Использование капсул для отрицательного окрашивания вирусных образцов в области биологического обогащения

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

В этом протоколе содержится инструкция для образцов отрицательного окрашивания вирусов, которые могут быть легко использованы в лабораториях BSL-2, -3 или -4. Он включает в себя использование инновационной капсулы для обработки, которая защищает сетку электронной микроскопии трансмиссии и обеспечивает удобство работы пользователя в более бурных средах в рамках биоконцентрации.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Blancett, C. D., Monninger, M. K., Nguessan, C. A., Kuehl, K. A., Rossi, C. A., Olschner, S. P., et al. Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment. J. Vis. Exp. (125), e56122, doi:10.3791/56122 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Передаточная электронная микроскопия (TEM) используется для наблюдения ультраструктуры вирусов и других микробных патогенов с нанометровым разрешением. Большинство биологических материалов не содержат плотных элементов, способных рассеивать электроны для создания изображения; Поэтому требуется отрицательное пятно, которое помещает плотные соли тяжелых металлов вокруг образца. Чтобы визуализировать вирусы в суспензии под ТЕМ, их следует наносить на небольшие сетки, покрытые прозрачной поверхностью толщиной всего нанометров. Из-за их небольшого размера и хрупкости эти решетки трудно обрабатывать и легко перемещать воздушными потоками. Тонкая поверхность легко повреждается, оставляя образец трудным или невозможным для изображения. Инфекционные вирусы должны быть обработаны в шкафу для биобезопасности (BSC), а некоторые требуют лабораторной среды для биоконцентрации. Окрашивание вирусов на уровнях биобезопасности (BSL) -3 и -4 особенно сложно, поскольку эти среды более бурные и требуются технические специалисты tO носить средства индивидуальной защиты (СИЗ), что снижает ловкость.

В этом исследовании мы оценили новое устройство, помогающее отрицательным окрашивающим вирусам в биоконцентрации. Устройство представляет собой капсулу, которая работает как специализированный наконечник пипетки. Когда сетки загружаются в капсулу, пользователь просто отсасывает реагенты в капсулу, чтобы доставлять вирус и пятна в инкапсулированную сетку, тем самым устраняя обработку пользователем сеток. Хотя этот метод был разработан специально для использования в биологическом обогащении BSL-3 или -4, он может облегчить подготовку проб в любой лабораторной среде, обеспечивая легкое отрицательное окрашивание вируса. Этот же метод может быть также применен для получения отрицательно окрашенных образцов ТЕМ наночастиц, макромолекул и аналогичных образцов.

Introduction

Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЕА) является эффективным инструментом для просмотра морфологии и ультраструктуры биологических образцов, которые слишком малы, чтобы их можно было увидеть с помощью обычного светового микроскопа 1 , 2 , 3 , 4 . TEM снимают электроны через очень тонкий образец, создавая изображение с более высоким разрешением, поскольку электроны имеют гораздо более короткую длину волны, чем свет. Регионы образца, которые изгибают или блокируют электроны, выглядят темными, а области, которые являются электронно-лучистыми, кажутся белыми.

Отсутствие электронного плотного вещества затрудняет просмотр вирусов при ТЭМ, поскольку они не могут рассеивать электроны. Отрицательное окрашивание является наиболее распространенным методом, используемым для создания контраста и просмотра вирусов с помощью TEM. Первая отрицательная процедура окрашивания была предложена Бреннером и Хорном в 1959 году на основе эксперимента, в котором Холл (1955) и Хаксли (1957) наблюдалиПривело к появлению биологических структур в обратном контрасте при погружении в электронно-плотное вещество 5 . Процесс отрицательного окрашивания практически не изменился за последние полвека. Отрицательное окрашивание включает кратковременное применение раствора соли тяжелых металлов к образцу на сетке ТЕА в попытке окружить вирус плотным материалом без проникновения вируса 6 . Это создает темную границу и показывает форму частицы 5 . В этом исследовании используются два реагента для отрицательного окрашивания, уранилацетат (UA) и фосфовольфрамовая кислота калия (PTA). Оба эти пятна обычно используются для негативного окрашивания небольших биологических образцов, таких как вирусы, белковые комплексы и наночастицы 7 , 8 , 9 .

Традиционная технология отрицательного окрашивания - это технология ручного отрицательного окрашивания капельNique 7 . Этот метод требует точной обработки небольших хрупких сеток ТЕА с помощью щипцов для нанесения небольшого количества образца вируса, пятен и полосканий. Типичный протокол подготовки включает в себя нанесение капельки суспензии образца на поверхность сетки ТЕА, покрытой пленкой ( рис. 1А ). После прикрепления образца к поверхности пленки сетку промывают для удаления неадгезивных вирусов и окрашивают либо UA, либо PTA в течение нескольких секунд до минуты, в зависимости от типа образца. Избыточная жидкость отходит от сетки, прикоснувшись к куску фильтровальной бумаги к краю сетки.

Метод ручной капли требует, чтобы каждая сетка была индивидуально изготовлена. Если не обрабатывать тщательно, покрытые сетки ТЕА легко проколоты, согнуты или загрязнены. Обработка нескольких выборок может привести к затруднениям в отслеживании сеток и обеспечении согласованного окрашивания для каждого образца. Эта процедура окрашивания вручную намного больше d(BSL) -3 и -4 лаборатории по биоконцентрации, из-за необходимого средства индивидуальной защиты (СИЗ), необходимого для этих сред. СИЗ громоздка, а окружающая среда биоконцентрации гораздо более бурная по сравнению с обычной лабораторией. Персонал, работающий в лабораториях по биологическому обогащению BSL-3, должен носить 2 пары перчаток и работать в шкафу для биобезопасности (BSC). Этот двойной слой перчаток снижает тактильную чувствительность и ограничивает тонкое движение мотора. Воздушный поток BSC, который защищает пользователя и помогает предотвратить загрязнение образца, может привести к тому, что образцы и пятна высохнут слишком быстро, что повлияет на качество пятен. Сильный турбулентный поток воздуха в BSC также может быстро сдуть сетку, которая недостаточно хорошо закреплена. В лабораториях по биологическому обогащению BSL-4 существуют дополнительные требования безопасности. Персонал должен носить костюм с положительным давлением, который дополнительно ограничивает физическое перемещение и способность четко видеть и манипулироватьUlate. Техник, работающий в BSL-4, также носит по крайней мере 2 пары перчаток, а внешняя пара - толстая перчатка, которая значительно снижает ловкость и осязание. Наконец, щипцы, используемые для работы с сетками ТЕА, являются острыми, что создает риск для техников из-за их способности проколоть перчатки. С капсулами, содержащими сетки, щипцы не нужны, тем самым обеспечивая безопасную альтернативу без использования щипцов для манипулирования сетками в биоконцентрации. Наконец, капсулы также обеспечивают эффективный способ хранения сеток во время обработки, дезактивации пара осмия и во время хранения; Тем самым сохраняя сетки организованными и безопасными от повреждений.

В этом отчете мы вводим новый метод для отрицательных окрашивающих сеток ТЕА в лабораториях по биологическому обогащению, в которых используются капсулы mPrep / g, капсульное устройство для обработки сетки и окрашивания 10 , 11 , 12 . Капсула вмещаетИзменяет две сетки ТЕА, сводит к минимуму прямую обработку и уменьшает вероятность повреждения сетки. Капсула прикрепляется непосредственно к одной или многоканальной пипетке таким же образом, что и наконечник пипетки, что позволяет применять различные жидкости к сеткам, содержащимся внутри. Это позволяет одновременно подготовить несколько образцов с дублирующими сетками ( рис. 1B ). К отрицательному пятну с капсулами образец вируса аспирируют в капсулу и выдерживают в течение 10 минут, чтобы вирусы адсорбировались на поверхности сетки. Затем сетки с адсорбированным вирусом промывают деионизированной (dI) водой и окрашивают либо UA, либо PTA в течение нескольких секунд до 1 мин. Этот процесс использует те же самые этапы и реагенты протокола, что и метод ручной капли; Разница в том, что вся работа происходит внутри капсулы без физической обработки сеток. ( Фиг.1С , 1D ).

Целью этого исследования было оценить капсулы какНовый метод отрицательного окрашивания образцов вирусов в средах биоконцентрации. В этом исследовании также изучалось качество изображений ТЕА, полученных из двух различных процедур инактивации вирусов: 1) быстрая инактивация, 1% пара тетроксида осмия и 2) 24-процентная инактивация с 2% глутаральдегидом. Оба они проводились с использованием капсул. Наконец, мы оценили два часто используемых отрицательных пятна, UA и PTA, для использования в капсуле. 13

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка эксперимента в среде BSL-2 до работы с образцами вирусов

  1. Подготовьте или купите медные сетки TEM Formvar и углеродного покрытия, обычно 200-400 меш.
  2. Вставьте покрытые сетки ТЕА в капсулы.
    1. Используйте увеличенный объектив, чтобы облегчить выполнение этого процесса. Одна или две сетки могут быть вставлены в каждую капсулу. Предварительно загруженные капсулы можно приобрести, чтобы устранить этот шаг, если это необходимо.
  3. Перенесите капсулы со вставленными сетками, покрытыми ТЕА, вместе с другими материалами и реагентами, в биоконцентрации, где вирусы будут отрицательно окрашены.

2. Способ капсулирования для отрицательного окрашивания в биологическом обогащении с использованием водного глутаральдегида и 1% -ной инактивации паратриоксида осмия

  1. Внутри биоконцентрирования BSC аспирировать 40 мкл суспензии вируса в капсулу, прикрепленную к пипетке.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Пипетка остается прикрепленной к нейE до завершения процесса. Подготовка вируса соответствует нашей предыдущей публикации 14 .
  2. Поместите пипетку на бок в течение 10 минут, сетки ориентированы горизонтально. Это должно способствовать равномерному распределению вирусных частиц на сетках с покрытием.
  3. Инактивировать вирус в капсуле внутри биоконтактного BSC.
    1. Возьмите пипетку и нажмите на поршень, чтобы распределить раствор вируса в контейнер для отходов.
    2. Аспирируйте 40 мкл 2% глутаральдегида в капсулы.
      Осторожно: глутаровый альдегид является опасным химическим веществом и требует соответствующей защиты. Глутаральдегид можно использовать в течение коротких периодов в нормальном BSC, но расширенный открытый реагент требует работы в канальном BSC или вытяжном шкафу.
    3. Поместите пипетку на бок в течение 20 минут. Это необходимо для правильной фиксации образцов.
    4. Извлеките фиксатор и аспирируйте 40 мкл воды dI в капсулы, чтобы wПепел от фиксатора. Повторите этот этап промывки в течение всего 3 циклов полоскания.
  4. Аспирируйте в капсулы по 40 мкл либо 1% уранилацетата (UA), либо 1% фосфовольфрамовой кислоты калия (PTA) и дайте ей сидеть в течение 30 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Время окрашивания может варьироваться от 10 с до 1 мин на основе образца вируса.
    Осторожно: UA является альфа-эмиттером и кумулятивным токсином. Обращайтесь с ней с соответствующей защитой.
  5. Удалите капсулу из пипетки и промокните сухие решетки, прикоснувшись к куску фильтровальной бумаги к краю сетки, в то время как решетки остаются в капсуле.
  6. Процедура инактивации паратексида осмия.
    1. Поместите капсулу с открытой крышкой в ​​пробирку для центрифуги на 50 мл, содержащую фильтровальную бумагу, смоченную в 1% -ном растворе тетраоксида осмия.
      Осторожно: четырехокиси Osmium чрезвычайно токсичен при низком давлении паров. Он должен использоваться в канальном BSC или вытяжном шкафу для химических веществ. Обращайтесь с ней с соответствующей защитой. Почтовое предупреждениеИнформации в рабочей зоне.
    2. Уплотните 50 мл центрифужную пробирку в течение 1 часа, чтобы обеспечить полное проникновение пара тетроксида осмия. Затем, затем дезактивируйте и перенесите трубку из биоконтейнера в установку EML BSL-2.
  7. Удалите сетки EM из капсулы.
    1. В установке BSL-2 EM удалите капсулу из пробирки центрифуги и поместите ее на пипетку.
    2. Аспирируйте 40 мкл воды dI в капсулу и три раза подавайте воду в контейнер для отходов.
    3. Удалите капсулу из пипетки и промокните сухие решетки с помощью фильтровальной бумаги, чтобы прикоснуться к краю сетки.
    4. После сушки на воздухе храните сетки для последующей визуализации TEM.

3. Способ капсулирования для инактивации в биоконцентрации с 2% глутаровым альдегидом с последующим отрицательным окрашиванием в лаборатории BSL-2

  1. Процедура инактивации вирусов.
      Осторожно: глутаровый альдегид является опасным химическим веществом и требует соответствующей защиты. Глутаральдегид можно использовать в течение коротких периодов в нормальном BSC, но расширенный открытый реагент требует работы в канальном BSC или вытяжном шкафу.
    1. Инактивировать вирусы с фиксацией в течение как минимум 24 часов перед упаковкой, дезактивацией и переносить их на оборудование BSL-2 EM.
  2. В установке EML BSL-2 аспирируйте вирус и фиксирующую смесь в капсулу, содержащую две сетки ТЕА, прикрепленные к пипетке.
  3. Поместите пипетку горизонтально в течение 10 минут с сетками, ориентированными горизонтально.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Это должно способствовать равномерному распределению вирусных частиц на сетках ТЕА.
  4. Возьмите пипетку и нажмите на поршень, чтобы выгнать вирус в контейнер для отходов. Аспирировать 40 мкл ДИВоду в капсулы и выталкивать ее в контейнер для отходов для 3 циклов полоскания.
  5. Аспирируйте 40 мкл либо 1% UA, либо 1% PTA в капсулы в течение 30 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Время окрашивания варьировало от 10 с до 1 мин на основе образца вируса.
    Осторожно: UA является альфа-эмиттером и кумулятивным токсином. Обращайтесь с ней с соответствующей защитой.
  6. Удалите капсулу из пипетки и промокните сухие решетки, прикоснувшись к краю сетки к части фильтровальной бумаги. Воздух высушите решетки и сохраните их для последующей визуализации TEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Метод капсул дает отрицательное окрашивание хорошего качества для изображений ТЕА:

Во-первых, мы оценили качество изображений, сгенерированных с использованием как ручного метода капель, так и методов капсул для отрицательного окрашивания эболавира Заира. Эболавирусы являются членами семейства Filoviridae вместе с вирусом Марбурга. Эболавирус обычно составляет от 80 до 100 нм в диаметре и может иметь длину более 1000 нм. Эболавирус должен быть обработан в среде биологического обогащения BSL-4. На рисунке 2 показаны изображения, полученные с использованием метода ручной капли, и метод капсул для отрицательного окрашивания. Рисунок 2A (метод ручной капли) и рисунок 2B (метод капсул) показывают образцы эболавируса, которые имеют четко определенные детали с нуклеокапсидными структурами в центре вириона и видимый гликопротеин эболавирусаS на поверхности. Таким образом, как капсульные, так и капельные методы обладают способностью создавать аналогичные изображения TEM качества.

Сравнивать и оценивать качество изображения EM после быстрой инактивации водным глутаральдегидом и 1% пара тетроксида осмия против 24-часовой инактивации 2% -ным водным глутаральдегидом с использованием метода капсул:

Мы оценили качество изображений ТЕА, полученных из двух разных методов инактивации образца с использованием вируса Чикунгунья. Вирус Chikungunya является членом рода Alphavirus в семье Togaviridae . Он сферический с диаметром 60-70 нм. Вирион содержит оболочку, богатую гликопротеинами, которые образуют тримерные пики на поверхности вируса. Вирус Chikungunya должен быть обработан в BSL-3. Быстрая инактивация достигается с использованием 2% глутарового альдегида в течение 20 мин с последующим 1 ч воздействием 1% пара тетроксида осмия, при этом весь отрицательныйАтивный процесс окрашивания, происходящий в капсуле внутри BSC в лаборатории биологического обогащения ( рис. 1C ). Однако при использовании 2% глутарового альдегида в течение 24 ч для инактивации вируса инактивация происходит внутри среды биоконцентрации, но процедура 1% UA отрицательной окраски проводится с использованием капсульного метода в лаборатории BSL-2 ( рисунок 1D ). Эти процедуры инактивации не дают одинаковых качественных изображений ( рисунок 3 ). Из рисунка 3 видно, что фиксация в глутаровом альдегиде без присутствия тетраоксида осмия ( фиг. 3А , 3В ) демонстрирует больше ультраструктурной детали, чем образцы, полученные с глутаральдегидом и тетраоксидом осмия ( фиг. 3С , 3D ).

Метод капсул хорошо работает с использованием уранилацетата (UA) и фосфораOtungstic acid (PTA) в качестве отрицательных пятен для фиксированных образцов альдегида.

Примеры отрицательного окрашивания UA и PTA с использованием капсульного метода показаны на фиг. 4 на фиксированных вирусах альдегида (VLP). VLP представляют собой белки, собранные в подобные вирусам структуры, но не содержащие вирусных генетических материалов. Они обычно используются в разработке вакцин и для основных вирусных исследований. Отрицательное окрашивание является ценным инструментом для оценки сборки и морфологии VLP. Мы использовали как UA, так и PTA для отрицательного окрашивания VLP с помощью метода капсул. Оба пятна демонстрируют результаты высокого качества с видимыми и четко определенными границами нано-VLP 15 ( рис. 4A , 4B ) и ячеистыми лейкозами 10 ( рис. 4C , 4D ) гликопротеинов.


Рисунок 1: Обзор методов отрицательного окрашивания. ( A ) Ручной метод капель выполняется путем последовательного перемещения сетки ТЕА от капли до капли образца, полосканий и пятен. ( B ) Настройка метода капсул с сетками и применение суспензии образца. ( C ) Типичная процедура, использующая метод капсул в биоконцентрации с кратковременной инактивацией 1% паром тетраоксида осмия. ( D ) Рекомендуемая процедура с использованием метода капсул в биоконцентрации с долгосрочной инактивацией с 2% глутаральдегидом. Рисунок был ранее опубликован и повторно использован с разрешениями из ссылки 13 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.


Рисунок 2: Сравнение 1% PTA отрицательно окрашенных частиц эболавируса. ( A ) Отрицательный, окрашенный ручным методом капель. ( B ) Отрицательное окрашивание с использованием капсульного метода. Рисунок был ранее опубликован и повторно использован с разрешениями из ссылки 13 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: 1% отрицательное окрашивание UA методом капсулы вируса Chikungunya с использованием различных процедур инактивации. ( А , В ) инактивации в течение как минимум 24 ч только с 2% глутаровым альдегидом. ( C ,D) Быстрая инактивация 2% глутаровым альдегидом и 1% пара тетроксида осмия. Рисунок был ранее опубликован и повторно использован с разрешениями из ссылки 13 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4
Рисунок 4: Примеры фосфовольфрамовой кислоты (PTA) и уранилацетата (UA), отрицательно окрашенных частиц, подобных вирусам (VLP), с использованием метода капсул. ( A ) Краткий обзор увеличения 1% PTA-окрашенных нановолоконных VLP-эбола. ( B ) Изображение TEM с высоким увеличением, показывающее структурные детали окрашенных PTA нано-VLP. ( C ) Краткий обзор увеличения 1% UA окрашенных VLP лейкоза мышей. ( D ) Изображение с высоким увеличением TEM, показывающее структурный detАуры UA, окрашивали VLP с мышей Leukemia с эболавирусным гликопротеином на их поверхности. Рисунок был ранее опубликован и повторно использован с разрешениями из ссылки 13 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Отрицательное окрашивание является ценным методом ТЕА для оценки и калибровки вирусов, белковых комплексов и наночастиц. Классификация протоколов на протяжении более полувека была составлена ​​каплеобразным составом этих образцов путем ручного перемещения сеток от реагента до отрицательных пятен. Это простой процесс, но требует опыта, полученного в результате обучения для успешного завершения. Отличное отрицательное окрашивание по-прежнему считается современным набором навыков и очень востребованным во многих лабораториях ТЕА. Метод капсул имеет несколько отличительных преимуществ по сравнению с методом ручной капли, особенно в лабораториях по биоконцентрации. Во-первых, метод ручной капельки требует существенной подготовки и опыта, прежде чем он может быть успешно выполнен, а простой в использовании метод капсул может быть выполнен специалистами начального уровня простой пипетировкой. Самая большая проблема с ручным методом капель - успешное обращение с сетями ТЕА с помощью щипцов в BSL-3 и BSL-4 PPE из-за tO значительно уменьшенное тактильное ощущение и ловкость. Сетчатые сетки TEM с хрупким покрытием легко повреждаются или пробиваются пинцетом. Повреждение сетки TEM с покрытием часто не выявляется до тех пор, пока оно не будет рассмотрено с помощью ТЕА. Второе преимущество капсул заключается в том, что сетки ТЕА обрабатываются только непосредственно, когда они вставляются в капсулы и когда они удаляются для введения в электронный микроскоп. Независимо от того, работаете ли вы в лаборатории биоразведки или на объекте EML BSL-2, нет прямой обработки сетки. Третьим преимуществом метода капсул является то, что обе стороны сетки покрыты вирусами и пятнами. Это может быть полезно, когда концентрация проб низкая; Однако это может привести к слишком большому количеству пробы, если концентрация будет высокой или приведет к разбавлению образца перед использованием.

Отрицательное окрашивание нескольких сеток с использованием методики ручной капель занимает много времени, потому что каждый образец должен быть индивидуально подготовлен и окрашен. Это приводит к трудностям обтайПоследовательное, воспроизводимое окрашивание. Кроме того, отслеживание многих отдельных сеток всегда является проблемой. Каждая капсула содержит две сетки и несколько капсул могут быть прикреплены к многоканальной пипетке, упрощая процесс. Поэтому капсулы гарантируют, что сетки окрашиваются с использованием очень схожего процесса, в условиях согласованной выборки и в то же время. Капсулы могут быть помечены, чтобы помочь в организации, таким образом уменьшая потенциал для смешивания или неправильной идентификации сеток. Еще одна распространенная проблема, с которой сталкивается при использовании метода ручной капли, - это загрязнение сетки. Это может произойти, когда решетки остаются на открытом воздухе слишком долго или отбрасываются. Капсула защищает сетки ТЕА от открытого воздуха и надежно удерживает их, чтобы они никогда не падали. Капсулы обеспечивают больший экспериментальный контроль и повторяемость при приготовлении и отрицательном окрашивании, поскольку капсула является более контролируемой средой.

Капсулы можно приобрести предварительно загруженными, еслихряков. Ручная загрузка сетки в капсулы требует определенной практики, чтобы гарантировать, что сетки не повреждены. Метод капсул также требует немного больше образца и пятна, чем метод ручной капли. Метод капсул требует, по меньшей мере, 40 мкл образца, по сравнению с методом ручной капли, который может быть выполнен всего лишь с 8 мкл.

Инактивация вируса является важной частью негативного окрашивания в BSL-3 и BSL-4, так как позволяет инактивированному вирусу выводиться из лабораторий биологического обогащения для получения изображений в установке EM. Инактивация с использованием фиксаторов имеет дополнительное преимущество для фиксации вируса, предотвращая деградацию. Существует два разных способа инактивации образца вируса, оба из которых были рассмотрены в этом исследовании. Первый адгезирует вирус на покрытые сетки ТЕА, фиксирует вирусы в течение 20 мин в 2% -ном растворе глутаральдегида, а затем 1 час воздействия сетки на пары тетроксида осмия ( рис. 1С ). Это инактивитИонный метод выгоден, поскольку он экономит время, позволяя отбирать образец из лаборатории биологического обогащения через 1 ч и 20 мин. Он также предотвращает разбавление вируса перед нанесением на покрытую сетку ТЕА, поэтому может потребоваться, чтобы образцы, которые предположительно находились вблизи предела обнаружения ТЕА. Однако 1% пара тетроксида осмия уменьшает качество изображений ТЕА, поскольку осмий может дополнительно окрашивать образец ( рис. 3 ). Предыдущие отчеты показывают, что 5-минутное воздействие пара тетроксида осмия дает большие результаты при отрицательном окрашивании; Однако более длительная экспозиция, необходимая для абсолютной дезактивации вируса, вызывала смесь положительного и отрицательного окрашивания 17 . Второй способ инактивации включает в себя минимум 24 часа в 2% -ном растворе глутаральдегида и не требует обработки паратексидом осмиума ( рис. 1D ). Этот второй метод занимает больше времени, поскольку образец не удаляется из labo biocontainmentНо может быть выгодным, поскольку он позволяет проводить отрицательное окрашивание за пределами биоконцентрирования в среде BSL-2 и устраняет необходимость в опасном осаждении тетраоксида осмия. Наши результаты показывают, что 24 часа инактивации глутарового альдегида дают изображения TEM более высокого качества, чем при обработке образцов тефтоксидом осмия ( рис. 3 ).

В этом эксперименте использовались два отрицательных пятна: UA и PTA. Оба пятна используются как 1% раствор. UA, ацетатная соль урана, хорошо работает как отрицательное пятно, потому что плотные атомы урана рассеивают электроны 5 . PTA, гетерополикислота, также хорошо работает как отрицательное пятно из-за плотных атомов вольфрама 5 . PTA иногда предпочтительнее, чем у UA, потому что он намного менее токсичен и только слабое раздражение при вдыхании или контакте. При отрицательном окрашивании необработанных образцов следует учитывать более низкое значение рН UA, так как это может привести к повреждению tO образец. Вирусы, используемые в этом эксперименте, требуют фиксации для инактивации, поэтому оба UA и PTA достигли аналогичных результатов, и никакое четкое преимущество не может быть обнаружено ни для одного пятна. Оба пятна легко работать, и оба они создают аналогичные изображения TEM ( рисунок 4 ).

В целом, капсульный метод легче использовать в среде биологического обогащения и может использоваться в качестве альтернативы ручному методу капель. Использование капсул облегчает дефекты обработки образцов и дает изображения TEM хорошего качества. Изображения, полученные с использованием метода капсул, сопоставимы с изображениями, полученными с использованием метода ручной капли. Короткая инактивация вируса с помощью тетроксида осмия улучшает скорость, но его следует использовать только в том случае, если приемлемо пониженное качество изображения, или предполагается, что разбавление вируса приведет к его снижению до предела обнаружения TEM для процедуры. Как UA, так и PTA предоставляют аналогичные результаты с фиксированными образцами вирусов, используемыми в этом исследовании; эйОднако при окрашивании незафиксированных вирусов результаты могут быть разными.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Мнения, толкования, выводы и рекомендации, изложенные в статье, принадлежат авторам и не обязательно поддерживаются армией США или министерством обороны.

Acknowledgements

Мы хотели бы выразить признательность и благодарность д-ру Джону Карре и Ровене Шокман за предоставление очищенных нано-VLP Эбола, доктора Раджини Мудхасани за предоставление вируса Чикунгунья и д-ра Чарльза (Джейсона) Шумейкера за предоставление VLP из мышиной лейкемии, выражающих гликопротеины Эболавируса. Мы также хотели бы поблагодарить МАЯ Карла Соффлера за содействие Программе летней стажировки (SIP) и Программе обучения в области науки и техники (SEAP) и доктору Кэтрин Вильгельмсен за обучение в области безопасности лабораторий.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formvar/carbon coated TEM grids SPI 3420C-MB 200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules EMS 85010-01 box
mPrep/f couplers EMS 85010-11 standard 16/Pk
glutaraldehdyde EMS 16320 50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide EMS 19190 4% aqueous solution
Uranyl Acetate EMS 22400 powder
Potassium phosphotungstic acid EMS 19500 powder
filter paper Whatman 1450-090 size 50
Tranmission Electron Microscope JEOL JEM-1011 TEM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37, (4), 403-422 (2014).
  2. Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355, (9216), 1713-1717 (2000).
  3. Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37, (2), 91-106 (2006).
  4. Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22, (4), 552-563 (2009).
  5. Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. Negative staining of proteins. Electron Microsc Rev. 3, (1), 43-72 (1990).
  6. Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
  7. Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
  8. Bradley, D. E. Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins. Bacteriol Rev. 31, (4), 230-314 (1967).
  9. Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94, (3-4), 305-308 (1987).
  10. Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, Suppl 3. 721 (2015).
  11. Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23, (5), 30-37 (2015).
  12. Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, Suppl 2. 174-175 (2011).
  13. Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
  14. Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7, (3), 857-872 (2015).
  15. Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
  16. Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. 403419 (2011).
  17. Barland,, Rojkind, M. Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212, (5057), 84-85 (1966).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics