Sialoglycanマイクロアレイアッセイによるヒト血清中の抗Neu5Gc IgGのプロファイリング

Behavior

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Summary

シアログリカンマイクロアレイアッセイを用いてヒト血清中の抗Neu5Gc抗体を評価し、癌および他の慢性炎症媒介ヒト疾患のハイスループット診断アッセイを可能にする。

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Leviatan Ben-Arye, S., Yu, H., Chen, X., Padler-Karavani, V. Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay . J. Vis. Exp. (125), e56094, doi:10.3791/56094 (2017).

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Abstract

細胞は、癌で一般的に変化し、シアル酸(Sia)発現の変化を含む炭水化物鎖(グリカン)の外皮で覆われている。これらは、9炭素骨格を有し、細胞表面上の脊椎動物グリカンをキャップする酸性糖である。哺乳動物の主要な2つのSia型は、 N-アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)およびそのヒドロキシル化形態であるN-グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)である。ヒトは、シチジン5 'モノホスフェート-Neu5Ac(CMP-Neu5Ac)ヒドロキシラーゼ(CMAH)をコードする遺伝子の不活性化のために、内因性Neu5Gcを産生することができない。外部Neu5Gcは、赤肉および乳製品の食物摂取を通じてヒト細胞によって獲得され、その後、細胞表面上の多様なグリカンに現れ、主に癌腫に蓄積する。結果として、ヒトは、癌および他の慢性炎症媒介性疾患において多様な役割を果たす循環型抗Neu5Gc抗体を有し、潜在的な診断および治療の可能性になっているラッツ。ここでは、ヒト血清中のそのような抗Neu5Gc抗体を評価するためのハイスループットのシアログリカンマイクロアレイアッセイを記載する。 Neu5Gc含有グリカンおよびそれらの対応する対の対照(Neu5Ac含有グリカン)は、それぞれコア第一アミンを有し、エポキシ被覆ガラススライドに共有結合される。我々は、1プリントあたり最大896個のアレイを生成することができる特定のナノプリンタを用いて、16ウェルフォーマットで56枚のスライドを印刷することを例示する。各スライドを使用して、抗Neu5Gc抗体特異性、強度および多様性の評価のための16の異なるヒト血清サンプルをスクリーニングすることができる。プロトコルは、この堅牢なツールの複雑さを記述し、配列形式で多様な臨床サンプルでNeu5Gc食物炭水化物抗原への応答を調査することを目指しているもののための基本的なガイドラインを提供します。

Introduction

Siasは、脊椎動物の細胞表面糖タンパク質および糖脂質上のグリカン鎖を覆う酸性糖である。 SIA発現は、癌細胞1に変更し、進行および/または転移2,3と相関されます。哺乳類における主要なシアル酸の形の二つはNeu5Acで、そのヒドロキシル形、Neu5Gcを2です。ヒトは、CMAH酵素をコードする遺伝子の特異的不活性化のためにNeu5Gcを合成することができない。この非人間シアル酸は、代謝、食事のNeu5Gcが豊富な食品( 例えば、赤肉)4、5から「自己」発信されたものとして、人間の細胞に組み込まれています。 Neu5Gcは、ヒト上皮および内皮の細胞表面上に低レベルで存在するが、特に癌腫に蓄積する。 Neu5Gcは、ヒト体液性免疫系2,6によって異物として認識されます。Neu5Gcグリカンの抗原複雑さは、すべての人間6における抗のNeu5Gc抗体応答の複雑さによって反射された、のNeu5Gc修正、結合、基礎となるグリカン及び足場、およびそれらの濃度を含む複数のレベルで生じ得ます。これらの抗体の一部は、癌腫バイオマーカーおよび潜在的な免疫療法剤として役立つ7 。異なるsialoglycans 8の化学酵素合成の出現は、グリカンマイクロアレイ技術9、10の使用によって容易にそのような抗体のより詳細な分析のために道を開きました。このように、天然および合成炭水化物の大きなライブラリーの促進準備と操作で、グリカンマイクロアレイは生体分子10、11の無数と炭水化物の相互作用を調査するための強力なハイスループット技術となっています12、13。アレイ形式では、最小限の量の材料が使用され、生物学的に関連するグリカンのこの多価ディスプレイは、単一の実験において数千の結合相互作用の調査を可能にする。重要なことは、この技術はまた、バイオマーカー探索へと様々なサンプル7、12で免疫応答をモニタリングに適用することができます。

成功したグリカンマイクロアレイ作製には、プリンターロボットタイプ、グリカンコンジュゲーション化学、および検出光学系という3つの重要な側面を考慮する必要があります。印刷装置の考察に関しては、接触型および非接触型の2つの技術が利用可能である。接触印刷では、1〜48個のスチールピンを、グリカン溶液を含むマルチウエル源プレートに浸漬し、ガラススライド表面に直接接触させることにより官能化ガラススライド上にスポットする。解の量deスライドに生きているのは、スライド表面上の持続時間の関数である。通常、試料はスライド表面に印刷される前にガラスブロック上に先ず予めスポットされ(均質なスポットに到達する)。非接触プリンタ( 例えば、圧電式プリンタ)では、制御された電気信号を用いてグリカンをガラスキャピラリから印刷する。電気信号は、接触印刷に比べてより正確な印刷を達成するために細かく較正することができる。スポットのサイズおよび形態も比較的均一である。さらなる利点は、印刷後にサンプルをソースプレートに再循環させることである。それにもかかわらず、ピエゾ電子式プリンタの主な欠点は、印刷チップの制限(4または8)であり、スライドの安定性、温度、湿度およびサンプルの蒸発に特に注意する必要がある非常に長い印刷時間をもたらす。非接触型インクジェットプリンタは、より大きなサンプル体積14を必要とする。

10、11、12、13のいずれかを用いて開発されてきました。 Uninitiateのための印刷されたグリカンマイクロアレイ技術に関する詳細な情報についてはDの研究者は、これらの優れたレビューは13、15を参照してください。重要なのは、グライコミクス実験(MIRAGE)イニシアチブのための最近の最低限必要な情報は、サンプル調製16のためにと、この成長分野で基準を改善するために17を解析し、糖鎖マイクロアレイからのデータを報告するためのガイドラインを説明します。

ここでは、特定の接触ナノプリンターを用いて16ウェルフォーマットでシアログリカンマイクロアレイを作製するための詳細なプロトコールについて説明する。各グリカンは、エポキシ活性化ガラススライドへのそれらの共有結合を媒介する第一級アミンを有する。我々はまた、様々なヒト血清サンプル、抗体、およびSia結合性植物レクチンを用いた1つのスライドの開発および分析について記載する。 Sialoglycanマイクロアレイアッセイは、アレイ作製、プロセシング、展開、および分析を含むいくつかの主要なステップを含む。アレイの製造には、arグリカンおよびソースプレートの準備、ナノプリンターのプログラミング、およびスライドの印刷を行うことができます。続いて、スライドを処理し、開発し、分析する( 図1 )。

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Protocol

ヒト血清サンプルはイスラエル血液銀行から入手し、ヘルシンキ宣言およびTel Aviv University Institutional Review Boardに従って使用した。

アレイ製造計画とレイアウト

  1. スライドのレイアウトを決定します。
    注:各スライドには、16個の同一のブロックB1〜B16( 図1B補足図1A )に分割された16個のサブアレイが含まれています。
  2. ピンレイアウトを決定します。スライドごとに4つのサブアレイ(ブロック)を印刷する4つのピンを使用します。
    ピン1は、ブロック1,2,9、および10を印刷します。
    ピン2は、ブロック3,4,11、および12を印刷します。
    ピン3はブロック5,6,13、および14を印刷し、そして
    ピン4は、ブロック7,8,15,16( 補足図1A )を印刷します。
  3. ブロックおよび384ウェルプレートのレイアウトを決定する。
    注:グリカンが各ブロックに現れる順序は、慎重に計画する必要があります。この例では、arr(スポット分析を容易にするため)、および標準曲線IgG(STD)スポットを6つの増加濃度で印刷する( 補足図1B )。
    1. 印刷された各スポットについて、まず材料を384ウェルプレートの4つのウェル(各ピンに1つ)に分配する。
      注:384ウェルプレートの材料の順序は、設計されたブロックレイアウト( 補足図1B-C )に依存しています。

2.グリカンおよびソースプレートの調製

  1. グリカン印刷バッファー(50mMの300mMリン酸緩衝液、pH8.4)を調製する。 40mLの脱イオン水(DIW)中にリン酸一ナトリウム一水和物(NaH 2 PO 4・ 1H 2 O)58.5mgおよびリン酸二ナトリウム7水和物(Na 2 HPO 4・ 7H 2 O)3.9gを秤量する。 4M NaOHを用いてpH8.4に滴定する。容量を50 mLに調整する0.2μmの膜を通して濾過して滅菌する。
  2. マーカー緩衝液(50mLの187mMリン酸緩衝液、pH5)を調製する。 40mLのDIW中で289mgのリン酸一ナトリウム一水和物(NaH 2 PO 4・ 1H 2 O)および1.94gのリン酸二ナトリウム7水和物(Na 2 HPO 4・ 7H 2 O)を秤量する。 1M HClを用いてpH5に滴定する。容積を50mLに調整し、0.2μm膜を通して滅菌する。
  3. STD曲線バッファー(50%のPBS-グリセロール:100%グリセロールストックから10%グリセロールを補充したリン酸緩衝化生理食塩水、pH7.4)を調製し、滅菌のため0.2μm膜を通してそれを濾過する。
  4. DIW中で各グリカンストック溶液を10mMで調製する。逆相高圧液体クロマトグラフィー分析による蛍光検出によるシアリル化グリカン濃度の確認18
  5. 各グリカンを100μLに希釈し、100μLのグリカン印刷バッファーマイクロ遠心チューブ中で。
  6. 蛍光色素を含む第一級アミンを調製する。 Alexa 555-ヒドラジドをマーカーバッファーで1 mg / mLに可溶化し、1 mLの総容量で1μg/ mLに希釈する。
    注:その他の第一級アミン含有染料はスライドスキャナーに応じて適切な波長で使用することができます。
    注:マーカースポットは、分析中に各ブロックのグリッドアライメントを容易にします。
  7. ヒトIgG STD曲線希釈液を調製する:STD曲線緩衝液中160μg/μLでヒトIgGのストック溶液0.5mLを調製する。ストックを1:1で6回連続的に希釈し、80μg、40μg、20μg、10μg、5μg/μL、2.5ng /μLを得る。
    注:実験に適している場合は、他のIgアイソタイプを使用することができます( 例えば、ヒトIgA、IgM、IgE、または異なる生物のIg)。
  8. 384ウェルプレートを氷上に置きます。電子マルチピペットを用いて、各グリカン、マーカー、およびSTD曲線の7μLのIgG-4レプリケートプレートレイアウト( 補足図1C )に従って、それぞれのsを決定する。正確性を高めるために、各サンプル35μLをロードし、サンプルの4つのウェルのそれぞれに7μLを分注する。各グリカンの残り7μLを元のチューブに戻す。
  9. プレートをパラフィルムで覆い、250gおよび12℃で2分間スピンダウンする。プレートを室温(RT)に置き、光から保護する。室内の湿度が60〜70%になる前にプレートを開けないでください。

3.ナノプリンタのプログラミング

  1. 「Microarray Manager」ソフトウェアを開きます。 「メソッドのプロパティ」ウィンドウを使用します。
  2. 作業表のレイアウトを設定します。「56スライド構成」を選択します。
    注記:これは56個のスライドを印刷するための事前定義された構成です。プレート、ピン、および印刷フォーマットの各タイプを較正します( 補足図2 、ステップ1)。
  3. [ピン構成]を選択します。| "ピンツール1x4 9 mm。"
    注:これは、4つのピンを使用するための事前定義された構成です( 補足図2 、ステップ2)。
  4. 「ピンタイプ」を定義します。印刷に適したピンタイプを計算して作成します。
    注:このステップでは、サンプルが384ウェルに再浸漬される前にピンが印刷するスポットの数を定義し、さまざまなピンの種類とスライド表面の化学的性質に合わせて最適化する必要があります。
    注:946MP3ピンを使用する場合、2つの重要な問題を考慮してください.1)各ピンは最大140個の均一なスポットを印刷できます.2)スライド上に印刷する前にピンの先端から余分な液体を排出するためにプリスポットが不可欠です。したがって、プリ印刷ブロック(エポキシ被覆スライド上の946MP3ピンに最適化された)上に20個のプレスポットを印刷するように各ピンをプログラムする。
    1. 1サンプルあたりの印刷スポットの総数を計算します。
      注:ここでは、各ピンはサブアレイ(ブロック)ごとに4つのスポットを印刷します。スライド当たり合計4つのサブアレイ= 16スポット/ slide。スライド7枚の後、各ピンは16×7 = 112スポットを印刷します。さらに、印刷前の20のプレスポットは132スポット/ディップを与える。したがって、ピンタイプは、「946MP3-132スポット」(1ブロックにつき4スポット×4ブロック×7スライド+ 20プレスポット= 132)と定義される。
    2. 「ピンタイプ」を作成します( 補足図2 、ステップ3)。 「セットアップ」(ソフトウェアの左パネル)を押します。 "マイクロスポットピン" | "新しい名前"(946MP3-132スポット)。ディップあたりのスポット数(132)、スポット直径(100μm)、取り込み量(0.25μL)、送達量(0.7nL)および最小スポット間隔(100μm)を定義する。 "OK"を押す| "OK。"
    3. "Method properties"ウィンドウで、作成されたピンタイプ "946MP3-132スポット"を選択します。
  5. 洗浄条件を定義する。 「開始前洗浄」および「仕上げ後の洗浄」を「標準洗浄」に設定します( 補足図2 、手順4)。
  6. 「プレートリスト」を定義します。
    注:これはプレートからのサンプリングパターン(384ウェルプレートからのディップの順序)です。プレートをプレートリストにアップロードするには、プレートのサンプリングパターンを設定します。
    1. プレート「サンプリングパターン」を作成します。 「テンプレート」( 補足図3 )に移動します。 "サンプリングパターン。"新しい名前( 例えば、Joveの配列)を付けて、「挿入」を選択| "最下部を埋める" | "ピンツール1 x 4 9 mm。"あらかじめ定義されたプレートレイアウト( 補足図1A )に従ってウェルピックアップの順序を選択します。 "OK"を押す| "OK。"
    2. プレートのサンプリングパターンをロードします。 [プレートリスト]セルの右側をクリックします( 補足図3 )。 "Add plate"を選択し、正しいプレートサンプリングパターン(ステップ3.6.1で説明した "JoVEアレイ")を選択します。 「ノーマルウォッシュ」を選択します。押す"OK" | "OK。"
  7. "サンプルプレート"に移動し、位置オフセットを1に変更します(プレートがアレイリーダーのどこにあるかが決まります)。
    注:0のオフセット位置は超音波処理槽に近い。
  8. 「Microarray Print Design」を定義します。ブロック間の距離と間隔を計算します。
    1. スライドを7 x 7 mmの16ウェルに分割する現像ツールの寸法を考え、サブアレイ間に2 mmのスペース(ブロック間の合計9 mm、 補足図4 )を考慮する。
    2. サブアレイの寸法を考えてみましょう。
      注:スポット間の間隔は0.275 mmで、この印刷デザインでは12列と18行あります。合計寸法は、幅(11×0.275mm = 3.025mm)と高さ(17×0.275mm = 4.675mm)である。水平間隔:9 mm - (11 0.275)= 5.97 mmを計算します。垂直間隔:9 mm - (17 x 0.275)= 4.325 mmを計算します。 dを計算するスライドの左側から:4.43mm + 1.07mm = 5.5mm。スライドの上面からの距離を計算する:2.95 mm + 0.55 mm = 3.5 mm( 補足図4 )。
    3. 「印刷デザイン」( 補足図5 )を定義します。 [テンプレート]を選択します。 "デザインを印刷する" | "新しい。"
      1. [ピン設定]を選択します。 "ピンツール1 x 4 9 mm" | "ピン - 946MP3-132スポット。" 「全般」タブで、「名前マイクロアレイの印刷」( すなわち、「Joveの配列を」)に変更。 「スポットスピード」を選択してください。 "複製番号"(4)| 「タッチポイントの高さ」(0 mm)| "ソフトタッチ高さ"(3 mm)| 「すべての利用可能な位置に印刷する」( 補足図5A )。
      2. 「Microarray」タブで、水平および垂直間隔(3.8.2から5.9 mmおよび4.325 mm)および水平および垂直マイクロアレイの数(2)を選択します。 「印刷」を選択Microarray Horizo​​ntally "|" Print Duplicate Microarray "( 補足図5B )。
      3. サブアレイタブで、最大列数(12)、最大行数(18)、列と行間の距離( 275μm )を選択します( 補足図5C )。
      4. 測定タブで、スライドの左側からの距離(5.5 mm)、スライドの上からの距離(3.8.2で計算された3.5 mm)、プリントスライドの幅(25 mm) 、印刷スライドの高さ(75 mm)( 補足図5D )。 "OK"を押す| "OK。"
  9. 「Microarray Print Designs」セルの右側をクリックし、定義されたデザイン(ステップ3.8.3の「JoVEアレイ」、 補足図6 )を選択します。
  10. 「スライドカウント」(56)を定義し、「位置オフセット」(0)を変更します。これにより、poアレイラーデッキに印刷される最初のスライドの配置( 補足図6 )。
  11. 「Microarray Pre-Print Design」( 補足図6 )を定義します。 [ガラスブロック]を選択します。 "Pre-Print 1 x 4 mmピンツール。"
    注:このスポットスペーシング設定では、ガラスブロック上の46,464のプリスポット(4つのすべてのピン用)が可能になり、ピン当たり46,464 / 4 = 11,616プリスポットが可能になります。プリプリントブロックのスペースが使い尽くされたら、プリンタは停止し、ブロックを反転させる必要があります。
    注:プレプリントブロックが一杯になったサンプル数を計算するには、次の点を考慮してください:384ウェルプレートで8枚のピンディップを取って56枚(ディップ1枚につき7枚)さらに20個のプレスポットを有し、サンプル当たり合計160個のプレスポットを与える。したがって、11,616 / 160 = 72.6サンプル。したがって、プレプリントガラスブロックは、72サンプル後に反転させる必要がある(反転する時間を評価するために、h1つのサンプルが56個のスライドで完全な実行を完了してから72倍になるまでには長い時間がかかります)。
  12. [Use PrePrint Design]を選択します。 "はい" | 「バーコードをスキャンする」(いいえ)| "Print Single Replicate"(いいえ)( 補足図6 )。
  13. "Validate"( 補足図6 )をクリックしてください。
  14. "保存"をクリックし、メソッドをarrファイルとして保存します( 例えば、 "JoVE array.arr" 補足図6 )。

4.設計された配列の印刷

注記:すべてのステップは、湿度が60〜70%のクリーンルーム内で、適切な手袋と保護服を使用して実施してください

  1. ナノプリンターの機械と加湿器の電源を入れます。
  2. 洗浄バッファーと加湿のために、DI水で満たしてください。洗浄ボトル(排水口)と加湿トラップcarboy( 補足図7A )を空にします。
  3. 加湿器を70%の湿度と加湿を開始します。
  4. 印刷する前にすべてのピンを清掃してください。 (65℃)のピンチップ洗浄液(ピンチップ洗浄剤15gと65℃の水50mLを50mLずつ調製し、固体試薬が完全に溶解するまで完全に混合する)。
    1. ピンチップのブラシ(細かい部分)をピンチップの洗浄液に浸し、各ピンチップの表面をブラッシングして、各ピンチップに洗浄液を塗布します。
      注:ピンチップの洗浄液は腐食性で毒性があります。このソリューションを使用するときは、必ず手袋と安全眼鏡を着用してください。ピンチップの洗浄液に数分以上浸漬すると、ピンが傷つくことがあります。
    2. 超音波槽に1Lの蒸留水を満たし、ピンを浮遊式ピンクリーニングラックに入れます。 5分間超音波処理し、ピンを外す。クリーンルームの特別なワイプで乾いて優しく拭いてください。
  5. "Microarray Manager"プリントを開きますソフトウェア;接続が設定されると、プリンタのランプが点灯します(赤/緑)。プレス "停止" | "クリア" | "Init"( 補足図7B 、ステップ1〜3)。プリントヘッドアームはX、Y、Zアライメントをリセットする。
  6. ピンをプリントヘッドにロードするには、「Load」( 補足図7B 、ステップ4)を押して、プリント/ピンツールレイアウトの定義された構成( 補足図7C )に従ってピンをプリントヘッドに配置します。このレイアウトは4つのピンを使用し、各スライドに4つのサブアレイを印刷して、スライドごとに合計16のサブアレイを取得します( 補足図1A )。ピンを配置したら、もう一度 "Init"を押してください。
  7. アレイのデッキにスライドを組み立てます。スライドボックスを開き、超高純度窒素ガスを吹き付けて各スライドを洗浄します。必要な数のスライドをアレイプラットフォームに置きます。スライドを2本の指で下隅に置き、スライドをポジション。 2つの右隅を持ち、スライドがしっかりと正しい位置に収まるまで、左隅を静かに押します。しっかりとフィットするように、左下隅にそっと押してください( 補足図7D )。
  8. 予備ブロックガラスを蒸留水、70%エタノール、100%エタノールで洗浄し、風乾させます(専用のクリーンルームワイプのみを使用してください)。プレブロックガラスをデッキの所定の位置に置きます。
  9. ソニケーターバスを満たしてください( 補足図7B )。 "Fill"を55秒間押した後、 "OK"を押してください。 "Drain"を20秒間押した後、 "OK"を押して超音波を排出します。充填と排水をもう一度繰り返してから、55秒間再度満たします。
  10. 洗浄浴を満たす( 補足図7B ):「Prime」を40秒間押した後、「OK」を押します。
  11. 384ウェルプレートをアリコートサンプルと共にアレイリーダーデッキのその位置に置き、パラフィルムカバーを取り外します。
  12. 印刷が完了したら、超音波洗浄槽( 図7B参照)を排出し、加湿器の電源を切ります。
  13. スライドを加湿なしで16〜24時間、アレイラーデッキ上で乾燥させる。
  14. アルコール/耐溶剤性マーキングペンでスライドに番号を付け、暗所で真空密閉ボックスに保管します。

5.配列の処理と開発

  1. 真空シールされた箱からスライドを取り出し、アレイを上に向けて化学フード内に5分間置き、余分な液体を蒸発させる。
  2. 最高のゲイン(950 PMT)でスライドをスキャンして、すべてのスポットが印刷されていることを確認します。
  3. スライド上のエポキシ基の化学的ブロッキングを続ける
    1. 50mLのエタノールアミンブロッキング溶液(0.1M Tris-HCl、pH8および0.05Mエタノールアミン)を調製する。 140mLのDIWを8.8mLのTris-HCl(1.7M、pH8)および0.45mLのエタノールアミン(16.6M)と混合する。 5への転送0mLの染色チューブ( 補足図8A )を添加し、50℃まで温める。
    2. スライドを水分補給します。スライドをDIWで満たした染色チューブに入れ、ホイルで覆い、RTでゆっくりと穏やかに振とうしながら5分間インキュベートする。
    3. スライド上の反応性エポキシ基をブロックする。予め加温したエタノールアミンブロッキング溶液で満たした50mLの染色チューブにスライドを浸し、ホイルで覆い、室温でゆっくりと穏やかに振とうしながら30分間インキュベートする。
    4. エタノールアミンブロッキング溶液を適切なバイオハザードゴミ容器に捨て、50℃DIWで満たした新しい清潔な染色チューブにスライドを置きます。ホイルで覆い、室温でゆっくりと穏やかに振とうしながら10分間インキュベートする。
    5. 水を捨て、スライドをガラス染色ホルダーに移す( 補足図8B )。ガラス染色ホルダーを揺動プレートホルダーに置き、スライドを200 xgおよびRTで5分間遠心分離して乾燥させる。
  4. 除算器を設定し、生物学的遮断を続行します。
    1. スライドを16ウェル分画器に置きます補足図8C )。
    2. PBST洗浄液を調製する:50mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH7.4 + 0.1%Tween-20。
    3. 生物学的ブロッキング溶液(PBS-OVA)を調製する:5mLのPBS、pH7.4 + 1%チキンオボアルブミン(10mg / mL)。
      注:ブロッキング試薬の選択は、抗Neu5Gc抗体の検出の成功のために重要です。オボアルブミンは、ヒトと同様に、Neu5Gcを合成することができないニワトリで作られ、このSiaの発現の欠如を引き起こす。 Neu5Gcの検出のために、たとえ軽微な汚染物質であっても、アッセイの感度を劇的に低下させることがあり、時にはいずれの抗Neu5Gc反応性も検出しない場合さえある。例えば、最も一般的に使用されるブロッキング試薬であるウシ血清アルブミン(BSA)は、それ自体はグリコシル化されていないが、Neu5Gc部分を有するウシIgG混入物を含み、したがって、抗のNeu5Gc抗体19、20を有するサンプルに結合するときに印刷グリカン第i。
    4. ウェルをあらかじめ濡らす。マルチピペットを使用して、スライドウェルにPBST 200μLを分注し、カバーした湿ったチャンバーに入れ、5分間振とうします。
      注:湿度チャンバーは、サンプルを光から保護するためにナイロンラップとフォイルで覆われた濡れたタオルペーパーを備えたガラストレイです。
    5. きれいなペーパータオルを軽く軽くたたいてからPBSTを除去し、各ウェルにPBS-OVAブロッキング緩衝液200μLを等分する。湿ったチャンバーに入れ、穏やかに振とうしながら室温で1時間インキュベートする。
  5. 表2示すように、PBS-OVAブロッキング緩衝液で希釈した一次検出を調製する。
    注:このシアログリカンマイクロアレイの品質管理(QC)評価には、いくつかのSia結合タンパク質を使用してください: Sambucus nigra lectin(SNA)は、elderberry樹皮から単離され、Siaα 26; Maackia Amurensis Lectin II (MALII)はSiaα23を認識すると予想される。ニワトリ抗Neu5Gc IgYはすべてのNeu5Gc含有シアログリカンを認識すると予想される。さらに、様々なヒト血清サンプルを使用して、抗Neu5Gc IgG応答をプロファイリングする。レクチン/抗体/血清の濃度は、実験的に較正する必要があります。
  6. 乾燥PBS-OVAブロッキングバッファーをフリックし、1ウェルあたり200μLの一次抗体(ウェルあたりの最小容量:70μL)を添加し、湿潤チャンバー内で2時間インキュベートする。
  7. 一次検出をフリック乾燥し、PBSTで4回洗浄する(3 回目と4 回目の洗浄の間に、PBST中でスライドをインキュベートし、湿ったチャンバーで5分間)。 PBSで1回洗浄する。
  8. 表2示すように、PBS中の二次抗体を調製する。
  9. PBSをフリック乾燥し、二次抗体200μLを加える。振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
  10. 二次抗体をフリック乾燥させ、PBSTで3回洗浄する(3RD及び 4洗浄、湿潤チャンバー中で5分間PBSTでスライドをインキュベートします)。
  11. 慎重にフレームを取り出し、PBSで満たした50mLスライド染色チューブにスライドを入れ、5分間振とうする。
  12. 2つのスライド染色浴( 補足図8D )をDIWで満たし、スライドをスライドホルダーに入れ、浴の中に浸す。すばやく10回ディップしてから2番目のバスに移し、さらに10回ディップします。振盪しながら室温で10分間インキュベートする。
  13. 水を捨て、スライドをガラス染色ホルダーに移す( 補足図8B ;スライドを風乾させる)。ガラス染色ホルダーを揺動プレートホルダーに置き、スライドを200gおよびRTで5分間遠心分離して乾燥させる。
  14. スライドをスキャンし、暗い場所の真空密閉ボックスに保管します。

6.アレイスキャンとデータ解析

  1. 蛍光スライドスキャナを開き、5分間温める。オープンソフトウェアのスキャンと分析。
  2. 走査パラメータを設定します( 補足図9A ):平均値が1ライン、焦点位置が0μmの350 PMTのゲインで、532 nmおよび100%出力でスキャンします。 10.0μmピクセルサイズの解像度を使用してください。
    注:スキャンパラメータは、異なるスライドタイプ、蛍光、および解像度に調整することができます。
  3. 現像したスライドをスキャンします。スキャナのドアを開き、スライドを内側に置き、アレイを下に向けます。スキャンを開始します(ソフトウェアナビゲーションパネルメニューの緑色の「再生」ボタン、 補足図9B )。
  4. スキャンしたスライドをTIFFファイルとして保存します。
  5. 分析のためにスライドを準備する。 "Load array list"を選択し、スライド上の各ブロックのアレイをマッピングする適切なGALファイルをアップロードします( 補足図9C )。
    注:GALファイルには、スライド上の各スポットの身元と場所(X、Y)の両方に関する情報が含まれています。このファイルを作成することができます384ウェルソースプレート内のサンプルアイデンティティおよび定義されたプリントデザインに基づいてタブ区切りのテキストファイルをエクスポートすることにより、
  6. アラインメントパラメータと解析パラメータを設定します。ソフトウェアナビゲーションパネルメニューの「オプション」ボタンを押します( 補足図10 )。
  7. アライメントパラメータを定義します。円形フィーチャの検索、50〜350%のアラインメント中のフィーチャのリサイズ、フィーチャの移動を最大40μmに制限、背景スレッショルド(CPIスレッショルド0)に失敗するフィーチャのフラグを外し、ブロックを見つけるときのラッピングと回転を推定し、 (10ピクセル)( 補足図10 )。
  8. 分析パラメータを定義する:W1 / 532比、標準偏差、不在特徴分析、バックグラウンド減算。 「選択」をクリックしてから「地物背景中央値」をクリックし、除外する2ピクセルと背景の3ピクセル幅を設定します。 「OK」を押します。セスキャナの飽和レベルをデフォルトに戻します( 補足図10 )。
    注:バックグラウンド減算法は実験設計に依存し、特定のニーズに応じて変更することができます。
  9. フィーチャーマップを整列させます。プログラムをブロックモード( "B"を押す)にし、すべてのブロック(Ctrl + A)を選択し、アレイマップグリッドを配置し、すべてのブロックを整列させる(Alt + Shift + F7)( 補足図11 )。
  10. 各ブロックのフィーチャの配置を調整します。左上のブロックにズーム(「Z」を押してズームモードにする)し、もう一度「B」を押して(ブロックモード)、このブロックのグリッドを押します。このブロックのグリッドをブロックスポットと完全に一致するまで移動し、F5キーを押してこの選択したブロックのフィーチャを揃えます。スポットが完全に丸くなるまで、グリッドの移動とF5の配置を繰り返します。すべてのグリッドが配置されるまで、16ブロックごとに同じ処理を行います。
  11. データを分析して保存します。すべてのブロック(Crtl +A)、データを分析します(Alt + A)。分析結果(Ctrl + U)を.gprファイルとして保存します。
  12. スプレッドシートプログラムで保存された.gprファイルを開き、ローカルバックグラウンド除去(F532-B532)後の蛍光に基づいて各スポットの強度を分析します。

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Representative Results

アレイ印刷、開発、分析:

複数のグリカンサンプルおよびヒトIgG STD曲線を含む16個の異なるブロックにシアログリカンマイクロアレイを印刷するには、スライドごとに16個のブロックすべてと同じ印刷操作ですべてのスライドにできるだけ均一にすべてのサンプルを印刷するための徹底的な較正が必要です。したがって、特定の印刷パラメータが決定される前に、384ウェルプレート中のサンプル体積、スライドタイプおよび製造、384ウェルプレートタイプ、湿度レベル、サンプル体積あらゆるタイプのサンプル、ヒトIgG STD曲線濃度、およびマーカータイプについての印刷。このような印刷されたシアログリカンアレイスライドの耐久性は、室温で暗所で真空密閉ボックス中で最大10ヶ月間持続することが立証された。あらゆる印刷実験において、均一性はさらにSia結合レクチンおよび抗体を用いた品質管理実験によってモニタリングおよび検証された。開発およびスキャニングのプロトコルは、同じ印刷作業のスライド内およびスライド間のサンプルを比較することによって、均一性および精度を達成するように最適化されています。スライドは最適化されたブロッキング条件(化学的および生物学的)、洗浄、およびインキュベーション時間を使用して、ブロック間の適切な分離を保証する16ウェル分画器で開発されています。一次および二次検出は、最小限のバックグラウンドおよび非特異的結合で最大の検出を確実にするように広範囲にわたって較正されていた。スライドのスキャンと分析では、出力結果をスプレッドシートファイルに転送し、分析して各スポットの検出を決定しました。各スポットは異常値のチェックを受け、QCを満たさない場合は省略された(%CVが> 20であり、スポットが4つの複製の平均から標準偏差の範囲外にある場合)。そして、平均信号強度afte局所的なバックグラウンドの減算は、サンプル当たりの複製スポットについて平均化され、印刷サンプルあたり相対蛍光単位(RFU)データポイントを生成した。試験したすべてのブロックでIgG STD曲線の一様性が検証されたら、RFU値をng /μLIgGに標準化し、実験内および実験間で試料をよりよく比較する機会を可能にした。

Sia結合ハイスループットアッセイ:

Sia含有グリカンに結合する決定基( 例えば、タンパク質、レクチン、抗体、ウイルスなど )を検出するために、シアログリカンアレイを使用することができる。印刷後のQCについては、Sia結合植物レクチンおよび抗Neu5Gc IgYが使用される19 。 SNAはα2-6結合Siaに結合し、MALIIはα2-3結合Siaに結合し、抗Neu5Gc IgYはNeu5Gc含有シアログリカンに結合するが、Neu5Aに結合しない図2(a)に示すように、sialoglycans 19 Cを含みます。 QC実験は、4つの異なるピンを使用して印刷されたブロック間のスポット印刷およびアイデンティティおよび変動性の妥当性を検証することを目的とする。スライドごとの一次検出ごとに4つのブロックを開発し、4つのピンのそれぞれに印刷されたブロックを同じ一次検出部分で比較することにより、ブロック間の変動性を監視する。大きな違いがないことを確認するために比較が行われます。

ヒト血清は、種々のヒト疾患2、21、22、23のための含意を用いて多様な抗のNeu5Gc抗体6を含みます。ヒト血清IgG中のシアログリカン認識を評価するために、健康なヒトドナー由来の12の血清を、プリントされたシアログリカンmicr蛍光標識抗ヒトIgGを用いて発色させた( 図2B )。各印刷されたブロックは、すべてのブロックにおいて同等で均質なヒトIgG STD曲線を含む( 図2C )。各ブロック( 図2C )のSTD曲線の品質を検証した後でのみ、グリカンスポットの結果はブロックの傾きに従って正規化され、次いで希釈係数が乗算される。 図2Bに示すように、試験したヒト血清は全て、様々なレベルの抗Neu5Gc IgGを含み、一致する対のNeu5Ac含有シアログリカンはほとんど認識されない。さらに、抗Neu5Gc IgG認識パターンは、強度および多様性レベルの両方において、これらの異なる血清間で非常に多様である。

図1
図1:概要アレイ印刷、現像、イメージ解析( A )Neu5Gc9Acα2-6GalNAcαProNH2は、エポキシ被覆ガラススライド上に印刷された第一級アミンを有する代表的なNeu5Gc含有Siaグリカンとして示される。 ( B )印刷されたアレイは、様々なSia結合タンパク質で発現され、続いて適切な蛍光標識二次抗体で検出される。各サブアレイは個別に開発することができます。 ( C )蛍光スキャナー中でプローブされたスライドを走査することにより、スキャナー画像ソフトウェアを用いてさらに分析される画像が生成される。サブアレイには、アレイ上の各スポットをマッピングするグリッドが重ねられ、各スポットについて蛍光が検出される。結果はスプレッドシートファイルに転送されます。単一のウェル内の単一のアレイが概略的に表される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2
図2:様々なSia結合タンパク質を用いたSialoglycanマイクロアレイのプロファイル
スライドは、各ブロックに1つずつ、16の異なる一次検出部分を用いて開発した。 ( A )Sia特異的植物レクチンSNAおよびMALIIおよびポリクローナルモノ特異的ニワトリ抗Neu5Gc IgYの結合パターンを示すQCスライドの代表的な3ブロック。結果は、個々のブロック(赤、白、青、それぞれ100 番目 、50 番目 、および0 番目のパーセンタイルを表す)のヒートマップ形式のRFUとして表示されます。 ( B )12種類の健康なヒト血清を1:100希釈で試験し、抗Neu5Gc IgG反応性をプロファイルするために抗ヒトIgGを用いて検出した。 RFUデータは、それぞれの値をそれぞれの特定のblにおけるIgG STD曲線勾配で割ることによってng /μLに正規化した次に希釈係数を掛けたものである。データは(赤、白、青、TE 100 番目 、50 番目 、0 番目のパーセンタイルを表し、それぞれ)結合されたすべてのブロックに対してヒートマップ形式で表現されます。 ( C )データを正常化するために用いられたヒト血清を用いて開発された12個のブロックのヒトIgG STD曲線。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

グリカンID 構造
1 Neu5,9Ac 2α3Galβ4GlcNAcβO(CH 2)2 CH 2 NH 2
2 Neu5Gc9Acα3Galβ4GlcNAcβO(CH 22 CH 2/ sub> NH 2
3 Neu5,9Ac 2α6Galβ4GlcNAcβO(CH 2)2 CH 2 NH 2
4 Neu5Gc9Acα6Galβ4GlcNAcβO(CH 22 CH 2 NH 2
5 Neu5Acα6GalNAcαO(CH 22 CH 2 NH 2
6 Neu5Gcα6GalNAcαO(CH 22 CH 2 NH 2
7 Neu5,9Ac 2α3Galβ3GlcNAcβO(CH 2)2 CH 2 NH 2
8 Neu5Gc9Acα3Galβ3GlcNAcβO(CH 22 CH 2 NH 2
9 Neu5,9Ac 2α3Galβ3GalNAcαO(CH 22 CH 2 NH 2
10 Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcαO(CH 22 CH 2 NH 2
11 Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβO(CH 22 CH 2 NH 2
12 Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβO(CH 22 CH 2 NH 2
13 Neu5Acα3Galβ3GlcNAcβO(CH 22 CH 2 NH 2
14 Neu5Gcα3Galβ3GlcNAcβO(CH 22 CH 2 NH 2
15 Neu5Acα3Galβ3GalNAcαO(CH 22 CH 2 NH 2
16 2)2 CH 2 NH 2
17 Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβO(CH 22 CH 2 NH 2
18 Neu5Gcα6Galβ4GlcNAcβO(CH 22 CH 2 NH 2
19 Neu5Acα6Galβ4GlcβO(CH 22 CH 2 NH 2
20 Neu5Gcα6Galβ4GlcβO(CH 22 CH 2 NH 2
21 Neu5Acα3Galβ4GlcβO(CH 22 CH 2 NH 2
22 Neu5Gcα3Galβ4GlcβO(CH 22 CH 2 NH 2
23 Neu5,9Ac 2α6GalNAcαO(CH 2)2 CH 2 NH 2
24 Neu5Gc9Acα6GalNAcαO(CH 22 CH 2 NH 2
25 Neu5Acα3GalβO(CH 22 CH 2 NH 2
26 Neu5Gcα3GalβO(CH 22 CH 2 NH 2
27 Neu5Acα6GalβO(CH 22 CH 2 NH 2
28 Neu5Gcα6GalβO(CH 22 CH 2 NH 2
29 Neu5,9Ac 2α3GalβO(CH 2)2 CH 2 NH 2
30 2 ) 2 CH 2 NH 2
31 Neu5,9Ac 2α6GalβO(CH 2)2 CH 2 NH 2
32 Neu5Gc9Acα6GalβO(CH 22 CH 2 NH 2
33 Neu5Acα3Galβ3GalNAcβO(CH 22 CH 2 NH 2
34 Neu5Gcα3Galβ3GalNAcβO(CH 22 CH 2 NH 2
35 Neu5,9Ac 2α3Galβ3GalNAcβO(CH 2)2 CH 2 NH 2
36 Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcβO(CH 22 CH 2 NH 2
Neu5,9Ac 2α6Galβ4GlcβO(CH 2)2 CH 2 NH 2
38 Neu5Gc9Ac6Galβ4GlcβO(CH 22 CH 2 NH 2
39 Neu5,9Ac 2α3Galβ4GlcβO(CH 2)2 CH 2 NH 2
40 Neu5Gc9Ac3Galβ4GlcβO(CH 22 CH 2 NH 2

表1:印刷されたグリカンのリスト。

一番目の、二番目の 抗体/レクチン ストック濃度 特異性 作業希釈/濃度
一次検出ビオチン化MALII 1mg / mL α2-3結合のシアル酸 1:50,20μg/ mL
ビオチン化-SNA 2mg / mL α2-6結合のシアル酸 1:100,20μg/ mL
ニワトリ抗Neu5Gc IgY ND Neu5Gcシアル酸 1:7,000
ヒト血清 100% 多数のエピトープ 1:100
二次検出 Cy3-Streptavidin 0.75mg / mL ビオチン 1:500,1.5μg/ mL
Cy3抗チキンIgY 0.75mg / mL 鶏IgY 1:2,000,0.375μg/ mL
Cy3-抗ヒトIgG H + L 0.6mg / mL ヒューマn IgG 1:1,500,0.4μg/ mL

表2:一次および二次検出タンパク質のリスト。

補足図: このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。

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Discussion

成功したグリカンマイクロアレイ作製には注意深い計画が必要であり、プロトコルにいくつかの重要なステップが含まれています。これらは、(1)すべての後続のパラメータ( 例えば、距離、間隔、サンプルの量、および印刷)を定義ブロックおよびプレートのレイアウトを計画します。 (2)ピンの清掃およびピンの完全性の確保。これはスポットの均質性を制御するために重要である。 (3)印刷中に高湿度を維持する。これは、スポットの均質性を損なう可能性のある長い印刷ランの間に試料の蒸発を避けるために重要である。 (4)結果に影響を与え得る適切なアライメントおよび分析パラメータ( 例えば、バックグラウンド減法、閾値、およびスポットサイズの柔軟性)を選択すること。

この方法は、特定の実験計画および目標を満たすようにさらに改変することができる。例えば、プリスポット番号は、アレイ上に印刷される各タイプの材料に適合するように変更することができる。ピン洗浄工程印刷物は、異なる印刷物に適合するように最適化することができ、短いまたは長い洗浄サイクルで行うことができる。さらに、ピンがディップ毎に印刷するスポットの量は、より多くのスポットまたはより少ないスポットを含むように変更することができるが、アレイ上で使用される材料の種類ごとに個別の較正を必要とする。蛍光標識のタイプおよびその濃度は、それが結合のための適切な化学基( すなわち、エポキシ被覆スライドのための第一級アミン)を含有する限り修飾することができる。 STD曲線の濃度およびタイプは延長することができる( 例えば、ヒト/マウス/他の生物体IgG、IgM、IgA など )。緩衝液の条件は、異なる材料に適合するように最適化することができ、好ましくはアレイへの非特異的結合を避けるために第一級アミンを含む材料を欠くことで、バックグラウンドが増加する。重要なことに、Neu5Gcの最適な検出のために、生物学的ブロッキング試薬は、Neu5Gc-シアログリカン検出を減少させる可能性があるため Neu5Gcを含まなくてはならない( 例えば、 BSA乳を避ける)ncrease背景19、20。一次および二次検出濃度は、高いバックグラウンドおよび非特異的結合を避けるために最適化すべきである。さらに、スキャンパラメータ( 例えば、パワー、ゲイン、および解像度)を変更して、バックグラウンドを低減したり、低信号を強調したりすることができます。最後に、アライメントおよび解析パラメータは、高いバックグラウンドまたは異なる形状のフィーチャに合うように変更することができます。グリカンマイクロアレイデータを報告するための推奨基準に関するさらなる情報およびガイドラインは、MIRAGEイニシアチブ17によって最近記載されており、最終的にデータ共有および解釈を容易にすることができる。

要約すると、グリカンマイクロアレイは、グリカンと生体分子の相互作用を調べるための堅牢なツールを提供し、様々な生物学的サンプルに適合させることができる。抗Neu5Gc抗体は、ヒトの疾患において異なる役割を果たす23 。例えば、癌において、抗Neu5Gcを抗体は二重の役割を果たしている。一方で、彼らは潜在的なバイオマーカーとして機能しますが、一方で、彼らは潜在的な治療薬7、21、24となります。これらの抗体はまた、アテローム性動脈硬化症25の増悪、異種移植20、26の効力、およびグリコシル化バイオ治療薬27の効果に寄与する。したがって、様々なヒト試料中の抗Neu5Gc抗体のプロファイリングが関心を集めており、ここに記載されているようなハイスループットアッセイは、ヒトの健康および疾患におけるそれらの役割の理解を促進することに寄与し得る。

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Disclosures

著者は何も開示することはない。

Acknowledgments

この研究は、イスラエル癌研究基金のResearch Career Development Award、Israeli National Nanotechnology Initiativeの助成金、Personalized Theranostics(VP-K)のNanomedicinesに関するFocal Technology AreaのHelmsley Charitable Trust、およびNational健康教育機関R01GM076360(XCへ)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primary-amine containing sialoglycans Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) Contact info@glycohubusa.com for compound requests Printed glycans
Monosodium phosphate monohydrate Sigma S9638 Printing buffer component
Disodium phosphate heptahydrate Sigma S9390 Printing buffer component
Phosphate buffered saline Hy-Labs BP-507/500D Printing buffer/ incubation/washing buffer
Tris-base Sigma T1503 Slide blocking reagent
Glycerol Sigma G-7893 Printing buffer component
Ethanolamine Thermo-Fisher Scientific 0700/08 Slide blocking reagent
Ovalbumin (Grade V) Sigma A5503 Slide Blocking protein
Tween-20 Sigma P7949 Slide washing detergent
Alexa 555-Hydrazide Thermo-Fisher Scientific A20501MP Marker on array
ChromPure Human IgG, whole molecule Jackson Immunoresearch 009-000-003 Printing component
Biotinylated- SNA Vector Laboratories B-1305 Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked
Biotinylated-MALII Vector Laboratories B-1265 Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked
Chicken-anti Neu5Gc IgY BioLegend 146903 Primary detection
Cy3-Streptavidin Jackson Immunoresearch 016-160-0848 Biotin binding
Cy3-anti Human IgG Jackson Immunoresearch 109-165-088 Secondary detection against human IgG
Cy3-anti Chicken IgY Jackson Immunoresearch 703-165-155 Secondary detection against chicken IgY
Human sera samples Israeli Blood Bank Primary detection
Compressed Nitrogen (Grade 5) General dusting/drying tool
Epoxy-coated slides Corning 40044 Slides
Epoxy-coated slides PolyAn 2D 104-00-221 Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots.
384-well microtiter plate Genetix 2070 Printing plate
VWR lab marker VWR 52877-310 Slide labeling
Staining Tube ArrayIt MST Slide developing tool
Staining bath VWR 25608-904 Slide developing tool
Slides glass holders VWR 631-9321 Slide developing tool
GenePix Scanner Molecular devices 4000B Slide scanner
LM-60 NanoPrinter ArrayIt LM-60 Array printer
Pins ArrayIt 946MP3 Printing pins
ProPlate Module Grace Bio-Labs P37004 Slide developing module
Distilled water Bio-Lab 2321020500 Required for arrayer and humidifier
Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL Thermo-Fisher Scientific (Matrix) MA-2131 Impact2 Equalizer 384 Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate

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References

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