Utilización de cápsulas para la tinción negativa de muestras víricas en biocontención

Published 7/19/2017
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Immunology and Infection

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Summary

Este protocolo proporciona instrucciones para muestras de virus de tinción negativas que pueden usarse fácilmente en laboratorios BSL-2, -3 o -4. Incluye el uso de una cápsula de procesamiento innovadora que protege la rejilla de microscopía electrónica de transmisión y proporciona al usuario un manejo más fácil en los ambientes más turbulentos dentro de la biocontención.

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Blancett, C. D., Monninger, M. K., Nguessan, C. A., Kuehl, K. A., Rossi, C. A., Olschner, S. P., et al. Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment. J. Vis. Exp. (125), e56122, doi:10.3791/56122 (2017).

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Abstract

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se utiliza para observar la ultraestructura de virus y otros patógenos microbianos con resolución nanométrica. La mayoría de los materiales biológicos no contienen elementos densos capaces de dispersar electrones para crear una imagen; Por lo tanto, se requiere una tinción negativa, que coloca sales densas de metales pesados ​​alrededor de la muestra. Con el fin de visualizar los virus en suspensión bajo el TEM que deben aplicarse a las pequeñas rejillas cubiertas con una superficie transparente sólo nanómetros de espesor. Debido a su pequeño tamaño y fragilidad, estas rejillas son difíciles de manejar y se mueven fácilmente por las corrientes de aire. La superficie delgada se daña fácilmente, dejando la muestra difícil o imposible de imagen. Los virus infecciosos deben ser manejados en un gabinete de bioseguridad (BSC) y algunos requieren un ambiente de laboratorio de biocontención. Tinción de virus en los niveles de bioseguridad (BSL) -3 y -4 es especialmente difícil debido a que estos entornos son más turbulentos y los técnicos se requieren tO use equipo de protección personal (PPE), lo que disminuye la destreza.

En este estudio, se evaluó un nuevo dispositivo para ayudar a la tinción negativa de virus en biocontención. El dispositivo es una cápsula que funciona como una punta de pipeta especializada. Una vez que las rejillas se cargan en la cápsula, el usuario simplemente aspira los reactivos en la cápsula para entregar el virus y las manchas a la rejilla encapsulada, eliminando así el manejo del usuario de las rejillas. Aunque esta técnica fue diseñada específicamente para su uso en el biocontenimiento BSL-3 o -4, puede facilitar la preparación de la muestra en cualquier ambiente de laboratorio permitiendo una fácil tinción negativa del virus. Este mismo método también se puede aplicar para preparar especímenes TEM negativos teñidos de nanopartículas, macromoléculas y especímenes similares.

Introduction

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) es una herramienta eficaz para visualizar la morfología y la ultraestructura de especímenes biológicos que son demasiado pequeños para ser vistos con un microscopio de luz tradicional 1 , 2 , 3 , 4 . TEMs disparar electrones a través de una muestra muy delgada que produce una imagen de mayor resolución como electrones tienen una longitud de onda mucho más corto que la luz. Las regiones de la muestra que doblan o bloquean electrones aparecen oscuras, mientras que las regiones que son electrón lucent aparecen en blanco.

La falta de materia densa de electrones hace que los virus sean difíciles de ver bajo un TEM porque no pueden dispersar electrones. La tinción negativa es el método más común utilizado para crear contraste y ver los virus con un TEM. El primer procedimiento de tinción negativa fue propuesto por Brenner y Horne en 1959, basado en un experimento donde Hall (1955) y Huxley (1957) observaronLa aparición de estructuras biológicas en contraste inverso cuando se sumerge en una sustancia densa en electrones 5 . El proceso de tinción negativa ha permanecido prácticamente sin cambios durante el último medio siglo. La tinción negativa consiste en aplicar brevemente una solución de sal de metales pesados ​​a una muestra en una rejilla TEM en un intento de rodear al virus con material denso sin infiltrarse en el virus 6 . Esto crea un borde oscuro y revela la forma de la partícula 5 . Este estudio utiliza dos reactivos para tinción negativa, acetato de uranilo (UA) y ácido fosfotúngstico de potasio (PTA). Ambas manchas se utilizan comúnmente para manchar negativamente pequeñas muestras biológicas, tales como virus, complejos de proteínas, y nanopartículas [ 7 , 8 , 9] .

La técnica de tinción negativa convencional es la tecnología de tinción negativa manual de gotitasNique 7 . Este método requiere el manejo preciso de pequeñas y frágiles rejillas TEM con pinzas para aplicar pequeñas cantidades de muestras de virus, manchas y enjuagues. El protocolo de preparación típico implica la aplicación de una gotita de suspensión de muestra sobre la superficie de una rejilla TEM revestida con película ( Figura 1A ). Después de la unión de la muestra a la superficie de la película, la rejilla se enjuaga para eliminar los virus no adherentes y se tiñe con UA ​​o PTA durante unos segundos a un minuto, dependiendo del tipo de muestra. El exceso de líquido es malo lejos de la rejilla tocando un pedazo de papel de filtro al borde de la rejilla.

El método de gota manual requiere que cada rejilla se haga individualmente. Si no se manejan con cuidado, las rejillas TEM revestidas se perforan fácilmente, se doblan o se contaminan. El procesamiento de muestras múltiples puede conducir a dificultades en el seguimiento de las rejillas y asegurar una tinción consistente para cada muestra. Este procedimiento de tinción manual es mucho másSi se realizan en laboratorios de nivel de bioseguridad (BSL) -3 y -4 biocontenedores, debido al equipo de protección personal (EPP) requerido para estos ambientes. El PPE es engorroso y el ambiente de biocontención es mucho más turbulento en comparación con un laboratorio regular. El personal que trabaja en los laboratorios de biocontención BSL-3 debe llevar 2 pares de guantes y trabajar en un gabinete de bioseguridad (BSC). Esta doble capa de guantes reduce la sensibilidad táctil y restringe el movimiento del motor fino. El flujo de aire de la BSC que protege al usuario y ayuda a prevenir la contaminación de la muestra puede hacer que las muestras y las manchas se sequen demasiado rápido afectando así a la calidad de las manchas. El fuerte flujo de aire turbulento en el BSC también puede eliminar rápidamente una rejilla que no está bien asegurada. En los laboratorios de biocontención BSL-4, existen requisitos de seguridad adicionales. Se requiere que el personal use un traje de presión positiva, lo que restringe aún más el movimiento físico y la capacidad de ver y manipular claramenteLas rejillas. El técnico que trabaja en BSL-4 también lleva por lo menos 2 pares de guantes, siendo el par externo un guante grueso que reduce en gran medida la destreza y la sensación táctil. Finalmente, los fórceps utilizados para manejar las rejillas TEM son agudos, lo que supone un riesgo para el técnico debido a su capacidad para perforar los guantes. Con las cápsulas que contienen rejillas, no es necesario pinzas, lo que proporciona una alternativa segura, sin fórceps para manipular las rejillas en biocontención. Finalmente, las cápsulas también proporcionan una manera eficaz de almacenar rejillas durante el procesamiento, la descontaminación del vapor de osmio y durante el almacenamiento; Manteniendo así las rejillas organizadas y protegidas contra daños.

En este informe, se introduce un nuevo método para la tinción negativa TEM grids en los laboratorios de biocontención que utiliza mPrep / g cápsulas, un dispositivo a base de cápsulas para el manejo de la red y la tinción 10 , 11 , 12 . La cápsula acompañaModula dos rejillas TEM, minimiza el manejo directo y reduce el potencial de daño en la red. La cápsula se fija directamente a una pipeta de una o varias canales de la misma manera que una punta de pipeta, permitiendo la aplicación de varios líquidos a las rejillas contenidas dentro. Esto permite la preparación simultánea de muestras múltiples con cuadrículas duplicadas ( Figura 1B ). Para la tinción negativa con cápsulas, la muestra de virus se aspira en la cápsula y se mantiene durante 10 minutos para dejar que los virus se adsorben sobre las superficies de la rejilla. Las redes con virus adsorbido se lavan posteriormente con agua desionizada (dI) y se tiñen con UA ​​o PTA durante unos segundos a 1 min. Este proceso utiliza los mismos pasos y reactivos del protocolo que el método manual de gotas; La diferencia es que todo el trabajo se produce dentro de la cápsula sin manipulación física de las rejillas. ( Figuras 1C , 1D ).

El propósito de este estudio fue evaluar las cápsulas comoUn nuevo método para la tinción negativa de muestras de virus en ambientes de biocontención. Este estudio también examinó la calidad de las imágenes TEM producidas a partir de dos procedimientos diferentes de inactivación viral: 1) inactivación rápida, con 1% de vapor de tetróxido de osmio, y 2) inactivación de 24 horas con 2% de glutaraldehído. Ambos se llevaron a cabo utilizando las cápsulas. Finalmente, evaluamos dos manchas negativas comúnmente usadas, UA y PTA, para uso en la cápsula. 13

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Protocol

1. Preparación del experimento en un entorno BSL-2 antes de trabajar con las muestras de virus

  1. Preparar o comprar Formvar y rejillas de cobre con recubrimiento de carbón TEM, generalmente 200-400 mallas.
  2. Inserte las rejillas TEM revestidas en cápsulas.
    1. Utilice una lente ampliada para hacer este proceso fácil de realizar. Se pueden insertar una o dos rejillas en cada cápsula. Las cápsulas precargadas se pueden comprar para eliminar este paso si se desea.
  3. Transferir las cápsulas con rejillas recubiertas con TEM insertadas, junto con otros suministros y reactivos, a biocontención donde el virus se tiñera negativamente.

2. El método de la cápsula para la tinción negativa en biocontención usando glutaraldehído acuoso y 1% de inactivación de vapor de tetróxido de osmio

  1. Dentro del biocontenimiento BSC, aspirar 40 μL de suspensión de virus en la cápsula unida a una pipeta.
    NOTA: La pipeta permanece unida a laE cápsula hasta que se complete el proceso. La preparación de virus es de acuerdo con nuestra publicación anterior 14 .
  2. Coloque la pipeta en su lado durante 10 minutos con las rejillas orientadas horizontalmente. Esto es para promover una distribución uniforme de partículas de virus sobre las rejillas revestidas.
  3. Inactivar el virus dentro de la cápsula dentro del BSC de biocontención.
    1. Recoger la pipeta y presionar el émbolo para dispensar la solución del virus en un contenedor de residuos.
    2. Aspirar 40 μL de fijador de glutaraldehído al 2% en las cápsulas.
      Precaución: El glutaraldehído es un producto químico peligroso y requiere protección adecuada. El glutaraldehído se puede utilizar durante breves períodos en un BSC normal, pero el reactivo abierto extendido requiere trabajar en un conducto de BSC o chimenea de humo.
    3. Coloque la pipeta en su lado durante 20 min. Esto es para asegurar que las muestras estén bien fijadas.
    4. Expulsar el fijador y aspirar 40 μL de agua dI en las cápsulas a wRetirar el fijador. Repita este paso de lavado durante un total de 3 ciclos de enjuague.
  4. Aspirar 40 μL de acetato de uranilo (UA) al 1% o ácido fosfotúngstico potásico al 1% (PTA) en las cápsulas y dejar reposar durante 30 s.
    NOTA: El tiempo de tinción puede variar de 10 s a 1 min basado en la muestra de virus.
    Precaución: UA es un emisor alfa, y una toxina acumulativa. Manéjalo con la protección adecuada.
  5. Retire la cápsula de la pipeta y seque las rejillas tocando un pedazo de papel de filtro al borde de las rejillas mientras las rejillas permanecen dentro de la cápsula.
  6. Tetróxido de Osmio Procedimiento de inactivación del vapor.
    1. Coloque la cápsula, con la tapa abierta, en un tubo de centrífuga de 50 ml que contenga papel de filtro empapado en una solución de tetróxido de osmio al 1%.
      Precaución: El tetróxido de osmio es extremadamente tóxico con baja presión de vapor. Debe utilizarse en una campana extractora de humos BSC o chimenea. Manéjalo con la protección adecuada. Advertencia de envíoInformación en el área de trabajo.
    2. Sellar el tubo de centrífuga de 50 ml durante 1 h para permitir la permeación completa del vapor de tetróxido de osmio. A continuación, descontaminar y transferir el tubo del biocontenimiento a la instalación de BSL-2 EM.
  7. Retire las rejillas EM de la cápsula.
    1. En la instalación BSL-2 EM, retire la cápsula del tubo de centrífuga y colóquela en una pipeta.
    2. Aspirar 40 μL de agua de dI en la cápsula y dispensar el agua en un contenedor de residuos tres veces.
    3. Retire la cápsula de la pipeta y secar las rejillas con papel de filtro para tocar el borde de las rejillas.
    4. Después del secado al aire, almacene las rejillas para la posterior formación de imágenes TEM.

3. El método de la cápsula para la inactivación en el biocontenimiento con 2% de glutaraldehído, seguido de tinción negativa en un laboratorio BSL-2

  1. Procedimiento de inactivación del virus.
      Precaución: El glutaraldehído es un producto químico peligroso y requiere protección adecuada. El glutaraldehído se puede utilizar durante breves períodos en un BSC normal, pero el reactivo abierto extendido requiere trabajar en un conducto de BSC o chimenea de humo.
    1. Inactivar los virus con fijador durante un mínimo de 24 h antes de envasar, descontaminar y transferirlo a la instalación de BSL-2 EM.
  2. En la instalación BSL-2 EM, aspirar el virus y la mezcla fijadora en la cápsula, que contiene dos rejillas TEM, unidas a una pipeta.
  3. Coloque la pipeta horizontalmente durante 10 minutos con las rejillas orientadas horizontalmente.
    NOTA: Esto es para promover una distribución uniforme de partículas de virus en las rejillas TEM.
  4. Recoja la pipeta y presione el émbolo para expulsar el virus a un contenedor de desechos. Aspirar 40 μL de dIAgua en las cápsulas y expulsarla en el contenedor de residuos durante 3 ciclos de enjuague.
  5. Aspirar 40 μ l de 1% UA o 1% PTA en las cápsulas durante 30 s.
    NOTA: El tiempo de tinción varió de 10 s a 1 min basado en la muestra de virus.
    Precaución: UA es un emisor alfa, y una toxina acumulativa. Manéjalo con la protección adecuada.
  6. Retire la cápsula de la pipeta y secar las rejillas tocando el borde de las rejillas a un pedazo de papel de filtro. Secar al aire las rejillas y almacenarlas para la posterior formación de imágenes TEM.

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Representative Results

El método de la cápsula produce una tinción negativa de buena calidad para la obtención de imágenes TEM:

En primer lugar, se evaluó la calidad de las imágenes generadas mediante el uso del método de gotita manual y los métodos de cápsula para la tinción negativa Zaire ebolavirus. Los ebolavirus son miembros de la familia Filoviridae , junto con el virus Marburg. El ébolavirus es típicamente de 80 a 100 nm de diámetro y puede tener más de 1.000 nm de longitud. El Ebolavirus debe manejarse en un ambiente de biocontención BSL-4. La Figura 2 muestra las imágenes generadas usando el método de gotita manual y el método de cápsula para la tinción negativa. La Figura 2A (método de gotita manual) y la Figura 2B (método de cápsula) muestran muestras de ebolavirus que tienen detalles claramente definidos con estructuras de nucleocápsida en el centro del virión, y glicoproteína de ebolavirus visibleS en la superficie. Por lo tanto, tanto la cápsula como los métodos de gotas tienen la capacidad de producir imágenes TEM de calidad similares.

Comparar y evaluar la calidad de imagen EM después de una rápida inactivación con glutaraldehído acuoso y vapor de tetróxido de osmio al 1% frente a inactivación de 24 horas con glutaraldehído acuoso al 2%, usando el método de la cápsula:

Se evaluó la calidad de las imágenes TEM generadas a partir de dos métodos diferentes de inactivación de la muestra utilizando el virus Chikungunya. El virus Chikungunya es un miembro del género Alphavirus en la familia Togaviridae . Es esférico con un diámetro de 60-70 nm. El virión contiene una envoltura rica en glicoproteínas que forman puntas triméricas en la superficie viral. El virus Chikungunya debe manejarse en BSL-3. La inactivación rápida se logra utilizando glutaraldehído al 2% durante 20 min seguido de una exposición de 1 h al vapor de tetróxido de osmio al 1%, con la negAtivo que ocurre en una cápsula dentro de un BSC en el laboratorio de biocontención ( Figura 1C ). Sin embargo, cuando se utiliza 2% de glutaraldehído durante 24 h para inactivar el virus, la inactivación se produce dentro de un entorno de biocontención, pero el procedimiento de tinción con un 1% de UA negativa se lleva a cabo usando el método de cápsula en un laboratorio BSL-2 ( Figura 1D ). Estos procedimientos de inactivación no producen las mismas imágenes de calidad ( Figura 3 ). De la Figura 3 se desprende claramente que la fijación en glutaraldehído sin la presencia de tetróxido de osmio ( Figura 3A , 3B ) muestra más detalle ultraestructural que las muestras preparadas con glutaraldehído y tetróxido de osmio ( Figura 3C , 3D ).

El método de cápsula funciona bien utilizando acetato de uranilo (UA) y fosfatoOtungstic acid (PTA) como manchas negativas para muestras fijadas con aldehído.

Ejemplos de tinción negativa de UA y PTA usando el método de cápsula se muestran en la Figura 4 sobre partículas tipo virus similares a aldehído (VLPs). Las VLP son proteínas montadas en estructuras similares a virus, pero no contienen ningún material genético viral. Se usan típicamente en el desarrollo de la vacuna y para la investigación viral básica. La tinción negativa es una valiosa herramienta para evaluar el montaje y la morfología de la VLP. Utilizamos UA y PTA para la tinción negativa de VLPs con el método de la cápsula. Ambas manchas muestran resultados de alta calidad con glicoproteínas visibles y claramente definidas en los bordes de las nano-VLP 15 de Ebola ( Figura 4A , 4B ) y VLPs 16 de Leucemia Murina ( Figura 4C , 4D ).


Figura 1: Visión general de los métodos de tinción negativa. ( A ) El método de gotitas manuales se realiza desplazando secuencialmente las rejillas TEM desde la gotita hasta la gotita de muestra, enjuagues y manchas. ( B ) Configuración del método de la cápsula con rejillas y aplicación de la suspensión de la muestra. ( C ) Procedimiento típico usando el método de la cápsula en biocontención con inactivación a corto plazo con 1% de vapor de tetróxido de osmio. ( D ) Procedimiento recomendado utilizando el método de la cápsula en biocontención con inactivación a largo plazo con 2% de glutaraldehído. La figura se publicó previamente y se volvió a utilizar con permisos de la referencia 13 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 2: Comparación de partículas de Ebolavirus teñidas negativas de PTA al 1%. ( A ) Teñido negativo con el método de gota manual. ( B ) Coloración negativa usando el método de la cápsula. La figura se publicó previamente y se volvió a utilizar con permisos de la referencia 13 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: 1% de tinción negativa UA con el método de la cápsula de Chikungunya virus utilizando diferentes procedimientos de inactivación. ( A , B ) durante un mínimo de 24 horas con 2% de glutaraldehído solamente. ( C ,D) Inactivación rápida con 2% de glutaraldehído y 1% de vapor de tetróxido de osmio. La figura se publicó previamente y se volvió a utilizar con permisos de la referencia 13 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Ejemplos de ácido fosfotúngstico (PTA) y Acetato de uranilo (UA) con partículas de virus asimiladas negativamente (VLP) usando el método de cápsula. ( A ) Ampliación de baja amplificación de 1% de PTA teñido ebola nano-VLPs. ( B ) Imagen de alta amplificación de TEM que muestra detalles estructurales de los nano-VLPs de ebola teñidos con PTA. ( C ) Ampliación de baja ampliación de 1% de VLPs de leucemia murina marcada con UA. ( D ) Ampliación alta imagen TEM que muestra det estructuralAils de VLPs de leucemia murina con tinción de UA con glicoproteína de ebolavirus en su superficie. La figura se publicó previamente y se volvió a utilizar con permisos de la referencia 13 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La tinción negativa es una valiosa técnica TEM para evaluar y calibrar virus, complejos proteicos y nanopartículas. La preparación de gotitas de estos especímenes mediante el movimiento manual de las rejillas desde el reactivo a las manchas negativas ha sido el protocolo clásico durante más de medio siglo. Es un proceso simple, pero requiere conocimientos adquiridos a través de la capacitación para su finalización con éxito. La excelente tinción negativa todavía se considera un conjunto de habilidades de última generación y altamente deseado en muchos laboratorios TEM. El método de la cápsula tiene varias ventajas distintas sobre el método de gotita manual, especialmente en los laboratorios de biocontención. En primer lugar, el método de gotas manuales requiere un entrenamiento y una experiencia sustanciales antes de que se pueda llevar a cabo con éxito, mientras que el fácil de usar el método de la cápsula puede ser realizado por técnicos de nivel de entrada por simple pipeteado. El mayor desafío con el método de gotas manuales es el manejo exitoso de las rejillas TEM con fórceps en BSL-3 y BSL-4 PPE debido aO la sensación táctil y la destreza muy reducidas. Las rejillas TEM frágiles se pueden dañar o perforar con pinzas. Los daños a la rejilla TEM revestida a menudo no se revelan hasta que se ve con un TEM. Una segunda ventaja de las cápsulas es que las rejillas TEM sólo se manipulan directamente cuando se insertan en cápsulas y cuando se retiran para su inserción en el microscopio electrónico. Ya sea trabajando en el laboratorio de biocontención o en la instalación de BSL-2 EM, no hay manejo directo de la red. Una tercera ventaja del método de la cápsula es que ambos lados de la rejilla están cubiertos con virus y manchas. Esto puede ser útil cuando la concentración de la muestra es baja; Sin embargo esto podría causar demasiada muestra si la concentración es alta, o resultar en la dilución de la muestra antes del uso.

La tinción negativa de múltiples rejillas utilizando la técnica de gotitas manuales consume mucho tiempo porque cada muestra necesita ser preparada y teñida individualmente. Esto conduce a dificultades obtaiConsistente y reproducible. Además, el seguimiento de muchas redes individuales siempre es un desafío. Cada cápsula contiene dos rejillas y múltiples cápsulas se pueden conectar a una pipeta multicanal, la racionalización del proceso. Por lo tanto, las cápsulas aseguran que las rejillas se tiñen usando un proceso muy similar, bajo condiciones de muestra consistentes y al mismo tiempo. Las cápsulas se pueden etiquetar para ayudar en la organización, reduciendo así el potencial de mezcla o mala identificación de las redes. Otro problema común que se enfrenta cuando se utiliza el método de gota manual es la contaminación de la red. Esto puede ocurrir cuando las rejillas se dejan al aire libre durante demasiado tiempo o se caen. La cápsula protege las rejillas TEM del aire libre y las mantiene firmemente para que nunca se caigan. Las cápsulas proporcionan mayor control experimental y repetibilidad cuando se preparan y tinción negativa porque la cápsula es un ambiente más controlado.

Las cápsulas se pueden comprar precargadas siSired Cargar manualmente las rejillas en las cápsulas requiere cierta práctica para asegurar que las rejillas no estén dañadas. El método de la cápsula también requiere un poco más de muestra y mancha que el método de gota manual. El método de la cápsula requiere al menos 40 μl de muestra, en comparación con el método de gotita manual, que se puede hacer con tan poco como 8 μL.

La inactivación del virus es una parte importante de la tinción negativa en BSL-3 y BSL-4, ya que permite que el virus inactivado sea extraído de los laboratorios de biocontención para la obtención de imágenes en la instalación EM. La inactivación con fijadores tiene el beneficio añadido de fijar el virus, evitando la degradación. Hay dos formas diferentes de inactivar la muestra de virus, las cuales fueron examinadas en este estudio. El primero adhiere el virus a las rejillas TEM revestidas, fija los virus durante 20 min en una solución de glutaraldehído al 2%, seguido de 1 h de exposición de la rejilla al vapor de tetróxido de osmio ( Figura 1C ). Esta inactividadIon es ventajoso porque ahorra tiempo permitiendo que la muestra sea sacada del laboratorio de biocontenido después de 1 h y 20 min. También previene la dilución del virus antes de su aplicación a la rejilla TEM revestida, por lo que puede ser necesario que las muestras que se sospecha estén cerca del límite de detección de TEM. Sin embargo, el vapor de 1% de tetróxido de osmio reduce la calidad de las imágenes TEM, ya que el osmio puede manchar la muestra ( Figura 3 ). Informes anteriores muestran una exposición de 5 min al vapor de tetróxido de osmio proporciona grandes resultados cuando la tinción negativa; Sin embargo, una exposición más larga requerida para la desactivación viral absoluta generó una mezcla de tinción positiva y negativa 17 . El segundo método de inactivación implica un mínimo de 24 h en una solución al 2% de glutaraldehído, y no requiere el tratamiento con vapor de tetróxido de osmio ( Figura 1D ). Este segundo método tarda más en completarse, ya que la muestra no se elimina del laboratorio de biocontenciónRatorio durante 24 h, pero puede ser ventajoso porque permite que la tinción negativa se haga fuera del biocontenido en un ambiente BSL-2, y elimina la necesidad de tetróxido de osmio peligroso. Nuestros resultados demuestran que 24 h de inactivación de glutaraldehído produce imágenes TEM de mayor calidad que cuando las muestras se tratan con vapor de tetróxido de osmio ( Figura 3 ).

Se usaron dos manchas negativas en este experimento: UA y PTA. Ambas manchas se utilizan como una solución al 1%. UA, la sal de acetato de uranio, funciona bien como una mancha negativa porque los átomos de uranio denso dispersan electrones 5 . PTA, un heteropoliácido, también funciona bien como una mancha negativa debido a densos átomos de tungsteno 5 . PTA se prefiere a veces sobre UA porque es mucho menos tóxico, y solamente un irritante leve si se inhala o entra en contacto con. Cuando se tiñen negativas las muestras no fijadas, se debe considerar el pH más bajo de UA, ya que puede causar daño tO la muestra. Los virus utilizados en este experimento requieren fijación para inactivación, por lo tanto tanto UA como PTA lograron resultados similares y no se pudo detectar ninguna ventaja distinta para ninguna de las manchas. Ambas manchas son fáciles de trabajar, y ambos producen imágenes TEM de calidad similar ( Figura 4 ).

En general, el método de la cápsula es más fácil de usar en un ambiente de biocontención y puede usarse como alternativa al método de gotitas manuales. El uso de cápsulas facilita los defectos de manipulación de la muestra y genera imágenes TEM de buena calidad. Las imágenes producidas usando el método de la cápsula son comparables a las imágenes producidas usando el método manual de la gotita. La inactivación corta del virus con tetróxido de osmio mejora la velocidad, pero sólo debe utilizarse si se acepta una calidad de imagen reducida, o se sospecha que la dilución del virus la situará por debajo del límite de detección TEM para el procedimiento. Tanto la UA como la PTA proporcionan resultados similares con las muestras de virus fijas utilizadas en este estudio; HoLos resultados pueden ser diferentes cuando se tiñen los virus no fijados.

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Disclosures

Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones que figuran en el artículo son las de los autores y no necesariamente están respaldadas por el Ejército de los Estados Unidos o el Departamento de Defensa.

Acknowledgements

Quisiéramos agradecer al Dr. John Carra y Rowena Schokman por proporcionar Nano-VLP puros de Ebola, al Dr. Rajini Mudhasani por proveer el virus Chikungunya, y al Dr. Charles (Jason) Shoemaker por proveer Leucemia Murina VLPs que expresan glicoproteínas de Ebolavirus. También queremos agradecer a MAJ Carl Soffler por facilitar el Programa de Prácticas de Verano (SIP) y el Programa de Aprendizaje de Ciencia e Ingeniería (SEAP) y la Dra. Catherine Wilhelmsen para el entrenamiento de seguridad en el laboratorio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formvar/carbon coated TEM grids SPI 3420C-MB 200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules EMS 85010-01 box
mPrep/f couplers EMS 85010-11 standard 16/Pk
glutaraldehdyde EMS 16320 50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide EMS 19190 4% aqueous solution
Uranyl Acetate EMS 22400 powder
Potassium phosphotungstic acid EMS 19500 powder
filter paper Whatman 1450-090 size 50
Tranmission Electron Microscope JEOL JEM-1011 TEM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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