Utnyttelse av kapsler for negativ farging av virale prøver innen biokonduksjon

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokollen gir instruksjon for negative fargevirusprøver som lett kan brukes i BSL-2, -3 eller -4 laboratorier. Den inkluderer bruk av en nyskapende prosesseringskapsel, som beskytter transmisjonselektronmikroskopisk rutenett og gir brukeren enklere håndtering i de mer turbulente miljøene innen biokonstruksjon.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Blancett, C. D., Monninger, M. K., Nguessan, C. A., Kuehl, K. A., Rossi, C. A., Olschner, S. P., Williams, P. L., Goodman, S. L., Sun, M. G. Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment. J. Vis. Exp. (125), e56122, doi:10.3791/56122 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Overføringselektronmikroskopi (TEM) brukes til å observere ultrastruktur av virus og andre mikrobielle patogener med nanometeroppløsning. De fleste biologiske materialer inneholder ikke tette elementer som er i stand til å sprede elektroner for å skape et bilde; Derfor kreves en negativ flekk, som plasserer tette tungmetallsalter rundt prøven. For å visualisere virus i suspensjon under TEM må de påføres små rister belagt med en gjennomsiktig overflate, bare nanometer tykk. På grunn av deres små størrelse og skjøthet er disse rutenettene vanskelige å håndtere og lett flyttes av luftstrømmer. Den tynne overflaten er lett skadet, slik at prøven er vanskelig eller umulig å bilde. Smittsomme virus må håndteres i et biosikkerhetsskap (BSC), og noen krever et biokonduktiv laboratoriemiljø. Staining-virus i biosikkerhetsnivåer (BSL) -3 og -4 er spesielt utfordrende fordi disse miljøene er mer turbulente og teknikere kreves tO Bruk personlig verneutstyr (PPE), noe som reduserer fingerfrekvensen.

I denne studien evaluerte vi en ny enhet som bidrar til negative farvingsvirusene i biokonvertering. Enheten er en kapsel som fungerer som en spesialisert pipettespiss. Når nettene er lastet inn i kapselen, aspirerer brukeren bare reagenser inn i kapselen for å levere viruset og flekker til det innkapslede rutenettet, og dermed eliminere brukerhåndtering av rister. Selv om denne teknikken ble designet spesielt for bruk i BSL-3 eller -4-biokonduksjon, kan det lette prøvepreparatet i alle laboratoriemiljøer ved å muliggjøre enkel negativ farging av virus. Den samme metoden kan også brukes til å lage negative TEM-prøver av nanopartikler, makromolekyler og lignende prøver.

Introduction

Transmissionselektronmikroskopi (TEM) er et effektivt verktøy for å vise morfologi og ultrastruktur av biologiske prøver som er for små til å bli sett med et tradisjonelt lysmikroskop 1 , 2 , 3 , 4 . TEMs skyver elektroner gjennom en veldig tynn prøve som produserer et høyere oppløsningsbilde som elektroner har en mye kortere bølgelengde enn lys. Regioner av prøven som bøyer eller blokkerer elektroner virker mørke, mens områder som er elektronlukende, vises hvite.

Mangel på elektron tett materie gjør virus vanskelig å se under en TEM fordi de ikke kan spre elektroner. Negativ farging er den vanligste metoden som brukes til å lage kontrast og vise virus med en TEM. Den første negative fargingsprosedyren ble foreslått av Brenner og Horne i 1959, basert på et eksperiment hvor Hall (1955) og Huxley (1957) observertVed utseendet av biologiske strukturer i motsatt kontrast når de nedsenkes i et elektronisk tett stoff 5 . Prosessen med negativ farging har vært nesten uendret i løpet av det siste halve århundre. Negativ farging involverer kort bruk av en tungmetallsaltløsning til en prøve på et TEM-grid i et forsøk på å omgjøre viruset med tett materiale uten å infiltrere viruset 6 . Dette skaper en mørk kant og avslører partikkelens form 5 . Denne studien bruker to reagenser for negativ farging, uranylacetat (UA) og kaliumfosfotungstinsyre (PTA). Begge disse flekkene brukes ofte til å plette små biologiske prøver negativt, for eksempel virus, proteinkomplekser og nanopartikler 7 , 8 , 9 .

Den konvensjonelle negative fargingsteknikken er den manuelle dråpe negative fargingsteknikkenNique 7 . Denne metoden krever presis håndtering av små, skjøre TEM-rister med tau for å bruke små mengder virusprøve, flekker og skyll. Den typiske fremstillingsprotokoll innebærer å påføre en dråpe av prøve-suspensjon på overflaten av et filmbelagt TEM-grid ( figur 1A ). Etter festing av prøven til filmoverflaten, blir ruten skyllet for å fjerne ikke-vedhengende virus og farget med enten UA eller PTA i noen sekunder til et minutt, avhengig av typen av prøve. Overflødig væske er ugudelig fra rutenettet ved å berøre et stykke filterpapir til kanten av rutenettet.

Den manuelle dråpemetoden krever at hvert rutenett gjøres individuelt. Hvis ikke håndteres forsiktig, kan de belagte TEM-nettene enkelt punkteres, bøyes eller forurenses. Behandling av flere prøver kan føre til vanskeligheter med å spore gridene og sikre konsekvent farging for hver prøve. Denne manuelle fargingsprosedyren er mye mer dEffektiv når det utføres i biosikkerhetsnivå (BSL) -3 og -4 biokonduktivitetslaboratorier, på grunn av det nødvendige personlige verneutstyret (PPE) som kreves for disse miljøene. PPE er tungvint og biokontekstmiljøet er mye mer turbulent sammenlignet med et vanlig laboratorium. Personell som arbeider i BSL-3 biokonduktivitetslaboratorier, må bruke to par hansker og arbeide i et biosikkerhetskapasitet (BSC). Dette doble lag av hansker reduserer taktil følsomhet og begrenser fin motorbevegelse. Luftstrømmen av BSC som beskytter brukeren og bidrar til å forhindre prøveforurensning kan føre til at prøvene og flekkene tørker for raskt og dermed påvirker flekkkvaliteten. Den sterke turbulente luftstrømmen i BSC kan også raskt blåse bort et rutenett som ikke er godt sikret. I BSL-4 biokonduktivitetslaboratorier er det ytterligere sikkerhetskrav. Personell er pålagt å ha på seg en positiv trykkdrakt, noe som ytterligere begrenser fysisk bevegelse og evnen til å tydelig se og manipulereUlate grids. Teknikeren som arbeider i BSL-4, har også minst 2 par hansker, og det ytre paret er en tykk hanske som i stor grad reduserer fingerferdighet og taktil følelse. Til slutt er tangene som brukes til å håndtere TEM-grensesnitt, skarpe og derved utgir en risiko for teknikken på grunn av deres evne til å punktere hansker. Med kapsler som inneholder rister, er det ikke nødvendig å tvinge, noe som gir et trygt, taufritt alternativ for å manipulere rister i biokonstruksjon. Til slutt gir kapslene også en effektiv måte å lagre rister under prosessering, osmiumdampdekontaminering og under lagring; Herved holder nettene organisert og trygt fra skade.

I denne rapporten introduserer vi en ny metode for negativ farging av TEM grensesnitt i biokonduktivitetslaboratorier som benytter mPrep / g kapsler, en kapselbasert enhet for gridbehandling og farging 10 , 11 , 12 . Kapselene kommer til syneModifiserer to TEM-grensesnitt, minimerer direkte håndtering og reduserer potensialet for gridskader. Kapselet festes direkte til en enkelt- eller flerkanalspipett på samme måte som en pipettespiss, slik at det påføres forskjellige væsker i rister. Dette muliggjør samtidig forberedelse av flere prøver med dupliserte grid ( Figur 1B ). Til negativ flekk med kapsler aspireres virusprøven inn i kapselen og holdes i 10 minutter for å la virusene adsorbere på gridoverflatene. Ristene med adsorbert virus vaskes deretter med deionisert (dI) vann og farves med enten UA eller PTA i noen sekunder til 1 min. Denne prosessen bruker de samme protokollstrinnene og reagensene som den manuelle dråpemetoden; Forskjellen er at alt arbeid skjer i kapselen uten fysisk håndtering av gridene. ( Fig. 1C , 1D ).

Formålet med denne studien var å evaluere kapsler somEn ny metode for negativ farging av virusprøver i biokonduktiv miljø. Denne studien undersøkte også kvaliteten på TEM-bilder produsert av to forskjellige virusinaktiveringsprosedyrer: 1) hurtig inaktivering med 1% osmiumtetroksiddamp og 2) 24 timers inaktivering med 2% glutaraldehyd. Begge disse ble gjennomført ved bruk av kapslene. Til slutt vurderte vi to ofte brukte negative flekker, UA og PTA, for bruk i kapselen. 1. 3

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Eksperimentering i et BSL-2 miljø før arbeid med virusprøver

  1. Forbered eller kjøp Formvar og karbonbelagt TEM kobbernettet, vanligvis 200-400 mesh.
  2. Sett de belagte TEM-nettene i kapsler.
    1. Bruk en forstørret linse for å gjøre denne prosessen enkel å utføre. Ett eller to gitter kan settes inn i hver kapsel. Pre-loaded kapsler kan kjøpes for å eliminere dette trinnet hvis ønskelig.
  3. Overfør kapslene med innfelt TEM-belagte rister, sammen med andre forsyninger og reagenser, til biokonduksjon der virusene vil bli negativt farget.

2. Kapselmetoden for negativ farging i biokonvertering ved bruk av vandig glutaraldehyd og 1% osmium tetroksid damp inaktivering

  1. Inne i biokonvensjons-BSC, aspirere 40 μl virus suspensjon i kapselen festet til en pipette.
    MERK: pipetten forblir festet til denE kapsel til prosessen er fullført. Viruspreparasjon er i henhold til vår tidligere publikasjon 14 .
  2. Plasser pipetten på siden i 10 minutter med grensesnittet orientert horisontalt. Dette er å fremme en jevn fordeling av viruspartikler på de belagte gridene.
  3. Inaktiver viruset i kapselen inne i biokonstruksjonen BSC.
    1. Plukk pipetten og trykk stemplet for å dispensere virusoppløsningen i en søppelbeholder.
    2. Aspirer 40 μL 2% glutaraldehydfiksativ i kapslene.
      Forsiktig: Glutaraldehyd er et farlig kjemikalie og krever passende beskyttelse. Glutaraldehyd kan brukes i korte perioder i et normalt BSC, men utvidet åpent reagens krever arbeid i en kanalisert BSC eller kjemisk avtrekksdeksel.
    3. Plasser pipetten på siden i 20 minutter. Dette er for å sikre at prøvene er godt løst.
    4. Utløs fiksativet og aspirer 40 μl dl vann inn i kapslene til wAske bort fiksativet. Gjenta dette vaske trinnet for totalt 3 skylle sykluser.
  4. Aspirer 40 μL av enten 1% uranylacetat (UA) eller 1% kaliumfosfotungstinsyre (PTA) i kapslene og la det sitte i 30 s.
    MERK: Staining tid kan variere fra 10 s til 1 min basert på virusprøve.
    Forsiktig: UA er en alfa-emitter, og et kumulativt toksin. Håndter den med passende beskyttelse.
  5. Fjern kapselen fra pipetten og tørk risten ved å røre et stykke filterpapir til kanten av ristene mens ristene forblir i kapselen.
  6. Osmium tetroksid Damp inaktivering prosedyre.
    1. Legg kapselen, med lokket åpent, i et 50 ml sentrifugerør som inneholder filterpapir gjennomvåt i en 1% osmiumtetroksidløsning.
      Forsiktig: Osmiumtetroksid er ekstremt giftig med lavt damptrykk. Den må brukes i en kanalisert BSC eller kjemisk avtrekksdeksel. Håndter den med passende beskyttelse. Legg inn advarselInformasjon på arbeidsområdet.
    2. Søl 50 ml-sentrifugerøret i 1 time for å tillate fullstendig permeasjon av osmiumtetroksiddampen. Deretter dekontaminerer og overfører deretter røret ut av biokonstruksjonen til BSL-2 EM-anlegget.
  7. Fjern EM-gitter fra kapselen.
    1. I BSL-2 EM-anlegget, fjern kapselen fra sentrifugerøret og legg det på en pipette.
    2. Aspirer 40 μl dl vann inn i kapselen og disponér vannet i en avfallsholder tre ganger.
    3. Fjern kapselen fra pipetten, og tørk risten med filterpapir for å berøre kantene på ristene.
    4. Etter lufttørking lagrer du nettene for etterfølgende TEM-bildebehandling.

3. Kapselmetoden for inaktivering i biokonvertering med 2% glutaraldehyd, etterfulgt av negativ farging i et BSL-2 laboratorium

  1. Virusinaktiveringsprosedyre.
      Forsiktig: Glutaraldehyd er et farlig kjemikalie og krever passende beskyttelse. Glutaraldehyd kan brukes i korte perioder i et normalt BSC, men utvidet åpent reagens krever arbeid i en kanalisert BSC eller kjemisk avtrekksdeksel.
    1. Inaktiver virus med fikseringsmiddel i minst 24 timer før pakking, dekontaminering og overfør det til BSL-2 EM-anlegget.
  2. I BSL-2 EM-anlegget, aspirere viruset og fikseringsblandingen i kapselen, som inneholder to TEM-rister, festet til en pipette.
  3. Plasser pipetten horisontalt i 10 minutter med grindene orientert horisontalt.
    MERK: Dette er å fremme en jevn fordeling av viruspartikler på TEM-nettene.
  4. Plukk pipetten og trykk stemplet for å utvise viruset til en søppelbeholder. Aspirer 40 μl dlVann inn i kapslene og kast det ut i avfallsbeholderen i 3 skyllesykluser.
  5. Aspirer 40 μL av enten 1% UA eller 1% PTA i kapslene i 30 s.
    MERK: Staining tid varierte fra 10 s til 1 min basert på virusprøve.
    Forsiktig: UA er en alfa-emitter, og et kumulativt toksin. Håndter den med passende beskyttelse.
  6. Fjern kapselen fra pipetten og tørk risten ved å berøre kantene på rutenettene på et stykke filterpapir. Lufttør nettene og lagre dem for senere TEM-bildebehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kapselmetoden gir god kvalitet negativ farging for TEM-bildebehandling:

Først vurderte vi kvaliteten på bildene som ble generert ved å bruke både manuell dråpe-metoden og kapselmetodene for negativ farging av Zaire ebolavirus. Ebolaviruser er medlemmer av Filoviridae- familien, sammen med Marburg-viruset. Ebolavirus er typisk 80 til 100 nm i diameter og kan være over 1000 nm i lengde. Ebolavirus må håndteres i et BSL-4 biokonduktivt miljø. Figur 2 viser bilder generert ved hjelp av manuell dråpemetode og kapselmetoden for negativ farging. Figur 2A (manuell dråpemetode) og figur 2B (kapselmetode) viser ebolavirusprøver som har klart definerte detaljer med nukleokapsidstrukturer i sentrum av virionen og synlig ebolavirusglykoproteinS på overflaten. Dermed har både kapsule- og dråpemetoder evnen til å produsere likeverdige TEM-bilder.

Sammenlign og vurder EM bildekvalitet etter rask inaktivering med vandig glutaraldehyd og 1% osmiumtetroksiddamp mot 24 timers inaktivering med 2% vandig glutaraldehyd ved hjelp av kapselmetoden:

Vi evaluerte kvaliteten på TEM-bilder generert fra to forskjellige metoder for prøveinaktivering ved hjelp av Chikungunya-virus. Chikungunya-viruset er medlem av Alfavirus- slekten i familien Togaviridae . Den er sfærisk med en diameter på 60-70 nm. Virionen inneholder en konvolutt som er rik på glykoproteiner som danner trimerte pigger på viraloverflaten. Chikungunya-viruset må håndteres i BSL-3. Hurtig inaktivering oppnås ved bruk av 2% glutaraldehyd i 20 minutter etterfulgt av en 1 time eksponering for 1% osmiumtetroksid damp, med hele negAtivfargingsprosess som forekommer i en kapsel i et BSC i biokonduktivitetslaboratoriet ( figur 1C ). Ved bruk av 2% glutaraldehyd i 24 timer for å inaktivere viruset, skjer inaktivering i et biokonduktivt miljø, men 1% UA-negativ flekkprosedyren utføres ved hjelp av kapselmetoden i et BSL-2-laboratorium ( Figur 1D ). Disse inaktiveringsprosedyrene produserer ikke de samme kvalitetsbildene ( figur 3 ). Det fremgår av figur 3 at fiksering i glutaraldehyd uten tilstedeværelse av osmiumtetroksid ( Figur 3A , 3B ) viser mer ultrastrukturell detalj enn prøver fremstilt med glutaraldehyd og osmiumtetroksid ( Figur 3C , 3D ).

Kapselmetoden fungerer godt ved bruk av uranylacetat (UA) og fosfonOtungstic syre (PTA) som negative flekker for aldehyd-faste prøver.

Eksempler på UA og PTA-negativ farging ved hjelp av kapselmetoden er vist i figur 4 på aldehyd-fikserte viruslignende partikler (VLPer). VLPene er proteiner samlet inn i viruslignende strukturer, men inneholder ikke noe viralt genetisk materiale. De brukes vanligvis i vaksineutvikling og for grunnleggende viralforskning. Negativ farging er et verdifullt verktøy for å evaluere VLP-montering og morfologi. Vi brukte både UA og PTA for negativ farging av VLP med kapselmetoden. Begge flekker viser resultater av høy kvalitet med glykoproteiner synlige og klart definerte grenser av Ebola nano-VLPs 15 ( Figur 4A , 4B ) og Murine Leukemia VLPs 16 ( Figur 4C , 4D ).


Figur 1: Negativ fargemetoder Oversikt. ( A ) Manuell dråpemetode utføres ved sekvensielt bevegelige TEM-rister fra dråpet til dråpe av prøven, skyll og flekker. ( B ) Konfigurere kapselmetoden med rister og påføring av prøveoppheng. ( C ) Typisk prosedyre ved bruk av kapselmetoden i biokonstruksjon med kortvarig inaktivering med 1% osmiumtetroksiddamp. ( D ) Anbefalt prosedyre ved bruk av kapselmetoden i biokonstruksjon med langvarig inaktivering med 2% glutaraldehyd. Figur ble tidligere publisert og gjenbrukt med tillatelser fra referanse 13 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.


Figur 2: Sammenligning av 1% PTA Negative Stained Ebolavirus Particles. ( A ) Negativ farget med manuell dråpemetode. ( B ) Negativ farget med kapselmetoden. Figur ble tidligere publisert og gjenbrukt med tillatelser fra referanse 13 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: 1% UA negativ farging med kapselmetoden for Chikungunya-virus ved bruk av forskjellige inaktiveringsprosedyrer. ( A , B ) inaktivering i minst 24 timer med kun 2% glutaraldehyd. ( C ,D) Hurtig inaktivering med 2% glutaraldehyd og 1% osmiumtetroksiddamp. Figur ble tidligere publisert og gjenbrukt med tillatelser fra referanse 13 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: Eksempler på fosfotungstinsyre (PTA) og urranylacetat (UA) negativt fargede viruslignende partikler (VLPer) ved bruk av kapselmetoden. ( A ) Forstørre oversikt over 1% PTA-farget ebola nano-VLP. ( B ) TEM-bilde med høy forstørrelse som viser strukturelle detaljer av PTA-farget ebola nano-VLP. ( C ) Forstørre oversikt over 1% UA-farget Murine Leukemia VLPs. ( D ) Høy forstørrelse TEM bilde som viser strukturelle detAils av UA farget Murine Leukemia VLPs med ebolavirus glykoprotein på deres overflate. Figur ble tidligere publisert og gjenbrukt med tillatelser fra referanse 13 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Negativ farging er en verdifull TEM-teknikk for evaluering og størrelse av virus, proteinkomplekser og nanopartikler. Dropletpreparering av disse prøvene ved manuell flytting av rister fra reagens til negative flekker har vært den klassiske protokollen i mer enn et halvt århundre. Det er en enkel prosess, men krever kompetanse oppnådd gjennom trening for vellykket gjennomføring. Utmerket negativ farging betraktes fortsatt som et toppmoderne ferdighetssett og svært ønsket i mange TEM-laboratorier. Kapselmetoden har flere forskjellige fordeler i forhold til manuell dråpemetode, spesielt i biokonduktivitetslaboratorier. For det første krever manuell dråpemetode betydelig opplæring og erfaring før den kan utføres med vellykket bruk, mens den enkle å bruke kapselmetoden kan oppnås av innledende teknikker ved enkel pipetting. Den største utfordringen med manuell dråpemetode er den vellykkede håndtering av TEM-nettene med tang i BSL-3 og BSL-4 PPE på grunn av tO den sterkt reduserte taktile følelsen og fingerfrekvensen Fragile belagte TEM-nett er lett skadet eller punktert med tau. Skader på det belagte TEM-nettet blir ofte ikke avslørt før det vises med en TEM. En annen fordel ved kapsler er at TEM-nettene bare håndteres direkte når de settes inn i kapsler og når de fjernes for innsetting i elektronmikroskopet. Enten det arbeider i biokonduktivitetslaboratoriet eller i BSL-2 EM-anlegget, er det ingen direkte netthåndtering. En tredje fordel ved kapselmetoden er at begge sider av rutenettet er dekket av virus og flekker. Dette kan være nyttig når prøven konsentrasjonen er lav; Dette kan imidlertid forårsake for mye prøve hvis konsentrasjonen er høy eller resultere i fortynning av prøven før bruk.

Negative farging av flere gitter ved hjelp av manuell droppteknikk er tidkrevende fordi hver prøve må være individuelt forberedt og farget. Dette fører til vanskeligheter obtaiNing konsistent, reproduserbar farging. Videre er det alltid en utfordring å holde styr på mange individuelle nett. Hver kapsel inneholder to rister, og flere kapsler kan festes til en flerkanalspipett, og strømlinjeforme prosessen. Kapsler sikrer derfor at rister blir farget ved hjelp av en meget lignende prosess, under konsekvente prøveforhold, og samtidig. Kapslene kan merkes for å hjelpe til med organisering, og dermed redusere potensialet for sammenblanding eller feilidentifikasjon av rister. Et annet vanlig problem som oppstår når man bruker den manuelle dråpemetoden, er ristkontaminering. Dette kan oppstå når gridene står i utelukket for lenge eller blir tapt. Kapselet beskytter TEM-nettet fra friluft og holder dem trygt slik at de aldri slippes. Kapsler gir større eksperimentell kontroll og repeterbarhet ved tilberedning og negativ farging fordi kapselen er et mer kontrollert miljø.

Kapslene kan kjøpes forhåndsbelastet hvis desired. Manuell lasting av gitter i kapslene tar litt øvelse for å sikre at gitter ikke er skadet. Kapselmetoden krever også litt mer prøve og flekk enn manuell dråpemetode. Kapselmetoden krever minst 40 μL prøve, sammenlignet med manuell dråpemetode, som kan gjøres med så lite som 8 μL.

Virusinaktivering er en viktig del av negativ farging i BSL-3 og BSL-4, da det tillater at det inaktiverte viruset tas ut av biokonduktivitetslaboratoriene for avbildning i EM-anlegget. Inaktivering ved hjelp av fikseringsmidler har den ekstra fordelen ved å fikse viruset, og forhindrer nedbrytning. Det er to forskjellige måter å inaktivere virusprøven, som begge ble undersøkt i denne studien. Den første overholder viruset til belagte TEM-griser, fikserer virusene i 20 minutter i en 2% glutaraldehydløsning, etterfulgt av 1 timers eksponering av rutenettet for osmiumtetroksydamp ( figur 1C ). Dette inaktivererIon-metoden er fordelaktig fordi den sparer tid ved å tillate at prøven tas ut av biokonstruksjonslaboratoriet etter 1 time og 20 minutter. Det forhindrer også fortynning av virus før påføring på det belagte TEM-nettet, slik at det kan være nødvendig for prøver som er mistenkt for å være nær TEM-deteksjonsgrensen. Imidlertid reduserer 1% osmiumtetroksiddamp kvaliteten på TEM-bilder da osmiumet kan fargere prøven ytterligere ( figur 3 ). Tidligere rapporter viser en 5 min eksponering for osmiumtetroksid damp gir gode resultater når negativ farging; Imidlertid ga lengre eksponering for absolutt viral deaktivering en blanding av positiv og negativ farging 17 . Den andre inaktiveringsmetoden involverer minst 24 timer i en 2% glutaraldehydløsning, og krever ikke osmiumtetroksiddampbehandling ( Figur 1D ). Denne andre metoden tar lengre tid å fullføre da prøven ikke fjernes fra biokonduktivitetslaboratorietRatory i 24 timer, men kan være fordelaktig fordi det tillater negativ farging å gjøres utenfor biokonstruksjon i et BSL-2 miljø, og eliminerer behovet for farlig osmiumtetroksid. Våre resultater viser at 24 timers glutaraldehyd-inaktivering gir TEM-bilder av høyere kvalitet enn når prøver blir behandlet med osmiumtetroksydamp ( figur 3 ).

To negative flekker ble brukt i dette eksperimentet: UA og PTA. Begge flekker brukes som 1% løsning. UA, acetatsaltet av uran, fungerer godt som en negativ flekk fordi tette uranatomer sprer elektroner 5 . PTA, en heteropolysyre, virker på samme måte som en negativ flekk på grunn av tette wolframatomer 5 . PTA er noen ganger foretrukket over UA fordi den er mye mindre giftig, og bare mild irriterende ved innånding eller kontakt. Ved negativ farging av ufiksede prøver må den lavere pH av UA vurderes, da det kan forårsake skade tO prøven Virusene som brukes i dette forsøket krever fiksering for inaktivering, slik at både UA og PTA oppnådde lignende resultater, og ingen klar fordel kunne oppdages for enten flekk. Begge flekker er enkle å jobbe med, og de produserer begge like TEM-bilder av god kvalitet ( figur 4 ).

Samlet sett er kapselmetoden enklere å bruke i et biokonduktivt miljø og kan brukes som et alternativ til manuell dråpemetode. Ved hjelp av kapsler blir det enklere å prøve manipulasjonsfeil og gir TEM-bilder av god kvalitet. Bildene som produseres ved hjelp av kapselmetoden, er sammenlignbare med bilder produsert ved hjelp av manuell dråpemetode. Kort virusinfeksjon med osmiumtetroksid forbedrer hastigheten, men bør bare brukes hvis redusert bildekvalitet er akseptabel, eller det er mistanke om at fortynning av viruset vil sette den under TEM-deteksjonsgrensen for prosedyren. Både UA og PTA gir lignende resultater med de faste virusprøver som brukes i denne studien; hoWever, resultater kan være forskjellige når farger ufiksete virus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Meninger, tolkninger, konklusjoner og anbefalinger angitt i artikkelen er forfatterne og er ikke nødvendigvis godkjent av den amerikanske hæren eller forsvarsdepartementet.

Acknowledgements

Vi vil gjerne anerkjenne og takke Dr. John Carra og Rowena Schokman for å gi renset Ebola nano-VLP, Dr. Rajini Mudhasani, for å gi Chikungunya-virus, og Dr. Charles (Jason) Shoemaker for å gi Murine Leukemia VLPs som uttrykker Ebolavirus glykoproteiner. Vi vil også takke MAJ Carl Soffler for å legge til rette for Summer Internship Program (SIP) og Science and Engineering Apprenticeship Program (SEAP) og Dr. Catherine Wilhelmsen for labsikkerhetstrening.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formvar/carbon coated TEM grids SPI 3420C-MB 200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules EMS 85010-01 box
mPrep/f couplers EMS 85010-11 standard 16/Pk
glutaraldehdyde EMS 16320 50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide EMS 19190 4% aqueous solution
Uranyl Acetate EMS 22400 powder
Potassium phosphotungstic acid EMS 19500 powder
filter paper Whatman 1450-090 size 50
Tranmission Electron Microscope JEOL JEM-1011 TEM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37, (4), 403-422 (2014).
  2. Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355, (9216), 1713-1717 (2000).
  3. Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37, (2), 91-106 (2006).
  4. Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22, (4), 552-563 (2009).
  5. Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. Negative staining of proteins. Electron Microsc Rev. 3, (1), 43-72 (1990).
  6. Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
  7. Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
  8. Bradley, D. E. Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins. Bacteriol Rev. 31, (4), 230-314 (1967).
  9. Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94, (3-4), 305-308 (1987).
  10. Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, Suppl 3. 721 (2015).
  11. Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23, (5), 30-37 (2015).
  12. Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, Suppl 2. 174-175 (2011).
  13. Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
  14. Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7, (3), 857-872 (2015).
  15. Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
  16. Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. 403419 (2011).
  17. Barland,, Rojkind, M. Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212, (5057), 84-85 (1966).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics