Leviatan Ben-Arye, S., Yu, H., Chen, X., Padler-Karavani, V. Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay . J. Vis. Exp. (125), e56094, doi:10.3791/56094 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وتغطي الخلايا مع عباءة سلاسل الكربوهيدرات (غليكانز) التي تتغير عادة في السرطان والتي تشمل الاختلافات في تعبير حمض السياليك (سيا). هذه هي السكريات الحمضية التي لديها العمود الفقري 9-الكربون وأن غليكانز الفقاريات كاب على أسطح الخلايا. اثنين من أشكال سيا الرئيسية في الثدييات هي حمض N- ستيلنورامينيك (Neu5Ac) وشكله الهيدروكسيلية، N -glycolylneuramin حمض (Neu5Gc). البشر لا يمكن أن تنتج neu5Gc الذاتية بسبب تعطيل الجين ترميز سيتيدين 5'monophosphate-Neu5Ac (سمب-Neu5Ac) هيدروكسيلاز (سماه). يتم الحصول على Neu5Gc الخارجية من قبل الخلايا البشرية من خلال الاستهلاك الغذائي من اللحوم الحمراء ومنتجات الألبان ويظهر لاحقا على غليكانز متنوعة على سطح الخلية، وتراكم معظمها على سرطان. ونتيجة لذلك، والبشر لديها تعميم الأجسام المضادة لمكافحة Neu5Gc التي تلعب أدوارا متنوعة في السرطان وغيرها من الأمراض المزمنة بوساطة التهاب والتي أصبحت المحتملة التشخيص والعلاجية تاrgets. هنا، نحن تصف عالية الإنتاجية سيالوغليكان ميكروأري فحص لتقييم هذه الأجسام المضادة لمكافحة Neu5Gc في المصل البشري. تحتوي على غليكانز ne5Gc وأزواجها مطابقة من الضوابط (nely5Ac التي تحتوي على غليكانز)، مع كل الأمين الأساسي الأساسية، مرتبطة تساهمية الشرائح الزجاجية المغلفة الايبوكسي. نحن مثال على طباعة 56 الشرائح في شكل 16 جيدا باستخدام طابعة نانو محددة قادرة على توليد ما يصل إلى 896 المصفوفات في الطباعة. كل شريحة يمكن استخدامها لفحص 16 عينات مختلفة من مصل الدم البشري لتقييم المضادة لل Neu5Gc خصوصية الأجسام المضادة، وكثافة، والتنوع. يصف البروتوكول تعقيد هذه الأداة قوية ويوفر التوجيهي الأساسي لتلك التي تهدف إلى التحقيق في الاستجابة لمضاد الكربوهيدرات الغذائي Neu5Gc في عينات سريرية متنوعة في شكل صفيف.

Introduction

سياس هي السكريات الحمضية التي تغطي سلاسل غليكان على بروتين سكري سطح الخلية والشحميات السكرية في الفقاريات. يتم تعديل التعبير سيا في الخلايا السرطانية 1 ويرتبط مع تطور و / أو ورم خبيث 2 ، 3 . اثنين من أشكال سيا الرئيسية في الثدييات هي Neu5Ac وشكل هيدروكسيلاتد، Neu5Gc 2 . البشر لا يمكن توليف Neu5Gc بسبب تعطيل معين من الجينات ترميز إنزيم سماه. هذا غير البشرية سيا يدمج الأيض في الخلايا البشرية باسم "النفس"، التي تنشأ من الأطعمة الغذائية NE5Gc الغنية (على سبيل المثال، واللحوم الحمراء) 4 ، 5 . Neu5Gc موجود في مستويات منخفضة على أسطح الخلايا من الظهارة البشرية و إندوثيليا، لكنه يتراكم خصوصا في سرطان. يتم التعرف على ne5Gc كما أجنبي من قبل الجهاز المناعي البشري الخلطية 2 ، 6 .قد تنشأ تعقيدات مستضد من Neu5Gc-غليكانز على مستويات متعددة، بما في ذلك تعديل Neu5Gc، الربط، غليكانز والسقالات الكامنة، وكثافتها، وكلها تنعكس من تعقيد استجابة الأجسام المضادة لمكافحة ne5Gc في البشر 6 . بعض هذه الأجسام المضادة بمثابة المؤشرات الحيوية سرطان و إمونوثيرابيوتيكش المحتملة 7 . وقد مهد ظهور توليف كيمونزيماتيك من سيالوغليكانز مختلفة 8 الطريق لمزيد من التحليل المتعمق لهذه الأجسام المضادة، ويسهلها استخدام تكنولوجيا ميكروأري غليكان 9 ، 10 . وهكذا، مع إعداد سهل والتلاعب من المكتبات الكبيرة من الكربوهيدرات الطبيعية والاصطناعية، أصبحت ميكروأرس غليكان قوية التكنولوجيا الإنتاجية العالية للتحقيق في التفاعلات من الكربوهيدرات مع عدد لا يحصى من الجزيئات الحيوية 10 ، 11 ، 12 ، 13 . في شكل صفيف، يتم استخدام كميات ضئيلة من المواد، وهذا العرض المتعدد من غليكانز ذات الصلة بيولوجيا يسمح للتحقيق في الآلاف من التفاعلات ملزمة في تجربة واحدة. الأهم من ذلك، يمكن أيضا أن تطبق هذه التكنولوجيا على اكتشاف العلامات البيولوجية ورصد الاستجابات المناعية في عينات مختلفة 7 ، 12 .

ناجحة غليكان ميكروأري تلفيق يتطلب النظر في ثلاثة جوانب هامة: نوع روبوت الطابعة، غليكان الكيمياء اقتران، والبصريات الكشف. وفيما يتعلق بالنظر في صك الطباعة، هناك تقنيتان متاحتان: طابعات الاتصال وغير المتصلة. في الطباعة الاتصال، 1-48 دبابيس الصلب هي مغموسة في لوحة متعددة مصادر جيدا تحتوي على حل غليكان ويتم رصدها على الشرائح الزجاجية فونكتيوناليزد عن طريق الاتصال مباشرة على سطح الشريحة الزجاجية. كمية الحل دي ليفيد إلى الشريحة هي وظيفة من المدة العالقة على سطح الشريحة. عادة، يتم أولا رصد العينات على كتلة زجاجية (للوصول إلى بقع متجانسة) قبل طباعتها على سطح الشريحة. في طابعات عدم الاتصال (على سبيل المثال، الطابعة بيزو الإلكترونية)، يتم طباعة غليكانز من شعري زجاجي باستخدام الإشارات الكهربائية التي تسيطر عليها. يمكن معايرة إشارة كهربائية بدقة لتحقيق الطباعة أكثر دقة بالنسبة للطباعة الاتصال. حجم ومورفولوجية البقع هي أيضا أكثر تجانسا نسبيا. ميزة إضافية هي إعادة تدوير العينة مرة أخرى إلى لوحة المصدر بعد الطباعة. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي للطابعات بيزو الإلكترونية هو الحد طرف الطباعة (4 أو 8)، مما أدى إلى فترة طباعة طويلة جدا، الأمر الذي يتطلب اهتماما خاصا لاستقرار الشريحة ودرجة الحرارة والرطوبة، وتبخر العينة. طابعة نافثة للحبر غير الاتصال تتطلب كميات أكبر عينة 14 .

s = "jove_content"> على النقيض من محدودية الخيارات المتاحة لطرق الطباعة، الكيمياء غليكان اقتران هو النظر أكثر تعقيدا، مع العديد من الخيارات للاختيار من بينها. يجب أن تمثل الكيمياء تجميد مختارة لكل من المجموعات النشطة على غليكانز وتفاعل سطح الشريحة. غليكانز أن يجمد على سطح ميكروأري محددة، إما توليفها صناعيا أو معزولة بشكل طبيعي، وكلها تتطلب مجموعة رد الفعل متطابقة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن غليكانز تحتاج إلى أن تكون نقية ومتجانسة. من ناحية أخرى، يجب أن يوفر سطح تجميد والكيمياء استنساخ وكثافة مرفق موثوق بها. وقد تم تطوير أساليب تجميد متعددة مع التساهمية أو التساهمية (امتصاص المادية) مرفق 10 ، 11 ، 12 ، 13 . للحصول على معلومات مفصلة للغاية عن تكنولوجيا غليكان ميكروأري المطبوعة ل أونينياتيتد المحقق، الرجوع إلى هذه الاستعراضات الممتازة 13 ، 15 . الأهم من ذلك، الحد الأدنى من المعلومات المطلوبة لمبادرة تجربة غليكوميكس (ميراج) يصف المبادئ التوجيهية لإعداد العينات 16 والإبلاغ عن البيانات من تحليل ميكروأري غليكان 17 لتحسين المعايير في هذا المجال المتنامي.

هنا، نحن تصف بروتوكول مفصل لتصنيع ميكروأرس سيالوغليكان باستخدام اتصال نانو طابعة محددة في شكل 16 جيدا. كل من غليكانز لديها أمين الأولية التي توسط ارتباط تساهمية إلى الشرائح الزجاجية المنشط الايبوكسي. نحن أيضا وصف تطوير وتحليل شريحة واحدة باستخدام مختلف عينات المصل البشري، الأجسام المضادة، و سيتين ملزم ليكتينس النبات. وتشمل المقايسات ميكروأري سيالوغليكان العديد من الخطوات الرئيسية التي تشمل تلفيق مجموعة والمعالجة والتنمية والتحليل. صفيف تلفيق يتطلب تخطيط أرتخطيط الشعاع، إعداد غليكانز و لوحة المصدر، برمجة نانو الطابعة، وطباعة الشرائح. وفي وقت لاحق، تتم معالجة الشرائح، وضعت، وتحليلها ( الشكل 1 ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على عينات من مصل الدم البشري من بنك الدم الإسرائيلي وتم استخدامها وفقا لإعلان هلسنكي ومجلس مراجعة المؤسسات بجامعة تل أبيب.

1. تخطيط تخطيط الصفيف والتخطيط

  1. حدد تخطيط الشريحة.
    ملاحظة: تحتوي كل شريحة 16 صفائف الفرعية مقسمة إلى 16 كتل متطابقة مرقمة B1 إلى B16 ( الشكل 1B ، التكميلي الشكل 1A ).
  2. تحديد تخطيط دبوس. استخدام أربعة دبابيس، كل طباعة أربع صفائف فرعية (كتل) لكل شريحة:
    دبوس 1 يطبع كتل 1، 2، 9، و 10؛
    دبوس 2 يطبع كتل 3، 4، 11، و 12؛
    دبوس 3 يطبع كتل 5، 6، 13، و 14؛ و
    دبوس 4 يطبع كتل 7، 8، 15، و 16 ( التكميلي الشكل 1A ).
  3. تحديد كتلة و 384 جيدا تخطيط لوحة.
    ملاحظة: الترتيب الذي تظهر فيه غليكانز في كل كتلة يتطلب التخطيط الدقيق. في هذا المثال أرأي، طباعة كل عينة في أربعة مكررات، تصميم البقع علامة الفلورسنت ليكون موجودا في الزاوية اليمنى السفلى (لتسهيل تحليل بقعة)، والطباعة القياسية منحنى إيغ (ستد) البقع في ستة تركيزات متزايدة ( التكميلي الشكل 1B ).
    1. لكل بقعة مطبوعة، أولا الاستغناء عن المواد إلى أربعة آبار (واحد لكل دبوس) في لوحة 384 جيدا.
      ملاحظة: ترتيب المواد في لوحة 384-جيدا يعتمد على تخطيط كتلة مصممة ( الشكل التكميلي 1B-C ).

2. إعداد غليكانز لوحة المصدر

  1. إعداد غليكان العازلة الطباعة (50 مل من 300 ملي الفوسفات العازلة، ودرجة الحموضة 8.4). تزن 58.5 ملغ من مونوهيدرات أحادية الصوديوم مونوهيدرات (ناه 2 بو 4 .1H 2 O) و 3.9 غرام من الصوديوم الفوسفات هيبتاهيدراتي (نا 2 هبو 4 .7H 2 O) في 40 مل من الماء منزوع الأيونات (ديو). المعايرة لدرجة الحموضة 8.4 باستخدام 4 M هيدروكسيد الصوديوم. ضبط مستوى الصوت إلى 50 مل لد مرشح من خلال غشاء 0.2 ميكرون للتعقيم.
  2. إعداد علامة العازلة (50 مل من 187 ملي العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 5). تزن 289 ملغ من مونوهيدرات أحادية الصوديوم مونوهيدرات (ناه 2 بو 4 .1H 2 O) و 1.94 غرام من الصوديوم الفوسفات هيبتاهيدراتي (نا 2 هبو 4 .7H 2 O) في 40 مل من ديو. معايرة لدرجة الحموضة 5 باستخدام 1 M حمض الهيدروكلوريك. ضبط مستوى الصوت إلى 50 مل وتصفية من خلال غشاء 0.2 ميكرون للتعقيم.
  3. إعداد ستد العازلة منحنى (50 مل من بس-الجلسرين: الفوسفات مخزنة المالحة، ودرجة الحموضة 7.4، تستكمل مع 10٪ الجلسرين من 100٪ الجلسرين الأسهم) وتصفية من خلال غشاء 0.2 ميكرون للتعقيم.
  4. إعداد كل محلول المخزون غليكان في 10 ملي في ديو. التحقق من تركيزات غليكان سياليلاتد عن طريق الكشف مضان على عكس المرحلة عالية الضغط تحليل اللوني السائل 18 .
  5. تمييع كل غليكان إلى 100 ميكرومتر في الحجم الكلي لل 100 ميكرولتر من العازلة الطباعة غليكانفي أنابيب ميكروسنتريفوج.
  6. إعداد الأمين الأساسي تحتوي على صبغة الفلورسنت. سولوبيليز اليكسا 555-هيدرازيد إلى 1 ملغ / مل مع العازلة علامة ثم تمييع إلى 1 ميكروغرام / مل في حجم إجمالي 1 مل.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي صبغات أولية أخرى تحتوي على أمين مع طول موجي مناسب وفقا لماسحة الشرائح.
    ملاحظة: البقع علامة تسهيل محاذاة الشبكة في كل كتلة خلال التحليل.
  7. إعداد إيغ الإنسان التخفيف منحنى منحنى: إعداد 0.5 مل من محلول المخزون من مفتش الإنسان في 160 نانوغرام / ميكرولتر في ستد العازلة منحنى. تمييع متسلسل الأسهم 1: 1 ست مرات للحصول على 80 و 40 و 20 و 10 و 5 و 2.5 نانوغرام / ميكرولتر، وكلها في ستد العازلة منحنى في حجم إجمالي 200 ميكرولتر لكل منهما.
    ملاحظة: إسوتيبس أخرى يمكن استخدامها إذا كانت مناسبة للتجربة (على سبيل المثال، إيغا الإنسان، إيغم، إيغ، أو إيغ من كائن حي مختلف).
  8. ضع لوحة 384 جيدا على الجليد. باستخدام الإلكترونية متعددة ماصة، قسامة 7 ميكرولتر من كل غليكان، علامة، ومنحنى ستد مفتش- أربعة مكررةثانية من كل وفقا لتخطيط لوحة ( الشكل التكميلي 1C ). للحصول على دقة أفضل، تحميل 35 ميكرولتر من كل عينة وقسامة 7 ميكرولتر في كل من الآبار الأربعة للعينة. وضع 7 ميكرولتر المتبقية من كل غليكان مرة أخرى إلى أنبوب الأصلي.
  9. تغطية لوحة مع بارافيلم وتدور باستمرار لمدة 2 دقيقة في 250G و 12 درجة مئوية. وضع لوحة في درجة حرارة الغرفة (رت)، محمية من الضوء. لا تكشف لوحة قبل الرطوبة في الغرفة تصل 60-70٪.

3. برمجة نانو الطابعة

  1. افتح برنامج "ميكروأري ماناجر". استخدم نافذة "خصائص الأسلوب".
  2. إعداد تخطيط جدول العمل: اختر "تهيئة الشريحة 56".
    ملاحظة: هذا هو تكوين معرف مسبقا يسمح لطباعة 56 الشرائح. معايرة لكل نوع من لوحة، دبوس، وشكل الطباعة ( الشكل التكميلي 2 ، الخطوة 1).
  3. حدد "تكوين دبوس"| "دبوس أداة 1x4 9 ملم."
    ملاحظة: هذا هو تكوين محدد مسبقا لاستخدام أربعة دبابيس ( الشكل التكميلي 2 ، الخطوة 2).
  4. حدد "نوع الدبوس". حساب وإنشاء نوع دبوس الذي هو مناسبة للطباعة.
    ملاحظة: هذه الخطوة يحدد عدد البقع دبوس ستطبع قبل إعادة الغمس في العينة 384 جيدا وينبغي أن يكون الأمثل لمختلف أنواع دبوس والكيمياء سطح الشريحة.
    ملاحظة: عند استخدام دبابيس 946MP3، والنظر في اثنين من القضايا الهامة: 1) يمكن لكل دبوس طباعة ما يصل إلى 140 البقع متجانسة و 2) قبل اكتشافها ضروري لاستنزاف السائل الزائد من طرف دبوس قبل الطباعة على الشرائح. لذلك، برنامج كل دبوس لطباعة 20 قبل البقع على كتلة ما قبل الطباعة (الأمثل ل 946MP3 دبابيس على الشرائح المغلفة الايبوكسي).
    1. حساب إجمالي عدد البقع المطبوعة لكل عينة.
      ملاحظة: هنا، كل دبوس يطبع 4 نقاط لكل صفيف الفرعي (كتلة). ما مجموعه 4 صفائف فرعية لكل الشرائح = 16 البقع / سيبيئة تطوير متكاملة. بعد 7 الشرائح، كل دبوس يطبع 16 × 7 = 112 البقع. وبالإضافة إلى ذلك، 20 قبل البقع قبل الطباعة يعطي 132 البقع / تراجع. لذلك، يتم تعريف نوع دبوس باسم "946MP3-132 البقع" (4 بقع لكل عينة في كتلة × 4 كتل × 7 الشرائح + 20 قبل البقع = 132).
    2. إنشاء "دبوس نوع" ( التكميلي الشكل 2 ، الخطوة 3). اضغط على "إعداد" (اللوحة اليمنى من البرنامج) | "ميكرو سبوتينغ بينس" | "اسم جديد" (946MP3-132 البقع). تحديد عدد البقع في الانخفاض (132)، وقطر بقعة (100 ميكرون)، وامتصاص (0.25 ميكرولتر)، والتسليم (0.7 نل)، والحد الأدنى تباعد البقعة (100 ميكرون). اضغط على "موافق" | "حسنا."
    3. في نافذة "خصائص الطريقة"، حدد نوع دبوس تم إنشاؤه: "946MP3-132 البقع."
  5. تحديد ظروف الغسيل. تعيين "غسل قبل البدء" و "غسل بعد التشطيب" إلى "غسل عادي" ( التكميلي الشكل 2 ، الخطوة 4).
  6. حدد "قائمة اللوحة".
    ملاحظة: هذا هو نمط أخذ العينات من لوحة (ترتيب الانخفاضات من لوحة 384 جيدا) وفقا لتخطيط لوحة. لتحميل لوحة في لائحة لوحة، وإعداد نمط أخذ العينات لوحة.
    1. إنشاء لوحة "نمط أخذ العينات". انتقل إلى "قوالب" ( الشكل التكميلي 3 ) | "أنماط أخذ العينات". إعطاء اسم جديد (على سبيل المثال، جوف مجموعة) وحدد "إدراج" | "املأ أعلى القاع" | "دبوس أداة 1 × 4 9 ملم." حدد ترتيب بيك آب جيدا وفقا لتخطيط لوحة محددة مسبقا ( التكميلي الشكل 1A ). اضغط على "موافق" | "حسنا."
    2. تحميل نمط أخذ العينات لوحة. انقر على الجانب الأيمن من "قائمة لوحة" الخلية ( التكميلي الشكل 3 ) | "إضافة لوحة" وحدد الصحيح نمط أخذ العينات لوحة ("صفيف المصفوفة" وصفها في الخطوة 3.6.1.). حدد "غسل عادي". صحافة"موافق" | "حسنا."
  7. انتقل إلى "لوحات العينة" وتغيير إزاحة الموقف إلى 1 (الذي يحدد أين يقع لوحة على سطح المركب).
    ملاحظة: موقف الإزاحة 0 هو أقرب إلى حمام سونيكاتور.
  8. تعريف "تصميم الطباعة ميكروأري". احسب المسافات من كتلة إلى كتلة وتباعد.
    1. النظر في أبعاد الأداة النامية التي تقسم الشريحة إلى 16 بئر 7 × 7 مم، مع المسافات 2 ملم بين صفائف الفرعية (ما مجموعه 9 ملم بين الكتل؛ الشكل التكميلي 4 ).
    2. النظر في أبعاد الصفيف الفرعية.
      ملاحظة: التباعد بين البقع هو 0.275 ملم وهناك 12 الأعمدة و 18 الصفوف في هذا التصميم الطباعة؛ الأبعاد الكلية هي: العرض (11 × 0.275 مم = 3.025 مم) والارتفاع (17 × 0.275 مم = 4.675 مم). احسب التباعد الأفقي: 9 مم - (11 0.275) = 5.97 مم. احسب التباعد الرأسي: 9 مم - (17 × 0.275) = 4.325 مم. حساب دإستانس من الجانب الأيسر من الشريحة: 4.43 مم + 1.07 مم = 5.5 مم. حساب المسافة من الجانب العلوي من الشريحة: 2.95 مم + 0.55 مم = 3.5 مم ( الشكل التكميلي 4 ).
    3. تعريف "تصاميم الطباعة" ( الشكل التكميلي 5 ). حدد "قوالب" | "تصاميم الطباعة" | "الجديد."
      1. حدد "تثبيت الإعداد" | "دبوس أداة 1 × 4 9 مم" | "دبوس - 946MP3-132 البقع." في علامة التبويب "عام"، تغيير "اسم ميكروأري طباعة" ( أي "جوف صفيف"). حدد "السرعة الفورية" | "تكرار رقم" (4) | "ارتفاع نقطة اللمس" (0 مم) | "ارتفاع اللمسة الناعمة" (3 مم) | "طباعة لجميع المواقف المتاحة" ( التكميلي الشكل 5A ).
      2. في علامة التبويب "ميكروأري"، اختر التباعد الأفقي والرأسي (5.9 مم و 4.325 مم من الخطوة 3.8.2) وعدد ميكروأرس الأفقي والرأسي (2). حدد "طباعةميكروأري أفقيا "|" طباعة ميكروأري مكرر "( التكميلي الشكل 5B ).
      3. في علامة التبويب صفيف الفرعية، واختيار الحد الأقصى لعدد الأعمدة (12)، والحد الأقصى لعدد الصفوف (18)، والمسافة بين الأعمدة والصفوف (275 ميكرون) ( الشكل التكميلي 5C ).
      4. في علامة التبويب القياسات، واختيار المسافة من الجانب الأيسر من الشريحة (5.5 مم)، والمسافة من الجزء العلوي من الشريحة (3.5 مم، المحسوبة في الخطوة 3.8.2)، وعرض الشريحة المطبوعة (25 ملم) ، وارتفاع شريحة الطباعة (75 ملم) ( التكميلي الشكل 5D ). اضغط على "موافق" | "حسنا."
  9. انقر على الجانب الأيمن من الخلية "ميكروأري طباعة تصاميم" الخلية وحدد التصميم المحدد ("جوف صفيف" من الخطوة 3.8.3؛ التكميلي الشكل 6 ).
  10. تعريف "عدد الشرائح" (56)، وتغيير "إزاحة الموضع" (0). هذا يحدد بو(الشريحة التكميلية 6 ).
  11. تحديد "ميكروأري قبل الطباعة تصميم" ( التكميلي الشكل 6 ). حدد "كتلة الزجاج" | "قبل الطباعة 1 × 4 مم أداة دبوس."
    ملاحظة: هذا الإعداد تباعد البقعة يسمح 46464 قبل البقع (لجميع دبابيس 4) على كتلة الزجاج، وبالتالي 46،464 / 4 = 11،616 قبل البقع لكل دبوس. عندما تم استخدام المساحة الموجودة على كتلة ما قبل الطباعة، سوف تتوقف الطابعة وسوف تحتاج إلى انقلبت كتلة.
    ملاحظة: لحساب بعد عدد عينات كتلة ما قبل الطباعة هو الكامل، والنظر في ما يلي: سيتم أخذ كل عينة من قبل 8 دبوس الانخفاضات في لوحة 384 جيدا لإكمال 56 الشرائح (7 الشرائح في الانخفاض)، و كل تراجع لديه 20 إضافية قبل البقع، وإعطاء ما مجموعه 160 قبل البقع لكل عينة. لذلك 11،616 / 160 = 72،6 عينة. وبالتالي، فإن كتلة الزجاج قبل الطباعة تحتاج إلى انقلبت على بعد 72 عينات (لتقييم الوقت للتقليب، وقياس حبعد فترة طويلة يستغرق عينة واحدة لإكمال تشغيل كامل على 56 الشرائح ثم ضرب من قبل 72).
  12. حدد "استخدام تصميم بريبرينت" | "نعم" | "مسح الباركود" (لا) | "طباعة واحدة تكرار" (لا) ( التكميلي الشكل 6 ).
  13. انقر على "التحقق من الصحة" ( الشكل التكميلي 6 ).
  14. انقر على "حفظ" وحفظ الطريقة كملف أر (على سبيل المثال، "جوف array.arr"، الشكل التكميلي 6 ).

4. طباعة صفائف مصممة

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات في غرفة نظيفة مع الرطوبة من 60-70٪ ومع القفازات المناسبة والملابس للحماية

  1. قم بتشغيل آلة الطباعة النانوية ومرطب الرطوبة.
  2. لغسل العازلة والترطيب، وملء مع المياه دي. إفراغ زجاجة غسل (استنزاف) والترطيب فخ كاربوي ( الشكل التكميلي 7A ).
  3. تعيين المرطب ل70٪ الرطوبة وتبدأ الترطيب.
  4. تنظيف جميع دبابيس قبل الطباعة. إعداد 50 مل من الساخنة (65 درجة مئوية) دبوس تنظيف طرف الحل (15 غرام من دبوس طرف تنظيف كاشف و 50 مل من 65 درجة مئوية الماء، مختلطة جيدا حتى كاشف الصلبة يذوب تماما).
    1. قم بتطبيق محلول التنظيف على كل طرف دبوس عن طريق غمس الفرشاة التي تربط بين طرفي الدبابيس (غرامة) في محلول تنظيف طرف الدبوس وتنظيف سطح كل طرف دبوس.
      ملاحظة: دبوس تنظيف طرف الحل هو تآكل وسامة. تأكد من ارتداء القفازات ونظارات السلامة في جميع الأوقات عند استخدام هذا الحل. قد تؤدي دبابيس النقع في محلول تنظيف طرفي الدبابيس لأكثر من بضع دقائق إلى تلف دائم للأسمار.
    2. ملء حمام بالموجات فوق الصوتية مع 1 لتر من الماء المقطر ووضع دبابيس في فلاتابل دبوس تنظيف الرف في الحمام. يصوتن لمدة 5 دقائق وإزالة الدبابيس. اسمحوا الجافة ويمسح برفق مع مناديل خاصة غرفة نظيفة.
  5. افتح الطباعة "ميكرواراي ماناجر"إيه البرمجيات؛ عند ضبط االتصال، سيضيء ضوء الطابعة) أحمر / أخضر (. اضغط على "إيقاف" | "واضح" | "إينيت" ( الشكل التكميلي 7B ، الخطوات 1-3). فإن ذراع الطباعة الرأس ثم إعادة تعيين X، Y، Z المحاذاة.
  6. لتحميل الدبابيس في رأس الطباعة، اضغط على "تحميل" ( الشكل التكميلي 7B ، الخطوة 4) ووضع دبابيس في رأس الطباعة وفقا للتكوين المحدد لتخطيط أداة الطباعة / دبوس ( الشكل التكميلي 7C ). يستخدم هذا التخطيط 4 دبابيس، كل الطباعة 4 صفائف فرعية على كل شريحة للحصول على مجموعه 16 صفائف الفرعية لكل شريحة ( الشكل التكميلي 1A ). بعد وضع الدبابيس، اضغط على "إينيت" مرة أخرى.
  7. تجميع الشرائح على سطح السفينة. فتح مربع الشريحة وتنظيف كل شريحة عن طريق تهب غاز النيتروجين فائقة النقاء. ضع العدد المطلوب من الشرائح على منصة المصفوفة. أمسك الشرائح بإصبعين في الزوايا السفلية ثم ضع الشريحة في مكانهاموضع. عقد الزوايا اليمنى ودفع الزوايا اليسرى بلطف حتى الشريحة يناسب بإحكام في موقفها. دفع بلطف نحو الزاوية اليسرى السفلى لضمان تناسب ضيق ( الشكل التكميلي 7D ).
  8. تنظيف الزجاج قبل كتلة مع الماء المقطر، 70٪ من الإيثانول، و 100٪ من الإيثانول والسماح لها الهواء الجاف (استخدام مخصصة فقط مناديل نظيفة غرفة). وضع الزجاج قبل كتلة في موقفها على سطح السفينة.
  9. ملء حمام سونيكاتور ( التكميلي الشكل 7B ). اضغط على "ملء" لمدة 55 ثانية ثم اضغط على "موافق". استنزاف سونيكاتور عن طريق النقر على "استنزاف" لمدة 20 ثانية ثم الضغط على "موافق". كرر ملء واستنزاف مرة أخرى ومن ثم ملء مرة أخرى لمدة 55 ثانية.
  10. ملء حمام الغسيل ( الشكل التكميلي 7B ): اضغط على "رئيس" لمدة 40 ثانية ثم اضغط على "موافق".
  11. ضع لوحة 384 جيدا مع عينات أليكوتد في موقعها على سطح السفينة وإزالة غطاء بارافيلم.
  12. عند اكتمال الطباعة، واستنزاف حمام سونيكاتور ( الشكل التكميلي 7B ) وإيقاف المرطب.
  13. السماح للشرائح لتجف على سطح السفينة لمدة 16-24 ساعة دون الترطيب.
  14. عدد الشرائح مع الكحول / مذيب مقاومة وسم القلم وتخزينها في فراغ-- مختومة مربع في الظلام.

5. تجهيز وتطوير الصفائف

  1. إخراج شريحة من فراغ-- مختومة مربع ووضعه في غطاء الكيميائية لمدة 5 دقائق، صفيف مواجهة، لتتبخر السائل الزائد.
  2. مسح الشريحة على أعلى ربح (950 بمت) للتأكد من أن جميع البقع قد طبعت.
  3. المضي قدما في حظر الكيميائية من مجموعات الايبوكسي على الشريحة
    1. إعداد 50 مل من محلول الإيثانولامين حجب (0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8 و 0.05 M الإيثانولامين). مزيج 140 مل من ديو مع 8.8 مل من تريس-حمض الهيدروكلوريك (1.7 M، ودرجة الحموضة 8) و 0.45 مل من الإيثانولامين (16.6 M). نقل إلى 50-مل تلطيخ أنبوب ( التكميلي الشكل 8A ) ودافئة إلى 50 درجة مئوية.
    2. هيدرات الشريحة. وضع الشريحة في أنبوب تلطيخ مليئة ديو، وتغطيته مع احباط، واحتضان لمدة 5 دقائق مع هز بطيء ولطيف في رت.
    3. منع مجموعات الايبوكسي رد الفعل على الشريحة. تراجع الشريحة في أنبوب تلطيخ 50 مل مليئة ما قبل تحسنت إيثانولامين حجب الحل، وتغطي مع احباط، واحتضان لمدة 30 دقيقة مع هز بطيء ولطيف في رت.
    4. تجاهل حل الإيثانولامين حجب في وعاء القمامة البيولوجية المناسبة ووضع الشريحة في أنبوب تلطيخ نظيفة جديدة مليئة 50 درجة مئوية ديو. تغطية مع احباط واحتضان لمدة 10 دقيقة مع هز بطيء ولطيف في رت.
    5. تجاهل المياه ونقل الشرائح إلى حامل الزجاج تلطيخ ( التكميلي الشكل 8B ). وضع حامل تلطيخ الزجاج في حامل لوحة يتأرجح وأجهزة الطرد المركزي الجافة الشريحة لمدة 5 دقائق في 200 x ج و رت.
  4. إعداد حاجز والمضي قدما في الحجب البيولوجي.
    1. وضع الشريحة على مقسم 16 جيدا ( الشكل التكميلي 8C ).
    2. إعداد بست حل الغسيل: 50 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (بس)، ودرجة الحموضة 7.4 + 0.1٪ توين 20.
    3. إعداد حل عرقلة البيولوجي (بس-أوفا): 5 مل من برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4 + 1٪ البيضاوي الدجاج (10 ملغ / مل).
      ملاحظة: اختيار كاشف حجب أمر بالغ الأهمية لنجاح الكشف عن الأجسام المضادة لمكافحة ne5Gc. يرصد أوفالبومين في الدجاج الذي، مثل البشر، لا يمكن توليف Neu5Gc، مما تسبب في عدم التعبير عن هذا سيا. للكشف عن Neu5Gc، حتى الملوثات الطفيفة يمكن أن تقلل بشكل كبير من حساسية الفحص، وأحيانا حتى فشل في الكشف عن أي تفاعل مضاد لل Neu5Gc. على سبيل المثال، كاشف حظر الأكثر شيوعا، ألبومين المصل البقري (بسا)، وإن لم يكن غليكوسيلاتد في حد ذاته، يحتوي على الملوثات البقري مفتش البقري التي تحمل Neu5Gc-ميوتيز وبالتالي تتنافس ثإيث المطبوعة غليكانز عند ملزم لعينة مع الأجسام المضادة لمكافحة Neu5Gc 19 ، 20 .
    4. بريويت الآبار. باستخدام ماصة متعددة، قسامة 200 ميكرولتر من بست في بئر الشريحة، ووضعها في غرفة رطبة مغطاة، ويهز لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: غرفة الرطوبة هي علبة زجاجية مع ورقة منشفة مبللة، مغطاة التفاف النايلون واحباط لحماية عينات من الضوء.
    5. إزالة بست عن طريق عبها والتنصت بلطف على منشفة ورقية نظيفة وقسامة 200 ميكرولتر من بس-أوفا عرقلة العازلة في كل بئر. مكان في غرفة رطبة واحتضان لمدة 1 ساعة في رت مع الهز لطيف.
  5. إعداد الكشف الأولي المخفف في بس-أوفا عرقلة العازلة، كما هو موضح في الجدول 2 .
    ملاحظة: لتقييم الجودة (ق) تقييم هذا ميكروأري سيالوغليكان، واستخدام عدة بروتينات ملزمة سيا: سامبوكس نيغرا ليتين (سنا)، معزولة عن النباح التوت، ومن المتوقع أن تعترف سيا &# 945؛ 26؛ ومن المتوقع أن تعترف مايا أمورنسيس ليتين الثاني (مالي) ب Siaα23؛ والدجاج لمكافحة Neu5Gc ومن المتوقع إيغي تعترف جميع سيالوغليكانز ne5Gc التي تحتوي على. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم مختلف عينات المصل البشري لملف الشخصي استجابة neu5Gc مفتش. وينبغي أن يتم معايرة تركيز ليكتينس / الأجسام المضادة / سيرا تجريبيا.
  6. نفض الغبار الجاف بس-أوفا عرقلة عازلة وإضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية لكل بئر (الحد الأدنى لحجم كل بئر: 70 ميكرولتر)، واحتضان في غرفة رطبة لمدة 2 ساعة.
  7. نفض الغبار تجف كشف الابتدائي وغسل 4 مرات مع PBST (بين 3 و 4 تشرين غسل، احتضان الشريحة في PBST لمدة 5 دقائق في غرفة رطبة). يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
  8. إعداد الأجسام المضادة الثانوية في برنامج تلفزيوني، كما هو موضح في الجدول 2 .
  9. نفض الغبار تجفيف برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية. احتضان لمدة 1 ساعة في رت مع اهتزاز.
  10. نفض الغبار تجفيف الأجسام المضادة الثانوية وغسل أربع مرات مع بست (بين 3أردي و 4 ال يغسل، احتضان الشريحة في بست لمدة 5 دقائق في الغرفة الرطبة).
  11. إزالة بعناية الإطار ووضع الشرائح في أنبوب تلطيخ الشريحة مل 50 مليئة بس ويهز لمدة 5 دقائق.
  12. ملء اثنين من الشريحة تلطيخ الحمامات ( التكميلية الشكل 8D ) مع ديو، ضع الشريحة في حامل الشريحة، وتراجع داخل الحمام. تراجع بسرعة 10 مرات ومن ثم نقل إلى الحمام الثاني وتراجع 10 مرات أخرى. احتضان لمدة 10 دقيقة في رت مع اهتزاز.
  13. تجاهل المياه ونقل الشريحة إلى حامل تلطيخ الزجاج ( التكميلي الشكل 8B ؛ السماح للشريحة إلى الهواء الجاف). وضع حامل تلطيخ الزجاج في حامل لوحة يتأرجح وأجهزة الطرد المركزي الجافة الشريحة لمدة 5 دقائق في 200 غرام و رت.
  14. مسح الشريحة ثم تخزينه في مربع مختومة فراغ في الظلام.

6. صفيف المسح الضوئي وتحليل البيانات

  1. فتح الماسح الضوئي الشريحة الفلورسنت والسماح لها الحارة لمدة 5 دقائق. افتح المسح وتحليل البرمجيات.
  2. تعيين المعلمات المسح ( الشكل التكميلي 9A ): مسح في 532 نانومتر و 100٪ السلطة مع مكاسب من 350 بمت، مع سطر واحد في المتوسط ​​و 0 ميكرون موقف التركيز. استخدام 10.0 ميكرون بكسل حجم القرار.
    ملاحظة: يمكن تعديل المعلمات المسح الضوئي لأنواع الشرائح المختلفة، مضان، والقرار.
  3. مسح الشريحة المتقدمة. فتح باب الماسحة الضوئية ووضع الشريحة داخل، صفيف تواجه أسفل. بدء المسح الضوئي (الأخضر "تشغيل" زر على قائمة لوحة الملاحة البرمجيات، التكميلي الشكل 9B ).
  4. حفظ الشرائح الممسوحة ضوئيا كملف تيف.
  5. إعداد الشريحة للتحليل. حدد "تحميل قائمة صفيف" وتحميل ملف غال المناسب الذي يصف المصفوفات في كل كتلة على الشريحة ( التكميلي الشكل 9C ).
    ملاحظة: يحتوي ملف غال على معلومات تتعلق بكل من الهوية والموقع (X، Y) لكل بقعة على الشريحة. يمكن إنشاء هذا الملفمن قبل برنامج الطابعة تصدير ملف نصي محدد بعلامات جدولة استنادا إلى هويات العينات في لوحة مصدر 384 جيدا وتصميم الطباعة المحدد.
  6. تعيين المعلمات المحاذاة والتحليل. اضغط على زر "الخيار" في قائمة لوحة الملاحة البرمجيات ( التكميلي الشكل 10 ).
  7. تحديد معلمات المحاذاة. العثور على ميزات دائرية، وميزات تغيير خلال المحاذاة بنسبة 50 - 350٪، والحد من ميزة ميزة إلى أقصى ترجمة 40 ميكرون، ونفلاغ الميزات التي تفشل عتبة الخلفية (كبي عتبة 0)، وتقدير التفاف والدوران عند العثور على كتل، وأتمتة تسجيل الصور (10 بكسل) ( التكميلي الشكل 10 ).
  8. تحديد المعلمات تحليل: نسبة W1 / 532، الانحراف المعياري العادي، وتحليل الميزات الغائبة، والطرح الخلفية. انقر على "تحديد" ثم "متوسط ​​خلفية الموضع المحلي" وحدد 2 بكسل لاستبعاد وعرض 3 بكسل للخلفية. اضغط موافق." سيt مستوى تشبع الماسح الضوئي إلى الافتراضي ( الشكل التكميلي 10 ).
    ملاحظة: طريقة الطرح الخلفية يعتمد على التصميم التجريبي ويمكن تعديلها وفقا لاحتياجات محددة.
  9. محاذاة خرائط الميزات. تعيين البرنامج في وضع كتلة (اضغط على "B")، حدد كافة الكتل (السيطرة + A)، ووضع شبكات خريطة صفيف، ومحاذاة كافة الكتل (ألت + شيفت + F7) ( الشكل التكميلي 11 ).
  10. قم بتحسين محاذاة الميزة في كل كتلة. التكبير (اضغط "Z" للوصول إلى وضع التكبير) في كتلة العلوي الأيسر، اضغط على "B" مرة أخرى (وضع كتلة)، واضغط على الشبكة من هذه الكتلة. فقط نقل الشبكة من هذه الكتلة حتى تتماشى تماما مع البقع كتلة واضغط F5 لمحاذاة الميزات في هذه المجموعة المحددة. كرر حركة الشبكة و F5 محاذاة حتى البقع محاطة تماما. تفعل الشيء نفسه لكل واحد من 16 كتل حتى جميع الشبكات في مكانها.
  11. تحليل وحفظ البيانات. حدد جميع الكتل (كرتل +أ) ومن ثم تحليل البيانات (ألت + A). حفظ نتائج التحليل (كترل + U) كملف .gpr.
  12. فتح ملف .gpr المحفوظة في برنامج جدول بيانات وتحليل كثافة كل بقعة على أساس مضان بعد الطرح الخلفية المحلية (F532-B532).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

طباعة الصفيف وتطويره وتحليله:

طباعة ميكروأري سيالوغليكان مع عينات غليكان متعددة والمنحنيات إيغ الإنسان ستد في 16 كتل مختلفة يتطلب معايرة شاملة لضمان أن يتم طباعة جميع العينات بشكل موحد ممكن في كل 16 كتل في الشريحة وجميع الشرائح في نفس تشغيل الطباعة. لذلك، هناك حاجة إلى عدة تجارب المعايرة قبل تحديد معلمات الطباعة المحددة، بما في ذلك تكوين المخزن المؤقت لكل نوع من العينة، نوع الشريحة وتصنيعها، نوع لوحة 384 جيدا، ومستويات الرطوبة، وحجم العينة في لوحة 384 جيدا، وكمية من قبل -طباعة لكل نوع من العينة، الإنسان إيغ ستد منحنى تركيزات، ونوع علامة. تم التحقق من متانة هذه الشرائح مجموعة سيالوغليكان المطبوعة لتستمر لمدة تصل إلى 10 شهرا في مربع فراغ مختومة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. في كل تجربة الطباعة، والتوحيد هومزيد من الرصد والتحقق من صحتها من خلال تجارب مراقبة الجودة باستخدام مكملات سيتا ملزمة والأجسام المضادة. وقد تم تحسين البروتوكولات النامية والمسح الضوئي لتحقيق الاتساق والدقة عن طريق مقارنة العينات داخل وبين الشرائح من نفس تشغيل الطباعة. يتم تطوير الشرائح مع مقسم 16-جيدا، والذي يضمن الفصل السليم بين الكتل، وذلك باستخدام ظروف حظر الأمثل (الكيميائية والبيولوجية)، يغسل، وأوقات الحضانة. وقد تم معايرة الكشف الأولي والثانوي على نطاق واسع لضمان أقصى قدر من الكشف مع الحد الأدنى من الخلفية وغير ملزمة ملزمة. عند مسح الشريحة والتحليل، تم نقل نتائج الإخراج إلى ملف جدول بيانات وتحليلها لتحديد الكشف في كل بقعة. تم إخضاع كل بقعة لفحص أوتلير وتم حذفها إذا لم تستوف مراقبة الجودة (إذا كانت النسبة المئوية للسيرة الذاتية أقل من 20، وتكون النقطة خارج نطاق انحراف معياري واحد بعيدا عن متوسط ​​المكررين الأربعة). ثم، متوسط ​​كثافة الإشارة بعدr تم حساب متوسط ​​الطرح من الخلفية المحلية لنقاط تكرار لكل عينة لتوليد وحدة البيانات مضان النسبية (رفو) نقطة البيانات في العينة المطبوعة. مرة واحدة تم التحقق من توحيد منحنيات إيغ ستد في جميع كتل اختبارها، تم تطبيع القيم رفو إلى نغ / ميكرولتر مفتش، مما يتيح فرصة للمقارنة أفضل العينات داخل وبين التجارب.

سيا ملزمة عالية الإنتاجية الفحص:

صفائف سيالوغليكان يمكن استخدامها للكشف عن المحددات (على سبيل المثال، البروتينات، ليكتينس، الأجسام المضادة، الفيروسات، الخ ) التي تربط غياكانز التي تحتوي على سيا. ل ق بعد الطباعة، سيكا ملزم مصنع ليكتينس ومكافحة neu5Gc إيغي تستخدم 19 . يربط سنا α2-6 مرتبطة سيا، مالي يربط α2-3 مرتبطة سيا، ومكافحة neu5Gc إيغي يربط NE5Gc التي تحتوي على سيالوغليكانز ولكن لا يربط Neu5Aج تحتوي على سيالوغليكانز 19 ، كما هو مبين في الشكل 2A . وتهدف تجربة مراقبة الجودة إلى التحقق من صحة الطباعة الفورية والهوية وعدم وجود تفاوت بين الكتل المطبوعة باستخدام الدبابيس الأربعة المختلفة. يتم مراقبة تقلب كتلة إلى كتلة من خلال تطوير أربع كتل لكل الكشف الأولي لكل شريحة وبمقارنة الكتل التي تم طباعتها مع كل واحد من دبابيس الأربعة مع نفس شدة الكشف الأولية. ثم يتم إجراء مقارنة لضمان عدم وجود اختلافات كبيرة.

المصل البشري يحتوي على الأجسام المضادة المضادة لل Neu5Gc متنوعة 6 مع ضمنا لمختلف الأمراض البشرية 2 ، 21 ، 22 ، 23 . لتقييم سيغالوغليكان الاعتراف في المصل البشري مفتش، تم تحليل 12 سيرا من المتبرعين الإنسان صحية على ميكر المطبوعة سيالوغليكانوواراي وضعت باستخدام فلورزنتلي المسمى مفتش الإنسان إيغ ( الشكل 2B ). كل كتلة مطبوعة تحتوي على منحنى إيغ الإنسان منحنى التي هي قابلة للمقارنة ومتجانسة في جميع الكتل ( الشكل 2C ). فقط بعد التحقق من جودة المنحنيات ستد في كل كتلة ( الشكل 2C ) هي نتائج البقع غليكان تطبيع وفقا للمنحدر في كتلة ومن ثم ضربها في عامل التخفيف. كما هو مبين في الشكل 2B ، جميع المصل البشري اختبارها تحتوي على مستويات مختلفة من المضادة لل Neu5Gc مفتش، مع ما يقرب من أي اعتراف من أزواج المتطابقة من سيالوغليكانس ne5Ac التي تحتوي على. وعلاوة على ذلك، وأنماط الاعتراف المضادة لل Neu5Gc مفتش متنوعة للغاية بين هذه المصل 12 مختلفة، سواء في مستوى كثافة والتنوع.

شكل 1
الشكل 1: نظرة عامةمن الصفيف الطباعة، النامية، وتحليل الصورة. ( A ) ويظهر Neu5Gc9Acα2-6GalNAcαProNH2 كممثل Neu5Gc-كونتينغ سيا غليكان، مع أمين الأولية التي يتم طباعتها على الشرائح الزجاجية المغلفة الايبوكسي. ( ب ) وضعت صفائف المطبوعة مع مختلف البروتينات سيا ملزمة، تليها الكشف مع المناسب فلورزنتلي المسمى الأجسام المضادة الثانوية. كل مجموعة فرعية يمكن تطويرها بشكل فردي. ( C ) مسح الشريحة التي تم مسحها في الماسح الضوئي مضان يولد صورة التي يتم تحليلها باستخدام برنامج صورة الماسح الضوئي. المصفوفات الفرعية مضافين مع شبكة رسم الخرائط كل بقعة على المصفوفات ومضان الكشف عن كل بقعة. ثم يتم نقل النتائج إلى ملف جدول بيانات. يتم تمثيل صفيف واحد في بئر واحد تخطيطي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: ملامح من ميكروأرس سيالوغليكان باستخدام مختلف البروتينات سيا ملزمة.
تم تطوير الشرائح مع 16 من مختلف أنواع الكشف الأولية، واحدة في كل كتلة. ( A ) ممثل 3 كتل من شريحة مراقبة الجودة تظهر أنماط ملزمة من سيا محددة مصنع ليكتينس سنا و مالي و بوليكلونل أحادية محددة الدجاج لمكافحة Neu5Gc إيغي. وتعرض النتائج على النحو في RFU في شكل خريطة التمثيل اللوني لكل كتلة الفردية (الأحمر والأبيض والأزرق، وهو ما يمثل 100 ال، ال 50، و0 المئين الخامس على التوالي). ( B ) تم اختبار 12 مختلفة من الأمصال البشرية صحية في التخفيف 1: 100 وكشف مع مفتش هوامن المضادة للملف الشخصي المضادة لل Neu5Gc مفتش. تم تطبيع البيانات رفو إلى نانوغرام / ميكرولتر بقسمة كل قيمة مع المنحنى منحنى إيغ ستد في كل بل محددةأوك ثم تضاعف في عامل التخفيف. يتم تمثيل البيانات في شكل خريطة التمثيل اللوني لجميع الكتل المؤتلفة (الأحمر والأبيض، والأزرق، وتمثل الشركة المصرية للاتصالات 100 ال، ال 50، و0 عشر المئوية، على التوالي). ( C ) الإنسان إيغ ستد منحنيات من 12 كتل المتقدمة مع المصل البشري التي استخدمت لتطبيع البيانات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

معرف غليكان بناء
1 Neu5،9Ac 2 α3Galβ4GlcNAcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
2 Neu5Gc9Acα3Galβ4GlcNAcβO (تش 2 ) 2 تش 2 </ سوب> نه 2
3 Neu5،9Ac 2 α6Galβ4GlcNAcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
4 Neu5Gc9Acα6Galβ4GlcNAcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
5 Neu5Acα6GalNAcαO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
6 Neu5Gcα6GalNAcαO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
7 Neu5،9Ac 2 α3Galβ3GlcNAcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
8 Neu5Gc9Acα3Galβ3GlcNAcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
9 Neu5،9Ac 2 α3Galβ3غالناكو (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
10 Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcαO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
11 Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
12 Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
13 Neu5Acα3Galβ3GlcNAcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
14 Neu5Gcα3Galβ3GlcNAcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
15 Neu5Acα3Galβ3GalNAcαO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
16 2 ) 2 تش 2 نه 2
17 Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
18 Neu5Gcα6Galβ4GlcNAcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
19 Neu5Acα6Galβ4GlcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
20 Neu5Gcα6Galβ4GlcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
21 Neu5Acα3Galβ4GlcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
22 Neu5Gcα3Galβ4GlcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
23 Neu5،9Ac 2 α6GalNAcαO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
24 Neu5Gc9Acα6GalNAcαO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
25 Neu5Acα3GalβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
26 Neu5Gcα3GalβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
27 Neu5Acα6GalβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
28 Neu5Gcα6GalβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
29 Neu5،9Ac 2 α3GalβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
30 2 ) 2 تش 2 نه 2
31 Neu5،9Ac 2 α6GalβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
32 Neu5Gc9Acα6GalβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
33 Neu5Acα3Galβ3GalNAcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
34 Neu5Gcα3Galβ3GalNAcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
35 Neu5،9Ac 2 α3Galβ3GalNAcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
36 Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
Neu5،9Ac 2 α6Galβ4GlcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
38 Neu5Gc9Ac6Galβ4GlcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
39 Neu5،9Ac 2 α3Galβ4GlcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2
40 Neu5Gc9Ac3Galβ4GlcβO (تش 2 ) 2 تش 2 نه 2

الجدول 1: قائمة غليكانز المطبوعة.

الابتدائية / الثانوية الأجسام المضادة / ليكتين تركيز الأسهم النوعية العمل التخفيف / التركيز
الكشف الأولي Biotinilated-MALII 1 مغ / مل حمض السياليك في α2-3 الربط 1:50، 20 ميكروغرام / مل
Biotinilated-SNA 2 مغ / مل حمض السياليك في α2-6 الربط 1: 100، 20 ميكروغرام / مل
الدجاج مكافحة ne5Gc إيغي ND Neu5Gc حمض السياليك 1: 7000
مصل الإنسان 100٪ العديد من الحواتم 1: 100
الكشف الثانوي CY3-Streptavidin 0.75 مغ / مل البيوتين 1: 500، 1.5 ميكروغرام / مل
CY3 مكافحة الدجاج إيغي 0.75 مغ / مل إيغي الدجاجة 1: 2،000، 0.375 ميكروغرام / مل
CY3 مكافحة إيغ الإنسان H + L 0.6 ملغ / مل هوماn مفتش 1: 1،500، 0.4 ميكروغرام / مل

الجدول 2: قائمة بروتينات الكشف الأولية والثانوية.

الأرقام الإضافية: الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نجاح التصنيع ميكروأري غليكان يتطلب تخطيط دقيق ويتضمن العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول. وتشمل هذه ما يلي: (1) تخطيط تخطيطات الفدرات واللوحة التي تحدد جميع المعلمات اللاحقة ( مثل المسافات والمباعدة بين العينات وكمية العينات والطباعة)؛ (2) تنظيف المسامير وضمان سلامة دبوس، وهو أمر بالغ الأهمية للسيطرة على التجانس بقعة. (3) الحفاظ على نسبة عالية من الرطوبة أثناء الطباعة، الحرجة لتجنب تبخر عينة أثناء تشغيل الطباعة الطويلة، والتي يمكن أن تضر التجانس بقعة؛ (4) اختيار المحاذاة الصحيحة وتحليل المعلمات، والتي يمكن أن تؤثر على النتائج (على سبيل المثال، طريقة الطرح الخلفية، عتبة، ومرونة حجم البقعة).

طريقة يمكن تعديلها إضافية لتلبية التصاميم التجريبية المحددة والأهداف. علی سبیل المثال، یمکن تعدیل رقم الضبط المسبق لتتناسب بشکل أفضل مع کل نوع من المواد المراد طباعتھا علی المصفوفة. الخطوة غسل دبوس خلالالطباعة يمكن أن يكون الأمثل لتناسب مختلف المواد المطبوعة، إما مع أقصر أو تمديد دورات الغسيل. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل كمية البقع يطبع دبوس لكل تراجع لتشمل أكثر أو أقل البقع ولكن يتطلب معايرة منفصلة لكل نوع من المواد المستخدمة على المصفوفة. يمكن تعديل نوع علامة مضان وتركيزه، طالما أنه يحتوي على المجموعة الكيميائية المناسبة للإقتران ( أي الأمين الأساسي للشرائح المغلفة الايبوكسي). يمكن تمديد تركيزات وأنواع منحنيات الأمراض المنقولة جنسيا (على سبيل المثال، الإنسان / الماوس / كائن آخر مفتش، إيغم، ايغا، الخ ). ويمكن تحسين الظروف العازلة لتناسب مواد مختلفة، ويفضل أن تفتقر المواد مع الأمين الأساسي لتجنب ملزمة غير محددة إلى مجموعة، مما يؤدي إلى زيادة الخلفية. الأهم من ذلك، للكشف الأمثل ل Neu5Gc، يجب أن يكون كاشف حجب البيولوجية خالية من Neu5Gc (على سبيل المثال، وتجنب الحليب أمد بسا)، وهذا قد يقلل من الكشف NE5Gc-سيالوغليكان وأنانكريس الخلفية 19 ، 20 . وينبغي تحسين تركيزات الكشف الأولية والثانوية لتجنب خلفية عالية وملزمة غير محددة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديل المعلمات المسح (على سبيل المثال، السلطة، والكسب، والقرار) للحد من الخلفية أو تعزيز إشارات منخفضة. وأخيرا، يمكن تعديل المعلمات المحاذاة والتحليل لتتناسب مع خلفية عالية أو ملامح على شكل مختلف. وقد تم مؤخرا وصف مزيد من المعلومات والمبادئ التوجيهية المتعلقة بالمعايير الموصى بها للإبلاغ عن البيانات ميكروأري غليكان من قبل مبادرة ميراج 17 ، والتي يمكن أن تسهل في نهاية المطاف تبادل البيانات والتفسير.

وباختصار، توفر ميكروأرس غليكان أداة قوية للتحقيق في التفاعلات جليكان جزيء حيوي ويمكن تكييفها لمختلف العينات البيولوجية. الأجسام المضادة لمكافحة Neu5Gc تلعب أدوارا مختلفة في مرض الإنسان 23 . على سبيل المثال، في السرطان، والأجسام المضادة لمكافحة ne5Gc تلعب أدوار مزدوجة: من ناحية، فإنها بمثابة المؤشرات الحيوية المحتملة، ولكن من ناحية أخرى، فإنها بمثابة العلاجات المحتملة 7 ، 21 ، 24 . هذه الأجسام المضادة تسهم أيضا في تفاقم تصلب الشرايين 25 ، وفعالية زرع الأعضاء 20 ، 26 ، وتأثير العلاجات الحيوية غليكوسيلاتد 27 . وهكذا، التنميط المضادة للأجسام المضادة neu5Gc في عينات بشرية مختلفة من الاهتمام المتزايد، وفحوصات عالية الإنتاجية، مثل واحد وصفها هنا، يمكن أن تسهم في تعزيز فهمنا لأدوارها في صحة الإنسان والمرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال جائزة تطوير مهنة البحث من الصندوق الإسرائيلي لبحوث السرطان، وهي منحة من المبادرة الوطنية الإسرائيلية لتكنولوجيا النانو، وصندوق هيلمزلي الخيرية لمنطقة تقنية مركزية لأجهزة نانوميدينيس ل ثيرانوستيكش شخصية (ف-K)، و ناتيونال معاهد الصحة منحة R01GM076360 (إلى شك).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primary-amine containing sialoglycans Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) Contact info@glycohubusa.com for compound requests Printed glycans
Monosodium phosphate monohydrate Sigma S9638 Printing buffer component
Disodium phosphate heptahydrate Sigma S9390 Printing buffer component
Phosphate buffered saline Hy-Labs BP-507/500D Printing buffer/ incubation/washing buffer
Tris-base Sigma T1503 Slide blocking reagent
Glycerol Sigma G-7893 Printing buffer component
Ethanolamine Thermo-Fisher Scientific 0700/08 Slide blocking reagent
Ovalbumin (Grade V) Sigma A5503 Slide Blocking protein
Tween-20 Sigma P7949 Slide washing detergent
Alexa 555-Hydrazide Thermo-Fisher Scientific A20501MP Marker on array
ChromPure Human IgG, whole molecule Jackson Immunoresearch 009-000-003 Printing component
Biotinylated- SNA Vector Laboratories B-1305 Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked
Biotinylated-MALII Vector Laboratories B-1265 Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked
Chicken-anti Neu5Gc IgY BioLegend 146903 Primary detection
Cy3-Streptavidin Jackson Immunoresearch 016-160-0848 Biotin binding
Cy3-anti Human IgG Jackson Immunoresearch 109-165-088 Secondary detection against human IgG
Cy3-anti Chicken IgY Jackson Immunoresearch 703-165-155 Secondary detection against chicken IgY
Human sera samples Israeli Blood Bank Primary detection
Compressed Nitrogen (Grade 5) General dusting/drying tool
Epoxy-coated slides Corning 40044 Slides
Epoxy-coated slides PolyAn 2D 104-00-221 Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots.
384-well microtiter plate Genetix 2070 Printing plate
VWR lab marker VWR 52877-310 Slide labeling
Staining Tube ArrayIt MST Slide developing tool
Staining bath VWR 25608-904 Slide developing tool
Slides glass holders VWR 631-9321 Slide developing tool
GenePix Scanner Molecular devices 4000B Slide scanner
LM-60 NanoPrinter ArrayIt LM-60 Array printer
Pins ArrayIt 946MP3 Printing pins
ProPlate Module Grace Bio-Labs P37004 Slide developing module
Distilled water Bio-Lab 2321020500 Required for arrayer and humidifier
Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL Thermo-Fisher Scientific (Matrix) MA-2131 Impact2 Equalizer 384 Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352, (1), 102-112 (2014).
  2. Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
  3. Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
  4. Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100, (21), 12045-12050 (2003).
  5. Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280, (6), 4228-4237 (2005).
  6. Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18, (10), 818-830 (2008).
  7. Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71, (9), 3352-3363 (2011).
  8. Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
  9. Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99, (10), 650-665 (2013).
  10. Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
  11. Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32, (7), 465-473 (2015).
  12. Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14, (1), 29-41 (2014).
  13. Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
  14. Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12, (10), (2011).
  15. Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42, (10), 4310-4326 (2013).
  16. Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26, (9), 907-910 (2016).
  17. Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. (2016).
  18. Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179, (1), 162-166 (1989).
  19. Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287, (27), 22593-22608 (2012).
  20. Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18, (1), 1-5 (2011).
  21. Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112, (2), 542-547 (2015).
  22. Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26, (2), 111-128 (2016).
  23. Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
  24. Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111, (16), 5998-6003 (2014).
  25. Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114, (25), 5225-5235 (2009).
  26. Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23, (5), 381-392 (2016).
  27. Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28, (8), 863-867 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics